Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69853

⸱

20 marca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Streszczenie

Błona plazmatyczna definiuje kształt komórki i pełni rolę interfejsu sterującego komunikacją międzykomórkową. Białka błonowe stanowią główną klasę celów terapeutycznych; Dlatego superrozdzielenie błony komórkowej poprzez białka konstytutywne niesie wielkie szanse na rozwój biologii komórkowej i terapii przeciwciałami. W tym kontekście mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek (SMLM) umożliwia wizualizację organizacji białek na skali nanoskalowej na strukturach biologicznych. Pomimo swojego znaczenia, zastosowanie SMLM do białek błony plazmatycznej stawia przed sobą wyjątkowe wyzwania. W tym protokole przedstawiamy skuteczne podejście wykorzystujące znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) poklatkowe, zwane błonowym SAL (mSAL). Dostarczamy szczegółowe instrukcje krok po kroku, w tym optymalizację stężenia przeciwciał, gęstości mocy lasera, czasu trwania interwałów nieiluminacyjnych, rekonstrukcję obrazów oraz analizę klastrów opartą na gęstości, aby rozwiązywać rozkład białek błonowych nanoskalowych i morfologię błony. Używamy białka tetraspaniny CD81 jako modelowego białka błonowego, aby wykazać zdolność mSAL zarówno na komórek ssaków przylegających, jak i zawiesinowych. Oprócz superrozdzielczości błony komórkowej i rozkładu białek błonowych, nasza technika umożliwia badanie farmakodynamiki przeciwciał terapeutycznych oddziałujących z ich celami błonowymi w naturalnym środowisku błonowym.

Wprowadzenie

Błona plazmatyczna zawiera różnorodne białka regulujące mobilność komórek, adhezję, wykrywanie oraz komunikację międzykomórkową. Zrozumienie nanoskalowego rozkładu białek błony plazmatycznej jest ważne, ponieważ funkcja białek często zależy nie tylko od poziomu ekspresji, ale także od ich przestrzennej organizacji na błonie 1,2. Co istotne, wiele przeciwciał terapeutycznych celuje w białka błonowe 3,4, co czyni badania na skalę nanobiologiczną niezbędną dla zrozumienia, jak interakcje przeciwciał są wpływane przez lokalną organizację białek błonowych. Jednak precyzyjne mapowanie rozkładu białek błonowych, profilowanie ich liczebności na pojedynczych cząsteczkach oraz monitorowanie w czasie rzeczywistym ich dynamicznych interakcji z partnerami wiążącymi pozostają wyzwaniem.

Szeroko stosowane techniki mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczych cząsteczek (SMLM), takie jak bezpośrednia stochastyczna mikroskopia optyczna rekonstrukcyjna (dSTORM)5,6 oraz akumulacja punktów oparta na DNA do obrazowania w topografii nanoskalowej (DNA-PAINT)7, wykorzystują barwienie immunofluorescencyjne (IF) do oznaczania próbek. Osiągają rozdzielczość boczną ~ 10 nm i dostarczyły szerokich informacji na temat organizacji nanoskalowej celów terapeutycznych błon, w tym ludzkiego receptora czynnika wzrostu naskórnego 2 (HER2)8,9, CD2010, receptorów limfocytów T11,12,13, ligandu zaprogramowanej śmierci 114, receptorów komórek B15, 16, 17 oraz CD1917, 18. Na przykład badania dSTORM z użyciem terapeutycznego przeciwciała monoklonalnego Trastuzumab do bezpośredniego wykrywania HER2, kluczowego receptora powiązanego z rakiem piersi, wykazały wyraźne stany klasteryzacji u pacjentów z HER2 pozytywnymi8, podczas gdy różne przeciwciała terapeutyczne modulowały klasteryzację HER29. DNA-PAINT w połączeniu z mikroskopią lattice light sheet wyjaśniło stany oligomeryczne i profile interakcji CD20 w komórkach B z terapeutycznymi przeciwciałami monoklonalnymi: rytuksymabem, ofatumumab i obinutuzumab10. Chociaż konwencjonalna SMLM dostarcza cennych informacji na temat organizacji w skali nano, jej pełny potencjał jest ograniczony przez tradycyjne metody barwienia IF. Jakość obrazu SMLM zależy od barwienia IF, które z kolei zależy od specyficzności i powinowactwa przeciwciała znakującego. Tradycyjne SMLM wykorzystuje przeciwciała o wysokiej afinitecie, które zazwyczaj osiągają lepsze barwienie IF i jakość obrazu. Jednak większość terapeutycznych przeciwciał oddziałuje z receptorami błonowymi komórek żywych o umiarkowanym powinowactwie, aby zminimalizować skutki uboczne poza celem19. Na przykład bispecyficzne aktywatory komórek T (TCE) wykazują niższą afinitet do CD3, co zapobiega internalizacji TCR 20,21,22. Takich interakcji nie da się dokładnie uchwycić konwencjonalnymi technikami IF.

Wcześniej opracowaliśmy strategię bezpośrednio wykorzystującą interakcje pojedyncząsteczkowych przeciwciał z epitopem, zwaną znakowaniem pojedynczego przeciwciała (SAL). SAL umożliwia mapowanie interakcji przeciwciało-epitop w dużej gęstości, zachowując jednocześnie natywne równowagi wiązania23. Chociaż wcześniej zgłaszaliśmy protokół dlawewnątrzkomórkowych białek cytoszkieletowych i mitochondrialnych, SAL na białkach błonowych nie został jeszcze potwierdzony. W tym protokole przedstawiamy krok po kroku workflow aplikacji SAL do białek błonowych, wykazany poprzez znakowanie tetraspaniny CD81, zgłoszonej terapeutycznej kandydatki docelowej 25,26,27,28, zarówno w komórkach zawiesiny, jak i adherentnych. Wykorzystując fluorescencyjnie znakowane przeciwciała anty-CD81 do bezpośredniego badania przestrzennego rozkładu CD81 na komórkach U2OS i Jurkat T, demonstrujemy zastosowanie badań nanoskalowych białek błonowych SAL. Strategię tę nazwaliśmy błonowym SAL (mSAL). Na koniec opisujemy strategię opartą na klasteryzacji, mającą na celu zmniejszenie izolowanych wykryć pojedynczych cząsteczek poza komórką.

W istocie SAL wykorzystuje poklatkowe oznaczanie pojedynczej cząsteczki do rejestrowania indywidualnych interakcji przeciwciało-epitop, a późniejsza dekonwolucja pojedynczego emitera daje obraz superrozdzielczy oparty na SMLM. Poprzez regulację stężenia przeciwciał i wybór odpowiedniego interwału nieiluminującego (NII) pomiędzy kolejnymi klatkami obrazu, SAL dopasowuje szybkość włączania przeciwciał do szybkości wykrywania pojedynczej cząsteczki, umożliwiając lokalizację pojedynczych cząsteczek. SAL wymaga dłuższych NII ze względu na inherentnie wolną kinetykę wiązania przeciwciał, która wydłuża czas akwizycji obrazu (~3-17 h). SAL najlepiej sprawdza się w zastosowaniach wymagających precyzyjnego mapowania epitopów na skalę nanoskalową oraz oceny dynamiki interakcji pojedynczego przeciwciało z epitopem. Pomimo niższej przepustowości, SAL oferuje unikalny wgląd w organizację epitopów i zaangażowanie przeciwciał w warunkach bliskich fizjologii, co czyni go szczególnie cennym do charakteryzowania terapeutycznych przeciwciał in situ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten wykorzystuje ustalone linie komórkowe Jurkat E6.1 i U2OS i nie obejmuje podstawowych materiałów ludzkich ani żywych zwierząt.

1. Siew/lądowanie i utrwalanie komórek

UWAGA: Przygotowanie próbki stosuje standardowe protokoły barwienia immunofluorescencji (IF), zoptymalizowane w celu zachowania podkomórkowej organizacji białek błony plazmatycznej w różnych typach komórek. Jeśli istnieje ustalony protokół immunodymastyki dla interesującego obiektu, użytkownicy mogą stosować go do etapu blokowania próbek 1.2.14. Znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) opiera się na skumulowanym wykrywaniu fluorescencyjnie oznakowanych przeciwciał podczas ich wiążenia się z antygenem na poziomie pojedynczych cząsteczek. Na etapie mikroskopu do próbek dodaje się fluorescencyjne przeciwciała rozcieńczone w buforze obrazowym, a znakowanie fluorescencyjne odbywa się dynamicznie w miarę postępu akwizycji obrazu. Podczas fazy przygotowywania próbki nie wykonuje się znakowania fluorescencyjnego.

  1. Przygotuj komórki adherentne, takie jak linia komórkowa U2OS, zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem24.
  2. Zawiesiny komórkowe
    1. Utrzymywanie komórek Jurkat T w gęstości 1 x 10do 10 x 106 komórek /mL w 10 mL kompletnego podłoża RPMI (RPMI 1640 uzupełnione o 10% (v/v) surowicę płodową bydła, 100 U/mL penicyliny oraz 100 μg/mL streptomycyny) w 37 °C w nawilżonym inkubatorze z dodatkiem 5%CO2.
      UWAGA: Zalecane 10 mL kompletnego nośnika dotyczy kolb T25; użytkownicy powinni odpowiednio skalować objętość przy użyciu różnych naczyń kulturowych.
    2. Przygotuj powierzchnię szkła, dodając 200 μL roztworu 0,01% Poli-L-Lizyny (PLL) do studni przeznaczonych do zastosowania w szkle pokrywowym o komorze 8-dołkowej. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 2 godziny w 37 °C.
    3. Policz komórki z hodowli za pomocą hemocytometru, a następnie przenieś 3,5 x 104 komórek do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
      UWAGA: Liczba komórek może wymagać korekty, aby uzyskać dobry rozkład pojedynczych komórek. Zakres zasiewów 30 000–60 000 komórek Jurkat T pozwala osiągnąć idealną gęstość, gdzie pojedyncze komórki są wyraźnie oddzielone od siebie, ale nie są zbyt rozproszone. Liczba komórek może wymagać korekty dla nowego typu komórek.
    4. Wiruj w 300 x g przez 3 minuty, aby uzyskać granulkę komórkową. Usuń supernatant i ponownie zawiesij osad komórki w 200 μL wcześniej podgrzanej (37 °C) soli fosforanowej Dulbecco (DPBS). Powstały osad komórkowy będzie widoczny jako mały, biały osad na dnie rurki mikrowirówki.
      UWAGA: Utylizacja odpadów biologicznie niebezpiecznych zgodnie z wytycznymi instytucji oraz wszystkimi obowiązującymi lokalnymi, stanowymi i federalnymi przepisami.
    5. Aspiruj roztwór PLL z przygotowanego szklanego pokrywa komorowego (krok 1.2.2). Jeśli inkubacja PLL odbywa się przez noc w temperaturze 4 °C, podgrzej szkło pokrywowe z komorą 8 dołków do 37 °C przed zasyssaniem roztworu.
    6. Dodaj zawiesinę ogniwową z etapu 1.2.4. na komorę pokrytą PLL. Inkubuj w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5%CO2 przez 30 minut, aby komórki mogły się przyczepić do powierzchni. Dokładnie wymieszaj zawiesinę komórkową przed powleknięciem i pipetuj w górę i w dół, aby rozbić grudki komórek i zapewnić równomierne rozmieszczenie w dołku.
    7. Sprawdź mocowanie komórki do powierzchni szkła za pomocą mikroskopu świetlnego. Przy 10-krotnym powiększeniu skup mikroskop na dole szkła pokrywy.
      UWAGA: Delikatne stuknięcie w komorowe szkło pokrywy podczas obserwacji pod mikroskopem może pomóc ocenić, czy komórki przyczepiły się do powierzchni, czy nadal unoszą się na powierzchni.
    8. Przygotuj 200 μL buforu fiksacyjnego (4% paradehydu i 0,1% glutaraldehydu w DPBS) i podgrzej go do 37 °C w kąpieli wodnej.
      UWAGA: Dostarczony bufor fiksacyjny jest zoptymalizowany pod kątem CD81 i zazwyczaj nadaje się do zachowania białek błonowych. Dla nowych celów białek błonowych może wymagać korekty składu buforu, aby osiągnąć optymalne zachowanie. Użytkownicy są zachęcani do przeglądania literatury pod kątem warunków fiksacji dostosowanych do nowych celów.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i rakotwórczy. Glutaraldehyd jest toksyczny i żrący. Należy nosić odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE) podczas obsługi tego odczynnika. W przypadku kontaktu ze skórą natychmiast dokładnie umyj dotknięte miejsce mydłem i wodą. Uśmieć się z odczynnikiem zgodnie z wytycznymi danej instytucji oraz wszystkimi obowiązującymi lokalnymi, stanowymi i federalnymi przepisami.
    9. Aspiruj DPBS z każdego dołka próbki (od kroku 1.2.6) za pomocą mikropipety.
      UWAGA: Kluczowe jest powolne wykonywanie wszystkich etapów wymiany roztworu, aby uniknąć oderwania się komórek od szkła pokrywowego. Utylizacja odpadów biologicznie niebezpiecznych zgodnie z wytycznymi instytucji użytkownika oraz wszystkimi obowiązującymi lokalnymi, stanowymi i federalnymi przepisami.
    10. Dodaj 200 μL wcześniej podgrzanego buforu utrwalającego 37 °C do rogu studni i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i rakotwórczy. Glutaraldehyd jest toksyczny i żrący. Noszę odpowiednie środki ochrony osobistej podczas obsługi tych odczynników. W przypadku kontaktu ze skórą natychmiast dokładnie umyj dotknięte miejsce mydłem i wodą. Uśmieć się z odczynnikiem zgodnie z wytycznymi danej instytucji oraz wszystkimi obowiązującymi lokalnymi, stanowymi i federalnymi przepisami.
    11. Przemyj stałe ogniwa 3 razy 500 μL DPBS. Pomiń ten krok, jeśli kontynuujesz krok 1.2.12.
    12. Opcjonalnie: Powoli usuwaj roztwór utrwalający i dodaj 200 μL świeżo przygotowanego borowodniku 0,1% sodu w DPBS, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 7 minut. Pomiń ten krok i przejdź do kroku 1.2.14, jeśli nie stosujesz redukcji borowodniku sodu.
      UWAGA: Redukcja borohydrykiem sodu pomaga tłumić autofluorescencję wywołaną przez glutaraldehyd i neutralizuje aldehydy niereagujące. Uwolnienie gazu wodoru w wyniku reakcji borowodniczku sodu z roztworem wodnym objawia się uwalnianiem pęcherzyków. Jeśli nie zaobserwuje się uwalniania wodoru, użyj świeżo przygotowanego roztworu borowodniku sodu.
      UWAGA: Borowodnikiem sodu jest toksyczny i żrący. Noszę odpowiednie środki ochrony osobistej podczas obsługi tego odczynnika. W przypadku kontaktu ze skórą natychmiast dokładnie umyj dotknięte miejsce mydłem i wodą. Uśmieć się z odczynnikiem zgodnie z wytycznymi danej instytucji oraz wszystkimi obowiązującymi lokalnymi, stanowymi i federalnymi przepisami.
    13. Aspiruj roztwór borowodniku sodu z każdego dołku, a następnie przepłucz trzy razy 500 μL DPBS.
    14. Przygotuj 200 μL bufora blokującego i dodaj go do odwiertu. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Nie stosuj odczynników permeabilizujących (np. TritonX-100, saponina), ponieważ mogą one usuwać białka błonowe. Protokół membranowego SAL (mSAL) przedstawiony tutaj dla CD81 nie zawierał etapu blokowania.
      UWAGA: Zaleca się użycie buforu blokującego zawierającego 5% (w/v) prowincji surowicy bydłej (BSA) w DPBS dla mSAL przy nowych celach. Przy użyciu przeciwciał wtórnych stosuje się odpowiednie surowicę do blokowania. Na przykład 10% surowicy koziej w DPBS przy użyciu przeciwciała wtórnego kozio-gospodarz. Jeśli istnieje ustalona receptura bufora blokującego i protokół dla celu, użytkownicy mogą stosować ten protokół. Bufor blokujący może być opcjonalnie uzupełniony przeciwciałami kontrolującymi izotyp lub przeciwciałami pochodzącymi z surowicy w celu zmniejszenia wiązań przeciwciał poza celem23,24. Należy włączyć odczynnik permeabilizacyjny do buforu blokującego tylko wtedy, gdy przeciwciało celuje w wewnątrzkomórkowy epitop białka błonowego.
    15. Dla mSAL z pierwotnymi przeciwciałami sprzężonymi barwnikami należy przejść bezpośrednio do kroku 1.2.20.
    16. Przygotuj 150 μL pierwotnego roztworu barwienia przeciwciał (przeciwciało w pożądanym stężeniu rozcieńczone w buforze blokującym). Pomiń ten etap dla mSAL z pierwotnymi przeciwciałami sprzężonymi z barwnikami.
      UWAGA: W przypadku pierwotnego barwienia przeciwciał należy zapoznać się z kartą danych dostawcy w celu uzyskania zalecanych warunków. Jeśli nie podano informacji o stężeniu, zacznij od 4 μg/mL (27 nM) dla pełnej długości IgG23,24.
    17. Zamień bufor blokujący na pierwotny roztwór przeciwciał. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub w 4 °C przez noc w wilgotnej komorze. Pomiń ten etap dla mSAL z pierwotnymi przeciwciałami sprzężonymi z barwnikami.
    18. Przemyj próbkę 2 razy 400 μL DPBS. Dodaj 200 μL bufora blokującego do otworu.
    19. Opcjonalnie: Zamień bufor blokujący na 200 μL buforu po fiksacji (4% paradehydu) i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Postfiksacja pomaga zachować blokowanie próbki dla SAL23,24. Jednak ten krok powinien zostać pominięty, jeśli zmniejsza dostępność epitopów. Aby ocenić wpływ postfiksacji na rozpoznawanie epitopów przez przeciwciała, wykonać standardowe barwienie immunofluorescencyjne z postfiksacją i bez niej oraz porównać jakość barwienia.
    20. Opcjonalnie: Przemyj próbkę 2 razy DPBS.
    21. Dodaj 200 μL DPBS do każdego dołka i przykryj komorę przezroczystą folią, aby zapobiec parowaniu. Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca. Jeśli wykonujesz mSAL bezpośrednio po kroku 1.2.14 lub 1.2.19 bez post-fiksacji, trzymaj próbkę w buforze blokującym i przejdź bezpośrednio do kroku 2.2.
      UWAGA: Przechowywanie próbki w DPBS z dodatkiem 5 mM azydu sodu zapobiega rozwojowi bakterii podczas przechowywania.
      UWAGA: Azyd sodu jest bardzo toksyczny i może być śmiertelny w przypadku spożycia. Noszę odpowiednie środki ochrony osobistej podczas obsługi tego odczynnika. W przypadku kontaktu ze skórą natychmiast dokładnie umyj dotknięte miejsce mydłem i wodą. Uśmieć się z odczynnikiem zgodnie z wytycznymi danej instytucji oraz wszystkimi obowiązującymi lokalnymi, stanowymi i federalnymi przepisami.

2. Akwizycja obrazu

UWAGA: Procedura obrazowania zarówno dla komórek przylegających, jak i zawiesinowych jest podobna i wykonywana jest za pomocą mikroskopii całkowitej odbicia wewnętrznej (TIRF). Jednak warunki obrazowania powinny być optymalizowane dla każdego typu komórek.

  1. Pozwól, by przechowywane próbki (w temperaturze 4 °C) osiągnęły temperaturę pokojową przed obrazowaniem, aby zapobiec kondensacji na szkle. Pomiń ten krok, jeśli przechodzisz bezpośrednio do obrazowania po przygotowaniu próbki.
  2. Zasilanie systemu mikroskopowego: mikroskop, aparat sCMOS, jednostka laserowa oraz komputer z oprogramowaniem do akwizycji obrazu. Pozwól systemowi mikroskopu ustabilizować się przez 5-10 minut po włączeniu, aby komponenty systemu osiągnęły temperaturę operacyjną i zminimalizować dryf termiczny.
    UWAGA: mSAL można wykonać przy użyciu dowolnego zestawu mikroskopu TIRF oraz kompatybilnego oprogramowania. Włączaj system zgodnie z instrukcjami instrumentu.
  3. Nakładam olej immersyjny na obiektyw TIRF (np. 100x/1.49) i montuj komorowe szkło pokrywowe na stole mikroskopu.
    UWAGA: Jeśli obiektyw jest wyposażony w kołnierz korekcyjny, upewnij się, że jest ustawiony na odpowiednią grubość szkła osłonowego przy 23 °C. Szkło osłonowe użyte w tym badaniu miało grubość 0,13-0,17 mm.
  4. Jeśli jest wyposażony, włącz Perfect Focus System (PFS), następnie ostrożnie podnieś obiektyw do szkła pokrywy i przygotuj próbkę do ostrości.
  5. Przygotuj złote koloidy jako markery fiducialne (rozcieńczenie 1:2 w ultraczystej wodzie). Sonikuj złote koloidy przed rozcieńczeniem przez 3 minuty, aby rozproszyć agregaty.
  6. Delikatnie zasysaj bufor magazynowy (DPBS lub bufor blokujący) z dołka próbki i dodaj 200 μL złotego roztworu koloidowego do próbki. Inkubuj przez 1 minutę i usuń roztwór.
  7. Użyj oświetlenia jasnego pola, aby sprawdzić, czy przed aspiracją roztworu naniesiono wystarczającą ilość złotych koloidów. Idealna gęstość składa się z 5 do 10 złotych koloidów w wyznaczonym obszarze zainteresowania (ROI).
    UWAGA: Alternatywnie, fluorescencyjne mikrosfery (patrz Tabela materiałów) mogą być stosowane w rozcieńczeniu 1:1 000 w DPBS.
  8. Przemyj 1 razy 500 μL ultraczystej wody, aby usunąć nadmiar złotych koloidów, a następnie dodaj 200 μL DPBS.
  9. W oprogramowaniu obrazującym stwórz konfigurację optyczną dla fluoroforu (sondy przeciwciała), uwzględniając odpowiednią długość fali dichroiczną, wzbudzenie lasera oraz gęstość mocy, czas integracji kamery, filtr emisji oraz binning pikseli kamery (jeśli dotyczy). Zaleca się piksel 150-160 nm, aby osiągnąć optymalną rozdzielczość.
  10. Stwórz konfigurację optyczną dla etapu fotobielenia. Zaleca się moc lasera 380 W/cm2 lub wyższą oraz czas integracji kamery 1 s.
    UWAGA: Fotobielenie podczas pobierania pomaga zminimalizować nakładanie się pojedynczych zdarzeń wiązania przeciwciał fluorescencyjnej. Zebrane światło może być kierowane przez filtr emisyjny o niedopasowanej długości fali, aby uniknąć nasycenia kamery.
  11. Reguluj kąt lasera, aby ustanowić oświetlenie TIRF. Za pomocą oświetlenia jasnego pola zidentyfikuj komórkę dla mSAL. Upewnij się, że w obrębie ROI jest widocznych co najmniej 5 złotych koloidów, aby skorygować dryf etapu podczas rekonstrukcji obrazu. Potwierdź autofluorescencję złotych koloidów przy gęstości mocy lasera obrazującego.
  12. Ustaw parametry obrazowania: interwał nieoświetlający (NII), liczbę klatek oraz częstotliwość kroku fotobielenia (jeśli jest to wymagane) w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Dla mSAL CD81 na komórkach U2OS i Jurkat T z przeciwciałem CD81, optymalne ustawienia to NII 5 s, łącznie 2000 klatek oraz krok fotobielenia co 5. klatka.
    UWAGA: Parametry te muszą być zoptymalizowane dla każdego interesującego białka, przeciwciała używanego dla mSAL oraz typu komórki. Więcej szczegółów na temat optymalizacji znajdziesz w kroku 3. Optymalna liczba klatek może się różnić zarówno w zależności od przeciwciała-celu, jak i typu komórki. W przypadku nowych systemów docelowych zaleca się przechwycenie 2 000-3 000 klatek jako punkt wyjścia. NII wydłużają czas akwizycji obrazu. Na przykład akwizycja mSAL z 3 000 klatek i NII 20 s skutkuje ~17 godzinami czasu akwizycji.
  13. Przygotuj bufor obrazowania, rozcieńczając przeciwciało CD81 do stężenia 1 μg/mL w 200 μL 5% BSA (w/v) w DPBS. Dla mSAL CD81 końcowe stężenie przeciwciał wynosiło 0,5 nM dla komórek Jurkat T i 2 nM dla komórek U2OS.
    UWAGA: Stężenie przeciwciał zależy od lokalnej obfitości substratu oraz powinowactwa przeciwciała. Kluczowe jest zoptymalizowanie stężeń przeciwciał dla każdego docelowego białka, każdego przeciwciała używanego do obrazowania oraz każdego typu komórek. Więcej szczegółów na temat optymalizacji znajdziesz w kroku 3.1.
  14. Dodaj przygotowany bufor obrazowania do studni i rozpocznij akwizycję.

3. Optymalizacja parametrów obrazowania

UWAGA: parametry obrazowania mSAL zależą od ekspresji białek, jego lokalnej organizacji oraz wyboru przeciwciał używanych do obrazowania. Celem optymalizacji parametrów obrazowania jest identyfikacja stężenia przeciwciał i NII, które powodują przestrzennie rozdzielone zdarzenia pojedynczych cząsteczek, przy jednoczesnym zachowaniu wystarczająco wysokich gęstości, aby zmaksymalizować pobieranie epitopów.

  1. Stężenie przeciwciał
    1. Rozcieńcz przeciwciało do 0,5 nM dla komórek Jurkat i 2 nM dla komórek U2OS w 200 μL 5% (w/v) BSA w DPBS i dodaj roztwór przeciwciał do dołku. Aby optymalnie oznaczać pojedyncze przeciwciała, użyj stężenia przeciwciał na poziomie lub blisko jego stałej równowagi dysocjacyjnej (Kd); jeśli Kd jest nieznane, zaleca się rozpoczęcie od 1 nM.
    2. Użyj funkcji podglądu na żywo w oprogramowaniu obrazującym skonfigurowanym dla mSAL do monitorowania wiązania przeciwciał.
    3. Dostosuj kąt TIRF i parametry obrazowania, aby uzyskać stosunek sygnału do szumu (SNR) ≥ 3.
      UWAGA: Optymalny kąt TIRF poprawia SNR poprzez ograniczenie rozmytej fluorescencji z dyfundujących przeciwciał w buforze obrazowania. Na początku można użyć gęstości mocy lasera 100-200 W/cm2 oraz czasu integracji kamery 50 ms. Jeśli SNR jest niskie, stopniowo zwiększ moc lasera i/lub czas integracji kamery i monitoruj zmiany w SNR, aż osiągnie optymalną wartość.
    4. Konfiguruj parametry obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, aby uzyskać co najmniej 10 klatek z NII 5 s (patrz krok 2.12).
      UWAGA: Zalecany jest NII na 5 s jako punkt wyjścia. Należy wykonać skan NII, aby zidentyfikować optymalne NII dla nowego układu przeciwciało-cel (krok 3.2).
    5. Rozpocznij akwizycję. Oceń rzadkość lokalizacji pojedynczych cząsteczek w nagranym filmie.
      UWAGA: Szczegółowe kroki uzyskania gęstości lokalizacji opisano w poprzedniej publikacji24. Gęstość lokalizacji pojedynczącej cząsteczki w zakresie od 0,02 do 0,15 zdarzeń/μm 2 okazała się optymalna dla mSAL.
    6. Jeśli po dodaniu buforu obrazującego zaobserwuje się wiele nakładających się zdarzeń wiązania przeciwciał lub lokalizacje pojedynczych cząsteczek kumulują się w czasie w trakcie nagrywania, przerwij akwizację. Zmniejsz stężenie przeciwciał dwukrotnie i powtórz pobieranie na nowej próbce. Powtarzaj ten proces, zmniejszając stężenie przeciwciał dwukrotnie i ponownie oceniając liczbę zdarzeń na jednostkę powierzchni, aż osiągniesz pożądaną gęstość zdarzeń lokalizacji pojedynczych cząsteczek.
      UWAGA: Nakładające się zdarzenia objawiają się wieloma dużymi punktami, które stają się jaśniejsze lub większe po związaniu nowego przeciwciała w granicy dyfrakcyjnej pierwszego przeciwciała.
    7. Jeśli gęstość zdarzeń jest rzadka, zwiększ stężenie przeciwciał w buforze obrazującym dwukrotnie i powtórz pobieranie na nowej próbce. Powtarzaj ten proces, zwiększając stężenie przeciwciał dwukrotnie i ponownie oceniając liczbę zdarzeń wiązania na jednostkę powierzchni, aż osiągnie się pożądaną gęstość zdarzeń lokalizacyjnych pojedyncząsteczki.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie świeżej próbki w każdym próbie optymalizacji stężenia, aby uniknąć potencjalnych zakłóceń ze strony przeciwciał wstępnie związanych podczas kolejnych ocen gęstości lokalizacji.
  2. Optymalizacja NII
    1. Konfiguruj parametry obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, aby uzyskać akwizję 50 klatek (patrz krok 2.12). Ustaw NII na 0 (bez opóźnienia).
    2. Przygotuj bufor obrazujący do zoptymalizowanego stężenia przeciwciał od kroku 3.1 i dodaj go do dołku próbki. Rozpocznij akwizycję.
    3. Powtarzaj kroki 3.2.1-3.2.2, dostosowując NII do 1, 3, 5, 10 lub 20 s. Wykonaj każde pobieranie na nowej próbce.
    4. Oceń gęstość i rzadkość lokalizacji pojedynczych cząsteczek w nagranym filmie (patrz kroki 3.1.5-3.1.7). Najniższy NII o optymalnej gęstości zdarzenia pojedynczej cząsteczki określa się jako NII.
      UWAGA: Stężenie przeciwciał może wymagać dalszej optymalizacji, aby osiągnąć optymalną gęstość lokalizacji pojedynczej cząsteczki dla odpowiadającego NII. Sprawdź krok 3.1. Wcześniejsze raporty pokazują, że dłuższe NII (10-20 s) były bardziej selektywne wobec zdarzeń o większej gęstości wiązania, ale wydłużenie NII powyżej 20 s nie przyniosło dodatkowej poprawy23,24. Jeśli w trakcie akwizycji obrazu wystąpią przestrzennie nakładające się zdarzenia wiązania, należy wprowadzić etap fotobielenia w odstępach wystarczających, aby usunąć fluorescencję z powiązanych przeciwciał. Na przykład, jeśli nakładające się zdarzenia pojawiają się w piątej klatce, stosuj fotowybielanie co piątą klatkę. Pojawienie się przestrzennie nakładających się zdarzeń opisano w NOCIE kroku 3.1.6.

4. Analiza danych

UWAGA: rekonstrukcja obrazów mSAL korzysta z darmowego oprogramowania NIH, Fiji29, z wtyczką ThunderSTORM30 . W tym protokole wykorzystano wersje Fiji v1.54r oraz ThunderSTORM 1.3. Szczegółowa analiza obrazów została opisana w poprzednim protokole 24. W tej części przedstawiamy workflow analizy stosowany specjalnie dla mSAL. Analiza przedstawiona w tym protokole wykorzystała kamerę Prime95B sCMOS (numer seryjny A18B203004) z fotoelektronami na A/D 0,98 oraz poziomem bazowym kamery 100. Rozmiar piksela obrazującego ustawiony na 147 nm.

  1. Ustaw parametry rekonstrukcji w oknie Run Analysis. Parametry używane do rekonstrukcji obrazów CD81 mSAL opisano poniżej. Funkcja Podglądu powinna być użyta do oceny wykrytych zdarzeń wiązania pojedynczych cząsteczek w wybranej klatce przed przeprowadzeniem pełnej analizy.
    Filtrowanie obrazów:
    Filtr: Filtr falkowy (B-spline)
    Kolejność B-Spline: 2
    Skala B-Spline: 4
    Przybliżona lokalizacja cząsteczek:
    Metoda: Lokalny maksimum
    Próg maksymalnej intensywności: std(Wave.F1)
    Łączność: 8-sąsiedztwo
    Lokalizacja cząsteczek w subpikselach:
    Metoda: PSF: Zintegrowany Gaussian
    Promień dopasowania [px]: 2
    Metoda dopasowania: Maksymalne prawdopodobieństwo
    Początkowa sigma [px]: 0,75
    Analiza dopasowania wielu emiterów: nie wybrana
    Wizualizacja wyników:
    Metoda: Znormalizowany Gaussjan
    Powiększenie: 7,3
    Częstotliwość aktualizacji [klatki]: 50
    Niepewność boczna: 20
    UWAGA: Parametry wstępnego filtrowania służą do poprawy wykrywania pojedynczego emitera w tle. Służą jako punkty wyjścia, ale powinny być optymalizowane pod kątem każdego zbioru danych. Przybliżone parametry lokalizacji i metody detekcji są wykorzystywane dla zdarzeń wiązania pojedynczych cząsteczek. Wykorzystanie lokalnych maksymalnych intensywności z łącznością 8-sąsiedztwa wykazuje się niezawodną wydajność31. Wybrano zintegrowaną metodę Gaussa z dopasowaniem maksymalnej prawdopodobieństwa, ponieważ jest szeroko stosowana i zapewnia wiarygodne przybliżenie funkcji rozrzutu punktowego (PSF) w aplikacjach obrazowania pojedyncząsteczkowego 32,33,34,35. Metodą wizualizacji używaną w tym protokole jest znormalizowany Gauss. Użytkownicy mogą wybrać metodę wizualizacji najlepiej dopasowaną do ich danych. Powiększenie zostało ustawione tak, aby uzyskać zrekonstruowany rozmiar piksela 20 nm, co odpowiada oczekiwanej precyzji lokalizacji osiągalnej przy oznakowaniu opartym na przeciwciałach, gdzie błąd sprzężenia wynosi około ~10 nm. Współczynnik powiększenia 7,3 obliczono przez podzielenie rozmiaru piksela ograniczonego dyfrakcją przez pożądany zrekonstruowany rozmiar piksela (147 nm / 20 nm = 7,3). Częstotliwość aktualizacji decyduje o częstotliwości odświeżania zrekonstruowanego obrazu podczas obróbki, ale nie wpływa na końcowy wynik. Niepewność boczna jest ustawiona na 20 (ale nie wymuszona), tak aby rekonstrukcja uwzględniała obliczone niepewności lokalizacji. Aby uzyskać więcej informacji o dostępnych opcjach, zapoznaj się z Przewodnikiem Użytkownika ThunderSTORM30 lub kliknij znak zapytania obok pola wprowadzania.
  2. Rozpocznij analizę ThunderSTORM od początkowego sigma 1,6 piksela i dopasowanego promienia 3. Doprecyzuj parametry w razie potrzeby. Dopasowanie wieloemitorowe nie było stosowane, ponieważ gęstości zdarzeń nie pokrywały się w obrazach ograniczonych dyfrakcją.
  3. Kliknij OK , aby uruchomić rekonstrukcję. Po zakończeniu okna wyników otwiera się automatycznie.
  4. Użyj funkcji histogramu Plot , aby znaleźć szczytową sigmę. Przekonwertuj tę wartość (nm) na piksele, dzieląc przez surowy rozmiar piksela danych, a następnie ponownie przeprowadź analizę ThunderSTORM, używając nowej wartości początkowego sigma i dopasowania ustawionego na liczbę całkowitą zbliżoną do 3x początkowej sigmy30.
  5. Określ korekcję dryfu, używając wybranego markera fiducjalnego24.
  6. Wykonaj rekonstrukcję obrazu na pełnym polu widzenia i zastosuj obliczoną korektę dryfu.
  7. Aby wykonać postprodukcję obrazu, kliknij zakładkę Filtr w oknie wyników. Stosuj filtry, aby usunąć słabo zlokalizowane zdarzenia. W wyświetlanych wynikach dla CD81 usunięto zdarzenia o sigma większej niż 200 nm i niepewności większej niż 20 nm. Użyj funkcji histogramu Plot, aby zbadać rozkład sigma i określić odpowiedni próg.
    UWAGA: Lokalizacje pojedyncząsteczki o dużych wartościach sigma zazwyczaj powstają z słabych fluoroforów o niskiej liczbie fotonów lub z nakładających się emiterów. Usunięto także lokalizacje o niepewności większej niż 20 nm, ponieważ niepewność przekraczająca ostateczny rozmiar piksela wskazuje na słabą dokładność lokalizacji. Dodatkowe wskazówki dotyczące parametrów filtrowania można znaleźć w Przewodniku użytkownika ThunderSTORM30.
  8. Zapisz tabelę wyników z danymi lokalizacji pojedynczych cząsteczek do dalszych analiz, wybierając Eksport. Eksportowany plik będzie w .csv formacie pliku i w tym protokole określany jako mSAL.csv. Zapisz powstały obraz znormalizowanego Gaussa.

5. Analiza klastrów

UWAGA: Podczas sondowania epitopów przeciwciała oddziałują zarówno z zamierzonymi celami, jak i z cząsteczkami poza celem (interakcje niespecyficzne). Ponieważ mSAL opiera się na kumulatywnym wykrywaniu pojedynczych zdarzeń wiązania przeciwciało-antygen, niektóre niespecyficzne interakcje nieuchronnie przyczyniają się do powstania zrekonstruowanego obrazu. Interakcje przeciwciało-epitop wykazują wyraźne odciski palców kinetycznych, które w zasadzie mogą odróżnić wiązanie specyficzne od niespecyficznego, gdzie zdarzenia specyficzne i niespecyficzne są rozróżniane przez lokalne gęstości oddziaływania, a nie przez długość pobytu pojedynczej cząsteczki razy36. Tutaj opisano grupowanie przestrzenne oparte na gęstości zastosowań z analizą szumu (DBSCAN)37, aby usunąć zdarzenia o niskiej gęstości, zachowując zdarzenia o wysokiej gęstości, które częściej odzwierciedlają specyficzne wiązanie przeciwciał. Ponadto klasteryzacja oparta na gęstości może również dostarczyć ilościowych informacji na temat nanoskalowej organizacji przestrzennej białek, szczególnie tych znanych z naturalnej organizacji w klastry, takich jak CD81 w mikrodomeny wzbogacone tetraspaniną 38,39,40,41,42 . Dostarczona analiza DBSCAN została przeprowadzona za pomocą MATLAB 2025a. Dla użytkowników bez dostępu do MATLAB-a zaleca się przeprowadzanie podobnych analiz DBSCAN z otwartymi alternatywami, takimi jak Python lub R 43,44,45. Kod używany w tym protokole można uzyskać z: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. Uruchamianie kodu
    1. Pobierz plik MATLAB z powyższego linku na GitHub.
    2. Uruchom MATLAB i otwórz kod. Na liniach 37 i 38 ustaw minimalną liczbę punktów (minPTS) oraz epsilon dla parametrów klastrowania. Zastosowano następujące parametry:
      Komórki T Jurkata:
      minPTS: 7
      Epsilon: 60
      Komórki U2OS:
      minPTS: 7
      Epsilon: 80
      UWAGA: Zobacz krok 5.2, aby uzyskać więcej szczegółów dotyczących optymalizacji tych parametrów.
    3. Ustaw ścieżkę pliku w oprogramowaniu MATLAB na folder, który zawiera odtworzony plik mSAL.csv.
    4. Uruchom kod, klikając Uruchom. Kod poprosi użytkownika o wybranie pliku. Wybierz plik mSAL.csv i kliknij Otwórz.
    5. Dane skupione są automatycznie zapisywane w folderze o nazwie MATLAB Data w ścieżce pliku wyznaczonej w kodzie. Otwórz ten plik w ThunderSTORM, klikając Plugins > ThunderSTORM > Import/Export > Import wyniki.
    6. Zapisz powstały obraz z mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki.
  2. Optymalizacja wejść klastrowania
    UWAGA: Dwa parametry wejściowe dla algorytmu DBSCAN to minPTS i epsilon. Epsilon definiuje promień wokół punktu, aby ustalić jego otoczenie, natomiast minPTS określa minimalną liczbę punktów w tym otoczeniu wymaganą do utworzenia gęstego obszaru. Punkty spełniające ten wymóg gęstości klasyfikuje się jako punkty rdzeniowe, a ich otoczenia są rekurencyjnie dodawane do klastra. Punkty, które nie spełniają wymogu gęstości, ale mieszczą się w okolicy punktu rdzeniowego, są oznaczane jako punkty graniczne, natomiast wszystkie pozostałe punkty są uznawane za punkty szumowe.
    1. Przeprowadź analizę, korzystając z opisanych powyżej danych wejściowych (krok 5.1.2) jako punktu wyjścia. Wybierz wartość minPTS wyższą niż liczba lokalizacji szumów, ale mniejszą niż liczba lokalizacji na komórce. Po wybraniu minPTS dostosuj epsilon tak, aby ta liczba lokalizacji była uchwycona w promieniu sąsiedztwa dla reprezentatywnych regionów na komórce.
      UWAGA: minPTS i epsilon można regulować niezależnie od siebie. Praktycznym podejściem do wyboru tych parametrów jest najpierw przeanalizowanie wykresu rozpraszania punktów szumowych poza komórką i porównanie ich z liczbą lokalizacji obserwowanych w obszarach o podobnej wielkości na komórce.
    2. Oceń okno oznaczone Rysunkiem 2 , przedstawiające skupione dane. Jeśli dane zachowują skupiska na komórce zawierającej oczekiwany fenotyp z minimalizacją lokalizacji poza komórką, dane wejściowe klastrowania są wystarczające.
      UWAGA: Dane skupione powinny zachować strukturę danych uzyskanych za pomocą mSAL. Jeśli klastry wydają się małe, zlokalizowane tylko do bardzo gęstych obszarów oryginalnych danych i wykluczają znaczną liczbę zdarzeń wiązań korelujących z oczekiwanym fenotypem, parametry klastrowania mogą być zbyt restrykcyjne. Jeśli niespecyficzne wiązanie poza komórką nie jest wystarczająco zredukowane przy dużych skupiskach, parametry skupień mogą być zbyt obszerne.
    3. Jeśli parametry klastrowania są zbyt restrykcyjne, zmniejsz minPTS i zwiększ epsilon, aby uwzględnić więcej punktów w danych klastrowanych. Jeśli parametry klastrowania są zbyt obszerne, zwiększ minPTS i zmniejsz epsilon.
    4. Po dostosowaniu minPTS i epsilon ponownie uruchom kod. Powtarzaj kroki 5.2.2-5.2.3, aż osiągniesz optymalne klasterowanie.

6. Walidacja wiązania przeciwciał z celem

UWAGA: W przypadku białek błonowych bez dobrze określonej morfologii weryfikacja dokładności rozdzielonych struktur może być wyzwaniem. Aby zweryfikować specyficzność przeciwciał, użytkownicy mogą ekspresjonować fluorescencyjną fuzję białka (FP) docelowego białka. Jako wstępną kontrolę można wykonać konwencjonalne barwienie immunofluorescencyjne na komórkach wyrażających fuzję FP. Aby uzyskać dokładniejszą walidację przy ocenie nowych przeciwciał, mSAL można wykonać na komórkach ekspresyjnych FP, aby potwierdzić, że lokalne zdarzenia wiązania odpowiadają fluorescencyjnemu celowi. Tutaj opisano protokół transfekcji komórek U2OS za pomocą CD81-mStayGold jako przykład, umożliwiający potwierdzenie, że lokalizacje CD81 mSAL odpowiadają FP-oznakowanemu CD81 na powierzchni komórki. Użytkownicy mogą zastąpić dowolne odpowiednie białko fluorescencyjne, pod warunkiem, że jego emisja nie pokrywa się z kanałem fluorescencyjnym walidowanego przeciwciała.

  1. Rozsiewaj komórki U2OS w komorze z 8 dołkami i rosną do ~70% konfluencji. Utrzymuj komórki w 200 μL kompletnego media wzrostu (DMEM uzupełniony o 10% (v/v) surowicę płodową bydła, 100 U/mL penicyliny oraz 100 μg/mL streptomycyny).
  2. Połącz 100 ng konstrukcji DNA kodującej białko z fluorescencyjnym reporterem z 5 μL Lipofectamine 2000. Wiruj przez 30 sekund i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystano CD81 połączony z mStayGold. Standardowe techniki klonowania molekularnego były stosowane do generowania plazmidów DNA, choć nie są one opisane w tym protokole. DNA: Dostępne proporcje lipofektaminy są zoptymalizowane pod kątem komórek zasiewanych w szkiełkach z komorą 8-dołkową i mogą wymagać korekty zgodnie z instrukcjami producenta dla innych formatów próbek.
  3. Dodaj do komórek 5 μL roztworu DNA/lipofektaminy. Inkubuj szkiełko komory przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, uzupełniając 5%CO2 w wilgotnym środowisku.
  4. Zamień podłoże na podgrzane podłoże do całkowitego wzrostu. Inkubować przez > 8 godzin w temperaturze 37 °C, uzupełniając 5%CO2 w wilgotnym środowisku, aby umożliwić wykrywalną ekspresję białek.
  5. Oceniaj poziom ekspresji fluorescencji w komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub obrazowania. Zalecana jest efektywność transfekcji ≥ 30%. Jeśli poziomy ekspresji fluorescencji są nieoptymalne, zoptymalizuj stosunek DNA do lipofektaminy zgodnie z wytycznymi producenta.
    UWAGA: Komórki przejściowe wyrażające się do walidacji przeciwciał powinny być użyte w ciągu 24-48 godzin po transfekcji.
  6. Aby naprawić komórki, prosimy o wykonanie kroków 1.2.8-1.2.13.
  7. Przechowywać stałe próbki w 200 μL DPBS z 5 mM azydu sodu do czasu przygotowania do obrazowania. Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
    UWAGA: Azyd sodu jest bardzo toksyczny i może być śmiertelny w przypadku spożycia. Noszę odpowiednie środki ochrony osobistej podczas obsługi tego odczynnika. W przypadku kontaktu ze skórą natychmiast dokładnie umyj dotknięte miejsce mydłem i wodą. Uśmieć się z odczynnikiem zgodnie z wytycznymi danej instytucji oraz wszystkimi obowiązującymi lokalnymi, stanowymi i federalnymi przepisami.
  8. Postępuj zgodnie z krokami 2.1-2.12, aby ustawić mikroskop i zamontować próbkę. Zidentyfikuj komórkę wyrażającą interesujące białko za pomocą sygnału fluorescencji.
  9. Dla porównania, zrób obraz komórki TIRF. Jeśli użyte jest białko fluorescencyjne w tym samym kanale obrazowania co przeciwciało mSAL, wykonaj fotobielenie białka fluorescencyjnego. Aby wybielić białko, wykorzystaj maksymalną moc lasera przez > 10 minut, aż sygnał nie zostanie zaobserwowany.
  10. Dodaj przygotowany bufor obrazowania do studni i rozpocznij obrazowanie. Analiza powinna być przeprowadzona zgodnie z opisaniem wcześniej (krok 4).
  11. Otwórz zarówno obraz zrekonstruowany, jak i obraz TIRF białka fluorescencyjnego uzyskanego przed pozyskaniem mSAL. Oceń lokalizacje wiązania przeciwciał mSAL poprzez porównanie wyglądu i lokalizacji wyrażonego białka, przedstawionego na obrazie TIRF ograniczonym dyfrakcją, z obrazem mSAL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Technika mSAL opisana w tym protokole umożliwia wizualizację zdarzeń wiązania pojedynczych przeciwciał z odpowiadającymi im celami białek błony plazmatycznej, tworząc superrozdzielczą mapę rozkładu białek błonowych. CD81 jest tutaj używany jako reprezentatywny przykład, choć podejście to jest łatwo adaptowalne do innych białek błonowych.

Unieruchomienie komórek Jurkat T przy odpowiedniej odległości między komórkami zapewnia dostęp membranowych epitopów przez przeciwciała i szklaną powierzchnię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Organizacja białek błony plazmatycznej odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcjonowania komórek. Konwencjonalne techniki mikroskopii fluorescencyjnej są ograniczone przez granicę dyfrakcyjną światła, co maskuje ich organizację na poziomie nano. SMLM przezwycięża to ograniczenie, osiągając rozdzielczość przestrzenną 10-20 nm47, co umożliwia charakteryzację ich zespołów w skali nanoskalowej: 10,48,49. Artef...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Badania opisane w tej publikacji zostały wsparte przez National Institute of General Medical Sciences przy National Institutes of Health w ramach Nagrody numer R35GM146786 oraz College of Liberal Arts and Sciences na University of Illinois Chicago. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciwciało anty-CD81 Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificMA5-44132Przeciwciała obrazowe
Wirówka stołowaEppendorf5424
Albumina surowicy bydłaMilliporeSigmaA7906-100G
Komorowe szkło pokrywowe, 8-dołkoweCellvisC8-1-N
Nośniki DMEMThermo Fisher Scientific11960069
Fosforanowa sól fizjologiczna DulbeccoThermo Fisher Scientific14190-144
Surowica bydła płodowaMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldehyd, 10%Nauki o mikroskopii elektronowej16120
Złote koloidy, 100 nmTed Pella15711 i minus; 20Znacznik powierniczy
Olej immersyjny Laboratoria Cargille16245
Mikroskop odwrócony  wyposażony w moduł TIRFNikon InstrumentsEclipse Ti2-EMikroskop
Linia komórkowa Jurkat E6.1MilliporeSigma88042803-1VLKomórki zawiesiny
Wystrzelenie laserowe, 6 liniiOxxiusL6CC-CS8-1511Laser wzbudzający
Lipofektamina 2000Thermo Fisher Scientific11668019Odczynnik transfekcyjny
Rurka mikrowirówkowa, 1,5 mL VWR89000-028
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowegoNikon InstrumentsZaawansowane badania NIS-ElementsOprogramowanie do pozyskiwania obrazów
Cel, 100x/1,49 CFI APO TIRF Nikon InstrumentsMRD01991Cel mikroskopowy
Paradehyd, 16%Nauki o mikroskopii elektronowej15710
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140-122Antybiotyki
Roztwór poli-L-Lizyny, 0,01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Aparat Prime 95B sCMOSTeledyne Vision Solutions01-PRIME-95B-R-M-16-CKamera
Nośniki RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093Medium dla ogniw zawiesinowych
Azyd soduThermo Fisher Scientific19038-1000
Borowodnikiem soduMilliporeSigma213462-25G
Flaszki kultury T25Thermo Fisher Scientific169900
Mikrosfery TetraSpeckZnacznik powierniczy
Naczynie do hodowli tkanek, 100 mm Corning353003
Linia komórkowa U2OSATCCHTB-96Komórki przylegające

Bibliografia

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

błona plazmatycznamikroskopia superrozdzielczabiałko CD81grupowanie oparte na gęstościwiązanie przeciwciałkorekcja dryftuprzeciwciała terapeutyczne
Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.