Artykuł metodologiczny

Model miażdżycy u myszy wywołany zarówno częściową ligacją szyjną, jak i nadekspresją PCSK9

548 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69862

⸱

27 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Department of Pathophysiology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Qinghai Cardio-Cerebrovascular Specialty Hospital, Qinghai High Altitude Medical Research Institute, 4Research Center of High Altitude Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Powtarzalny model myszy indukuje miażdżycę szyjną poprzez połączenie hipercholesterolemii pośredniczonej przez dietę PCSK9-ADENO-powiązaną z dietą PCSK9-AAV oraz częściowej podwiązaniem lewej szyi szyjnej (PCL), co odzwierciedla ludzką patofizjologię. Umożliwia to szybkie indukcje podobnych do ludzkich zmian miażdżycy szyjnej u myszy typu dzikiego bez edycji genomowej, zapewniając standaryzowane narzędzie ułatwiające badania nad miażdżycą szyjną.

Streszczenie

Brak szybkich, powtarzalnych modeli miażdżycy specyficznych dla szyjnych u myszy typu dzikiego ogranicza badania translacyjne biologii blaszek i terapii. Protokół ten opisuje niegenomowo edytowaną, czasowo efektywną metodę indukowania powtarzalnej miażdżycy szyjnej u myszy C57BL/6 poprzez połączenie nadekspresji PCSK9 powiązanej z adenowirusem (AAV), aterogenicznej diety wysokotłuszczowej oraz częściowej liżacji szyjnej lewej szyi (PCL). Celem jest zapewnienie ustandaryzowanego przepływu pracy, który odtwarza kluczowe cechy patofizjologiczne choroby szyjnej u człowieka – hiperlipidemię oraz zaburzenia przepływu – bez konieczności stosowania zwierząt modyfikowanych genetycznie. Metody obejmują dawkowanie i podawanie PCSK9-AAV, przygotowanie okołooperacyjne, krok-po-kroku chirurgiczną ligację lewej szyjnej szyjki, opiekę pooperacyjną, dietę, pobieranie tkanek oraz ocenę histologiczną, w tym barwienie Oil Red O i Verhoeff-Van Gieson. Wyniki wskazują na podwyższony poziom cholesterolu krążącego oraz poziom lipoproteiny o niskiej gęstości w porównaniu z wartościami referencyjnymi. Wyraźne miażdżyce nazębne rozwijają się w lewej podwiązanej tętnicy szyjnej, z istotnym zwiększonym nagromadzeniem lipidów oraz znacznym pogrubieniem ośrodka głębokiego tętnicy w porównaniu do prawej tętnicy kontrolnej bez podwiązania. Ten standaryzowany protokół poprawia powtarzalność i dostępność dla badaczy badających powstawanie, postęp płytki szyjnej, strategie interwencji oraz ułatwia porównania terapii eksperymentalnych w laboratorium.

Wprowadzenie

Choroby sercowo-naczyniowe (CVD) pozostają główną przyczyną globalnej śmiertelności, a miażdżyca stanowi ich wspólną patologiczną podstawę1. Tętnica szyjna jest kluczowym miejscem dla zmian miażdżycowych; Badanie miażdżycy szyjnej jest kluczowe dla zrozumienia patogenezy chorób układu krążenia i opracowania strategii terapeutycznych2. Modele zwierzęce są niezbędnymi narzędziami badań nad miażdżycą in vivo , jednak istniejące modele często mają ograniczenia pod względem wygody i zdolności do odtwarzania cech patofizjologicznych człowieka.

W porównaniu z miażdżycą w innych miejscach tętnicowych (np. aorta, tętnica udowa), powstawanie miażdżycy szyjnej jest silniej zależne od hemodynamiki. Tętnica szyjna doświadcza wysokiego naprężenia ścinającego (10-15 dyn/cm², dyny na centymetr kwadratowy), co ustępuje jedynie tętnicy wieńcowej (6-45 dyn/cm²)3. Szczególnie w miejscu bifurkacji tętnicy szyjnej występuje przepływ wirowy, który charakteryzuje się zakłóconym, oscylacyjnym naprężeniem ścinającym ścinaniem. To nieprawidłowe środowisko hemodynamiczne wywołuje długotrwałą prozapalną aktywację lokalnych komórek śródbłonka, charakteryzującą się zwiększoną ekspresją cząsteczek adhezji i chemokinami ułatwiającymi rekrutację monocytów oraz rozpoczęcie miażdżycy3. Dodatkowo, wysokiego ryzyka zmiany miażdżycy szyjnej u człowieka często wykazują stopień zwężenia przekraczający 70%, co definiuje się jako procentowe zmniejszenie średnicy promieniowania światła spowodowane przez blaszek4. Dlatego ważne są modele zwierzęce zdolne do wywołania ciężkiej miażdżycy zwężenia.

Model częściowej ligacji szyi szyjnej (PCL) to model miażdżycy wywołany przez utrzymujące się zaburzenia przepływu krwi, który ma zalety w postaci krótkiego czasu modelowania i ciężkich zmian5. Apolipoproteina E (ApoE) jest kluczowym białkiem zaangażowanym w metabolizm i oczyszczanie krążącego cholesterolu oraz lipoproteinów bogatych w trójglicerydy, odgrywając kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy lipidów w osoczu. Jednak tradycyjny model PCL z myszami ApoE-knockout (ApoE⁻/⁻) jest trudny i kosztowny do stworzenia5. Gdy wymagany jest knockout genu docelowego, konieczny jest knockout podwójnego genu (zarówno genu docelowego, jak i genu ApoE), co dodatkowo komplikuje proces modelowania. Dla porównania, gdy do PCL stosuje się wyłącznie dzikie myszy typu C57BL/6, model nie wykazuje hipercholesterolemii, kluczowego czynnika ryzyka miażdżycy u człowieka, i rzadko tworzy wyraźne, bogate w lipidy zmiany miażdżycowe 6,7. Inne modele, takie jak myszy ApoE⁻/⁻ lub LDLR-knockout (LDLR⁻/⁻) karmione dietą wysokotłuszczową (HFD), są szeroko wykorzystywane w badaniach nad miażdżycą do badania miażdżycy aorty. Niemniej jednak modele te nie uwzględniają efektu zaburzonego przepływu krwi i nie mogą w krótkim czasie rozwinąć ciężkiej miażdżycy. Wcześniejsze badania wykazały, że po 3 miesiącach karmienia HFD myszy ApoE⁻/⁻ lub LDLR⁻/⁻ rozwijają jedynie łagodne płytki miażdżycowe w rejonach tętnic aortalnych lub ramienionowogłowych, podczas gdy w tętnicach szyjnych nie powstają widoczne uszkodzenia (8,9).

Proproteinowa konwertaza subtilizyna/keksina typu 9 (PCSK9) jest kluczowym regulatorem metabolizmu niskiej gęstości cholesterolu lipoproteinowego (LDL-C): sprzyja degradacji receptorów LDL, a tym samym zwiększa poziom LDL-C w surowicy10. Rekombinowany wirus adeno-adekrowersyjny ekspresujący PCSK9 (PCSK9-AAV) umożliwia kontrolowalną dawkę hipercholesterolemię u myszy WT bez konieczności modyfikacji genetycznych11. Połączenie hipercholesterolemii wywołanej PCSK9-AAV, HFD (która dodatkowo pogarsza zaburzenia metabolizmu lipidów) oraz PCL (wywołującej lokalne zaburzenia hemodynamiczne) pozwala na stworzenie modelu zwierzęcego uwzględniającego dwa kluczowe czynniki ryzyka miażdżycy u ludzi: hipercholesterolemię i zaburzenia przepływu.

Opierając się na wcześniejszych postępachbadawczych 12, protokół ten ustanawia ustandaryzowaną metodę wywoływania miażdżycy szyjnej u myszy C57BL/6. W porównaniu z istniejącymi protokołami modelowymi oferuje trzy kluczowe zalety: (1) Znaczenie patofizjologiczne: jednocześnie odtwarza hipercholesterolemię i zaburzenia przepływu, skutkując zmianami szyjnymi o cechach podobnych do miażdżycy w średnim i późnym stadium; (2) Powtarzalność: szczegółowa parametryzacja dawki AAV, procedur chirurgicznych i kontroli dietetycznej zmniejsza zmienność między laboratoriami; (3) Terminowość: Całkowity okres modelowania wynosi 5 tygodni, co znacznie skraca czas potrzebny na utworzenie modelu.

Protokół ten jest odpowiedni dla badaczy zajmujących się biologią ścian naczyniowych, oceniającymi skuteczność leków przeciwmiażdżycowych oraz badającym interakcje między hemodynamiką a metabolizmem lipidów w miażdżycy. Co istotne, protokół ten jest modelem skoncentrowanym na szyi szyjnej, który nie jest w stanie w pełni odtworzyć wszystkich aspektów ogólnoustrojowych czynników ryzyka miażdżycy u ludzi, w tym między innymi palenia palenia, cukrzycy, nadciśnienia i otyłości. Poniżej znajduje się krok po kroku przewodnik dotyczący ustanowienia modelu i oceny zmian.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Komitetu Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach w Peking Union Medical College (ACUC-A02-2024-006) i są zgodne z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie eksperymentalnych zwierząt

  1. Kup samce myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni (masa ciała: 22-25 g).
  2. Myszy domowe w specyficznym środowisku wolnym od patogenów (SPF) w ściśle kontrolowanych warunkach: temperatura (23 ± 1°C), wilgotność (50 ± 5%) oraz 12-godzinny cykl światła/ciemności (oświetlenie: 07:00-19:00).
  3. Przed eksperymentem zapewnij myszom standardową dietę chow (10% tłuszczu energetycznego) oraz sterylną wodę, z darmowym dostępem do jedzenia i wody, przez tydzień aklimatyzacji.

2. Przygotowanie i zarządzanie PCSK9 - AAV

UWAGA: Traktuj AAV jako zagrożenie dla bezpieczeństwa biologicznego i przekonuj wszystkie procedury zgodnie z odpowiednim poziomem bezpieczeństwa biologicznego instytucjonalnego (zazwyczaj BSL-2). Noś podwójne rękawiczki, ochronę oczu i odzież ochronną. Unikaj generowania aerozoli podczas manipulacji. Dekontaminuj materiały zanieczyszczone AAV odpowiednimi środkami dezynfekującymi (np. wybielacz 10%) i stosuj się do jasno określonych protokołów odpowiedzialności i reagowania na incydenty. Wszystkie odpady skażone wirusami muszą być inaktywowane przez zanurzenie w środkach dezynfekujących zawierających chlor.

  1. Zakup rekombinowanego PCSK9-AAV (rAAV8-HCRApoE/hAAT-D377Y-mPCSK9).
  2. Zweryfikować miano AAV za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym skierowanego do promotora CMV: ostateczne miano wynosiło 6,10×10¹³ vg/mL (genomy wektora na mililitr). Przechowuj AAV w temperaturze -80°C i unikaj powtarzających się cykli zamrożenia i rozmrażania (≤3 cykle zamarzania-rozmrażania).
  3. Rozmraź AAV na lodzie przez 15-20 minut, a następnie delikatnie odwróć rurkę wirówki 3-5 razy, aby wymieszać (unikaj wirowania).
  4. Rozcieńcz PCSK9-AAV sterylną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) do końcowego stężenia 2×10¹¹ vg/200 μL na mysz.
  5. Podaj przez zastrzyk do żyły ogonowej (dożylnie): Napraw mysz za pomocą uchwytu na wstrzyk do ogona myszy z wizualizacją żył i powoli wstrzykuj 200 μL rozcieńczonego AAV za pomocą strzykawki insulinowej (szybkość wstrzyknięcia: 10 μL/s). Czas podawania iniekcji to tydzień przed PCL (rysunek 1A).

3. Przygotowanie przedoperacyjne do częściowej podwiązania szyi

UWAGA: Tribrometanol to kontrolowany odczynnik z ryzykiem przedawkowania. Podawaj ściśle według masy ciała, unikaj powtarzających się zastrzyków i dokładnie dokumentuj czas oraz objętość dawkowania. Przechowuj je w zamkniętym pojemniku i upewnij się, że przygotowanie i użycie wykonuje wyłącznie wykwalifikowany personel. W przypadku podejrzenia przedawkowania rozpocznij zarządzanie kryzysowe i udokumentuj incydent.

  1. Znieczulaj myszy poprzez podanie tribrometanolu dootrzewnowego (2,5% Avertin, 0,18 mL/10 g) do czasu utraty odruchu prostowania (około 2-3 minuty). Następnie przełóż mysz na termofor (37 ± 0,5°C). Sprawdź działanie znieczulające, szczypiąc palce.
    UWAGA: Znieczulenie jest kluczowe dla udanej operacji. Aby zminimalizować ryzyko znieczulenia, należy unikać wielokrotnych zastrzyków znieczulających. Przed rozpoczęciem operacji dawka znieczulenia powinna być ustalana na podstawie przewidywanego czasu trwania operacji. Dodatkowo, zaleca się czas operacji dla każdej myszy <30 minut, aby zminimalizować ryzyko związane z przedłużonymi zabiegami.
  2. Podczas operacji sprawdź tętniące oddechy myszy (normalne: 40-60 oddechów na minutę) oraz odruch podeszwowy, delikatnie szczypiąc tylną poduszkę łapy kleszczami co 5 minut.
  3. Dokładnie nałóż krem depilacyjny na przednią skórę szyjki myszy. Po 2-3 minutach usuń przednie włosy szyjne patyczkami i wyczyść pozostałe włosy solą fizjologiczną. Dezynfekuj odsłoniętą skórę 5% povidon-jod trzy razy.
  4. Przeprowadz operację w szafce bioasepcyjnej w aseptycznej pomieszczeniu z myszami. Sterylizuj przestrzeń operacyjną światłem ultrafioletowym, aby jak najlepiej utrzymać asepsę, i autoklawuj wszystkie metalowe narzędzia.
    UWAGA: Środowisko aseptyczne i dokładna dezynfekcja są niezbędne dla zapewnienia przeżycia po operacji i stabilności fizjologicznej myszy.

4. Częściowe podwiązanie szyi – zabieg chirurgiczny

  1. Wykonaj nacięcie środkowe (około 1,0-1,5 cm długości) na szyi myszy sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi; oddzielenie tkanek podskórnych i mięśnia mostkowo-poduszko-stoidowego za pomocą tępych kleszczy, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną wspólną (LCCA).
    UWAGA: Obszar operacyjny powinien być stale nawilżony podgrzaną solą fizjologiczną, aby zapobiec dalszym urazom spowodowanym wysychaniem naczyniowym/tkankowym.
  2. Bezpośrednio oddziel LCCA od nerwu błędnego (znajdującego się obok tętnice), aby uniknąć uszkodzenia nerwu błędnego (co może powodować depresję oddechową).
  3. Rozcinać w górę wzdłuż LCCA, odsłaniając tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA), tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), tętnicę potyliczną (OA) oraz tętnicę tarczycową górną (STA) (Rysunek 1B).
  4. Użyj szwów 6-0 sterylnych z jedwabiu, aby podwiążyć lewą zewnętrzną tętnicę szyjną powyżej STA. Następnie użyj kolejnego sterylnego jedwabnego szwu 6-0, aby jednocześnie podwiązać korzenie ICA i OA.
    UWAGA: Unikaj podwiązywania nerwów i innych otaczających tkanek. Całkowicie zablokować przepływ zastawkowy ECA/ICA/OA, zachowując pewien stopień przepływu wstecznego w LCCA. Efekt podwiązywania należy ocenić poprzez obserwację stanu krwawienia/przepływu krwi oraz pulsacji tętnicy dystalnej.
  5. Sprawdź krwawienie w miejscu operacji. Jeśli pojawi się krwawienie, delikatnie dociskaj sterylnymi patyczkami przez 30-60 sekund, aby osiągnąć hemostazę. Zszyj skórę klejem tkankowym lub szwem chirurgicznym.
    UWAGA: Unikaj nadmiernego przenikania kleju tkankowego do tkanki podskórnej.

5. Opieka po częściowej podwiązaniu szyi i interwencja diety wysokotłuszczowej

  1. Podaj 0,5 mL ciepłej soli fizjologicznej za pomocą zastrzyku dootrzewnego, aby uzupełnić płyn po operacji.
  2. Złagodzić ból poprzez podskórne zastrzyki meloksykamu (0,1 mg/kg) bezpośrednio po operacji i 12 godzin po zabiegu.
  3. Umieść mysz w podgrzewanej klatce regeneracyjnej (37°C), aż odruch powrotu do pozycji piersiowej zostanie przywrócony (około 15-30 minut). Monitoruj mysz pod kątem nieprawidłowych zachowań (np. ospałości, duszności) w ciągu 24 godzin po operacji.
  4. Podawaj antybiotyki zapobiegające infekcji po operacji, zgodnie z zaleceniami weterynarzy, takie jak woda pitna zawierająca antybiotyki przez 7 dni po operacji.
  5. Karmić zachodnim HFD (z 40% stosunkiem energii tłuszczu i 1,25% cholesterolu) do oceny zmiany (4 tygodnie po operacji).
    UWAGA: Przechowuj HFD w temperaturze 4°C, aby zapobiec utlenianiu tłuszczu i użyj go w ciągu 2 tygodni od otwarcia. Wymieniaj HFD co 2 dni, aby zapewnić świeżość i codziennie monitoruj spożycie pożywienia myszy (normalne spożycie: około 4-5 g na mysz dziennie). Synchronizacja karmienia HFD z hipercholesterolemią wywołaną PCSK9-AAV maksymalizuje odkładanie lipidów w tętnicy szyjnej; opóźnienie rozpoczęcia HFD zmniejszy nasilenie zmiany.

6. Zbieranie próbek i przetwarzanie

UWAGA: Paraformaldehyd emituje toksyczne opary. Przygotowanie, użycie i usunięcie muszą odbywać się w okapie chemicznym, przy użyciu odpowiedniej ochrony osobistej (rękawiczki, gogle ochronne i fartuch laboratoryjny). Utylizacja odpadów stosując ustalone procedury neutralizacji i zbierania odpadów chemicznych. Utrwalacze powinny być neutralizowane i centralnie zbierane zgodnie z instytucjonalnymi protokołami utylizacji ciekłych odpadów.

UWAGA: Ludzkie próbki miażdżycy szyjnej w tym badaniu pozyskano od pacjentów ze stenozą tętnicy szyjnej, którzy przeszli endarterektomię szyjnej. Badanie to jest zgodne z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Instytucjonalnej Szpitala Medycznego Kolegium Pekińskiego (PUMCH) (nr JS-2966). Wszyscy uczestnicy badania wyrazili pisemną świadomą zgodę.

  1. 4 tygodnie po operacji znieczulać myszy poprzez podanie tribrometanolu dootrzewnowego.
  2. Wykonaj obustronną torakotomię u znieczulonych myszy i nakłuj serce, aby pobrać próbki krwi do badań lipidów. Następnie przepłucz lewą komorę 20 mL lodowatego PBS, aby usunąć resztki krwi z naczyń krwionośnych w tempie 3-6 mL/min. Obserwuj zmiany koloru tkanek jako wizualny wskaźnik zakończenia perfuzji.
    UWAGA: Jeśli są to dozwolone przez etykę instytucjonalną/regulacje, można stosować alternatywne metody, jeśli są jasno określone i wykonywane zgodnie z wymaganiami lokalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Zwłoki zwierząt muszą zostać spalone przez zespół weterynaryjny instytucjonalny lub upoważnionych wykonawców zgodnie z przepisami dotyczącymi odpadów biologicznych lub przetworzone zgodnie z zatwierdzonymi procedurami utylizacji zagrożeń biologicznych.
  3. Rozcinamy i pobieram tętnice szyjne razem z sercem, izoluję obustronną tętnicę szyjną pod mikroskopem i mocuję ją w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4°C przez 24 godziny.
  4. Przenieś usztywnioną tętnicę szyjną do roztworu 30% sacharozy (rozpuszczonej w PBS) i inkubuj w temperaturze 4°C przez 24 godziny (aż tkanka zapadnie). Umieść tętnicę w stosunku o wysokiej temperaturze cięcia (OCT) i przechowuj w temperaturze -80°C.
  5. Użyj kriostatu do wycięcia przekroju poprzecznych lewej tętnicy szyjnej o grubości 5 μm (lokalizacja przekroju: 1 mm blisko miejsca podwiązania; temperatura cięcia: -20°C ~ -22°C, precyzyjne dostosowanie w zależności od zawartości wody w tkankach). Za pomocą schłodzonej, drobnej pędzli delikatnie przenieś fragment na płytę antytoczną kriostatu, aby leżała płasko. Trzymaj szkieł pokryty poli-L-lizyną pod kątem niemal pionowym i powoli zbliżaj go do przekroju.
    UWAGA: Etap perfuzji jest kluczowy dla usunięcia pozostałej krwi; w przeciwnym razie przeszkodzi to w powstawaniu zmian po zmianach. Całkowite utrwalenie tętnic w ciągu 30 minut po eutanazji, aby zachować morfologię tkanek.

7. Ocena zmiany miażdżycowej 1 - Zabarwienie olejowo-czerwonego O

  1. suszyć sekcje na powietrzu w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przez 30 minut; Mocz w 60% izopropanolu przez 1 minutę, a następnie inkubuj w roztworze roboczym Oil Red O (rozcieńczonym 3:2 z 60% izopropanolem) w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przez 10 minut.
  2. Rozróżnić je, całkowicie zanurząc szkiełko w 60% izopropanolu w temperaturze pokojowej przez ~5-10 sekund, delikatnie mieszając w celu usunięcia niewiązanego barwnika; barwienie hematoksyliną przez 30 sekund; Przepłukaj wodą z kranu przez 5 sekund (aby zasinieć jądra komórek).
  3. Rejestrowanie obrazów przekrojów za pomocą skanera slajdowego lub mikroskopu optycznego z powiększeniem 5x, 10x i 20x; ilościowo analizuj powierzchnię osadzania lipidów za pomocą oprogramowania ImageJ (wersja 1.54p) – oblicz procent powierzchni Oil Red O-dodatniej względem całkowitej powierzchni intymalnej.
  4. Procedury ilościowej Obrazu J
    1. Otwórz obraz; wybierz narzędzie Freehand Selection , aby ręcznie zaznaczyć obszar intima-media. Przejdź do Narzędzia Analizy > > Menedżerze ROI i kliknij Dodaj (Dodaj).
    2. Przejdź do obrazu > dostos>uj próg kolorów; dostosuj parametry odcienia i jasności tak, aby pasowały do obszarów olejowo-czerwonych O-dodatnich. Kliknij Zaznacz, a następnie Dodaj do Menedżera ROI.
    3. Wybierz zarówno ROI intima-media, jak i ROI barwionego, kliknij I , aby uzyskać obszar olejowo-czerwony O-dodatni w obszarze intima-media.
    4. Kliknij Dodaj i zmierz, aby obliczyć powierzchnie obszarów intima-media i Oil Red O-dodatnie.
    5. Wzór obliczeniowy:
      Obszar Oil Red O (%) = (Oil Red O_positive_area / intimal_media_area) × 100

8. Ocena zmian miażdżycy 2 - barwienie Van Giesona Verhoeffa

  1. Pobierz zamrożone przekroje OCT z osadzonymi w złożu na slajdach.
  2. Zanurz preparaty w wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej (20-25°C) przez 10-15 minut z delikatnym mieszaniem (2-3 razy), aby całkowicie rozpuścić związek OCT.
  3. Wyrzuć wodę zawierającą związek OCT, a następnie przepłucz fragmenty świeżą wodą destylowaną przez 2 minuty, aby wyeliminować pozostałości związku OCT.
  4. Inkubuj przekroje w barwniku Verhoeffa (zawierającym hematoksylinę, jod i chlorek żelaza) w temperaturze pokojowej (20-25°C) przez 15 minut, delikatnie potrząsając stojakiem szkiełek 2-3 razy podczas inkubacji, aby zapewnić równomierne barwienie.
  5. Szybko przepłucz fragmenty wodą destylowaną dwa razy, po 10 sekund za każdym razem.
  6. Różnicować w roztworze chlorku żelaza 2% przez 30-60 sekund; obserwuj pod mikroskopem, aż włókna elastyczne będą wyglądać na niebiesko-czarne, a tło na szare. Płukaj wodą destylowaną dwa razy, za każdym razem po 1 minutę.
  7. Preparaty należy traktować 5% roztworem tiosiarczanu sodu przez 1-2 minuty, aby usunąć jod pozostałości.
  8. Przepłukuj wodą destylowaną przez 2 minuty, potem nałóż barwię Van Gieson (kwas fuchsin + kwas pikrinowy) przez 5 minut, aby włókna kolagenowe zabarwić na jaskrawoczerwo.
  9. Stopniowo odwodnić w 95% etanolu (dwa razy, po 1 minutę) i 100% etanolu (dwa razy, po 1 minutę); przezroczysty w ksylenie przez 5 minut; Sekcje były pokrywane za pomocą syntetycznego żywicznego medium mocujących.
  10. Uchwyćcie zdjęcia sekcji; Użyj oprogramowania do analizy obrazów cyfrowych, aby zmierzyć grubość ośrodka intimnego lub grubość intymnej blaszek w czterech kierunkach (przedni, tylny, lewy, prawy) za pomocą narzędzia do pomiaru długości, a następnie oblicz średnią wartość.
    1. Otwórz slajd, przybliż przekrój celowego statku i kliknij Narzędzie pomiarowe.
    2. Kliknij wewnętrzną część intima i zewnętrzne krawędzie intim/media w kierunku przednim, tylnym, lewym i prawym kolejno i zapisz cztery wartości grubości.
    3. Oblicz średnią wartość i zapisz pomiary.
      Średnia wartość = (przedni + tylny + lewy + prawy) ÷ 4

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki barwienia olejowo-czerwonego O wykazały, że podwiązane tętnice wykazywały silne tworzenie blaszek miażdżycowych, widoczne rdzenie lipidowe oraz martwicze obszary. Udział obszarów lipidowych był istotnie wyższy w lewej tętnicy szyjnej niż w kontrolnej tętnicy prawej (s. < 0,001) (Rysunek 2A). Barwienie VVG wykazało zniszczenie lub zniknięcie włókien elastycznych w części intymnej, a także znaczne pogrubienie płytki intymnej. Zarówno grubość środka intimnego (IMT), jak i grubość intymna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje standaryzowaną metodę ustanowienia modelu miażdżycy szyjnej u myszy C57BL/6 poprzez połączenie hipercholesterolemii wywołanej PCSK9-AAV, diety wysokotłuszczowej (HFD) oraz częściowej ligacji tętnicy szyjnej (PCL).

W porównaniu z tradycyjnymi modelami, takimi jak ApoE -/- lub LDLR-/- czy modelami PCL wykorzystującymi mysz WT5, ten model oferuje unikalne zalety w badaniach nad miażdżycą. Najpierw myszom podaje się PCSK9-AAV i karmi H...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te otrzymały dofinansowanie od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82470516 8227022021), Specjalnego Funduszu Badawczego dla Uniwersytetów Centralnych, Pekińskiego Unii Medycznego (3332025111), Krajowego Funduszu Badań Klinicznych Szpitali Wysokiego Szczebla (2025-PUMCH-A-181, 2025-PUMCH-D-001) oraz Fundacji Nauk Przyrodniczych prowincji Syczuan (2024NSFC0715).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylny szew nylonowy 6-0Jinhuan MedicalF602NA
Myszy C57BL/6Shanghai Model Organisms Center, Inc. (SMOC)SM-001NA
Chow deitXietong BioNie. XT93GNA
Kriostat  Leica  CM1950NA
Krem do depilacjiVeetRB Health LLCNA
Dieta wysokotłuszczowaXietong BioXT108cNA
OCTSakura4582NA
Roztwór Oil Red OServiceBio G1017-100mLNA
Mikroskop optycznyLeicaDM4BNA
Paraformaldehyd  Servicebio G1101-500mLNA
PCSK9-AAVWZBioscience AV208001-AV8NA
Szkiełki powlekane poli-L-lizynąSigmaP0425NA
Skaner slajdów3DHISTECHSKAN PanoramicNA
SulfametoksazolSelleckS1915 NA
Klej tkankowy3M Vetbond1469SBNA
Uchwyt do wtrysku do ogona myszy wizualizujący żyły Jinan Yiyan Nauka i Nauka Technology Development Co., LtdYLS-Q9GNA

Bibliografia

  1. Vaduganathan, M., Mensah, G. A., Turco, J. V., Fuster, V., Roth, G. A. The global burden of cardiovascular diseases and risk: A compass for future health. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2361-2371 (2022).
  2. Saba, L., et al. Carotid artery atherosclerosis: Mechanisms of instability and clinical implications. Eur Heart J. 46 (10), 904-921 (2025).
  3. Soehnlein, O., Lutgens, E., Döring, Y. Distinct inflammatory pathways shape atherosclerosis in different vascular beds. Eur Heart J. 46 (33), 3261-3272 (2025).
  4. Aburahma, A. F., et al. Society for vascular surgery clinical practice guidelines for management of extracranial cerebrovascular disease. J Vasc Surg. 75 (1s), 4s-22s (2022).
  5. Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), e1861(2010).
  6. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
  7. Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), e66-e73 (2010).
  8. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. Apoe-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).
  9. Ma, Y., et al. Hyperlipidemia and atherosclerotic lesion development in ldlr-deficient mice on a long-term high-fat diet. PLoS One. 7 (4), e35835(2012).
  10. Maxwell, K. N., Fisher, E. A., Breslow, J. L. Overexpression of pcsk9 accelerates the degradation of the ldlr in a post-endoplasmic reticulum compartment. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (6), 2069-2074 (2005).
  11. Keeter, W. C., Carter, N. M., Nadler, J. L., Galkina, E. V. The aav-pcsk9 murine model of atherosclerosis and metabolic dysfunction. Eur Heart J Open. 2 (3), oeac028(2022).
  12. Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in c57bl6 mice by overexpressing aav-mediated pcsk9 and partial carotid ligation. Lab Invest. 97 (8), 935-945 (2017).
  13. Gogulamudi, V. R., Durrant, J. R., Adeyemo, A. O., Ho, H. M., Walker, A. E., Lesniewski, L. A. Advancing age increases the size and severity of spontaneous atheromas in mouse models of atherosclerosis. Geroscience. 45 (3), 1913-1931 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nadekspresja PCSK9dieta wysokot uszczowamyszy C57BL 6wirus towarzysz cy adenowirusomtworzenie blaszek mia d ycowychbarwienie Oil Red Obarwienie Verhoeffa Van Giesonahiperlipidemia

Powiązane artykuły