$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Eksperymentalny proces oceny skuteczności inokulantów mikroorganizmów w zwiększaniu odporności na stres wodny w sałacie rzymskiej (Lactuca sativa L. var. Paspartu) został podsumowany na Rysunku 1. Protokół integrował ciągły monitoring precyzyjnych reżimów nawadniania z okresowym pozyskiwaniem danych fizjologicznych i termicznych. Wykorzystano dwa odrębne produkty mikrobiologiczne: (I) konsorcjum mikrobiologiczne, złożone konsorcjum 67 szczepów obejmujących PGPR, aktinomycety i pożyteczne grzyby, zaprojektowane jako bufor fizjologiczny poprzez kolonizację korzeni i wydzielanie egzopolisacharydów (EPS); oraz (II) Trichoderma harzianum, inokulant pojedynczego szczepu Trichoderma harzianum , mający na celu wywołanie oporności systemowej i modyfikację architektury korzeni. Odczynniki, sprzęt i oprogramowanie używane są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Szczepienie mikrobiologiczne
Dla obu zabiegów mikrobiologicznych wprowadzono ustandaryzowany reżim szczepienia, składający się z sześciu aplikacji zanurzonych w glebie skierowanych do ryzosfery, wykorzystując wysokoprecyzyjne mikropipety do symulacji dawek na skalę polową. Pierwsza faza miała miejsce w fazie siewki, 5 i 15 dni po wysiewie (DAS). W 30 DAS sadzonki przesadzano do większych tacek z próchnicą, a druga faza szczepień przeprowadzana był 1 dzień po przesadzeniu (DAT), a następnie kolejne aplikacje w 7, 15 i 20 DAT.
W konsorcjum mikroorganizmów dawki były dostosowane do fenologii roślin: pierwsze dwie aplikacje stosowano przy 500 g/ha (3 mL/roślinę), następnie przy przesadzaniu podawano dawkę o wysokim stężeniu 2 kg/ha, a na koniec trzy dawki podtrzymujące 300 g/ha. Podobnie T. harzianum był stosowany w stosunku 1 L/ha podczas dwóch pierwszych etapów, 3 L/ha przy przesadzaniu oraz 1 L/ha w trzech ostatnich aplikacjach. To podejście etapowe zostało zaprojektowane, aby zapewnić solidną kolonizację korzeni oraz utrzymać rolę populacji mikroorganizmów jako bufora fizjologicznego przez krytyczne okresy wzrostu i indukcji stresu.
2. Przygotowanie upraw
Certyfikowane nasiona sałaty rzymskiej (Lactuca sativa L. var. Paspartu) kiełkowały w tackach polistyrenu o pojemności 311 wnęk (11 mL na wnękę) na profesjonalnym podłożu opartym na torfie na głębokości 1 cm. Kiełkowanie przeprowadzono w kontrolowanej komorze bioklimatycznej utrzymywanej w zakresie od 15 °C do 22 °C oraz wilgotności względnej 60%–70%. Po osiągnięciu 90% kiełkowania (około 3–5 dni po wysiewie) siewki przesadzano do większych tac o pojemności 55 mL na bryły korzeniowe, aby umożliwić nieograniczony rozwój korzeni (Rysunek 2 i Rysunek 3). Badanie było zorganizowane w całkowicie losowym projekcie (CRD), z 9 jednostkami eksperymentalnymi (tackami) i 20 siewek na tacę. Układ ten został skonstruowany tak, aby umożliwić układ 3 × 3 czynniki (3 zabiegi mikrobiologiczne × 3 reżimy nawadniania). Szczegółowe właściwości fizyczno-chemiczne podłoża oraz specyficzne programowanie komory bioklimatycznej14przedstawione są na Rysunku 3, Tabeli Uzupełniającej 1, Tabeli Uzupełniającej 2 oraz Tabeli Uzupełniającej 3.
Eksperymentalne tace były rozprowadzane w całkowicie losowym układzie w komorze bioklimatycznej, aby wyeliminować efekty krawędziowe i zapewnić jednolitą ekspozycję. Komora została zaprogramowana do symulacji dynamicznych warunków podobnych do pola, wykorzystując wysoki reżim temperaturowy do odtworzenia naprężeń termicznych na otwartym polu. W fazie wegetatywnej parametry środowiskowe utrzymywano w zmiennym zakresie wilgotności względnej, a 9-godzinny fotookres zapewniał oświetlenie LED o wysokiej intensywności (ustawione powyżej 50% maksymalnej pojemności, aby zapewnić odpowiednią promieniowanie fotosyntetycznie aktywne)15. Po fazie ustanowienia program środowiskowy został dostosowany, aby odzwierciedlić rosnące wymagania oczyszczania deficytu wody, co ilustrują krokowe przejścia atmosferyczne15 (Rysunek 4 i Rysunek 5). Szczegółowe dzienne/nocne wartości nastawienia temperatury, wilgotności i natężenia światła są szczegółowo opisane w Tabeli Uzupełniającej 1 oraz Tabeli Uzupełniającej 2 , aby usprawnić główny protokół.
Strategia nawożenia została zaprojektowana tak, aby spełnić specyficzne potrzeby fenologiczne sałaty rzymskiej, utrzymując zrównoważony przepływ składników odżywczych przez cały cykl wegetatywny. W fazie sadzonki (12 do 24 DAS) składniki odżywcze były dostarczane poprzez ukierunkowane aplikacje azotanu potasu (KNO3), fosforanu monopotasu (KH2PO4) oraz azotanu wapnia (Ca(NO3)2). Aby ułatwić wczesne ustanowienie, w ciągu pierwszych 24 dnii 16 dołączono komercyjny biostymulant.
Od 26 DAS aż do końcowej oceny w 76 DAS, program zapłodnienia przeszedł na reżim podtrzymujący, w którym biostymulant został wyeliminowany, aby wyizolować specyficzne efekty szczepionków mikrobiologicznych. Wszystkie zastosowania zostały skalibrowane tak, aby utrzymać optymalną przewodność elektryczną (EC) i pH w ryzosferze. Pełny chronologiczny harmonogram stężeń minerałów oraz konkretnych objętości dawkowania16jest szczegółowo opisany w Tabeli Uzupełniającej 3.
3. Leczenie mikroorganizmami
Aby ocenić skuteczność interwencji biologicznych przeciwko stresowi hydrykalnemu, ustanowiono trzy odrębne metody leczenia: (I) konsorcjum mikrobiologiczne, konsorcjum mikrobiologiczne o wysokiej różnorodności obejmujące 67 korzystnych szczepów, w tym Rośliny wspierające wzrost ryzobakterii (PGPR), Actinomycete oraz grzyby; (II) T. harzianum, specjalistyczna formuła pojedynczego szczepu Trichoderma harzianum; oraz (III) niezaszczepioną kontrolą. Terapie te zostały wybrane ze względu na ich potencjał do indukowanej tolerancji systemowej (IST), głównie poprzez mechanizmy takie jak modyfikacja architektury korzeni, produkcja deaminazy ACC oraz wydzielanie egzopolisacharydów (EPS).
Szczepienie przebiegało etapowo strategicznie. Początkowe zastosowanie (3 mL na roślinę) wykonano za pomocą precyzyjnej mikropipety bezpośrednio do ryzosfery na drugim etapie prawdziwego liścia, aby zapewnić wczesną kolonizację korzeni. Kolejne zastosowania były kalibrowane do równoważników na skalę polową (symulując gęstość 75 000 roślin/ha). Dla T. harzianum zastosowano stężenie 2 L/ha, natomiast konsorcjum mikroorganizmów podawano 1 kg/ha. Formuły te rozpuszczano w wodzie irygacyjnej i stosowano co 15 dni, aby utrzymać stabilną populację mikroorganizmów jako bufor fizjologiczny przez cały cykl wegetatywny17.
4. Różne metody nawadniania
Aby ocenić plastyczność fizjologiczną i agronomiczną L. sativa w różnych warunkach hydrotechnicznych, wdrożono trzy reżimy nawadniające oparte na zastępowaniu ewapotranspiracji upraw (ETc). Objętościowa zawartość wody była kalibrowana względem pojemności pola (FC) podłoża, aby zapewnić precyzyjną indukcję naprężeń. Reżimy zostały zdefiniowane następująco: (I) Kontrolowane/Dobrze nawodnione (CC-100% ETc), gdzie pełna ewapotranspiracja była uzupełniana; (II) Umiarkowany deficyt wody (75% ETc), zaprojektowany w celu wywołania pośredniego ograniczenia hydraulicznego; oraz (III) Poważny Deficyt Wody (50% ETc), mający na celu wywołanie krytycznego stresu wodnego. Nawadnianie było przeprowadzane codziennie po wykonaniu obrazów termicznych za pomocą pipet stopniowanych, aby zapewnić dokładne uzupełnienie ilości wody utraconej podczas ewapotranspiracji18.
5. Rejestrowanie danych i obrazów
Aby ocenić rozkład termiczny roślin i stan wody, codziennie od poniedziałku do piątku wykonywano obrazy termiczne w podczerwieni przez cały okres eksperymentalny. Wszystkie nagrania fotograficzne przeprowadzono między 12:00 a 14:00, aby standaryzować pomiary w okresie maksymalnej transpiracji i intensywności słonecznej. Kluczowe jest wykonanie tych zdjęć bezpośrednio przed codziennymi zabiegami nawadniania, aby zarejestrować skumulowany stres wodny, jakiego doświadczały rośliny w ciągu poprzedniego 24-godzinnego cyklu. Do akwizycji kamery termowizyjnej na podczerwień była podłączona do urządzenia mobilnego i utrzymywała orientację prostopadłą względem grzbietu sałaty w stałej odległości 60–70 cm. Oprogramowanie zostało skonfigurowane z wielokolorową paletą termiczną, w której gradienty temperatury są reprezentowane od najniższego do najwyższego: zaczynając od fioletu (najzimniejsze), przechodząc przez królewski niebieski, turkusowy, zielony (środek punktu), żółty, pomarańczowy, a na końcu czerwony (najcieplejszy). W interfejsie programowym ręcznie wybrano konkretny obszar tacy zawierający zadaszenie rośliny, aby przechwycić dane termiczne. Ta skala kolorystyczna służy jako wskaźnik fizjologiczny: dobrze nawodnione rośliny wykazują niższe temperatury korony (fioletowy/niebieski) dzięki aktywnej transpiracji, podczas gdy odwodnione rośliny wykazują wyższe temperatury korony (pomarańczowe/czerwone) z powodu zamknięcia aparatów szparkowych i zmniejszonego chłodzenia parowego. Następnie te obrazy o wysokiej rozdzielczości zostały przetworzone za pomocą funkcji pomiaru trzech punktów dla określonych obszarów zainteresowania (ROI), aby uzyskać precyzyjne wartości temperatury korony (Tc) do obliczenia Wskaźnika Stresu Wodnego Upraw (CWSI).
Jeśli CWSI jest:
0, wtedy uprawa nie jest pod stresem wodnym
1 wtedy uprawa jest pod silnym stresem wodnym
Gdzie:
Tc to temperatura korony upraw, mierzona obrazowaniem na podczerwień. Tw to temperatura korony w warunkach niezwiązanych ze stresem wodnym. Td to temperatura korony drzewa przy maksymalnym stresie wodnem19.
Wskaźniki wzrostu, rozwoju i stanu fizjologicznego roślin, takie jak wysokość, liczba liści i temperatura liści, oceniane za pomocą termografii podczerwonej, są przedstawione w Tabeli Uzupełniającej 4 wraz ze zmiennymi badania oraz definicjami koncepcyjnymi i operacyjnymi użytymi w eksperymencie. Połączenie tych zmiennych umożliwiło kompleksową ocenę wpływu eksperymentalnych zabiegów na funkcjonowanie fizjologiczne i rozwój każdej rośliny.
6. Analiza danych
Dane fizjologiczne i morfologiczne zostały przeanalizowane za pomocą jednokierunkowej metody ANOVA dla każdego reżimu irygacyjnego, aby określić wpływ różnych zabiegów mikrobiologicznych. Wszystkie procedury statystyczne były wykonywane za pomocą oprogramowania statystycznego. Przed przeprowadzeniem analizy wnioskacyjnej zweryfikowano podstawowe wymagania statystyki parametrycznej, aby zapewnić wiarygodność wyników. Normalność reszt została potwierdzona za pomocą testu Andersona-Darlinga (s. > 0,100), co wskazuje na normalność. Dodatkowo jednorodność wariancji została zweryfikowana za pomocą testu Levene'a (p = 0,989), potwierdzając wysoką homoskedastyczność między grupami. Ponieważ oba założenia zostały spełnione, test Post-hoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) został użyty do identyfikacji istotnych różnic (p < 0,05) między średnimi leczenia. Pojedyncza roślina została zdefiniowana jako jednostka eksperymentalna dla wszystkich ewaluacji statystycznych.
