Artykuł metodologiczny

Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

DOI:

10.3791/69844

⸱

3 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy poprzez sekwencyjne trawienie kolagenazą A i trypsyną. Metoda ta daje żywotne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co sprawia, że są kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek czy cytometrprzepływowy y.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako najbardziej zewnętrzna warstwa gałki ocznej, rogówka odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy powierzchni oka i widzenia. Najnowsze osiągnięcia w sekwencjonowaniu pojedynczokomórkowego RNA (scRNA-seq) umożliwiły wysoką rozdzielczość analizę heterogeniczności komórek rogówki, jednak przygotowanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z tkanki rogówki pozostaje wyzwaniem ze względu na ich gęstą i złożoną strukturę. W tym badaniu ustalamy solidny protokół generowania zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy. Procedura polega na rozdrobnieniu rogówek na drobne fragmenty, a następnie sekwencyjnym trawieniu enzymatycznym przy użyciu kolagenazy A i trypsyny. Jakość zawiesziny komórkowej oceniano za pomocą wielu wskaźników: do oceny żywotności i liczebności komórek zastosowano barwienie trypanowe na niebieski; barwienie immunofluorescencyjne dla pancytokeratyny i keratokanu umożliwiło identyfikację i ilościowe określenie głównych typów komórek rogówki; a integralność RNA została zweryfikowana za pomocą bioanalizatora. Protokół ten konsekwentnie zapewnia przygotowania pojedynczych komórek o wysokiej liczbie komórek, doskonałej żywotności (≥ 94,6%) oraz wysokim odsetku pojedynczych komórek (96,3%), spełniając wymagania zgodne z wymagającymi zastosowaniami w dalszej fazie, w tym scRNA-seq.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rogówka, położona w najbardziej zewnętrznej warstwie gałki ocznej, jest niezbędna do swojej bariery i funkcji refrakcyjnej, ze względu na wysoce zorganizowaną architekturę składającą się z pięciu odrębnych warstw: nabłonka, warstwy Bowmana, stromy, błony Descemeta oraz śródbłonka1. Nabłonek rogówki to niekeratynowa, warstwowa struktura płaskokształtna, która stanowi fizyczną barierę przed patogenami zewnętrznymi i wykazuje silne właściwości antybakteryjne i regeneracyjne. Zławie, złożone z precyzyjnie ułożonych włókien kolagenowych, zachowuje przezroczystość rogówki oraz jednolity współczynnik załamaniaświatła 2. Śródbłonek, będący warstwą jednokomórkową, reguluje transfer płynów między stromą a wodną korzycią, zachowując tym samym nawodnienie rogówki i dopływ składników odżywczych3. Niemniej jednak ta złożoność strukturalna i komórkowa historycznie stanowiła poważne wyzwania w badaniu funkcji biologicznych rogówki i ich mechanizmów4.

Aby badać interakcje międzykomórkowe i identyfikować markery specyficzne dla typu komórek, szeroko stosuje się techniki takie jak sortowanie cytometrii przepływowej5 oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq)6 . Główną przeszkodą techniczną wspólną dla obu podejść jest jednak przygotowanie wysokiej jakości zawiesin jednokomorowych. Parametry takie jak całkowita wydajność komórek, udział pojedynczych komórek oraz żywotność komórek są kluczowe dla wiarygodności dalszych zastosowań mających na celu charakteryzację funkcji komórek rogówki i ekspresji markerów powierzchniowych7. Pomimo jego znaczenia, nadal brakuje ustandaryzowanych i efektywnych protokołów generowania zawiesin jednokomórkowych z całych rogówek myszy.

Opracowano kilka metod pozyskiwania zawiesin jednokomórkowych z tkanki rogówki. Sekwencyjne trawienie enzymatyczne z użyciem kolagenazy A, trypsyny lub TrypLE zostało wykorzystane do izolowania pojedynczych komórek zarówno z rogówki ludzkiej, jak i mysiej8. Powtarzająca się trypsynizacja była również stosowana do dysocjacji rogówki⁷. Dodatkowo komercyjne zestawy do dysocjacji wielotkankowej, takie jak te firmy Miltenyi Biotec, zostały z powodzeniem zastosowane do generowania zawiesin pojedynczych komórek rogówki9. W naszym wcześniejszym badaniu porównawczym różnych metod trawienia rogówki wykazaliśmy, że sekwencyjne leczenie kolagenazą i trypsyną stanowi optymalne podejście. Metoda ta konsekwentnie daje wysoką liczbę komórek, doskonałą żywotność (≥94,6%), wysoki odsetek pojedynczych komórek (96,3%) oraz dobrze zachowaną integralność RNA10.

W tym protokole przedstawiamy szczegółową, krok po kroku procedurę generowania wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych z całych rogówek myszy, wykorzystując tę zoptymalizowaną strategię trawienia enzymatycznego, opartą na naszych ugruntowanych doświadczeniach i wcześniejszych ustaleniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samice myszy C57BL/6 (B6), w wieku 6-8 tygodni, zostały dostarczone przez Centrum Eksperymentalnych Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Guizhou. Zwierzęta były trzymane w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności , z czasem dostępem do jedzenia i wody. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentalnych Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Guizhou (Nr 2305185) i przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

1. Przygotowanie

  1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych: Oczyść dwie pary nożyczek okulistycznych, dwie pary kleszczy okulistycznych, jedną parę kleszczy tkankowych oraz jedną rurkę wirówki o pojemności 2 mL poprzez dwukrotne płukanie wodą destylowaną (DDW). Wysterylizuj instrumenty i rurkę za pomocą autoklawu parowego. Wszystkie produkty susz przez noc w tradycyjnym piekarniku w temperaturze 65 °C.
  2. Przygotowanie roztworu
    1. Dodatkowe hormonalne medium nabłonkowe (SHEM): Przygotuj SHEM, uzupełniając podłoże DMEM/F12 o następujące składniki: 5% (v/v) surowicę płodową bydła (FBS), 0,5% (v/v) dimetylosulfoksyd (DMSO), 10 ng/mL czynnika wzrostu naskórka myszy, transferynę 5,5 μg/mL, hydrokortyzonu 0,5 μg/mL, 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny (100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny).
      UWAGA: SHEM służy do utrzymania żywotności komórek podczas przetwarzania. Można ją zastąpić alternatywnymi podłożami, takimi jak bazalny DMEM lub fosforanowa buforowana sól fizjologiczna (PBS) zawierająca co najmniej 10% (v/v) FBS.
    2. Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)
      1. Rozpuścić 22,4 g proszku PBS w 2 L wody podwójnie destylowanej (DDW) pod mieszaniem za pomocą mieszadła magnetycznego, aby uzyskać 1× PBS.
      2. Zautoklaw roztwór PBS dzień wcześniej i pozwól mu ostygnąć.
      3. W warunkach sterylnych przelej 47,5 mL sterylnego 1× PBS do probówki wirówki 50 mL i dodaj 2,5 mL 1% (v/v) penicylin-streptomycyny.
        UWAGA: Formuła 1× PBS (2 L) zawiera 137 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4 oraz 2 mM NaH2PO4, pH 7,2.
    3. Rozwiązania kolagenazy A
      1. Roztwór zapasowy: Rozpuścić 1 g proszku kolagenazy A w 40 mL DDW. Filtr sterylizuj przez filtr 0,2 μm i przechowuj w temperaturze -20 °C.
      2. Roztwór roboczy: Rozcieńcz 1 mL roztworu kolagenazy A w 4 mL sterylnego DDW, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mg/mL.
    4. Roztwór trypsyny: Rozmraża dostępny komercyjnie roztwór 0,25% (w/v) trypsyny/EDTA (zawierający 0,91 mM EDTA) na lodzie przed użyciem.
    5. Roztwór Trypan Blue (0,4%): Rozpuszcz 0,4 g Trypan Blue w 100 mL DDW. Przefiltruj za pomocą papieru filtrującego i przechowuj w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Roztwór Trypan Blue 0,4% służy do oceny całkowitej liczby komórek, proporcji pojedynczych komórek oraz żywotności. Może być zastępowany komercyjnymi zestawami do barwienia żywych/martwych lub zautomatyzowanymi systemami liczenia komórek.

2. Przygotowanie rogówek myszy

  1. Wysterylizuj mikroskop i miejsce robocze, przecierając 75% etanolem, a następnie wystaw to miejsce na działanie światła UV wewnątrz szafki zabezpieczającej przez 30 minut.
  2. Przygotuj następujące szalczki w warunkach sterylnych: jedną szalkę Petriego o średnicy 60 mm z 5 mL medium SHEM, trzy szalki Petriego o pojemności 60 mm, każda zawierająca 5 mL 1× PBS z dodatkiem 5% penicylin-streptomycyny (P-S), trzy szalerze Petriego o średnicy 60 mm, każda z 5 mL zwykłego 1× PBS oraz jedną sterylną rurkę do wirówki 2 mL
  3. Uśpienie myszy za pomocą uduszeniaCO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  4. Dokładnie przepłucz głowicę myszy i zamknięte powieki przez trzykrotne zanurzenie w PBS zawierającym 5% P-S, zanim przejdziesz do enukleacji.
  5. Za pomocą nożyczek okulistycznych wykonaj nacięcie wzdłuż tylnego bieguna każdej gałki ocznej i ostrożnie umieść izolowane oczy w szalce Petriego zawierającej lodowato zimne medium SHEM (Rysunek 1A).
    UWAGA: Aby zmaksymalizować żywotność komórek, wszystkie roztwory powinny być wstępnie schłodzone do 4 °C, a wszystkie etapy sekcji muszą być wykonywane na lodzie.
  6. Natychmiast przenieś szalkę Petriego z gałkami ocznymi do szafki biologicznej bezpieczeństwa. Przemyj gałki oczne trzy razy w 1× PBS zawierającym 5% P-S, inkubując przez 5 minut podczas każdej płukania.
  7. Pod mikroskopem rozcinającym ostrożnie oddziel tkankę rogówki: Za pomocą nożyczek okulistycznych i kleszczy wykonaj nacięcie od bieguna tylnego w kierunku limbusu rogówki. Delikatnie odłącz rogówkę od twardówki i spojówki wzdłuż krawędzi limbala. Całkowicie usuń soczewkę i tęczówkę, używając dwóch par kleszczy (Rysunek 1B).
  8. Za pomocą kleszczy okulistycznych przenieś tkankę rogówki do szalki Petriego zawierającej 1× PBS i przepłucz trzy razy (po 5 minut każda), aby usunąć resztki tkanki nierogówki i antybiotyki.
    UWAGA: Tęczówka często mocno przylega do rogówki. Upewnij się, że jest delikatnie i całkowicie usunięta za pomocą kleszczy, aby uniknąć zanieczyszczenia, pozostawiając jedynie przezroczystą tkankę rogówki.
  9. Za pomocą kleszczy okulistycznych przenieś oczyszczoną tkankę rogówki do rurki wirówki o pojemności 2 mL i dodaj 1 ml roztworu roboczego kolagenazy A (5 mg/mL).
  10. Za pomocą nożyczek okulistycznych pokrój tkankę rogówki na fragmenty o grubości około 0,5 mm × 0,5 mm bezpośrednio wewnątrz rurki.
  11. Inkubuj probówkę zawierającą fragmenty rogówki i roztwór kolagenazy A w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (rysunek 2A-C).
  12. Podczas trawienia kolagenazy A monitoruj tkankę co 10 minut. Zakończ trawienie, gdy nie pozostaną duże fragmenty tkanek, przechodząc do wirowania. Wiruj próbkę w 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w wirówce. Ostrożnie zasysaj supernatant.
  13. Ponownie zawiesij pellet w 200 μL roztworu trypsyny/EDTA o stężeniu 0,25%.
  14. Inkubuj probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby strawić pozostałe fragmenty tkanki.

3. Izolacja pojedynczych komórek rogówki

  1. Delikatnie trituruj mieszaninę (tkankę i roztwór trypsyny/EDTA) wielokrotnie za pomocą pipety P1000 z szerokim końcówką, aby rozłożyć tkankę do zawiesiny jednokomórkowej.
  2. Wiruj zawiesinę ogniwową w stężeniu 300 x g przez 5 minut i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1 mL PBS zawierającego 0,04% albuminy surowicy bydłej (BSA), aby uzyskać zawiesinę pojedynczą.
    UWAGA: W przypadku komórek przeznaczonych do sekwencjonowania lub cytometrii przepływowej należy ponownie zawiesić w PBS bez surowicy (PBS). Dla komórek, które będą hodowane, użyj 1x PBS z dodatkiem 0,04% BSA.
  3. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez wstępnie zwilżony filtr komórek o pojemności 40 μm do nowej rurki wirówki 50 mL, aby usunąć grudki i zanieczyszczenia.
    UWAGA: Wstępnie zwilż sitko komórkowe PBS, aby zminimalizować utratę komórek. W razie potrzeby filtrowane komórki można ponownie odwirować i zawiesić w pożądanej objętości do stężenia.

4. Liczenie komórek

  1. Połącz 9 μL zawiesiny ogniwowej z 1 μL roztworu 0,4% Trypan Blue i wymieszaj delikatnie.
  2. Powoli ładuj mieszankę do komory hemocytometru przez wyznaczony kanał załadunku. Policz komórki metodą czterech kwadrantów, aby określić całkowitą liczbę komórek, żywotność oraz proporcję pojedynczych komórek. Wykonaj co najmniej dwie techniczne repliki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakość zawiesin jednokomórkowych oceniano na podstawie całkowitej wydajności komórek, proporcji pojedynczych komórek oraz żywotności komórek. Zawieszenie zostało zabarwione Trypan Blue i przeanalizowane za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej w wielu polach (Rysunek 3). Z czterech oczu myszy (osiem rogówek) uzyskano łącznie 1,05 × 105 komórek , ze średnią żywotnością komórek 94,6% i stosunkiem pojedynczych komórek przekraczającym 96,3%. Wyniki te potwierdzają, że przygotowana za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzenie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek znacząco zwiększyło wykorzystanie technologii genomicznych, transkryptomicznych, epigenetycznych i proteomicznych w badaniach okulistycznych 9,10,11,12. W konsekwencji przygotowanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek stało się coraz ważniejsze, ponieważ pozwala wykrywać różnice sygnalizacyjne między pojedynczymi komórkami i dost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność i szacunek wszystkim zwierzętom, które przyczyniły się do rozwoju swoich komórek w tym badaniu. Badanie to było częściowo wspierane przez Prowincjonalne Projekty Naukowo-Technologiczne Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043 [do S.O.]); Fundusz Naukowy Prowincji Fujian dla Wybitnych Młodych Naukowców (2023J06053 [dla S.O]); Fundacja Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82101084 [dla S.O.]; Prowincjonalny Program Badań Podstawowych Guizhou (nauki przyrodnicze) (QKHJC-ZK[2025]MS-473) [dla S.O.]; Fundusz Unii Badań Medycznych na rzecz wysokiej jakości rozwoju zdrowia prowincji Guizhou (2024GZYKYJJKM0043) [dla S.O.].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 594 przeciwkrólikowy przeciw osłomAbcamab150064
AntykeratynaAbcamab230175
AntypancytokeratynaThermo Fisher ScientificAE1/AE3, Alexa FluorTM 488
Sterylizator autoklawuAn ShenLDZH-100KBS
Albumina serum bydła VSolarbioA8020
Filtr komórkowyNEST25836940 μ m
Maszyna odśrodkowaEppendorf AG22331 Hamburg
Kolagenaza ARoche10103578001
Mikroskop konfokalny  OberkochenZeiss LSM 880
Tablica liczącaMARIENFELDM407859
Rurka odśrodkowaNEST6206112 mL, 50 mL
Slip pokrywkowyMARIENFELDM407859
DAPISolarbioC0065
Mikroskop rozcinającyCarl ZEISSVISU150
DMEM/F12  MediaGibco11320033
DMSOSolarbioD8371
Fetal  bovine  surowicaGibco16140071
HydrokortyzonSolarbioIH0100
ITSGibco23337619
Czynnik wzrostu naskórka myszyInvitrogenPMG8041
chirurgii okulistycznej  KleszczeDumot0208-5-PO
Nożyczki chirurgiczne okulistyczneFST15021-15
PiekarnikAISITEDH6000 II
Penicylina i StreptomycynaGibco15070063100mL
Szalka PetriegoNEST70520160mm
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSolarbioP1010
Inkubator termostatycznyThermo Fisher Scientific3111
Triton-X 100SolarbioT8200
Trypan Blue SolarbioT8070
Trypsyna/EDTA  GibcoR001100
Stół ultra-czyszczącyYou QiVS-840-2
4% paradehyduSolarbioP1110

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eghrari, A. O., Riazuddin, S. A., Gottsch, J. D. Overview of the cornea:structure, function, and development. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 7-23 (2015).
  2. Delmonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. J Cataract Refract Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
  3. Zhang, X., et al. Dry eye management:targeting the ocular surface microenvironment. Int J Mol Sci. 18 (7), 1398(2017).
  4. Dou, S., et al. Molecular identity of human limbal heterogeneity involved in corneal homeostasis and privilege. Ocul Surf. 21, 206-220 (2021).
  5. Adan, A., et al. Flow cytometry:basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 37 (2), 163-176 (2017).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Altshuler, A., et al. Discrete limbal epithelial stem cell populations mediate corneal homeostasis and wound healing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1248-1261.e8 (2021).
  8. Kaplan, N., et al. Single-cell RNA transcriptome helps define the limbal/corneal epithelial stem/early transit amplifying cells and how autophagy affects this population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (10), 3570-3583 (2019).
  9. Collin, J., et al. A single cell atlas of human cornea that defines its development, limbal progenitor cells and their interactions with the immune cells. Ocul Surf. 21, 279-298 (2021).
  10. Liu, X., et al. Optimization of method for achieving a single-cell suspension from mouse corneas. Exp Eye Res. 233, 109544(2023).
  11. Espana, E. M., Birk, D. E. Composition, structure and function of the corneal stroma. Exp Eye Res. 198, 108137(2020).
  12. Topouzi, H., et al. Methods for the isolation and 3D culture of dermal papilla cells from human hair follicles. Exp Dermatol. 26 (6), 491-496 (2017).
  13. Zhang, T., et al. The effect of amniotic membrane de-epithelialization method on its biological properties and ability to promote limbal epithelial cell culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 3072-3081 (2013).
  14. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods Mol Biol. 1430, 61-76 (2016).
  15. Chen, W., et al. Existence of small slow-cycling Langerhans cells in the limbal basal epithelium that express ABCG2. Exp Eye Res. 84 (4), 626-634 (2007).
  16. Song, Z., Tsai, C. H., Mei, H. Comparison of different methods to isolate mouse limbal epithelial cells. Exp Eye Res. 212, 108767(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

r g rog wki myszytrawienie enzymatycznekolagenaza Atrawienie trypsynbarwienie immunofluorescencyjneywotno kom rekintegralno RNAtypy kom rek rog wkicytometria przep ywowa

Powiązane artykuły