Profilowanie fitochemiczne, chromatografia gazowa – analiza spektrometrii mas oraz aktywność in vivo terminalia mantaly u szczurów

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół integrujący analizę fitochemiczną, chromatografię gazową – spektrometrię mas oraz zwalidowane testy in vivo w celu oceny działania przeciwzapalnego, przeciwbólowego i przeciwpiretycznego Terminalia mantaly, zapewniając powtarzalne ramy do oceny farmakologicznej roślin leczniczych.

Streszczenie

Syntetyczne leki na stan zapalny, ból i gorączkę są skuteczne, ale często powodują skutki niepożądane, zwiększając zainteresowanie roślinnymi alternatywami terapeutycznymi. Terminalia mantaly H. perrier, tradycyjnie stosowana w medycynie afrykańskiej, ma ograniczone potwierdzenie naukowe. Badanie to przedstawia zintegrowany protokół eksperymentalny łączący badania przesiewowe fitochemiczne, ilościową analizę związków fenolowych i flawonoidowych, charakterystykę chromatografii gazowo-spektrometrii masowej (GC-MS) oraz testy farmakologiczne in vivo w celu oceny potencjału terapeutycznego ekstraktu metanolowego T. mantaly. Badania fitochemiczne potwierdziły obecność wielu klas bioaktywnych, a analiza GC–MS zidentyfikowała dwadzieścia składników, w tym kwasy tłuszczowe, fitosterole, tokoferole oraz inne związki bioaktywne o znanych właściwościach przeciwzapalnych i antyoksydacyjnych. Farmakologiczna ocena in vivo u szczurów wykazała zależną od dawki działanie przeciwzapalne w modelu obrzęku łapy wywołanego karagenanem, znaczące wydłużenie opóźnienia odstawienia bólu w teście zanurzenia ogona oraz zmniejszenie krwinki wywołanej przez drożdże. W wyższych dawkach ekstrakt wykazywał efekty porównywalne ze standardowymi lekami, takimi jak diklofenak i paracetamol. Oceny ostrej toksyczności i cytotoksyczności wskazywały na korzystny profil bezpieczeństwa w badanych dawkach. Razem te wyniki potwierdzają etnomedyczne zastosowanie T. mantaly i pokazują powtarzalne ramy eksperymentalne łączące skład fitochemiczny z aktywnością farmakologiczną. Protokół stanowi praktyczne źródło metodologiczne dla badaczy roślin leczniczych oraz wspiera rozwój środków pochodzenia roślinnego do leczenia stanów zapalnych i gorączkowych.

Wprowadzenie

Stan zapalny, ból i gorączka to powiązane procesy patologiczne, które leżą u podstaw szerokiego zakresu chorób ostrych i przewlekłych. Chociaż leki syntetyczne, takie jak niesteroidowe leki przeciwzapalne, kortykosteroidy i paracetamol, pozostają podstawą terapii, ich długotrwałe stosowanie często wiąże się z podrażnieniem przewodu pokarmowego, powikłaniami nerek, wątrobotoksyną i innymi skutkami niepożądanymi¹. Te ograniczenia spowodowały rosnące zainteresowanie roślinami leczniczymi jako bezpieczniejszą, bardziej zrównoważoną alternatywą w leczeniu stanów zapalnych i gorączkowych. Produkty naturalne są dobrze znane z bogatej różnorodności bioaktywnych cząsteczek, z których wiele stanowi rolę liderów w nowoczesnym rozwoju leków. W tym kontekście T. mantaly, członek rodziny Combretaceae, zwrócił uwagę ze względu na swoje etnomedyczne zastosowanie w tradycyjnych afrykańskich systemach leczenia infekcji, dolegliwości żołądkowo-jelitowych i zaburzeń zapalnych ^2,3. Pomimo tradycyjnego znaczenia, systematyczne badania farmakologiczne potwierdzające jego potencjał terapeutyczny pozostają ograniczone. W szczególności brakuje kompleksowych badań integrujących badania fitochemiczne, oceny biologiczne in vivo oraz zaawansowane metody profilowania chemicznego, takie jak GC–MS. Wypełnienie tej luki jest kluczowe dla naukowego potwierdzenia jego zastosowań folklorystycznych oraz identyfikacji potencjalnych związków ołowiowych do zastosowań farmaceutycznych⁴. W niniejszym badaniu ekstrakt metanolowy T. mantaly został poddany szczegółowej ocenie fitochemicznej i farmakologicznej. Wstępna analiza potwierdziła obecność kluczowych metabolitów, w tym fenolików, flawonoidów, taninow, saponin i terpenoidów, które wszystkie są znane z działania przeciwzapalnego, przeciwbólowego i antyoksydacyjnego⁵. Testy ilościowe wykazały również, że ekstrakt zawierał znaczne ilości związków fenolowych i flawonoidowych, o wartościach porównywalnych ze standardami referencyjnymi, co sugeruje silny potencjał antyoksydacyjny.

Zastosowano modele zwierzęce, ponieważ oceniane odpowiedzi farmakologiczne obejmują zintegrowane szlaki zapalne, nerwowe i termoregulacyjne, których nie da się odtworzyć in vitro. Badania in vivo dostarczyły wyraźnych dowodów farmakologicznych na bioaktywność. U szczurów testowano właściwości przeciwzapalne (obrzęk łapy wywołany karagenanem), przeciwbólowe (zanurzenie w ogonie) oraz przeciwgorączkowe (gorączka wywołana przez drożdże) właściwości, wykazując działanie przeciwzapalne zależne od dawki podobne do diklofenaku sodu w wyższych dawkach. Podobnie ekstrakt zwiększył opóźnienia zanurzenia w ogonach u szczurów, potwierdzając jego skuteczność przeciwbólową, podczas gdy modele piroksji wywołanej drożdżami wykazały wyraźne działanie przeciwpiretyczne, bardzo podobne do efektów paracetamolu⁶. Profilowanie chemiczne za pomocą analizy GC–MS dostarczyło głębszych informacji o jego składzie bioaktywnym. Zidentyfikowano łącznie 20 związków, w tym 3,5-dihydroksy-6-metylo-2,3-dihydro-4H-pyran-4-one, kwas linolowy, γ-sitosterol, skwalen oraz witaminę E. Związki te są dobrze udokumentowane ze swoich właściwości antyoksydacyjnych, przeciwzapalnych i kardioprotekcyjnych, wspierając obserwowane efekty farmakologiczne ^7,8. Co ważne, oceny toksyczności wykazały znikome efekty cytotoksyczne, podkreślając jego bezpieczeństwo przy testowanych dawkach. Razem to badanie rozwiązuje kluczową lukę, dostarczając zarówno fitochemicznych, jak i farmakologicznych dowodów na wartość leczniczą T. mantaly. Wyniki te nie tylko potwierdzają jego tradycyjne zastosowania, ale także podkreślają potencjał jako naturalnego źródła związków ołowiowych do opracowywania nowych terapii przeciw stanom zapalnym i pokrewnym zaburzeniom. Modele eksperymentalne użyte w tym badaniu odzwierciedlają przede wszystkim ostre odpowiedzi zapalne i nocyceptywne, a zatem dostarczają wstępnych dowodów farmakologicznych, a nie bezpośredniego wskazania przewlekłej skuteczności terapeutycznej.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz zgodne z zaleceniami OECD. Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Bahauddina Zakariyi w Multanie. (Zatwierdzenie nr 3 /UREC/2025). Podjęto wszelkie wysiłki, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i ograniczyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.

1. Przygotowanie całkowitego ekstraktu metanolowego T. mantaly (TMWM)

1. Zbierz świeże łodygi, korzenie i liście T. mantaly, potwierdzi materiał roślinny i złóż okaz voucherowy w uznanym zielniku.
   UWAGA: Materiał roślinny użyty w tym badaniu został zebrany z Punjab Nursery przy Mattital Road w Multanie 12 listopada 2023 roku. Współrzędne geograficzne miejsca zbioru to 30,2236° N, 71,4755° E. Roślina została taksonomicznie potwierdzona przez taksonoma prof. dr. Zafar Ullah Zafar, profesor botaniki na Uniwersytecie Bahauddin Zakariya w Multanie, oraz okaz voucherowy (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) zostali zdeponowani w zielniku Uniwersytetu Bahauddin Zakariya w Multanie. Roślina została zebrana z naturalnego środowiska w odpowiednich warunkach środowiskowych, a miejsce zbioru zostało udokumentowane fotografiami.
2. Opłucz materiał roślinny wodą z kranu, następnie wodą destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia, a następnie susz w cieniu w temperaturze 25–30 °C przez 7–10 dni, aż osiągniesz stałą wagę.
3. Zmielić wysuszony materiał na zgrubiony proszek i ważyć 500 g za pomocą wagi analitycznej. Przelej proszek do czystego szklanego pojemnika i dodaj 2,5 litra metanolu.
4. Maceruj mieszankę w temperaturze pokojowej przez 72 godziny, z przerywanym potrząsania co 6–8 godzin. Przefiltruj papier filtrujący Whatman No.1.
5. Skoncentruj filtrat pod obniżonym ciśnieniem za pomocą parownika obrotowego w temperaturze 39 °C, a następnie przechowuj wysuszony ekstrakt w szczelnych pojemnikach w temperaturze pokojowej aż do użycia.
   UWAGA: Metanol jest toksyczny i łatwopalny. Zajmij się ochroną w kapturze wypalającej, mając na sobie rękawiczki i okulary ochronne. Utylizacja odpadów rozpuszczalnikowych zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa chemicznego instytucji.
   UWAGA: Suszony ekstrakt można przechowywać w szczelnych pojemnikach w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni przed dalszą analizą.

2. Szacowanie całkowitej zawartości fenolu (metoda Folin–Ciocalteu)

1. Przygotuj roztwór kwasu galowego (100 μg/mL) poprzez rozpuszczenie 10 mg kwasu galowego w 100 mL metanolu i przygotuj rozcieńczenia w zakresie od 1 do 10 μg/mL.
2. Rozpuść ekstrakt 10 mg w 10 mL metanolu, aby uzyskać roztwór 1 mg/mL. Przelej 0,5 mL każdego standardu lub próbki do probówek.
3. Dodaj 2,5 mL odczynnika Folin–Ciocalteu rozcieńczonego w 1:1 wodą, a następnie 2,0 mL roztworu węglanu sodu 7,5%. Wymieszaj i inkubuj w temperaturze 25 ± 2 °C przez 30 minut.
4. Zmierz absorpcję przy 765 nm względem pustego odczynnika i oblicz całkowitą zawartość fenolu jako mg ekwiwalentów kwasu galowego na g ekstraktu.

3. Szacowanie całkowitej zawartości flawonoidów (metoda chlorku glinu)

1. Przygotuj roztwór rutynowy (1000 μg/mL) przez rozpuszczenie rutyny w metanolu, a następnie przygotuj rozcieńczenia seryjne w zakresie 10–80 μg/mL.
2. Przelej 0,5 mL standardowego lub ekstraktowego roztworu do probówek i dodaj 1,5 mL metanolu, 0,1 mL roztworu 10% chlorku glinu (AlCl₃), 0,1 mL roztworu octana potasu o pojemności 1 M oraz 2,8 mL wody destylowanej.
3. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut i mierz absorpcję przy 415 nm. Wyniki wyrażaj jako mg ekwiwalentów rutyny na g ekstraktu⁹.

4. Analiza chromatografii gazowej – spektrometrii mas (GC–MS)

1. Rozpuść ekstrakt 10 mg w 1 mL metanolu klasy HPLC i przefiltrować przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 μm do fiolki GC.
2. Analiza wykonana jest za pomocą Agilent 7890B GC w połączeniu z 5977A MS wyposażonym w kolumnę kapilarną HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Używaj helu jako gazu nośnego o wydajności 1,0 mL/min przy temperaturze wtryskiwacza 250 °C.
3. Utrzymuj temperaturę źródła jonów na poziomie 230 °C i temperaturę kwadrupolową na 150 °C. Zaprogramuj piekarnik z 60 °C (2 minuty) do 180 °C przy 10 °C/min, a następnie do 280 °C przy 5 °C/min z końcowym utrzymaniem przez 10 minut.
4. Wstrzyknij 1 μL filtrowanego ekstraktu w trybie splitu (10:1) i rejestruj chromatogramy w zakresie m/z od 40 do 600. Przed wstrzyknięciem próbki przeprowadź rozpuszczalnik w pustym kształcie.
5. Identyfikacja związków, porównując widma z biblioteką spektralną NIST i potwierdzanie tożsamości za pomocą czasu retencji oraz normalizacji powierzchni szczytów.

5. Działanie przeciwzapalne (obrzęk łapy wywołany karagenanem)

1. Używaj zdrowych albinosów Wistar o wadze 180–220 g i aklimatyzuj się przez 7 dni. Szybkie zwierzęta przez noc przed eksperymentem z darmowym dostępem do wody.
2. Losowo podziel zwierzęta na pięć grup (n = 5 na grupę). Podawanie normalnej soli fizjologicznej kontrolom; doustnie podawać 100, 200 i 300 mg/kg grupom leczonym; oraz podawanie diklofenaku sodu (40 mg/kg, podskórnie) do grupy standardowej.
3. Po 1 godzinie wstrzyknij 0,1 mL świeżo przygotowanego 1% karagenanu do podpodeszwowej części prawej tylnej łapy.
4. Zmierz grubość łapy w wysokości 0, 1, 2, 3 i 4 godzin za pomocą cyfrowego zacisku werniera i oblicz wzrost względem poziomu wyjściowego.
5. Określić procentowy poziom hamowania obrzęku w porównaniu z grupą kontrolną¹⁰.
   UWAGA: Proszek karagenanu może powodować podrażnienia. Unikaj wdychania i kontaktu ze skórą oraz utylizuj odpady biologiczne zgodnie z procedurami instytucjonalnego biobezpieczeństwa.

6. Aktywność analgetyczna (test zanurzenia ogona)

1. Używaj aklimatyzowanych szczurów Albino Wistar, utrzymywanych w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności z darmowym dostępem do jedzenia i wody.
2. Podziel zwierzęta na pięć grup (n = 5). Podawać wodę destylowaną kontrolnym, ekstrakcję doustnie w dawcach 100, 200 i 300 mg/kg grupom leczonym oraz paracetamol (20 mg/kg) grupie standardowej.
3. Utrzymuj kąpiel wodną na poziomie 55 ± 1 °C. Zanurz 1–2 cm ogona dystalnego i zapisz bazową latencję wycofania przy użyciu czasu odcięcia 15 sekund.
4. Powtarzaj pomiary po 30, 60, 90 i 120 minutach po zabiegu, upewniając się, że za każdym razem ta sama część ogona jest zanurzona.
5. Oblicz procentowy wzrost opóźnień i wyraź wyniki jako średnią ± SD.

7. Działanie przeciwpiretyczne

1. Używaj zaaklimatyzowanych szczurów i mierz normalną temperaturę odbytu za pomocą nawilżonego termometru cyfrowego.
2. Przygotuj 20% zawiesiny drożdży piwowarskich w wodzie destylowanej i wstrzyknij podskórnie w ilości 10 mL/kg do grzbietu, aby wywołać gorączkę.
3. Po 18 godzinach ponownie zmierz temperaturę odbytu i wyklucz zwierzęta, które nie wykazują wzrostu co najmniej 0,5 °C.
4. Losowo dziel gorączkowe szczury na pięć grup (n = 5 na grupę). Podawaj prawidłową sól fizjologiczną grupie kontrolnej, ekstrakt roślinny doustnie w dawce 100, 200 i 300 mg/kg grupom leczonym oraz paracetamol (150 mg/kg) grupie standardowej.
5. Zmierz temperaturę odbytu w 0, 1, 2 i 3 godzinach po leczeniu i oblicz obniżenie względem poziomu^{wyjściowego 11}.
   UWAGA: Zawiesiny drożdżowe piwowarskie to materiały biologiczne i należy je obchodzić z zastosowaniem standardowych środków ostrożności biologicznej. Utylizować niewykorzystane zawiesina i zanieczyszczone materiały jako odpady biologiczne.
   UWAGA: Po podaniu drożdży zwierzęta mogą być ponownie umieszczone w klatkach i utrzymywane w standardowych warunkach do czasu pomiaru temperatury.

8. Badania toksyczności ostrej

1. Przeprowadz badanie zgodnie z wytycznymi 423 Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD), wykorzystując zdrowe albinosy szczury Wistar obu płci o wadze 180–220 g.
2. Zwierzęta szybkie przez noc przed dawkowaniem i losowo dzielą je na grupy (n = 5 na grupę).
3. Podaj pojedynczą doustną dawkę 5 g/kg ekstraktu zwierzętom leczonemu oraz wodę destylowaną (1 mL/kg) zwierzętom kontrolnym.
4. Obserwuj zwierzęta nieprzerwanie przez pierwsze 4 godziny po podaniu, okresowo przez pierwsze 24 godziny i codziennie przez 14 dni.
   UWAGA: Kryteria obserwacji obejmują zmiany w stanie skóry i sierści, oczach i błonach śluzowych, wzorzec oddechu, ślinienie, drżenia, drgawki, aktywność lokomotoryczną oraz ogólne reakcje behawioralne.
5. Rejestruj kliniczne objawy toksyczności, śmiertelności i masy ciała w dniu 0, 7 i 14.
6. Ocena bezpieczeństwa na podstawie wskaźnika przeżycia oraz zaobserwowanych zmian behawioralnych lub fizycznych¹².
   UWAGA: Ocena behawioralna obejmuje monitorowanie postawy, chodu, poziomu aktywności, zachowań związanych z pielęgnacją, reakcji na bodźce zewnętrzne oraz oznak ospałości lub nadpobudliwości.

9. Analiza statystyczna

1. Zebrać wszystkie dane eksperymentalne i wyrazić wyniki jako średnią ± odchylenia standardowego, gdzie n = 5 zwierząt w grupie.
2. Wprowadź dane do oprogramowania GraphPad Prism w formacie kolumnowym.
3. Oceń normalność danych za pomocą testu Shapiro–Wilk przed zastosowaniem analizy porównawczej.
4. Wykonaj analizę statystyczną za pomocą oprogramowania GraphPad Prism, wybierając: Analizuj → jednokierunkowe porównania ANOVA → Tukey.
5. Wykonaj jednokierunkową analizę wariancji, a następnie test wielokrotnych porównań pośrednich Tukey'a, aby określić istotność statystyczną między grupami.
6. Rozważ różnice statystycznie istotne przy p < 0,05.

Wyniki

Opisane w badaniu eksperymentalne podejścia dostarczyły powtarzalnych danych in vitro i in vivo, które umożliwiły ocenę zarówno składu fitochemicznego, jak i aktywności farmakologicznego ekstraktu metanolicznego T. mantaly. Wszystkie pomiary eksperymentalne były wykonywane w replikach, a wyniki prezentowane są jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Istotność statystyczna między grupami była określana za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya, przy czym p < 0,05 uznano za istotne...

Dyskusja

W tym badaniu zastosowano kombinację charakterystyki fitochemicznej oraz ustalonych modeli farmakologicznych in vivo, aby ocenić potencjał przeciwzapalny, przeciwbólowy i przeciwpiretyczny ekstraktu metanolowego T. mantaly. Stosowane modele eksperymentalne są szeroko stosowane w badaniach nad produktami naturalnymi i stanowią praktyczne ramy do wstępnej oceny aktywności biologicznej.

Powtarzalne czasy retencji związków wspierają złożoność chemiczną ekstraktu i stanowią podstawę do dal...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albinosowe szczury Wistar	Instytucjonalny dom dla zwierząt	Nie ma	Zwierzęta doświadczalne
Chlorek glinu	Sigma-Aldrich	237051	Badanie flawonoidowe
Brewer' Drożdże	Sigma-Aldrich	YSC2	Indukcja w Pyrexji
Carrageenan	Sigma-Aldrich	C1013	Indukcja obrzęku łapy
Wirówka	Eppendorf	5810R	Przetwarzanie próbek
Diklofenak sodowy	Sigma-Aldrich	D6899	Standard przeciwzapalny
Cyfrowy termometr odbytniczy	Omron	MC-246	Pomiar temperatury odbytniczej
Cyfrowy zacisk wernier	Mitutoyo	500-196-30	Pomiar grubości łapy
Woda destylowana	Wewnątrz	Nie ma	Rozpuszczalnik
Folin– Odczynnik Ciocalteu	Sigma-Aldrich	F9252	Test fenolowy
Kwas galowy	Sigma-Aldrich	G7384	Standard fenolowy
System GC–MS	Agilent Technologies	7890B– 5977A	Profilowanie fitochemiczne
GraphPad Prism	Oprogramowanie GraphPad	Wersja 8.0	Oprogramowanie do analizy statystycznej
Metanol (klasa HPLC)	Merck	106009	Rozpuszczalnik ekstrakcyjny
Igła do doustnej głąbki	Instech	FTP-20-38	Administracja ustna
Paracetamol	Sigma-Aldrich	P0300000	Standard analgetyczny i przeciwpiretyczny
Octan potasu	Merck	104820	Badanie flawonoidowe
Rotacyjny parownik	Bü chi	R-200	Stężenie ekstraktu
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143	Standard flawonoidów
Węglan sodu	Merck	106392	Test fenolowy
UV– Spektrofotometr widzialny	Shimadzu	UV-1800	Pomiar absorpcji
Kąpiel wodna (termostatyczna)	Memmert	WNB14	Test zanurzenia w ogon