Sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA do profilowania segmentów grubokomórkowych i agangliocznych jelita grubego u pacjentów z chorobą Hirschsprunga

Yan Qu; Lei Wan; Nian He; Hong Liu; NianJie Zhang; Meng Cao; Shuo Yin; Xu Chen; Xun Deng; Xuefeng Yang

doi:10.3791/69825

Method Article

Sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA do profilowania segmentów grubokomórkowych i agangliocznych jelita grubego u pacjentów z chorobą Hirschsprunga

DOI:

10.3791/69825

⸱

May 22nd, 2026

Yan Qu¹ , Lei Wan¹ , Nian He¹ , Hong Liu¹ , NianJie Zhang¹ , Meng Cao¹ , Shuo Yin¹ , Xu Chen¹ , Xun Deng¹ , Xuefeng Yang¹

¹Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje proces sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek do analizy infiltracji komórek immunologicznych oraz specyficznych dla typu komórek różnic transkrypcyjnych między segmentami jelita jewojowego i aganglionicznego w chorobie Hirschsprunga.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Hirschsprunga (HSCR) to wrodzone zaburzenie motoryki jelit, charakteryzujące się brakiem neuronów jelitowych w jelicie dystalnym. W porównaniu z sekwencjonowaniem RNA objętości, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) umożliwia profilowanie ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek, eliminując heterogeniczność komórkową maskowaną w analizach uśrednionych populacji. Ustanowiono standaryzowany workflow scRNA-seq do charakteryzacji krajobrazu transkrypcyjnego segmentów ganglionowych i agangliocznych u pacjentów z HSCR. Pobrano tkanki jelita grubego, a w celu identyfikacji regionów ganglionowych i aganglionicznych wykonano barwienie hematoksyliny i eozyny. Tkanki były enzymatycznie i mechanicznie dysocjowane do zawiesin jednokomórkowych, po czym przeprowadzono filtrację, ocenę żywotności oraz budowę bibliotek transkryptomowych pojedynczych komórek. Biblioteki przechodzące kontrolę jakości były sekwencjonowane, a surowe dane przetwarzane w celu kwantyfikacji komórek i filtracji jakości, aby usunąć komórki niskiej jakości i artefakty techniczne. Po normalizacji i redukcji wymiarowości komórki były klastrowane i anotowane na podstawie ustalonych genów markerowych. Analizy porównujące skład komórek między tkankami ganglionymi a aganglionicznymi oraz zidentyfikowały geny różnicowo ekspresyjne w kluczowych podzbiorach komórek odpornościowych. Wyniki ujawniają istotne różnice w mikrośrodowisku immunologicznym pomiędzy segmentami gangliotycznymi a aganglionikowymi w HSCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Hirschsprung (HSCR) jest jednym z najczęstszych wrodzonych zaburzeń motoryki jelit, z występowaniem około 1 na 5 000 żywych urodzeń na całym świecie¹. Choroba powstaje w wyniku niepowodzenia komórek grzebienia nerwowego jelitowego (ENCC) do migracji do jelita dystalnego w tygodniach embrionalnych 5–12, co skutkuje brakiem zwoji jelitowych w dotkniętych segmentach². Segment aganglionowy wykazuje w konsekwencji utrzymujący się skurcz spazmatyczny i zaburzoną perystaltykę, co prowadzi do bliższego rozszerzenia jelit. Klinicznie objawia się to jako niedrożność czynnościową, powodująca zaparcia, rozdęcie brzucha i wymioty, a w ciężkich przypadkach może być zagrażające życiu. Chirurgiczne wycięcie segmentu agangielicznego pozostaje podstawowym leczeniem HSCR; jednak znaczna część pacjentów doświadcza powikłań pooperacyjnych, w tym zaparcia, zapalenia jelit i zabrudzania kału, które znacząco obniżają jakość życia³. Dodatkowo zespół krótkich jelita (SBS) może wystąpić po rozległej resekcji jelitowej, co skutkuje zaburzeniem wchłaniania składników odżywczych i zwiększonym wyzwaniem w leczeniu klinicznym. Dlatego wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw HSCR oraz identyfikacja nowych celów terapeutycznych pozostają kluczowymi potrzebami klinicznymi.

W ostatnich latach sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA (scRNA-seq) zostało szeroko stosowane do badania mechanizmów molekularnych związanych z chorobą. W przeciwieństwie do konwencjonalnego sekwencjonowania RNA w objętości, scRNA-seq umożliwia analizę ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki, umożliwiając identyfikację heterogeniczności komórkowej oraz rzadkich subpopulacji maskowanych w analizach objętych⁴. W konsekwencji scRNA-seq stała się potężnym narzędziem do analizowania heterogeniczności komórkowej i komunikacji międzykomórkowej, co przyczynia się do rozwoju badań w biologii i medycynie⁵. Takie podejście ujawniło nowe mechanizmy patogenne i cele terapeutyczne w chorobach złożonych, w tym chorobie Alzheimera⁶, reumatoidalnym zapaleniu^{stawów 7}, raku płuc⁸ oraz cukrzycy typu 2⁹.

W tym badaniu zastosowano scRNA-seq do charakteryzacji krajobrazu transkrypcyjnego komórek immunologicznych oraz wzorców infiltracji w tkankach jelita grubego ganglionowego i aganglionowego u pacjentów z HSCR. Workflow składał się z trzech głównych etapów: przygotowania i oceny jakości zawiesin pojedynczych komórek, budowy 3′ bibliotek RNA-seq z pojedynczą komórką oraz analizy bioinformatycznej w dalszej fazie. Próbki tkanek były przechowywane w dedykowanym roztworze do zachowania pojedynczych komórek zaraz po resekcji i enzymatycznie rozłożone na zawiesiny pojedynczych komórek w ciągu 48 godzin. Żywotność komórek przekroczyła 80%, a końcowe stężenie komórek zostało skorygowane do 700–1 500 komórek/μL przed przygotowaniem bibliotecznym. Porównano infiltrację komórek immunologicznych pomiędzy segmentami gangliońskimi a aganglionikowymi oraz zidentyfikowano subpopulacje komórek odpornościowych wykazujące wyraźne różnice transkrypcyjne. Analizy te wskazują zmiany komórek odpornościowych związane z patologią jelita grubego w HSCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytucjonalnej Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Medycznego Zunyi (nr zatwierdzenia: KYLL-2024-030). Badanie jest zgodne z Deklaracją Helsińską. Wszyscy uczestnicy i ich opiekunowie uzyskali świadomą zgodę (ustną i pisemną). Tabela 1 przedstawia informacje o pacjentach z HSCR.

Pobieranie tkanek okrężnicy, w tym segmentów ganglionów i aganglionicznych, od pacjentów z HSCR, u których zdiagnozowano i którzy przechodzą operację w Katedrze Chirurgii Dziecięcej w Szpitalu Afiliowanym Uniwersytetu Medycznego Zunyi. Uwzględnić segmenty ganglioniczne i aganglioniczne od dwóch mężczyzn z HSCR. Szczegółowe informacje kliniczne znajdują się w Tabeli 1. Wszystkie odczynniki, chemikalia, sprzęt i oprogramowanie są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Barwienie hematoksyliną i eozyną

Pobieranie i utrwalanie tkanek
1. Utrwalić próbki tkanek jelit w 4% roztworze wiązania paraformaldehydu przez co najmniej 24 godziny.
  UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i uwalnia pary formaldehydu. Wszystkie procedury wykonuj w okapie chemicznym i używaj odpowiednich środków ochrony osobistej.
2. Przycinaj tkanki do około 5 × 5 × 2 mm³ skalpelem. Włóż chusteczki do kaset osadzających i płukaj pod bieżącą wodą przez 24 godziny.
  UWAGA: Usuń krawędzie tkanki i przygotuj bloki z co najmniej jedną płaską powierzchnią. Jeśli są nierówne, po płukaniu umieść chusteczkę między papierami filtracyjnymi.
Stopniowe odwodnienie etanolem
1. Zanurz tkanki kolejno w roztworach etanolowych: 70% etanolu przez noc, 80% etanolu przez 3 godziny, 90% etanolu przez 2 godziny, 95% etanolu I przez 2 godziny, 95% etanolu II przez 1 godzinę, 100% etanolu I przez 1 godzinę oraz 100% etanolu II przez 30 minut.
  UWAGA: Rozcieńcz etanol (≥99,7%) w ultraczystej wodzie do wskazanych stężeni.
  UWAGA: Wykonuj obsługę etanolu w okapie chemicznym.
2. Wyjmij koszyk odwodniający i dokładnie opróżnij między krokami.
Oczyszczanie
1. Przenieś tkanki do ksylenu na 30 sekund, aby uzyskać przezroczystość.
Infiltracja i osadzanie parafiny
1. Roztopić wosk parafinowy w 60 °C dzień wcześniej. Poddaj świeży wosk trzem cyklom zamrażania i rozmrażania, aby usunąć pęcherzyki. Po trzecim cyklu przefiltruj stopioną parafinę przez papier filtracyjny.
2. Infiltruj tkanki w czystym wosku parafinowym (wosk parafinowy I) przez 1 godzinę.
3. Infiltruj tkanki w mieszance parafinowej (wosk parafinowy II; czysty wosk parafinowy: wosk pszczeli = 8:1) przez 2 godziny.
  UWAGA: Całkowicie roztop wosk pszczeli i przefiltruj przed użyciem.
4. Wlew wosk parafinowy II do form do osadzania. Umieść bloki tkanek pionowo i płasko, włóż etykiety i pozwól im zastygnąć.
Sekcjonowanie
1. Przycinaj bloki parafiny, aby uzyskać gładkie powierzchnie bez nacinania tkanki.
2. Zamontuj bloki na mikrotomie. Dostosuj orientację i usuń nadmiar parafiny. Cięcie sekcji seryjne o grubości 4 μm. Unieś sekcje na wodzie w temperaturze 50 °C i przenieść na szklane szkiełki.
3. Susz w piekarniku o temperaturze 60 °C, aby usunąć resztki wilgoci.
  UWAGA: Suche sekcje przez 12–48 godzin.
Deparafinizacja
1. Wykonaj inkubację sekwencyjną: ksylen I (15 min), ksylen II (15 min), 100% etanol I (5 min), 100% etanol II (5 min), 90% etanol (5 min), 80% etanol (5 min), 70% etanol (5 min) oraz woda destylowana (5 min).
Barwienie hematoksylyną
1. Barwimy fragmenty hematoksyliną przez 50 sekund.
2. Przepłukuj pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
Barwienie eozyną
1. Barwimy fragmenty eozyną przez 40 sekund.
Odwodnienie
1. Zanurz sekcje kolejno w 95% etanolu I (30 s), 95% etanolu II (30 s), 100% etanolu I (30 s) oraz 100% etanolu II (30 s).
Oczyszczanie
1. Przenieś sekcje do ksylenu I na 10 minut i ksylenu II na 10 minut.
Montaż i obserwacja
1. Dodaj medium mocujące. Przykryj szklaną pokrywką i usuń pęcherzyki powietrza.
2. Pozwól, by medium mocujące się zastygnęło. Zbadaj przekroje pod mikroskopem świetlnym.

2. Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek

Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
1. Siekać tkanki jelitowe na fragmenty o grubości ~1 mm³ nożyczkami.
2. Inkubuj fragmenty tkanki w zmodyfikowanym medium Eagle (DMEM) Dulbecco zawierającym 1 mg/mL kolagenazę II oraz 0,1 mg/mL DNazę I w temperaturze 37 °C przez 30 minut z delikatnym poruszeniem na platformie bujającej (60 obr./min).
3. Zakończ trawienie poprzez dodanie równej ilości zimnego DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydła (FBS).
4. Przefiltruj zawiesinę przez sitko ogniwa 70 μm. Wirówka w 300 × g przez 5 minut w 4 °C.
5. Usuń supernatant i zachowaj pellet komórkowy. Przemyj raz sólą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) zawierającą 0,04% bydłej albuminy surowicy (BSA).
6. Rozdziel skupiska komórek delikatnym pipetowaniem, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
7. Przefiltruj zawiesinę przez sitko ogniwa 40 μm.
8. Wirować w 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usuń supernatant i zbierz granulat.
9. Ponownie zawiesić komórki DMEM zawierające 10% FBS i 1% penicylin-streptomycyny (P/S).
10. Określ żywotność i gęstość komórek za pomocą wykluczenia trypanowego niebieskiego. Używaj próbek o żywotności >80% i dostosuj stężenie do 700–1 500 komórek/μL.
  UWAGA: Wymieszaj zawiesinę komórkową z trypanowym niebieskim (1:1) i licz żywotne komórki za pomocą hemocytometru.
Przygotowanie do biblioteki
1. Załaduj około 15 000 komórek na przejście do przygotowania biblioteki.
  UWAGA: W mikrokroplach z kulki żelowej (GEM) mRNA hybrydyzuje z poli(dT) oligonukleotydami na kulkach żelowych.
2. Wykonaj transkrypcję odwrotną i amplifikuj cDNA za pomocą PCR (95 °C przez 10 min; 40 cykli 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 35 s, 72 °C przez 25 s; końcowe rozszerzenie przy 72 °C przez 25 s). Do budowy 3′ scRNA-seq do użycia amplifikowanego cDNA.
  UWAGA: Podczas syntezy cDNA dodaje się przewis CCC i łączy się z sekwencją oligonukleotydu zamieniającego szablon (TSO).
3. Rozbijanie emulsji i odzyskiwanie cDNA z GEM-ów.
Kontrola jakości bibliotek i sekwencjonowanie
1. Ilościowo określić ekspresję genów i ocenić rozkład wielkości fragmentów.
2. Wykonaj dokładną ilościową analizę za pomocą fluorescencyjnego instrumentu qPCR.
  UWAGA: Zadbaj o koncentrację biblioteki ≥10 nM.
3. Biblioteki sekwencji z wykorzystaniem instrumentu sekwencjonowania.
  UWAGA: Struktura czytania: Odczyt 1 (26 bp), Read 2 (91 bp), indeks i7 (8 bp); Głębokość celu ~50 000 odczytów na komórkę.
Kontrola danych
1. Wyrównaj surowe odczyty do bazy referencyjnej. Wykonaj liczenie UMI i wygeneruj macierz komórka po genie.
2. Importuj wyniki w formacie AnnData (Annotated Data) do analizy dalszej.
3. Przeprowadz filtrowanie kontroli jakości na podstawie UMI, liczby genów i odczytów mitochondrialnych.
  UWAGA: Zdejmij dublety (Scrublet); Wykluczyć komórki z <200 lub >5 000 genów, czyli total_counts >40 000, czyli mt_ratio >20%.
Redukcja wymiarowości i adnotacja
1. Normalizuj liczbę unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) do 10 000 na komórkę.
2. Identyfikacja genów o wysokiej zmienności.
3. Wykonaj analizę głównych składowych (PCA).
4. Skonstruuj graf k-najbliższych sąsiadów.
5. Wykonaj osadzanie UMAP.
6. Klaster komórek za pomocą algorytmu Leiden w Scanpy (wersja 1.9.3).
  UWAGA: Użyj sc.pp.neighbors i sc.tl.leiden (rozdzielczość = 0,5).
7. Anotuj typy komórek za pomocą narzędzia zaprojektowanego do zautomatyzowanej, wysokoprecyzyjnej annotacji typów komórek w danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq).
Analiza różniczkowa
1. Przeprowadz analizę różnicowej ekspresji genów w R (v4.2.2) za pomocą Seurat (v4.3.0).
  UWAGA: Użyj funkcji FindMarkers z testem sumy rang Wilcoxona.
2. Wykonaj analizę wzbogacenia GO za pomocą clusterProfiler (v4.8.1) z enrichGO.
  UWAGA: Obejmuje kategorie CC, MF i BP.
3. Wykonaj analizę wzbogacenia szlaku KEGG za pomocą clusterProfiler (v4.8.1) z enrichKEGG¹⁰.

3. Utylizacja odpadów

Zbieraj odpady zawierające paraformaldehyd i ksylen osobno.
Neutralizuj roztwory kwasowe, gdy jest to stosowne, lub utylizuj jako odpady niebezpieczne.
Przestrzegaj instytucjonalnych przepisów dotyczących zdrowia i bezpieczeństwa środowiska (EHS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie hematoksyliny i eozyny (HE) (Rysunek 1) wykazało wyraźne różnice histologiczne między segmentami gangliońskimi a agangliońskimi. W porównaniu z segmentami zwojowymi, segmenty aganglionowe wykazywały zwiększoną złuszczonkość błony śluzowej, wyraźne zmniejszenie liczby komórek pucharowych i neuronów podśluzowych oraz zatarte granice między warstwą śluzową a mięśniową. W podzbiorze przekrojów zachowanie tkanek było nieoptymalne, z częściowym odwarstwieniem nabłonka i zaburzeniami arch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA zastosowano do profilowania cech transkrypcji chirurgicznie usuniętych tkanek okrężnicy (segmentów ganglionowych i aganglionicznych) u pacjentów z chorobami Hirschsprunga ^4,5. Szczególną uwagę poświęcono strategii dysocjacji tkanek, ponieważ parametry dysocjacji wpływają na odzyskiwanie komórek, reprezentację typów komórek oraz integralność RNA. Warunki trawienia enzymatycznego zostały zoptymalizowane, aby zrównoważyć wy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Projekt Nauki i Technologii Guizhou (Fundacja Współpracy Naukowo-Technologicznej Guizhou - ZK - [2024] Ogólne 344) (dla X.F. Yanga) oraz Umowy Projektu Naukowo-Technologicznego Zunyi (Współpraca Naukowo-Technologiczna Zunyi) (Zunyi Science and Technology Cooperation HZ (2023) nr (do Y. Qu).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Wosk pszczeli	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	8012-89-3	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Wosk pszczeli	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	8012-89-3	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Albumina surowicy bydła	Thermofisher	30066575	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
Albumina surowicy bydła	Thermofisher	30066575	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
CellTypist	Nie ma	NA	http://celltypist.org/tutorials/onlineguide
CellTypist	Nie ma	NA	http://celltypist.org/tutorials/onlineguide
Cluster profiler package	Bioconductor	v4.8.1	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Cluster profiler package	Bioconductor	v4.8.1	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Kolagenaza II	Thermofisher	17101015	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Kolagenaza II	Thermofisher	17101015	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Szkło okładkowe	CITOTEST	80340-0130	https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Szkło okładkowe	CITOTEST	80340-0130	https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Jednorazowe mikrotomowe ostrze	Pióro	S-35	https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
Jednorazowe mikrotomowe ostrze	Pióro	S-35	https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
DNaza I	Thermofisher	18047019	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
DNaza I	Thermofisher	18047019	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
Suszarka	BORUK	DHG-9140A	http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Suszarka	BORUK	DHG-9140A	http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle Medium	Thermofisher	12491015	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle Medium	Thermofisher	12491015	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Alkohol etylowy	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	10009218	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Alkohol etylowy	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	10009218	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Surowica bydła płodowa	Thermofisher	A5669801	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Surowica bydła płodowa	Thermofisher	A5669801	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny	Beyotime	C0105S	https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0105S
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny	Beyotime	C0105S	https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0105S
Kwas solny	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	10011028	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Kwas solny	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	10011028	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Szkiełko mikroskopowe	CITOTEST	80302-3111	https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Szkiełko mikroskopowe	CITOTEST	80302-3111	https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Medium montażowe	Beyotime	C0173-100ml	https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Medium montażowe	Beyotime	C0173-100ml	https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Mikroskop optyczny	Nikon	WYKLUCZENIE SI	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Mikroskop optyczny	Nikon	WYKLUCZENIE SI	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Wosk parafinowy	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	8002-74-2	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Wosk parafinowy	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	8002-74-2	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Roztwór paraformaldehydu	Beyotime	P0099-3L	https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
Roztwór paraformaldehydu	Beyotime	P0099-3L	https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
Penicylina– Streptomycyna	Thermofisher	15140122	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Penicylina– Streptomycyna	Thermofisher	15140122	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym	Thermofisher	10010023	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym	Thermofisher	10010023	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Jakościowy papier filtrujący	Solarbio	YA0166	https://www.solarbio.com
Jakościowy papier filtrujący	Solarbio	YA0166	https://www.solarbio.com
Pakiet oprogramowania R	R Foundation for Statistical Computing	v4.2.2	https://www.r-project.org/
Pakiet oprogramowania R	R Foundation for Statistical Computing	v4.2.2	https://www.r-project.org/
Mikrotom obrotowy	Leica	Leica RM2125 RTS	https://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
Mikrotom obrotowy	Leica	Leica RM2125 RTS	https://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
Skandalny	Stworzone przez społeczność	v1.9.3	https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
Skandalny	Stworzone przez społeczność	v1.9.3	https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
Seurat	CRAN	v4.3.0	https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
Seurat	CRAN	v4.3.0	https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
Suszarka tkankowa	Wuhan Junjie Electronics Co., LTD	JT-12H	http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Suszarka tkankowa	Wuhan Junjie Electronics Co., LTD	JT-12H	http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Maszyna do osadzania tkanek	Wuhan Junjie Electronics Co., LTD	JB-L8	http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Maszyna do osadzania tkanek	Wuhan Junjie Electronics Co., LTD	JB-L8	http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Trypan blue	Solarbio	C0040	https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
Trypan blue	Solarbio	C0040	https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
Ksylen	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	10023418	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
Ksylen	Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.	10023418	https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA do profilowania segmentów grubokomórkowych i agangliocznych jelita grubego u pacjentów z chorobą Hirschsprunga

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles