Method Article

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

DOI:

10.3791/69853

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona plazmatyczna definiuje kształt komórki i pełni rolę interfejsu sterującego komunikacją międzykomórkową. Białka błonowe stanowią główną klasę celów terapeutycznych; Dlatego superrozdzielenie błony komórkowej poprzez białka konstytutywne niesie wielkie szanse na rozwój biologii komórkowej i terapii przeciwciałami. W tym kontekście mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek (SMLM) umożliwia wizualizację organizacji białek na skali nanoskalowej na strukturach biologicznych. Pomimo swojego znaczenia, zastosowanie SMLM do białek błony plazmatycznej stawia przed sobą wyjątkowe wyzwania. W tym protokole przedstawiamy skuteczne podejście wykorzystujące znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) poklatkowe, zwane błonowym SAL (mSAL). Dostarczamy szczegółowe instrukcje krok po kroku, w tym optymalizację stężenia przeciwciał, gęstości mocy lasera, czasu trwania interwałów nieiluminacyjnych, rekonstrukcję obrazów oraz analizę klastrów opartą na gęstości, aby rozwiązywać rozkład białek błonowych nanoskalowych i morfologię błony. Używamy białka tetraspaniny CD81 jako modelowego białka błonowego, aby wykazać zdolność mSAL zarówno na komórek ssaków przylegających, jak i zawiesinowych. Oprócz superrozdzielczości błony komórkowej i rozkładu białek błonowych, nasza technika umożliwia badanie farmakodynamiki przeciwciał terapeutycznych oddziałujących z ich celami błonowymi w naturalnym środowisku błonowym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona plazmatyczna zawiera różnorodne białka regulujące mobilność komórek, adhezję, wykrywanie oraz komunikację międzykomórkową. Zrozumienie nanoskalowego rozkładu białek błony plazmatycznej jest ważne, ponieważ funkcja białek często zależy nie tylko od poziomu ekspresji, ale także od ich przestrzennej organizacji na błonie 1,2. Co istotne, wiele przeciwciał terapeutycznych celuje w białka błonowe 3,4, co czyni badania na skalę nanobiologiczną niezbędną dla zrozumienia, jak interakcje przeciwciał są wpływane przez lokalną organizację białek błonowych. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wykorzystuje ustalone linie komórkowe Jurkat E6.1 i U2OS i nie obejmuje podstawowych materiałów ludzkich ani żywych zwierząt.

1. Siew/lądowanie i utrwalanie komórek

UWAGA: Przygotowanie próbki stosuje standardowe protokoły barwienia immunofluorescencji (IF), zoptymalizowane w celu zachowania podkomórkowej organizacji białek błony plazmatycznej w różnych typach komórek. Jeśli istnieje ustalony protokół immunodymastyki dla interesującego obiektu, użytkownicy mogą stosować go do etapu blokowania próbek 1.2.14. Znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) opiera się na skumulowanym wykrywaniu fluorescencyjnie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika mSAL opisana w tym protokole umożliwia wizualizację zdarzeń wiązania pojedynczych przeciwciał z odpowiadającymi im celami białek błony plazmatycznej, tworząc superrozdzielczą mapę rozkładu białek błonowych. CD81 jest tutaj używany jako reprezentatywny przykład, choć podejście to jest łatwo adaptowalne do innych białek błonowych.

Unieruchomienie komórek Jurkat T przy odpowiedniej odległości między komórkami zapewnia dostęp membranowych epitopów przez przeciwciała i szklaną powierzchnię.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organizacja białek błony plazmatycznej odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcjonowania komórek. Konwencjonalne techniki mikroskopii fluorescencyjnej są ograniczone przez granicę dyfrakcyjną światła, co maskuje ich organizację na poziomie nano. SMLM przezwycięża to ograniczenie, osiągając rozdzielczość przestrzenną 10-20 nm47, co umożliwia charakteryzację ich zespołów w skali nanoskalowej: 10,48,49. Artef.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji zostały wsparte przez National Institute of General Medical Sciences przy National Institutes of Health w ramach Nagrody numer R35GM146786 oraz College of Liberal Arts and Sciences na University of Illinois Chicago. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
przeciwciało anty-CD81 Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificMA5-44132Przeciwciała obrazowe
Wirówka stołowaEppendorf5424
Albumina surowicy bydłaMilliporeSigmaA7906-100G
Komorowe szkło pokrywowe, 8-dołkoweCellvisC8-1-N
Nośniki DMEMThermo Fisher Scientific11960069
Fosforanowa sól fizjologiczna DulbeccoThermo Fisher Scientific14190-144
Surowica bydła płodowaMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldehyd, 10%Nauki o mikroskopii elektronowej16120
Złote koloidy, 100 nmTed Pella15711 i minus; 20Znacznik powierniczy
Olej immersyjny Laboratoria Cargille16245
Mikroskop odwrócony  wyposażony w moduł TIRFNikon InstrumentsEclipse Ti2-EMikroskop
Linia komórkowa Jurkat E6.1MilliporeSigma88042803-1VLKomórki zawiesiny
Wystrzelenie laserowe, 6 liniiOxxiusL6CC-CS8-1511Laser wzbudzający
Lipofektamina 2000Thermo Fisher Scientific11668019Odczynnik transfekcyjny
Rurka mikrowirówkowa, 1,5 mL VWR89000-028
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowegoNikon InstrumentsZaawansowane badania NIS-ElementsOprogramowanie do pozyskiwania obrazów
Cel, 100x/1,49 CFI APO TIRF Nikon InstrumentsMRD01991Cel mikroskopowy
Paradehyd, 16%Nauki o mikroskopii elektronowej15710
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140-122Antybiotyki
Roztwór poli-L-Lizyny, 0,01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Aparat Prime 95B sCMOSTeledyne Vision Solutions01-PRIME-95B-R-M-16-CKamera
Nośniki RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093Medium dla ogniw zawiesinowych
Azyd soduThermo Fisher Scientific19038-1000
Borowodnikiem soduMilliporeSigma213462-25G
Flaszki kultury T25Thermo Fisher Scientific169900
Mikrosfery TetraSpeckZnacznik powierniczy
Naczynie do hodowli tkanek, 100 mm Corning353003
Linia komórkowa U2OSATCCHTB-96Komórki przylegające

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulatio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationMembrane ProteinsSingle Antibody LabelingPlasma MembraneSuper Resolution MicroscopyCD81 ProteinDensity Based ClusteringAntibody BindingDrift CorrectionTherapeutic Antibodies

Related Articles