Wizualizacja liści i nazubników bawełny za pomocą mikroskopii cyfrowej w celu poprawy dokładności punktacji i zachowania danych

Summary

Tutaj ilustrujemy krok po kroku procesy fenotypowania nektariów liści i braktealnych u roślin bawełny, wykorzystując obrazy wygenerowane mikroskopią cyfrową. Jest to skuteczna metoda oceniania nektariów zarówno liści, jak i przysadek bawełny, ponieważ informacje te mogą być zbierane i przechowywane w formie obrazów cyfrowych.

Abstract

Nektarze to odrębne gruczoły produkujące nektar, obecne u wielu gatunków roślin. Nektarze wykazują różnorodne struktury i funkcje. W bawełnie tradycyjne ocenianie cechy nektarowej jest podatne na błędy, niewiarygodne i ma ograniczenia, ponieważ fenotypy tej cechy często nie są widoczne gołym okiem. Ekspresja cech nektarowych jest kontrolowana przez geny Ne1 i/lub Ne2. Dodatkowo, ekspresja cech może być zależna od środowiska i etapów wzrostu, co podkreśla potrzebę dokładnych metod punktowania. W szczególności ocena fenotypowa na podstawie obrazów cyfrowych skutkuje dokładniejszą metodą oceniania nektarów. Ta metoda przezwycięża ograniczenia tradycyjnego podłoża punktowego, generując obrazy o wysokiej rozdzielczości. Ponadto ułatwia identyfikację i różnicowanie drobnych różnic w ekspresji cech nektarowych, jednocześnie zachowując te cyfrowe obrazy na przyszłość. Opisaną tutaj metodę oceniania fenotypów można łatwo dostosować do oceny innych cech roślin, takich jak gruczoły, włosy i kolor. Metody oceny, które można dostosować do innych gatunków roślin. W tym artykule wyjaśniamy krok po kroku procedurę pobierania próbek z pola lub szklarni, rozcinania ich w celu obserwacji za pomocą mikroskopu cyfrowego oraz zachowania tych obrazów na przyszłą analizę punktową. W tej metodzie wykorzystamy na przykład punktowanie próbek liści i nazubień bawełny, aby rozróżnić obecność nektarów (w pełni rozwiniętych, zredukowanych i szczątkowych) oraz brak nektarów.

Introduction

Rośliny mają wyspecjalizowane gruczoły zwane nektariami, które syntetyzują i produkują nektar u większości okrytonasiennych, niektórych paproci oraz niektórych nagonasiennych 1,2,3,4. Nektarze dzielą się na trzy typy: mezofilne, trójczomatowe i nabłonkowe, oparte na pochodzeniu komórek produkujących nektar⁵. Nektarze w bawełnie to zmodyfikowane szparki szparkowe zbudowane z gruczołowych trichomatów zwanych brodawkami i są klasyfikowane jako typ trichomatów ^5,6. Większość gatunków Gossypium posiada nektary; jednak liczba nektariów obecnych w tym rodzaju różni się w zależności od gatunku⁷. Nektarze kwiatowe (FN) są częstsze niż nektarze pozakwiatowe (EFN) u roślin⁸. Te nektarium może występować wszędzie na roślinie z wyjątkiem korzeni ^1,2. Na przykład Gossypium hirsutum wykazuje zarówno kwiatowe, jak i pozakwiatowe nektarze⁹. Rośliny bawełny domowej mają trzy dodatkowe kwiatowe i jeden kwiatowy nektar¹⁰. Trzy dodatkowe nektarze kwiatowe to nektarze liściowe, orgaste i około-okołowe¹¹. Nektarz liściowy jest wegetatywny i zazwyczaj występuje na liściach po dolnej stronie żyłka środkowego, natomiast nektarze orkiełowy i około-okołowy są rozmnażające i rozwijają się u podstawy przylistka i powierzchni kaliszku auksjalnego. Nektarz kwiatowy jest związany z kwiatem, który rozwija się na powierzchni przylegającej (górnej) kielicha. Ta cecha nektarowa jest kontrolowana przez pojedynczy locus^{genu 12}. Badania przeprowadzone przez dwie niezależne grupy badawcze wykazały, że cecha nektarowa jest kontrolowana przez jeden gen, Ne1 w genomie A lub Ne2 w genomie D, mapowany na chromosomy 12 i 26, odpowiednio^12,13. Ta cecha objawia się tylko w stanie podwójnie recesywnym, co oznacza, że tylko homozygotyczny stan recesywny wykazuje cechę bezktarkową.

Oprócz tych genów, warunki środowiskowe i etapy wzrostu odgrywają rolę w kontrolowaniu stopnia ekspresji. Dlatego musi istnieć dokładna metoda oceny tej cechy. Obecne badanie koncentruje się na fenotypowaniu nektariów liści i orębiowych w bawełnie. Rośliny z widocznymi nektarowymi nektarami oceniane są jako nektarizowane, natomiast rośliny pozbawione tej cechy oceniane jako bezktarowe 1,2,3,4. Głównym celem tego artykułu jest przedstawienie dokładnych metod oceniania cechy nektarowej z wykorzystaniem technologii mikroskopii cyfrowej. Tradycyjne punktowanie przez bezpośrednią obserwację wzrokową nie pozwala łatwo wykryć różnic w wyrazie cechy nektarowej in situ gołym okiem. Te subtelne różnice w ekspresji cech nektarowych można zobrazować za pomocą mikroskopii cyfrowej. Dla zobrazowania, w nektarze liści bawełny rubryka punktacji opiera się na standardowej skali 1-4, w której 1 oznacza brak nektaru, 2 oznacza wypukłość na fenotypie żyły, 3 niedorozwinięte opuszki lub grzbiety bez nektaru, a 4 to w pełni uformowane/kompletne nektary z przezroczystymi poduszkami i grzbietami¹³. To ocenę fenotypu uzyskano za pomocą cyfrowych obrazów nektarium liści [z cyfrowych obrazów abaksialnej (dolnej) strony śródżebra liścia]. Ogólnie rzecz biorąc, brak nektariów ocenia się jako 0, ale dla istotności statystycznej nie można użyć wartości 0 i zastąpić ją wartością 1. W związku z tym zakres ocen fenotypowania został zmodyfikowany do 1-4 z ustandaryzowanej klasyfikacji 0-4¹³. Ruryka punktacji dla kwiatów przebiega według podobnego wzorca oceny: 1-4, w którym 1 oznacza bezktarową, brak wyraźnych gruczołów bez opuszków czy grzbietów, 2 dla gruczołów zamaskowanych, w których nektary mają jedynie subtelne oznaczenia poduszek i brak nektaru, 3 dla źle uformowanych gruczołów z delikatnymi lub nieobecnymi grzbetami i/lub poduszkami, oraz 4 dla w pełni uformowanych nektarów z nektarem. Ten wzorzec oceniania pokazuje 4 dla fenotypów nektarowych (homozygotyczny/heterozygotyczny dominujący dla jednego z genów), 3, 2 dla różnicowej ekspresji cechy nektarowej jak u heterozygotyczności oraz 1 dla bezktarowych (homozygotyczny recesywny dla obu genów).

Podobnie kwiaty są zbierane i rozkładane na sekcje zgodnie z opisem krok po kroku w tym artykule, aby zebrać cyfrowe obrazy do oceny nektarów na ramionach. Ten fenotyp można wizualizować za pomocą mikroskopu, aby uzyskać dokładne wynikowanie i przechowywać go w formie obrazów cyfrowych. W bawełnie cechy nektarowe przyciągają nie tylko zapylacze, ale także szkodniki, które powodują utratę plonów¹⁴. Aby rozwiązać ten problem, hodowcy wybrali rośliny bez cech nektarowych (bezktarowych) jako alternatywę do naturalnej kontroli szkodników bez użycia chemicznych pestycydów ^9,15. Cecha bezbezktarna pierwotnie została introgresyjowana z Gossypium tomentosum na Gossypium hirsutum (uprawianą bawełnę górską^). Ta metoda punktacji jest szczególnie przydatna do identyfikacji segregacji cech bezktarowych w populacjach powstających przez krzyżowanie rodziców nektarycznych z rodzicami bezktarowymi. W wyniku tych krzyżowań różnorodnych rodziców, F₂ (Drugie Pokolenie Synowskie) wykazuje różne genotypy homozygotycznych nektarowych, heterozygotycznych nektarzycznych i homozygotycznych bez nektaryzacji. Do ekspresji cech nektarowych potrzebny jest tylko jeden gen dominujący, który odpowiada stosunkowi segregacji 15:1 (9:3:3:1). W związku z tym 1 na 16 osób wyraża cechę bezktarną w homozygocie recesywnej z genotypem ne1ne1ne2ne2. Jednak badacze z programów hodowlanych zaobserwowali więcej linii bezktarowych niż oczekiwany stosunek 1 na 16. Oznacza to, że cecha nektarowa jest wyrażana, gdy geny wyrażają się jako Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne11Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2 oraz ne1ne1ne2Ne2. Różnorodny wzorzec ekspresji cech nektarowych w takich populacjach homozygotycznych nektarowych (Ne1Ne1Ne2Ne2Ne2), heterozygotycznych nektarowych (Ne1ne1Ne2ne2) oraz homozygotycznych bezuktarnych (ne1ne1ne2ne2) roślin można perfekcyjnie ocenić, wykrywając zmiany widoczne na obrazach cyfrowych^12,13. Ponieważ rośliny heterozygotyczne z obniżonym nektarium mogą nie wykazywać cechy nektarowej wizualnie i mogą przypominać cechę bezktarową bez nektaru, fenotypowanie wzrokowe stanowi wyzwanie przy wiarygodnym wyborze tej cechy. Problemy te nasilają się pod koniec sezonu wegetacyjnego, gdy nektarie nie występują w niektórych odmianach bawełny. Różnice między roślinami heterozygotycznymi a homozygotycznymi bezbezktarowymi można łatwo wykryć za pomocą obrazowania cyfrowego, ponieważ rośliny heterozygotyczne mogą wykazywać małe lub zredukowane nektaria, podczas gdy rośliny homozygotyczne całkowicie nie mają tej cechy. Fenotypowo obecność nektarza klasyfikuje się jako nektarowy (homozygotyczny/heterozygotyczny z co najmniej jednym dominującym genem), obecność małych lub szczątkowych nektarów jako heterozygotycznych oraz brak nektarów u homozygotycznych roślin bezktarowych. Cyfrowe ocenianie obrazów zmniejszało niedokładne ocenianie roślin heterozygotycznych jako roślin bezktarowych. Podobnie, preferowany jest etap średniego kwitnienia, gdy występuje maksymalna ekspresja cech. Dlatego na tym etapie pobrano próbki liści i kwiatów, aby przeprowadzić eksperymenty z oceną fenotypów w celu dokładnego i wiarygodnego oceniania cech nektarowych. Ponadto wizualizacja cech nektarowych za pomocą mikroskopii cyfrowej zapobiega/zmniejsza liczbę fałszywie pozytywnych wyników populacji bez cech nektarowych. To fenotypowe ocenianie cechy nektarowej jest również wykorzystywane w badaniach mapowych do identyfikacji markerów DNA związanych z cechą bezktarową, które hodowcy mogą wykorzystać do selekcji wspomaganej markerami (MAS) cechy bezktarowej¹³. Technika oceniania może być rozszerzona na inne gatunki roślin, oprócz badania cech, takich jak gruczoły, włosy i kolor. Ogólnie rzecz biorąc, cyfrowe ocenianie obrazów nie tylko rozwiązuje problem niedokładnego oceniania cech nektarowych poprzez dostarczanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ale także wykrywa subtelne zmiany ekspresji i przechowuje cyfrowe obrazy do przyszłego użytku. Bawełna z cechą bezktarową może być wykorzystywana do biokontroli szkodników, a także do odpowiadania na pytania badawcze dotyczące tego, jak ta cecha sprzyja korzystnym interakcjom owadów.

Protocol

1. Pobieranie próbek liści w szklarni/na polu (Rysunek 1)

1. Przygotuj próbne woreczki strunowe z identyfikatorami próbek. Przechowuj torebki z próbkami w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
2. Włóż chłodziarkę do lodówki dzień przed pobraniem próbki. Połóż okład z lodu z zamrażarki na dno chłodziarki. Połóż plastikową tackę na okładzie z lodem w chłodziarce.
   UWAGA: Do tego celu można użyć dowolnej przenośnej chłodnicy. Włóż okład z lodu do chłodziarki, a następnie plastikową tackę (to rozdzielenie zapobiega uszkodzeniom spowodowanym zamarznięciem, które powstaje w bezpośrednim kontakcie próbki z lodem), a następnie przetransportuj chłodziarkę do miejsca pobrania próbki.
3. Przenieś chłodziarkę i oznaczone woreczki strunowe do szklarni lub na pole, gdzie pobierać próbki. Regularnie planowano opryski, aby rośliny polowe zebrały próbki wolne od szkodników. Podobnie dla roślin szklarniowych regularnie stosowano opryski i harmonogramy nawozów dla zdrowych roślin.
4. Zbieraj młodą tkankę liściową z pojedynczych roślin szklarni lub bawełny uprawianej w polu w oznaczonych workach na próbki.
   1. Wybierz etap śródkwitnienia do wyboru próbki ze względu na najwyższą ekspresję cechy nektarowej na tym etapie. Wybieraj młode liście ze wszystkich roślin na tym etapie rozwoju. Oprócz wpływu genetycznego i środowiskowego, cecha nektarowa jest również zależna od etapu rozwoju.
   2. Aby utrzymać stały etap rozwojowy do porównania dla różnych genotypów w populacji_F2 , należy jednolicie pobierać próbki liści na jednym etapie, aby ograniczyć porównania do tego etapu. Używaj wielkości liścia 5 do 7 cm jako miary, ale ze wszystkich próbek można zebrać takie same młode liście. Stare liście wykazują wyraz cech nektarowych, ale w niektórych liniach cecha nektarowa nie będzie widoczna na późniejszych etapach rozwoju. Aby uniknąć tych różnic i poprawić spójność zbierania danych, stosuj się do tych wskazówek podczas pobierania próbek.
5. Pobierz tkankę z liści próbki i umieść ją w odpowiednim woreczku na próbkę. Zbieraj co najmniej 2 liście na każdą próbkę rośliny.
6. Dla tkanki liściowej wybierz zdrowe liście o długości 5 do 7 cm na liściu od górnej gałęzi rośliny.
   UWAGA: Młode liście obecne na górnych gałęziach są preferowane dla wszystkich próbek. Tego typu zbieranie próbek nie tylko ogranicza próbkowanie do określonego etapu rozwojowego, ale także zmniejsza błędy w fenotypowaniu poprzez utrzymanie stałego typu próbki. Inne parametry to łatwy dostęp i zdrowe liście. Spójne porównanie danych zostanie przeprowadzone, gdy z tego samego etapu rozwojowego zostanie zebranych kilka liści roślin, aby zidentyfikować różnice fenotypowe oparte na genotypie w populacji.
7. Każdą szczelnie zamkniętą torbę próbki z chusteczką z liści umieść w chłodziarce. Przetransportuj chłodziarkę do laboratorium.
8. Przenieś pojedyncze próbki do lodówki, aby utrzymać warunki chłodzenia na poziomie 4 °C. Przechowuj próbki w lodówce do czasu cyfrowego obrazowania nektarza. Liście można przechowywać do 2 dni na potrzeby obrazowania cyfrowego, ale najlepiej robić zdjęcia tego samego dnia lub następnego.
9. Aby przesiewać dużą liczbę próbek liści, należy zbierać próbki partiami, aby zakończyć obrazowanie w przedziale 1 dnia po zbiorze. Pobieraj próbki w partiach po 10-20 lub używaj kilku chłodziark, aby zapobiec uszkodzeniom tkanek lub ich fałdaniu. Należy zwracać uwagę na zbieranie próbek, aby uzyskać dobre zdjęcia cyfrowe.

2. Pobieranie próbek kwiatów w szklarni/na polu (Rysunek 1)

1. Postępuj zgodnie z krokami 1.1 do 1.6. Zbieraj kwiaty z 8-12-tygodniowej szklarni lub rośliny bawełny uprawianej na polu. Zbierz co najmniej 2 kwiaty na każdą próbkę rośliny.
   1. Kwiaty zbieraj zwykle z górnych gałęzi, gdy rośliny są w fazie średniego kwitnienia. Cecha nektarowa wykazuje najwyższy wyraz w połowie kwitnienia.
2. Zbieraj zdrowe kwiaty. Każdą szczelnie zamkniętą torbę z próbkami z co najmniej dwoma kwiatami umieść w lodówce. Przetransportuj chłodziarkę do laboratorium.
3. Przenieś pojedyncze próbki do lodówki, aby utrzymać warunki chłodzenia na poziomie 4 °C. Przechowuj próbki w lodówce do czasu cyfrowego obrazowania nektarium ortusowego.
   1. Przetwarzaj próbki tego samego dnia lub następnego dnia po pobraniu. Zbieraj próbki kwiatów, przechowuj je w temperaturze 4 °C i przetwarzaj nektarze nazubione tego samego dnia. Zbieraj kwiaty, które są wyprodukowane później następnego dnia lub później w tygodniu, i tego samego dnia przetwarzaj cyfrowe obrazowanie nektariów orteuszowych.

3. Początkowe przygotowanie mikroskopu cyfrowego (Rysunek uzupełniający 1)

UWAGA: Inne podobne mikroskopy mogą być używane do cyfrowego rejestrowania i przechowywania obrazów.

1. Włącz mikroskop (VHX 600) i wykonaj wstępne kroki. Umieść półzłożoną białą folię A4, która odpowiada rozmiarowi stołu mikroskopowego.
2. Reguluj światło na platformie/scenie mikroskopu za pomocą małych pokręteł światła dostępnych na kontrolerze konsoli.
3. Przekręć przełącznik światła (małe pokrętło na konsoli) na maksimum, aby uzyskać maksymalną jasność i przełącznik jasności (duże pokrętło na konsoli), na średnią wysokość, przekręcając pokrętło na konsoli 3/4 drogi.
4. Wbudowane oprogramowanie VHX 600 pokazuje opcje regulacji obiektywu na ekranie komputera. Ustawisz obiektyw na powiększenie 10x, wybierając na ekranie opcję 10x. Włącz przełącznik zasilania monitora na przednim ekranie komputera, a pojawi się menu główne, które pokazuje opcje obiektywu i nagrywania obrazu.
5. Weź niewielką liczbę próbek (3 do 5) z lodówki do chłodnicy do cyfrowego obrazowania. Postaw chłodziarkę z próbkami obok mikroskopu.
6. Trzymaj deskę do krojenia i sterylne ostrze na stole blisko mikroskopu. Wybierz jedną próbkę z chłodziarki i wyjmij tkankę, aby przejść do obrazowania cyfrowego (Rysunek 1).

4. Cyfrowe obrazowanie i punktowanie nektaru liścia (Rysunek 2)

1. Postępuj zgodnie z krokami 1 i 3. Otwórz woreczek strunowy i połóż próbkę liścia na desce do krojenia. Przetnij ogonek liścia sterylnym ostrzem.
   UWAGA: Dla bezpiecznego używania ostrzy zakładaj rękawiczki i trzymaj ostre krawędzie ostrza skierowane z dala od palców, a tkanka jest umieszczona między palcami podczas wykonywania nacięć.
2. Przenieś tkankę liściową na wcześniej przyciętą białą przestrętkę umieszczoną na scenie. Przewróć tkankę liścia na środku etapu mikroskopu tak, że strona brzuszna jest skierowana do góry.
3. Skup się na śródżłobie liścia, delikatnie obracając grube i precyzyjne regulacje pokręteł mikroskopu. Konstatuj regulację, aż obraz nie będzie rozmycia.
4. Ponieważ nektarz znajduje się na dolnym końcu żyłki środkowej, należy utrzymać go w centrum tam, gdzie zaobserwowano żyłkę środkową i rozchodzące się późniejsze żyłki. Trzymaj liść wyśrodkowany i skupiany na scenie.
   UWAGA: W bawełnie domowej obserwuje się tylko jeden nektarz liściowy, natomiast dzikie typy wykazują trzy nektaria: jeden na żyłce środkowej i po jednej na każdej bocznej żyłce po obu stronach żyłki środkowej (łączna liczba nektarium :3).
5. Reguluj grube i precyzyjne regulacje mikroskopu, aby poprawić klarowność obrazu cyfrowego. Dokonaj wszystkich zmian obrazu, aby uchwycić i zapisać obraz nektaru liścia.
   1. Aby uniknąć odbicia światła na obrazie cyfrowym, wyłącz wszystkie światła i zapisz obraz na ekranie komputera. Wyłącz wszystkie światła w pokoju i użyj lampki stołowej do przetwarzania każdej próbki. Po wykonaniu wszystkich kroków wyłącz lampę, pozostawij włączone tylko światło mikroskopu i zapisz obraz.
6. Zapisz obraz, gdy program wyświetli okno z kilkoma opcjami zapisu. Zapisz obraz (oznaczając każdy obraz) numerem ID próbki. Oceniaj cyfrowy obraz nektarza liścia jako 1, 2, 3 i 4 w zależności od fenotypu nektarza. Zaktualizuj arkusz punktacji dla każdego ID próbki.

5. Obrazowanie cyfrowe i punktowanie nektarza naramowego (Rysunek 3)

1. Postępuj zgodnie z krokami 2 i 3. Przenieś niewielką liczbę próbek kwiatów (2-3) do obrazowania. Wyjmij próbkę kwiatów z woreczka strunowego.
2. Usuń przysadki z kwiatu za pomocą kleszczy lub ręcznie ręcznie. Połóż kwiat na czystej desce do krojenia. Użyj sterylnego ostrza, aby przeciąć łodygę kwiatu. Użyj sterylnego ostrza, aby zrobić proste nacięcie wzdłuż krawędzi usuniętych podsadek.
3. Połóż tkankę do góry nogami (z ogonkiem skierowanym do góry) na przygotowanej białej tafli położonej na scenie mikroskopu.
4. Stosuj grube i precyzyjne regulacje, aby poprawić klarowność obrazu wyświetlanego na ekranie. Dokonaj wszystkich zmian obrazu i kliknij przycisk nagrywania na kontrolerze konsoli, aby uchwycić obraz liścia.
   1. Zmiany obrazu wykonuj, ustawiając małe pokrętło/przełącznik światła na maksimum, a duże pokrętło/przełącznik jasności na średnią wysoką (przekręcając pokrętło na 3/4^kąta). Następnie popraw rozdzielczość obrazu, obracając grube i precyzyjne regulacje mikroskopu. Utrzymuj te regulacje na stałym poziomie i zmieniaj próbki, aż do momentu nagrania obrazów dla całego zestawu próbek. Aby uniknąć odbicia światła na obrazie cyfrowym, wyłącz wszystkie światła i zapisz obraz na komputerze.
5. Następnie program wyświetla okno pokazujące wszystkie lokalizacje komputera, aby zapisać obraz. Zapisz cyfrowy obraz w komputerze z numerem ID próbki.
6. Oceniaj nektarze naramnicze (Rysunek Uzupełniający 2) 1, 2, 3 i 4 na podstawie fenotypu obserwowanego na uzyskanych obrazach cyfrowych. Zaktualizuj arkusz punktacji o identyfikator próbki i odpowiedni wynik do przyszłej analizy

Results

Do tego badania wybrano rośliny bawełny uprawiane na polu przez 8 do 12 tygodni. Zebrano co najmniej dwie techniczne repliki dla każdej rośliny na każdy typ tkanki. Zdrowe próbki młodych liści są zbierane z górnych gałęzi z listami o długości 5 do 7 cm. Zdrowe próbki kwiatów pobierane są z otwartych kwiatów lub pąków, które otwierają się tego samego dnia. Próbki liści i kwiatów zostały pobrane z terenu z różnych linii roślinnych, a w laboratorium za pomocą mikroskopu wygenerowano cyfrowe obrazy dla obu typów tkanek (Rysunek 1). Wszystkie kroki zostały wykonane zgodnie z opisaniem powyżej w procedurze od pobrania próbki do obrazowania (jak wyjaśniono na Rysunku 2 i Rysunku 3). Reprezentatywne wyniki zarówno dla nektarów liściowych, jak i nazubionych zazwyczaj wskazują na brak nektarza (1), obecność nektarza z fenotypami pośrednimi (2, 3) oraz w pełni rozwinięte nektarze produkujące nektar (4). Dane wygenerowane na Rysunku 4 to cyfrowe obrazy uzyskane z dwóch różnych roślin bawełny (nektarowej i bezktarowej). Wyniki cyfrowego punktowania obrazu powierzchni oddolnej liścia (po dolnej stronie śródżądła) wykazały dwa fenotypy z ocenami 1 (bez nektarium na śródżle) i 4 (z w pełni rozwiniętym nektarzem z nektarem; Rysunek 4A,B). Podobnie, podczas analizy próbek kwiatowych pod kątem nektarów ortealnych wykazano dwa fenotypy: 1 (bez nektaru) i 4 (w pełni uformowany nektar produkujący nektar; Rysunek 4C,D). Idealnie zarówno liście, jak i kwiaty zebrane z tej samej rośliny powinny podążać za tym samym wzorem, co oznacza, że liść bez nektary i kwiat bez nektary powinny należeć do jednej rośliny, natomiast liść nektarowy i kwiat nektarowy powinny należeć do tej samej rośliny. Rysunek 5 powstał poprzez zebranie cyfrowych obrazów zarówno liści, jak i nazubionych nektarów roślin nektarowych w formie 10x, 20x i 40x, aby wyraźnie zobrazować cechy nektarowe. Ponadto, aby zrozumieć, jak to wynik jest podawany przy segregacji populacji F₂ z nektarem i bezktarowym rodzicami bawełny, pobrano tkanki liściowe z jednej z tych populacji oraz wykonano cyfrowe obrazy dla każdej próbki nektaru liściowego. Wybrane cyfrowe obrazy liści odpowiadające standardowemu formatowi punktacji 1, 2, 3 i 4 są zaznaczone na Rysunku 6¹³. Powszechnym i łatwym do rozpoznania wzorcem jest brak nektaru i obecność nektaru. Brak nektarza otrzymuje najniższą ocenę, natomiast w pełni rozwinięty nektarz najwyższą ocenę 4. Zakres wyników między 1 a 4, czyli 2, 3, jest niedorozwinięty i mniejszy niż w przypadku zwykłych nektarów. Ten wzór można zaobserwować u homozygoty bezktarnej, która jest 1 (nieobecna), heterozygotyczna, jak w 2 i 3 punktach (zredukowane nektary), oraz 4 (w pełni rozwiniętych) nektarów. Dodatkowo można hodować linie rodzicielskie z nektarem i bez nektary wraz z populacjami, aby porównać i zrozumieć te różnice.

Rysunek 1: Przegląd wizualizacji nektariów liści i nazubionych od pobierania próbek do mikroskopii cyfrowej. (A) Wybierz rośliny bawełny w stadium średnim kwitnienia do zbierania próbek liści i kwiatów. (B) Zbieranie próbek liści z terenu w celu obserwacji cech nektarowych na liściu. (C) Odwróć liść tak, aby strona odbłokowa liścia była skierowana do góry i obserwuj cechę nektarową w podświetlonym obszarze czarnej skrzynki. (D) Umieść liść na stole mikroskopu i utrzymuj ostrość w podświetlonym obszarze czarnej skrzynki do rejestrowania cyfrowych obrazów nektarza liścia. (E) Zbieranie kwiatów na etapie połowy kwitnienia z pola (A). (F) Wykonaj nacięcie, umieszczając kwiat na desce do krojenia i nacinając w linii prostej w białym obszarze pudełka w kierunku strzałki, oddzielając podstawę kwiatu. (G) Umieścić naciętą część na scenie mikroskopu do cyfrowego obrazowania nektarów ortealnych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Stopniowa procedura cyfrowego obrazowania i oceniania nektariów liści w bawełnie. 1. Zbieranie liści z pola w oznaczonych workach na próbki i umieszczenie ich w chłodziarce 2. Przetransportuj chłodziarkę z próbkami do laboratorium 3. Wyjmij pojedyncze próbki z coolera 4. Otwórz pojedynczy woreczek i wyjmij liść 5. Ogonek liścia odetnij ręcznie lub użyj ostrza. 6. Umieść liść na predefiniowanym stopniu mikroskopu z dolną stroną skierowaną do góry 7. Ustawij zoom na 10x w programie VHX 600 na ekranie komputera. Dostosuj grube i precyzyjne regulacje mikroskopu, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość obrazu. 8. Spójrz na ekran komputera pod kątem wszelkich korekt obrazu obserwowanego na ekranie (reguluj światło i jasność kontrolowaną małymi i dużymi pokrętłami przez ich obrót, używaj precyzyjnych i grubych przycisków mikroskopu dla najlepszej rozdzielczości obrazu oraz wyłącz inne światła, aby usunąć odbicia itp.) w nektarze liścia 9. Zachowaj cyfrowy obraz do oceny punktowej. Kreska okrąg wokół nektarza w liściu podkreśla obszar nektarza liściowego na zdjęciach 8 i 9. Obserwuj nektarze liści pod mikroskopem z powiększeniem 10x (100 μm). W bawełnie domowej obserwuje się tylko jeden nektarz liścia (jak widać na tym obrazie). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Stopniowa procedura obrazowania cyfrowego i punktowania nektarium ortealnego w bawełnie. 1. Zbieranie próbek kwiatów z pola w oznaczonych torebkach i przechowywanie ich w chłodziarce 2. Wyjmij jedną próbkę z chłodziarki 3. Wyjmij jeden kwiat 4. Usuń ręcznie przysadki, odcinając je z dala od kwiatu 5. Wykonaj nacięcie sterylnym ostrzem, tnąc wzdłuż krawędzi orkieszy prostą (białe pole pokazano na Rysunku 1 przed przejściem do cyfrowego obrazowania nektarów ortealnych) 6. Odwróć naciętą sekcję 7. Umieść naciętą część z ogonkiem skierowanym do góry na scenie mikroskopu, etap 8. Reguluj światło, używając przełączników światła i jasności na konsoli podłączonej do mikroskopu. Używaj grubych i drobnych korekt na mikroskopie, aby zbierać obrazy z dobrą rozdzielczością. Wszystkie obrazy są obserwowane pod mikroskopem z powiększeniem 10x (100 μm). Zbieraj cyfrowe obrazy do nacinania nektariów naramowych. Okręgi na cyfrowych obrazach nektaru naramowego podkreślają obecność nektaru, a w bawełnie domowej znajdują się 3 nektarze orkielarne. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Cyfrowe obrazy nektaru bawełnianego i nektaru braktealnego. (A) Liść z nektarzem; (B) Liść bez nektarza; (C) Kwiat z 3 nektariami na ramionach oraz (D) Kwiat bez nektarów na orteosie. Obserwuj zarówno nektarie liści, jak i kwiatów pod mikroskopem z powiększeniem 10x (100 μm). Kreskowe okręgi wskazują obecność i brak nektarza w nektarze liściowym i braktealnym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Nektarze liści i nazubników zostały powiększone o 10, 20 i 40 razy, aby wyraźnie zidentyfikować nektarium na obrazach cyfrowych. (A) Pobierz próbki liści, aby obserwować cechę nektaru na żyłku środkowym. (B) Obserwuj nektarz liścia na żyłku środkowym pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. (C) Obserwuj nektarz liścia na żyłku środkowym pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu. (D) Obserwuj nektarz liścia na śródżegu pod mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu. (E) Nacinaj przekrój kwiatowy dla niektarów nazubionych. (F) Obserwuj nektarie aparatu pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. (G) Obserwować nektarie aparatu pod mikroskopem z 20-krotnym powiększeniem. (H) Obserwuj nektarze narządu pod mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu. Paski skali na każdym obrazie oznaczają powiększenie, przy jakim wykonano obrazy nektaru liścia lub niektaru na oręściu (jak pokazano tutaj jako 10x, 20x i 40x). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Standardowy wzór punktacji nektarza liścia według wzorców 1, 2, 3 i 4. (A) Próbka liścia bez nektarza, jak zaznaczone na przerywanych kółkach (Ocena 1 za brak nektarza). (B) Obserwowany nektarz na liściu wykazuje wzór jednego z heterozygotycznych stanów (obrazek nektaru w przerywanym kółku oceniany jako 2). (C) Nektarz liścia z wynikiem 3, kolejny wzór heterozygoty. (D) W pełni uformowane nektarze z wynikiem 4. Skala 10x oznacza powiększenie, przy jakim wykonano zdjęcia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 7: Nektarz liściowy i niektarze orlatowe bez użycia mikroskopu. Figura przedstawia, jak nektarze wyglądają przy tradycyjnym nacinaniu. Ta figura została zaadaptowana z¹³. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 8: Możliwe genotypy populacji Rysunek przedstawia genotypy populacji_F2 powstałe w wyniku krzyżowania różnych rodziców, nektarowych i bezktarowych. Ta tabela została zaadaptowana z¹³. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Ilustracja uzupełniająca 1: Konfiguracja mikroskopu cyfrowego. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Obserwowana różna liczba nektariów na ortearach. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Nektarze to wyspecjalizowane gruczołowe trichome, które produkują nektar w roślinach umożliwiając skuteczne krzyżowanie zapylenia. W roślinach występują zarówno nektarze wegetatywne, jak i rozrodcze. Rodzaj Gossypium (bawełna) obejmuje ponad 50 gatunków, z których większość zawiera¹⁶ nektariów liściowych. Jednak ta cecha bawełny przyciąga także szkodniki, co prowadzi do dodatkowych strat plonów¹⁷. Hodowcy wybrali naturalnie istniejące cechy bezktarkowe (brak nektarów), które po raz pierwszy odkryto u G. tomentosum , aby rozwiązać ten problem. Z tego powodu wprowadzili tę cechę bezktarową do uprawianej bawełny górskiej¹⁷. Ostatecznie powstało kilka populacji wybierając linie nektarowe i bezktarowe jako rodziców. Ponieważ homozygotyczne populacje bezktarowe i heterozygotyczne bez nektaryzy nie wykazują różnic gołym okiem, potrzebne jest specjalne narzędzie do rozróżnienia tych roślin. Dlatego ta metoda oceniania za pomocą mikroskopii cyfrowej, w przeciwieństwie do tradycyjnego punktowania (jak pokazano na Rysunku 7), nie tylko wizualizuje zredukowane nektariarze, ale także zapobiega niedokładnemu ocenianiu heterozygotycznych roślin beznektarnych jako homozygotycznych roślin bezktarowych.

Ocena fenotypowa za pomocą obrazów cyfrowych zależy od kilku kluczowych czynników, takich jak konkretny moment czasu pobrania próbki, wybór próbki, zastosowanie standardowej skali punktacji dla nektarów liści i nazubników, możliwy genotyp oraz sposób interpretacji danych punktacyjnych dla dalszych zastosowań. Po pierwsze, ważne jest, aby zbierać liście i kwiaty w sezonie wegetacyjnym, gdy wydzielina nektaru jest najwyższa, zazwyczaj w połowie kwitnienia w lipcu. Po drugie, wybór liści lub kwiatów o odpowiednim rozmiarze i stadium odgrywa kluczową rolę w ocenie fenotypów. Do liści preferowano górne gałęzie z listami o długości 5 do 7 cm do nacięcia nektariów liściowych. Podobnie do punktowania nektariów na ortuszach wybrano zdrowe kwiaty z górnych gałęzi. Selekcja próbki na określonych etapach rozwojowych pomoże, nawet przy porównywaniu wszystkich roślin w populacji poprzez wykluczenie cech zależnych od etapów rozwoju (jak pokazano na Rysunku 8). Aby sprawdzić, czy ocena jest powtarzalna, wygenerowano obrazy cyfrowe dla co najmniej dwóch próbek na każdą tkankę na roślinę. Zbieranie wielu replik tej samej rośliny pomaga w regularnym zbieraniu danych.

Możliwym ograniczeniem metody jest utrzymanie roślin wolnych od szkodników do czasu pobrania próbki. Obszary infestacji szkodników można rozpoznać po plamach tkanek lub jaj złożonych w tkankach albo po uszkodzeniach obszarów nektarowych z czarnymi obszarami bez widocznego wyglądu na nektarz spowodowany ich spożyciem przez mszyce lub inne owady. Obserwowano to podczas przesiewania setek próbek. W takich przypadkach ponownie zbierano zdrowe liście i kwiaty, które analizowano pod kątem spójnych danych z tych próbek. Można to rozwiązać, utrzymując regularne harmonogramy zwalczania szkodników i uzupełniając nawozy, aby osiągnąć zdrowe rośliny. Przestrzeganie wszystkich kluczowych kroków pomoże w rozwiązywaniu problemów z oceną fenotypową.

Technika ta ma kilka zastosowań, takich jak mapowanie w celu identyfikacji markerów DNA, które pomagają hodowcom identyfikować genotypy do selekcji wspomaganej markerami. To ocenowanie fenotypu wymaga potwierdzenia markerami DNA ze względu na wpływ środowiskowy i rozwojowy, a także geny kontrolujące tę cechę. Dlatego fenotypowanie tej cechy za pomocą mikroskopii cyfrowej będzie punktem wyjścia do zawężenia dużej liczby roślin z kilku populacji do niewielkiej liczby podejrzewanych linii bezktarowych. Za pomocą markerów DNA linie te są dodatkowo weryfikowane do zastosowań w programach hodowlanych, aby rozwijać odporność na choroby pośredniczone cechami bezktarkownymi u nowo rozwiniętych odmian. Ta metoda może również pomóc naukowcom zrozumieć rolę cechy nektarowej w roślinach oraz pożytecznych interakcjach owadów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop cyfrowy	Keyence VHX	VHX 600	Można stosować inne mikroskopy
Deska do krojenia farberware	Farberware	Model nr 78892-10	14''L x 11''W X 0.5''Th, można używać dowolnej marki, ta dostępna jest w amazon.com
Mały chłodnik Igloos Laguna 9 QT	Igloo	Numer części 00043567	Można użyć dowolnej marki/dowolnego rozmiaru w zależności od potrzeb projektu
Plastikowe torby (400 części), 3 x 4 cale	Marka Aubeco	NA	4''L X 3''W X 0.01'H, można używać dowolnej marki, preferowane przezroczyste plastikowe kolory
Singiel  Edge Razor Blades, 100 opakowanie	Weupe	NA	Można używać dowolnej marki, ta jest dostępna w amazon.com