W niniejszym badaniu oceniono nowatorski test klonalności BCR/TCR oparty na NGS (OriMIRACLE LTM) do wykrywania MRD w nowotworach układu chłonnego, w tym w szpiczaku mnogim (MM). Z wykorzystaniem linii komórkowych oraz rozmazów klinicznych wykazano poziom detekcji >90% oraz zgodność z cytometrią przepływową na poziomie 81,36%. Test ten oferuje wysoką czułość, pozwala przewidzieć nawrót choroby i wspomaga podejmowanie decyzji terapeutycznych.
Artykuł badawczy
Testy klonalności z wykorzystaniem sekwencjonowania nowej generacji: walidacja kliniczna w monitorowaniu minimalnej choroby resztkowej w szpiczaku mnogim
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykrywanie minimalnej choroby resztkowej (MRD) ma kluczowe znaczenie w leczeniu nowotworów układu chłonnego. Niniejsze badanie przedstawia OriMIRACLE LTM, nowy test klonalności receptora komórek B (BCR) i receptora komórek T (TCR) oparty na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS) do wykrywania MRD. Przebadaliśmy ten test z wykorzystaniem linii komórkowych oraz próbek klinicznych, w tym rozmazów resztkowych, pobranych od pacjentów z szpiczakiem mnogim (MM). Test klonalności BCR/TCR wykazał ponad 90% dodatnią wskaźnikiem wykrywalności w nowotworach układu chłonnego. Badania walidacyjne u pacjentów z MM wykazały 81,36% (48/59) zgodności między wielokolorową cytometrią przepływową (MFC) a kliniczną oceną odpowiedzi w zakresie wykrywania komórek nowotworowych. Co istotne, u 61,11% (11/18) pacjentów z MM z dodatnim wynikiem MRD zarówno w NGS, jak i MFC, wystąpiła progresja choroby lub nawrót. Pacjenci, u których MRD wykryto wyłącznie za pomocą NGS, wykazywali niższe wskaźniki pełnej odpowiedzi klinicznej, a u niektórych pacjentów z MM, którzy początkowo odpowiedzieli na leczenie, nastąpił nawrót po jego zaprzestaniu. Wyniki te wskazują, że ten test oparty na NGS oferuje wysoką czułość i swoistość wykrywania MRD w nowotworach układu chłonnego, nawet w próbkach rozmazów resztkowych pochodzących od pacjentów z MM. Wykazuje on przewagę nad MFC i okazuje się wartościowy w monitorowaniu MRD. Podsumowując, obecne dowody wspierają zastosowanie NGS jako narzędzia uzupełniającego MFC, szczególnie u pacjentów MFC⁻/NGS⁺, ponieważ NGS umożliwia głębszą stratyfikację ryzyka. Niemniej jednak optymalny próg interwencji pozostaje do ustalenia w badaniach prospektywnych.
Wprowadzenie
szpiczak mnogi (MM) jest nowotworem hematologicznym charakteryzującym się proliferacją aberrantnych klonalnych plazmocytów w szpiku kostnym1. W Chinach w 2022 roku odnotowano około 22 450 nowych rozpoznań MM oraz 17 360 zgonów z nim związanych2. Mimo znaczących postępów w leczeniu MM w ciągu ostatniej dekady, które istotnie wydłużyły medianę przeżycia pacjentów, większość z nich ostatecznie doświadcza nawrotu choroby3,4. Ten gwałtowny wzrost podkreśla krytyczną potrzebę precyzyjnego monitorowania remisji, wczesnego przewidywania nawrotów oraz terminowego wdrażania interwencji terapeutycznych.
Dowody kliniczne jednoznacznie potwierdziły prognostyczne znaczenie statusu minimalnej choroby resztkowej (MRD) w nowotworach hematologicznych5,6,7. Uznając jej istotność, International Myeloma Working Group (IMWG) w 2016 roku włączyła ocenę MRD do swoich kryteriów oceny odpowiedzi na leczenie8. Obecne metody oceny MRD w szpiku kostnym obejmują reakcję łańcuchową polimerazy z użyciem oligonukleotydów swoistych dla allelu (ASO-PCR), cyfrową PCR (dPCR), multiparametryczną cytometrię przepływową (MFC) oraz testy sekwencjonowania nowej generacji (NGS)8. Chociaż ASO-PCR oferuje wysoką czułość wykrywania, jest metodą czasochłonną i trudną do standaryzacji ze względu na wymóg stosowania starterów swoistych dla każdego pacjenta9,10. Podobnie dPCR jest ograniczona przez swój specyficzny dla allelu projekt10,11. MFC odegrała istotną rolę w wykrywaniu MRD12, dostarczając szybkich informacji na poziomie komórkowym, jednak napotyka ona trudności w zakresie standaryzacji i powtarzalności.
NGS stanowi odtwarzalne i wysoce czułe podejście, które eliminuje konieczność stosowania starterów specyficznych dla danego pacjenta. Umożliwia ono wiarygodną identyfikację i kwantyfikację unikalnych rearanżacji immunoglobulin w nowotworach hematologicznych13. Food and Drug Administration (FDA) zatwierdziła system ClonoSEQ firmy Adaptive Biotechnologies do badania MRD u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL), MM oraz przewlekłą białaczką limfocytową (CLL)14,15,16. Liczne międzynarodowe wytyczne kliniczne zalecają obecnie NGS jako rekomendowaną metodę monitorowania MRD. Chińskie wytyczne dotyczące diagnostyki i leczenia MM (zaktualizowane w 2020 r.) również popierają ocenę MRD u pacjentów z MM z wykorzystaniem takich metod jak nowej generacji cytometria przepływowa (NGF) oraz NGS17.
Z naszej wiedzy wynika, że ze względu na ograniczenia kosztowe i czasowe technologia NGS nie jest preferowaną metodą wykrywania MRD w nowotworach układu chłonnego w praktyce klinicznej. Gdy wyniki MFC są ujemne, w celu wykrycia MRD często konieczna jest dodatkowa aspiracja szpiku kostnego. Ta dodatkowa procedura może stanowić znaczne obciążenie fizyczne i psychiczne dla pacjentów, co potencjalnie ogranicza jej powszechne zastosowanie kliniczne.
W niniejszym badaniu opracowaliśmy, scharakteryzowaliśmy i zwalidowaliśmy wydajność testu klonalności receptorów komórek B lub T (BCR/TCR) opartego na technologii NGS (OriMIRACLE LTM). Głównym celem badania była walidacja czułości i swoistości tego testu w monitorowaniu MRD w nowotworach układu chłonnego, nawet z wykorzystaniem pozostałych próbek rozmazów. Metoda ta pozwala na bezpośrednie wykorzystanie pozostałych po rutynowej diagnostyce rozmazów szpiku kostnego, co pozwala przełamać immanentne ograniczenia próbek z rozmazów. Nawet gdy DNA w rozmazach jest pofragmentowane na skutek utrwalenia, barwienia i długotrwałego przechowywania, występuje w skrajnie niskich ilościach lub jest częściowo zdegradowane, możliwe jest uzyskanie wiarygodnych profili repertuaru immunologicznego dzięki zoptymalizowanej ekstrakcji kwasów nukleinowych i amplifikacji multiplex PCR. Umożliwia to wysokoczułe śledzenie klonalne z czułością od 10⁻5 do 10⁻6, co przewyższa dolną granicę wykrywalności konwencjonalnego MRD opartego na cytometrii przepływowej. Praca ta podkreśla potencjał oceny klonalności BCR/TCR opartej na NGS w usprawnianiu monitorowania MRD i wspieraniu decyzji terapeutycznych u pacjentów z MM, co może rozwiązać obecne ograniczenia w praktyce klinicznej.
Protokół
Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Komisję Etyki Pierwszego Szpitala Klinicznego Uniwersytetu Medycznego Gannan (numer zgody etycznej: 22SC-2023011201). Od wszystkich uczestników przed włączeniem ich do badania uzyskano pisemną świadomą zgodę.
Wybór próbek
Próbki kliniczne pobrano od 40 pacjentów z diagnozą różnych nowotworów hematologicznych, w tym ALL, MM, CLL i chłoniaka. Dodatkowo zebrano pary próbek z fazy przewlekłej i fazy blastycznej u pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową. Próbki pozyskano w First Affiliated Hospital of Gannan Medical University w prowincji Jiangxi w Chinach w okresie od grudnia 2016 do sierpnia 2022 roku. Materiał pobrano z aspiratów szpiku kostnego (BMA) lub krwi obwodowej. Wykorzystano również cztery linie komórkowe nowotworów układu chłonnego: linie B-ALL REH i NALM6, linię T-ALL Jurkat oraz linię chłoniaka H9, wszystkie zakupione w American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA).
Do badania walidacji analitycznej włączono podzbiór sparowanych klinicznych rozmazów pozostałości szpiku kostnego, pobranych przed i po leczeniu od 30 pacjentów z nowo zdiagnozowanym lub nawrotowym MM. Analizy MFC przeprowadzono na próbkach BMA w odpowiadających sobie punktach czasowych z wykorzystaniem 4-kolorowej cytometrii przepływowej.
Próbki barwiono sześcioma różnymi 4-kolorowymi kombinacjami przeciwciał (rozcieńczenia zgodnie z instrukcjami producenta): CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR oraz K/L/CD45/CD38. Barwienie przeprowadzano przez 30 min w temperaturze 4 °C w ciemności, a następnie dwukrotnie przemywano próbki roztworem PBS (wirowanie przy 500 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C). W laboratoriach immunohematologicznych pozytywność MFC-MRD w szpiku kostnym definiuje się obecnie przy użyciu progu 10-4 (1 komórka na 10 000). Jakość akwizycji w cytometrii przepływowej weryfikowano poprzez wizualizację rozpraszania światła w przód i w bok (forward/side scatter) oraz potwierdzenie obecności co najmniej 10 000 zdarzeń CD45+ na probówkę.
Wykrywanie klonalności i monitorowanie MRD za pomocą testu klonalności opartego na NGS
gDNA wyekstrahowano z 200 µL BMA, krwi obwodowej lub całego rozmazu resztkowego (resuspendowanego w 200 µL PBS) przy użyciu odpowiedniego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Wymagane było minimalne stężenie gDNA wynoszące 20 ng/µL oraz całkowita wydajność ≥ 1 µg. Zweryfikowano stosunek A260/A280 w zakresie 1,8–2,0. W badaniu tym gDNA jest amplifikowany za pomocą locus-specyficznej multiplex PCR z użyciem starterów, a następnie do amplifikowanej sekwencji receptora dodawany jest kod kreskowy indeksu specyficzności reakcji w celu identyfikacji próbki. Zakodowane, amplifikowane DNA są następnie łączone w celu przygotowania bibliotek sekwencyjnych, które poddawane są NGS na platformie Illumina. Końcowy rozmiar biblioteki 350–450 bp oraz stężenie ≥ 5 nM zostały zweryfikowane na Bioanalyzerze. Dane sekwencyjne są przetwarzane za pomocą dostosowanych rurociągów bioinformatycznych i rygorystycznych środków kontroli jakości. Odczyty są przypisywane do przeorganizowanych BCR lub TCR dla każdej próbki i agregowane w klonalne sekwencje receptorowe. Następnie sekwencje te są oceniane pod kątem potencjału związanego z chorobą i przydatności do późniejszego monitorowania. Aby sekwencja została uznana za odpowiednią, musi ona stanowić co najmniej 10% wszystkich sekwencji BCR w danym locus i wykazać wystarczającą unikalność. Podczas oceny sekwencji do monitorowania MRD jej unikalność jest określana poprzez porównanie jej z kompleksową bazą danych repertuaru komórek B lub T, taką jak baza danych ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org). Częstość występowania sekwencji w tej bazie danych jest wykorzystywana do oceny jej odrębności. Po zidentyfikowaniu odpowiednich sekwencji związanych z chorobą są one porównywane z kolejnymi próbkami w celu monitorowania MRD. Próbki klasyfikuje się jako MRD-dodatnie (+) w przypadku znalezienia dopasowań sekwencji lub MRD-ujemne (-) w przypadku braku wykrytych dopasowań. Ilościowo określa się stężenie każdej monitorowanej sekwencji, co umożliwia obliczenie konsensusowej liczby komórek nowotworowych i całkowitej liczby komórek jądrzastych na poziomie próbki. Stosunek tych wartości daje szacunkową częstotliwość występowania komórek nowotworowych w próbce, dostarczając cennych informacji o progresji lub remisji choroby. Sekwencję klonalną uznano za nadającą się do monitorowania, jeśli wykryto co najmniej 50 odczytów wspierających, a sekwencja stanowiła ≥10% całkowitego repertuaru BCR/TCR w momencie diagnozy.
Wszystkie próbki pochodzenia ludzkiego traktowano jako materiały biologicznie niebezpieczne w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC) klasy II, stosując środki ochrony indywidualnej (PPE). Zanieczyszczone materiały jednorazowe autoklawowano (121 °C, 20 min) przed utylizacją, a odpady płynne poddawano działaniu 10% roztworu podchlorynu sodu.
Badania precyzji i czułości
Granicę wykrywalności (LOD) określono z wykorzystaniem próbek klinicznych i linii komórkowych na tle gDNA krwi obwodowej od zdrowych dawców. W celu ustalenia liniowości wykrywania, do normalnego gDNA dodano gDNA linii komórkowej, aby uzyskać zakres częstotliwości klonalnych obejmujący kilka rzędów wielkości. W szczególności dodawano komórki złośliwe, zaczynając od 10 komórek, a następnie wykonywano 10-krotne rozcieńczenia szeregowe: 10, 100, 1 000 i 10 000 komórek. LOD obliczono jako oczekiwaną liczbę wprowadzonych komórek złośliwych, przy której dopasowana krzywa probit osiąga 95% prawdopodobieństwa wykrycia. Zgodność między częstotliwościami obserwowanymi a oczekiwanymi przeanalizowano za pomocą regresji liniowej. Parametry te stanowią solidną podstawę do szacowania MRD na poziomie próbki w kolejnych badaniach ewaluacyjnych. Ta dopracowana wersja zachowuje ton akademicki, zwiększając jednocześnie jasność i zwięzłość. Zapewnia ona również właściwe użycie terminologii naukowej i jest zgodna z konwencjami pisma naukowego w dziedzinie nauk o życiu i medycyny.
Analiza statystyczna
Za istotne statystycznie uznano dwustronne p < 0.05. Liniowość oceniono i obliczono przy użyciu współczynnika korelacji Pearsona (r) w programie GraphPad Prism. Analizę statystyczną przeprowadzono w języku R (wersja 3.6.1). Obliczenia czasu przeżycia bez progresji choroby (PFS) rozpoczynają się w momencie, gdy u pacjenta wystąpi całkowita odpowiedź (CR), odpowiedź częściowa (PR) lub bardzo dobra odpowiedź częściowa (VGPR), i trwają do momentu wystąpienia progresji choroby (PD) lub zgonu z jakiejkolwiek przyczyny. Do analizy przeżycia wykorzystano krzywą Kaplana-Meiera, a do porównania różnic w przeżywalności między podgrupami zastosowano test log-rank. Analizę Coxa przeprowadzono za pomocą analiz jednowymiarowych i wielowymiarowych.
Wyniki
Przetwarzanie, liniowość i precyzja wykrywania klonalności
Testy klonalności BCR/TCR oparto na dwóch rundach PCR multipleksowego z następującym sekwencjonowaniem NGS (Rysunek 1). Testy klonalności BCR pozwalały na identyfikację rearanżacji IGH (VH-DH-JH lub DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde oraz intronRSS-Kde) i IGL (Vλ-Jλ), a także translokacji BCL1-IGH i BCL2-IGH przy użyciu oddzielnych reakcji lub jednej zmodyfikowanej reakcji mieszanej. Testy klonalności TCR pozwalały na wykrycie rearanżacji TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) i TCRG (Vγ –Jγ). Klonalność BCR w nowotworach limfoidalnych komórek B wykazano w 93,94% przypadków, a klonalność TCR w nowotworach limfoidalnych komórek T w 90,91% przypadków (Tabela 1).
Liniowość wykazano dla szerokiego zakresu wejściowych ilości próbek (0,2 µg, 2 µg i 20 µg) na podstawie wyników testów linii komórkowych, obejmujących kilka rzędów wielkości. W celu ustalenia liniowości komórki nowotworowe wprowadzano do normalnego gDNA, stosując 10-krotne rozcieńczenia seryjne (10, 100, 1 000 i 10 000 komórek). Zaobserwowano liniowość z szacowanymi nachyleniami od 0,93 do 1,06 dla częstotliwości klonalnych od 1 do 10-6 (Rycyna 2A). Granicę wykrywalności (LOD) oszacowano na 1 do 2 komórek nowotworowych w obu testach klonalności BCR i TCR (Rycina 2B). Ponadto testy klonalności BCR/TCR pozwoliły na wykrycie klonalności w chłoniaku z wykorzystaniem próbek tkanek (BMA) oraz dopasowanej krwi obwodowej (Tabela uzupełniająca 1).
Pacjenci i próbki wykorzystane do walidacji detekcji MRD
Walidacja detekcji MRD objęła łącznie 29 pacjentów z MM, przy czym jeden pacjent został wykluczony z powodu uszkodzenia próbki. Populacja badana składała się w 65,52% (19/29) z mężczyzn i w 34,48% (10/29) z kobiet, przy medianie wieku wynoszącej 65 lat (zakres 33–82) (Tabela 2). Wśród kohorty 31,03% (9/29) pacjentów zaklasyfikowano do grupy wysokiego ryzyka, 24,14% (7/29) do grupy ryzyka standardowego, a 37,93% (11/29) do grupy niskiego ryzyka zgodnie z kryteriami IMWG18. Stopnie I, II i III w zrewidowanym międzynarodowym systemie stadiów szpiczaka mnogiego (R-ISS) reprezentowały odpowiednio 10,34% (3/29), 48,28% (14/29) i 20,69% (6/29) pacjentów19.
Porównanie testów NGS i MFC
Przeprowadzono bezpośrednie porównanie parzyste w celu oceny dokładności ilościowej testów OriMIRACLE LTM oraz MFC. Wyniki wykazały podobną dokładność ilościową w badanym zakresie, szczególnie przy częstotliwościach MRD powyżej 10−4, przy współczynniku korelacji Pearsona R wynoszącym 0,73 (Ryc. 3). Komórki nowotworowe zostały wykryte zarówno metodą MFC, jak i NGS w 59 próbkach od 29 pacjentów z MM, a spójność osiągnęła poziom 81,36% (48/59). Spójność ta odzwierciedla obecność wykrywalnych komórek nowotworowych w różnych punktach czasowych, a nie rzeczywistą zgodność między metodami. Wśród próbek 62,07% (18/29) uzyskało wynik MRD+ w obu testach (NGS i MFC), u jednego pacjenta oba testy wykazały wynik MRD−, a u 11 pacjentów test NGS wykazał wynik MRD+, podczas gdy MFC wykazało wynik MRD−. Wśród pacjentów z niespójnymi wynikami detekcji u trzech osób częstotliwość wykrywania była niższa niż 10-4, natomiast u ośmiu osób mieściła się w zakresie 10-2–10-4 (Ryc. 3). Ekstrakcję DNA z pozostałych próbek rozmazów szpiku kostnego przeprowadzono w celu uzyskania jak największej ilości DNA. W celu wykrycia klonalności przed leczeniem przetestowano średnio 91,95 ng (do 100,0 ng) wejściowego DNA. Do późniejszego badania MRD wyekstrahowano średnio 1623,39 ng DNA (w zakresie od 50,1–17400,0 ng) (Tabela uzupełniająca 2). Wykazało to, że NGS może wykryć MRD nawet w przypadku niewystarczającej ilości pozostałej próbki, podczas gdy MFC w niektórych przypadkach nie wykryło MRD.
Ważność kliniczna wykrywania MRD za pomocą testu NGS w interwale wiodącym
Sekwencje klonalne wykryto w punkcie wyjściowym u wszystkich pacjentów z MM, po czym przeprowadzono ocenę MRD (Rysunek 4). U osiemnastu pacjentów potwierdzono status MRD+ za pomocą detekcji NGS i MFC. Wśród pacjentów z MRD+ w obu metodach, MFC i NGS, 61,11% (11/18) doświadczyło następnie PD lub nawrotu. 38,89% (7/18) pacjentów osiągnęło stabilizację choroby (SD) lub PR w trakcie badania. Wśród pacjentów z potwierdzonym MRD+ w NGS, lecz MRD− w MFC, 36,36% (4/11) nie było w stanie osiągnąć klinicznej CR podczas ostatniej oceny klinicznej (Tabela uzupełniająca 2). Ponadto, spośród wszystkich pacjentów, u których odpowiedź kliniczna była CR, 37,50% (3/8) pacjentów doświadczyło nawrotu po przerwaniu leczenia. zbadano również podstawowe cechy kliniczne i wyniki MFC w odniesieniu do wyniku PFS (Rysunek uzupełniający 1). Analizy jednowymiarowe i wielowymiarowe PFS wykazały, że nie były one istotnie ze sobą powiązane. W niniejszym badaniu nie zaobserwowano istotnej różnicy w PFS przy analizie wyłącznie wyników MRD uzyskanych za pomocą MFC.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH
Ze względu na ograniczenia dotyczące prywatności pacjentów oraz politykę instytucjonalną, surowe dane nie są publicznie dostępne. Podsumowanie zebranych danych znajduje się w Pliku uzupełniającym 1.
Rysunek 1: Analiza klonalności BCR/TCR obejmowała wielokrotny PCR, po którym nastąpiło NGS. W pierwszej rundzie PCR przeprowadzono amplifikację regionu CDR3 przeorganizowanych genów receptorów immunologicznych przy użyciu primerów specyficznych dla locusu oraz indeksów specyficznych dla próbki, natomiast adaptery NGS dodano podczas drugiej rundy PCR. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Liniowość wykrywania klonalności oceniano poprzez dodanie gDNA linii komórkowej do prawidłowego gDNA w zakresie różnych częstotliwości klonalnych. (A) Liniowość testów klonalności BCR i TCR. (B) Granica wykrywalności (LOD) oszacowana przy użyciu próbek klinicznych oraz linii komórkowych dodanych do gDNA krwi obwodowej zdrowego dawcy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Porównanie parzyste pomiarów częstości MRD pomiędzy MFC a testem NGS MRD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Dynamika MRD u pacjentów z MM oraz różne statusy kliniczne pacjentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Typ próbki | Nr | Typ choroby | Dominujący klonotyp | |
| Linie komórkowe | REH | 1 | B-ALL | IGH, IGK |
| NALM6 | 2 | B-ALL | IGH, IGK | |
| Jurkat | 3 | T-ALL | TCRB, TCRG | |
| H9 | 4 | Chłoniak | TCRB, TCRG | |
| Kliniczne nowotwory limfoidalne z komórek B | 5 | B-ALL | IGH | |
| 6 | B-ALL | IGL | ||
| 7 | B-ALL | IGH | ||
| 8 | B-ALL | Nie wykryto | ||
| 9 | CLL | IGH, IGK | ||
| 10 | CLL | IGH, IGK | ||
| 11 | CP-CML | IGH | ||
| 12 | BP-CML | IGH | ||
| 13 | MM | IGK | ||
| 14 | MM | IGH, IGK | ||
| 15 | MM | IGK | ||
| 16 | MM | IGH | ||
| 17 | MM | IGH | ||
| 18 | MM | IGK | ||
| 19 | MM | IGH | ||
| 20 | MM | IGH, IGK | ||
| 21 | MM | IGH, IGK | ||
| 22 | MM | IGH | ||
| 23 | Chłoniak | IGH, IGK | ||
| 24 | Chłoniak | IGH, IGK, IGL | ||
| 25 | Chłoniak | IGH, IGK, IGL | ||
| 26 | Chłoniak | IGH, IGK, IGL | ||
| 27 | Chłoniak | IGH | ||
| 28 | Chłoniak | IGH | ||
| 29 | Chłoniak | IGH, IGK, IGL | ||
| 30 | Chłoniak | IGH, IGK | ||
| 31 | Chłoniak | IGH, IGK | ||
| 32 | Chłoniak | IGH, IGK, IGL | ||
| 33 | Chłoniak | IGK | ||
| 34 | Chłoniak | IGH | ||
| 35 | Chłoniak | Nie wykryto | ||
| Kliniczne nowotwory limfoidalne z komórek T | 36 | Chłoniak | TCGR | |
| 37 | Chłoniak | TCRB, TCRG | ||
| 38 | Chłoniak | TCRB, TCRG | ||
| 39 | Chłoniak | TCRB, TCRG | ||
| 40 | Chłoniak | TCRB, TCRG | ||
| 41 | Chłoniak | TCRB, TCRG | ||
| 42 | Chłoniak | TCRB, TCRG | ||
| 43 | Chłoniak | TCRB, TCRG | ||
| 44 | Chłoniak | Nie wykryto | ||
Tabela 1: Wykrywanie klonalności z użyciem testów klonalności BCR/TCR w 4 liniach komórkowych i 40 próbkach klinicznych. B-ALL: ostra białkowa białaczka limfoblastyczna; T-ALL: ostra T-komórkowa białaczka limfoblastyczna; CP-CML: przewlekła faza przewlekłej białaczki szpikowej; BP-CML: faza blastowa przewlekłej białaczki szpikowej; CLL: przewlekła białaczka limfatyczna; MM: szpiczak mnogi.
| Charakterystyka | Suma (N = 29) |
| Wiek mediana, lata (zakres) | 65 (33-82) |
| Płeć, n (%) | |
| Mężczyzna | 19 (65.52) |
| Kobieta | 10 (34.48) |
| Typ łańcucha ciężkiego, n (%) | |
| IgG | 14 (48.28) |
| IgA | 7 (24.14) |
| IgE | 1 (3.45) |
| Typ łańcucha lekkiego, n (%) | |
| k | 19 (65.52) |
| λ | 8 (27.59) |
| Nieprawidłowość cytogenetyczna, n (%) | |
| del17p | 2 (6.90) |
| del13q14 | 9 (31.03) |
| gain/amp 1q21 | 12 (41.38) |
| t (4;14) | 2 (6.90) |
| Brak nieprawidłowości | 9 (31.03) |
| Stopień ISS, n (%) | |
| I | 4 (13.79) |
| II | 13 (44.83) |
| III | 12 (41.38) |
| Stopień R-ISS, n (%) | |
| I | 3 (10.34) |
| II | 14 (48.28) |
| III | 6 (20.69) |
| Brak danych | 6 (20.69) |
| IMWG, n (%) | |
| Wysokie ryzyko | 9 (31.03) |
| Ryzyko standardowe | 7 (24.14) |
| Niskie ryzyko | 11 (37.93) |
| Brak danych | 2 (6.90) |
Tabela 2: Charakterystyka wyjściowa 29 pacjentów z MM włączonych do niniejszego badania. k: kappa; λ: Lambda; DS: Durie-Salmon; ISS: międzynarodowy system etapowania (International staging system); R-ISS: zrewidowany międzynarodowy system etapowania (revised International staging system); IMWG: Międzynarodowa Grupa Robocza ds. Szpiczaka (International Myeloma Working Group)
Rycina uzupełniająca 1: Analiza przeżywalności w oparciu o charakterystykę kliniczną i wyniki MFC. (A) Analizy jednowymiarowe i wielowymiarowe PFS. (B) Krzywa Kaplana-Meiera z wynikiem MFC. (C) Krzywa Kaplana-Meiera z wynikiem NGS. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 1: Wykrywanie klonalności chłoniaka przy użyciu testów klonalności BCR/TCR w próbkach tkanek i odpowiadającej im krwi obwodowej.NHL: chłoniak nieziarniczy; HGBL: wysokozłośliwy chłoniak z komórek B; FL: chłoniak pęcherzykowy; DLBCL: dyfuzyjny chłoniak z dużych komórek B; ITLPD-GI: indolentne zaburzenia T-limfoproliferacyjne przewodu pokarmowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 2: Wyniki wykrywania MRD w oparciu o testy MFC i NGS. ND: nie wykryto; Odpowiedź częściowa: PR; Odpowiedź całkowita: CR; Stabilizacja choroby: SD; Bardzo dobra odpowiedź częściowa: VGPR. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 1: Podsumowanie surowych danych zebranych w niniejszym badaniu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
W ostatnich latach odnotowano znaczną poprawę wyników klinicznych w leczeniu nowotworów układu chłonnego, co napędziło poszukiwania alternatywnych markerów zdolnych do wcześniejszego przewidywania punktów końcowych przeżycia oraz przyspieszenia oceny nowych terapii20. Kompleksowa metaanaliza obejmująca 8 098 pacjentów potwierdziła silną wartość prognostyczną ujemnego wyniku MRD w zwiększaniu długoterminowego przeżycia wśród pacjentów z MM21. Ponadto klonalne przegrupowania BCR i TCR stały się kluczowymi markerami diagnostycznymi i monitorującymi MRD, kierując decyzjami terapeutycznymi w nowotworach układu chłonnego22.
Coraz więcej dowodów potwierdza wyższość oceny klonalności BCR/TCR opartej na NGS nad analizami MFC i PCR, szczególnie w przypadku dostępności wystarczających próbek DNA. NGS oferuje wyższą czułość i prostszą standaryzację10,23,24,25,26 i został zidentyfikowany jako silny czynnik prognostyczny zarówno dla PFS, jak i przeżycia całkowitego w momencie rozpoczęcia terapii podtrzymującej27.
W niniejszym badaniu opracowaliśmy analizę opartą na NGS, która wykazuje wskaźnik dodatnich wyników przekraczający 90% zarówno dla klonalności BCR, jak i TCR w nowotworach układu chłonnego. LOD analizy szacuje się na od 1 do 2 komórek nowotworowych dla obu analiz klonalności (BCR i TCR), co jest porównywalne z wysoką czułością analizy clonoSEQ z LOD wynoszącym 1,903 komórek nowotworowych16. Zaobserwowano liniowość z szacowanymi nachyleniami w zakresie od 0,93 do 1,06 dla częstotliwości klonalnych od 1 do 10-6, co wskazuje na silną proporcjonalność między obserwowanymi a oczekiwanymi częstotliwościami klonalnymi. Po ustanowieniu zestandaryzowanych metod detekcji i zakończeniu walidacji laboratoryjnej, przeprowadziliśmy walidację kliniczną, aby zapewnić przydatność analizy do klinicznego monitorowania MRD.
Badanie to wykazało 81,36% (48/59) zgodności między testem opartym na NGS a MFC. Obie metody wykazały 100% czułości w identyfikacji komórek nowotworowych w przypadkach nowo zdiagnozowanych lub nawrotowych. W przypadku monitorowania po leczeniu nie stwierdzono istotnej korelacji między statusem MRD ocenianym za pomocą MFC a PFS, co prawdopodobnie wynika z ograniczonej wielkości próby. W związku z tym przeprowadzono kompleksową analizę wszystkich przypadków.
Spośród 18 pacjentów zidentyfikowanych jako MRD-dodatni obiema metodami, wyniki MRD były zgodne z ocenami odpowiedzi klinicznej. Dziewięciu z tych pacjentów doznało PD lub nawrotu, czterech osiągnęło SD, czterech osiągnęło PR, a jeden zmarł. Sugeruje to, że u pacjentów z wynikiem MRD-dodatnim w obu metodach niemal niezmiennie obserwuje się PD lub nawrót. Dane te wskazują, że dodatni wynik MRD w badaniach NGS i MFC w większości odzwierciedla ograniczoną skuteczność leczenia lub złe rokowanie u tych pacjentów. Spośród 11 pacjentów, którzy byli MRD-dodatni w badaniu NGS, ale MRD-ujemni w MFC, 36,36% nie osiągnęło CR. Wyniki te podkreślają zdolność NGS do wykrywania MRD przy częstotliwościach w zakresie od 10-2 do 10-6, nawet przy ograniczonej ilości pozostałych próbek, podczas gdy MFC w niektórych przypadkach nie wykryła MRD. Potwierdza to dodatkowo wyższą czułość i swoistość NGS w wykrywaniu MRD w porównaniu z MFC.
Poprzednie badania wykazały, że status MRD oceniany za pomocą MFC jest silnym predyktorem PFS oraz przeżycia całkowitego u pacjentów z MM, co podkreśla znaczenie monitorowania MRD w podejmowaniu decyzji terapeutycznych i ocenie rokowań po autologicznym przeszczepieniu komórek macierzystych28. Przedstawione tutaj wyniki dodatkowo uwypuklają istotność testów NGS, co obrazują dwa przypadki (pacjenci 11 i 14), w których u pacjentów uzyskano wynik MRD-ujemny w MFC, ale MRD-dodatni w NGS. Kluczowe jest zauważenie, że przerwanie leczenia w takich przypadkach może wiązać się z ryzykiem nawrotu, co podkreśla konieczność dokładnej oceny odpowiedzi na leczenie w sytuacji wystąpienia rozbieżnych wyników MRD.
Niniejsze badanie eliminuje zależność istniejących metod NGS i MFC od świeżych aspiratów szpiku kostnego lub mrożonych komórek i po raz pierwszy systematycznie potwierdza, że pozostałe, zabarwione rozmazy szpiku kostnego po rutynowej diagnostyce mogą służyć jako wiarygodny materiał wyjściowy do wysokoczułej detekcji MRD. Bezpośrednio rozwiązuje to następujące luki kliniczne i metodologiczne: (1) eliminuje konieczność pobierania dużych objętości płynu ze szpiku kostnego do monitorowania MRD, szczególnie u pacjentów starszych lub tych, u których pobranie próbek jest utrudnione; (2) umożliwia retrospektywną analizę zarchiwizowanych rozmazów, wykorzystując tym samym istniejące zasoby patomorfologiczne do ustanowienia dowodów prognostycznych opartych na MRD w kohortach historycznych; oraz (3) dzięki czułości detekcji na poziomie 10-5-10-6 jest znacznie skuteczniejsza niż konwencjonalna MFC (zazwyczaj 10-4-10-5) i pozwala uniknąć wyników fałszywie ujemnych spowodowanych problemami z jakością próbek w MFC, dostarczając opartego na DNA, możliwego do śledzenia narzędzia oceny MRD do praktyki klinicznej.
Zidentyfikowano kilka krytycznych etapów, aby zapewnić sukces i wiarygodność analizy. Delikatne zdrapywanie pozostałości rozmazów, a następnie natychmiastowe zastosowanie buforu, było niezbędne do uzyskania odpowiedniej wydajności gDNA. Wymagana była precyzyjna ilość wejściowego DNA (100 ng na reakcję, z dokładnością do ±10%), aby uniknąć wypadania alleli lub stronniczej amplifikacji. Equimolarny pooling produktów z kodami kreskowymi (2 nM) przyczynił się do jednorodnej głębokości sekwencjonowania, a spójne stosowanie progów bioinformatycznych (≥10% częstotliwości klonalnej w momencie diagnozy i ≤5% niedopasowań w celu śledzenia) pomogło zapobiec fałszywie dodatnim wynikom MRD. Ponadto wprowadzono kilka modyfikacji do standardowego protokołu, aby rozwiązać typowe problemy eksperymentalne. Gdy końcowe stężenie biblioteki spadło poniżej 5 nM, ostrożnie dodano drugą rundę PCR z 2–4 dodatkowymi cyklami, aby uniknąć błędu nadmiernej amplifikacji. W przypadku próbek, w których śledzenie klonalne nie powiodło się z powodu zbyt wielu niedopasowań (>5%), zaktualizowano referencyjną bazę danych IMGT, a tolerancję niedopasowań tymczasowo poluzowano do 8% na potrzeby analizy eksploracyjnej, choć 5% pozostało standardowym progiem dla raportowania klinicznego. Jeśli głębokość sekwencjonowania spadła poniżej 50 000 odczytów na próbkę, przeprowadzono ponowny pooling i ponowne sekwencjonowanie bez powtarzania etapu PCR.
Podsumowując, ta walidacja w warunkach rzeczywistych wykazuje, że resztkowe próbki rozmazów szpiku kostnego dają spójne i wiarygodne wyniki testów w różnych ustawieniach terapeutycznych. W regionach o niskim poziomie ekonomicznym, gdzie rutynowo wykonuje się biopsję szpiku kostnego i MFC zamiast NGS, wyniki sugerują, że NGS można rozważyć w celu dalszej oceny molekularnej w przypadku negatywnych wyników wstępnych. Wykorzystanie próbek resztkowych jest w takich sytuacjach odpowiednie, ponieważ eliminuje konieczność ponownej aspiracji szpiku kostnego, redukując tym samym obciążenie pacjenta.
Choć nasze trwające badanie w warunkach rzeczywistych (real-world study) ma na celu zwiększenie wielkości próby dla dalszych analiz, uznajemy kilka ograniczeń. Mogą wystąpić wyniki fałszywie ujemne, szczególnie gdy zawartość wyekstrahowanego DNA jest niewystarczająca, co zaobserwowano podczas drugiej detekcji MRD u pacjenta 10. Dodatkowo, proporcja klonów wykrytych za pomocą NGS zależy od kwantyfikacji komórek, co może prowadzić do przeszacowania proporcji komórek MRD. Walidacja koncentruje się głównie na próbkach szpiku kostnego. Jednak długoterminowe znaczenie NGS-MRD polega na wielokrotnych badaniach kontrolnych po leczeniu, w których krew obwodowa może być bardziej odpowiednia. Walidacja próbek krwi obwodowej nie została jeszcze przeprowadzona. Ze względu na ograniczoną liczbę próbek do walidacji klinicznej, losowy dobór pacjentów oraz różnorodne podejścia terapeutyczne w tym badaniu w warunkach rzeczywistych, gromadzenie kolejnych próbek MRD okazało się trudne. W konsekwencji skupiliśmy się na ocenie znaczenia wczesnych odpowiedzi MRD w odniesieniu do późniejszej progresji i nie mogliśmy wykazać wpływu utrzymującego się statusu MRD na wyniki długoterminowe. Ponadto NGF nie została uwzględniona w analizie porównawczej. Choć NGS i konwencjonalne MFC były systematycznie porównywane, NGF, jako jedna z dwóch rekomendowanych przez IMWG metod MRD (drugą jest NGS), dostarczyłaby dodatkowych informacji na temat wydajności testu. Co więcej, wielkość próby jest stosunkowo mała (n = 40), a kohorta jest heterogeniczna i obejmuje różne nowotwory hematologiczne. W celu potwierdzenia i rozszerzenia naszych wniosków uzasadnione jest przeprowadzenie przyszłych wieloośrodkowych badań na dużą skalę, uwzględniających NGF i koncentrujących się na jednym typie nowotworu, takim jak szpiczak mnogi.
Po dokładnej charakterystyce i walidacji wydajności testu klonalności BCR/TCR opartego na NGS, wykazaliśmy, że posiada on potencjał jako wysoce czuła, dokładna i praktyczna metoda ilościowego oznaczania i monitorowania MRD w pozostałych próbkach rozmazów szpiku kostnego u pacjentów z MM.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.
Podziękowania
Badania te zostały sfinansowane z grantu Natural Science Foundation of the Jiangxi Provincial Department of Science and Technology (nr 20232BAB206059), projektu badawczego Jiangxi Provincial Department of Education Science and Technology (nr GJJ211518), projektu w ramach planu naukowo-technologicznego Jiangxi Provincial Health Commission (nr 202310782) oraz projektu w ramach kierunkowego planu naukowo-technologicznego Ganzhou Science and Technology Bureau of Jiangxi Province (nr GZ2020ZSF027). Projekt w ramach planu naukowo-technologicznego Jiangxi Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (nr 2024B0710)
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało anty-CD19 | Abcam | AB134114 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| Przeciwciało anty-CD20 | Abcam | AB64088 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| Przeciwciało anty-CD22 | Abcam | AB32123 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| Przeciwciało anty-CD33 | Abcam | AB134115 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| Przeciwciało anty-CD34 | Abcam | AB81289 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| Przeciwciało anty-CD38 | Abcam | AB183326 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| Przeciwciało anty-CD45 | Abcam | AB40763 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| Przeciwciało anty-CD56 | Abcam | AB75813 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| Przeciwciało anty-CD9 | Abcam | AB2215 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| Przeciwciało anty-HLA-DR | Abcam | AB20181 | Rozcieńczenie zgodnie z instrukcją producenta |
| GraphPad Prism | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | NovaSeq 6000 | https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html |
| Baza danych ImMunoGeneTics (IMGT) | Baza danych ImMunoGeneTics (IMGT) | http://www.imgt.org/ | |
| Linie komórkowe nowotworów układu chłonnego | ATCC | https://www.atcc.org/ | Linie B-ALL REH i NALM6, linia T-ALL Jurkat oraz linia chłoniaka H9 (DSMZ) |
| Wieloparametryczna cytometria przepływowa | BECKMAN COULTER | CytoFLEX | |
| Test OriMIRACLE LTM | Origimed Co., Ltd., Shanghai, Chiny | ||
| Język R | R Foundation for Statistical Computing | wersja 3.6.1 |
Bibliografia
- van de Donk N, Pawlyn C, Yong KL. Multiple myeloma. Lancet. 2021;397(10272):410-27.
- Xia C, et al. Cancer statistics in China and United States, 2022: Profiles, trends, and determinants. Chin Med J. 2022;135(5):584-90.
- Ricciuti G, Falcone A, Cascavilla N, Martinelli G, Cerchione C. Autologous stem cell transplantation in multiple myeloma. Panminerva Med. 2020;62(4):220-4.
- Feng D, Sun J. Overview of anti-BCMA CAR-T immunotherapy for multiple myeloma and relapsed/refractory multiple myeloma. Scand J Immunol. 2020;92(2):e12910.
- Ontario Health. Minimal residual disease evaluation in childhood acute lymphoblastic leukemia: A clinical evidence review. Ont Health Technol Assess Ser. 2016;16(7):1-52.
- Yanamandra U, Kumar SK. Minimal residual disease analysis in myeloma: When, why and where. Leuk Lymphoma. 2018;59(8):1772-84.
- Bassan R, Brüggemann M, Radcliffe HS, Hartfield E, Kreuzbauer G, et al. A systematic literature review and meta-analysis of minimal residual disease as a prognostic indicator in adult B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 2019;104(10):2028-39.
- Kumar S, et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. Lancet Oncol. 2016;17(8):e328-e346.
- Dogliotti I, Drandi D, Genuardi E, Ferrero S. New molecular technologies for minimal residual disease evaluation in B-cell lymphoid malignancies. J Clin Med. 2018;7(9).
- Drandi D, et al. Highly sensitive MYD88(L265P) mutation detection by droplet digital polymerase chain reaction in Waldenström macroglobulinemia. Haematologica. 2018;103(6):1029-37.
- Camus V, et al. Digital PCR for quantification of recurrent and potentially actionable somatic mutations in circulating free DNA from patients with diffuse large B-cell lymphoma. Leuk Lymphoma. 2016;57(9):2171-9.
- Riva G, et al. Multiparametric flow cytometry for MRD monitoring in hematologic malignancies: Clinical applications and new challenges. Cancers. 2021;13(18).
- Anderson KC, et al. Minimal residual disease in myeloma: Application for clinical care and new drug registration. Clin Cancer Res. 2021;27(19):5195-212.
- ClonoSEQ cleared for residual cancer testing. Cancer Discov. 2018;8(12):OF6.
- Walzer S, Krenberger S, Vollmer L, Hewitt T, Eckert B. A cost impact analysis of clonoSEQ® as a valid and CE-certified minimal residual disease (MRD) diagnostic compared to no MRD testing in multiple myeloma in Germany. Oncol Ther. 2021;9(2):607-19.
- Ching T, et al. Analytical evaluation of the clonoSEQ assay for establishing measurable (minimal) residual disease in acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, and multiple myeloma. BMC Cancer. 2020;20(1):612.
- Chinese Society of Hematology. The guidelines for the diagnosis and management of multiple myeloma in China (2020 revision). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2020;59(5):341-6.
- Chng WJ, et al. IMWG consensus on risk stratification in multiple myeloma. Leukemia. 2014;28(2):269-77.
- Hagen P, Zhang J, Barton K. High-risk disease in newly diagnosed multiple myeloma: Beyond the R-ISS and IMWG definitions. Blood Cancer J. 2022;12(5):83.
- Rawstron AC, et al. Minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry in multiple myeloma: Impact on outcome in the Medical Research Council Myeloma IX Study. J Clin Oncol. 2013;31(20):2540-7.
- Munshi NC, et al. A large meta-analysis establishes the role of MRD negativity in long-term survival outcomes in patients with multiple myeloma. Blood Adv. 2020;4(23):5988-99.
- Brüggemann M, et al. Standardized next-generation sequencing of immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations for MRD marker identification in acute lymphoblastic leukaemia: A EuroClonality-NGS validation study. Leukemia. 2019;33(9):2241-53.
- Medina A, et al. Comparison of next-generation sequencing (NGS) and next-generation flow (NGF) for minimal residual disease (MRD) assessment in multiple myeloma. Blood Cancer J. 2020;10(10):108.
- Kruse A, Abdel-Azim N, Kim HN, Ruan Y, Phan V, et al. Minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia. Int J Mol Sci. 2020;21(3).
- Kriegsmann K, et al. Comparison of NGS and MFC methods: Key metrics in multiple myeloma MRD assessment. Cancers. 2020;12(8).
- Takamatsu H. Comparison of minimal residual disease detection by multiparameter flow cytometry, ASO-qPCR, droplet digital PCR, and deep sequencing in patients with multiple myeloma who underwent autologous stem cell transplantation. J Clin Med. 2017;6(10).
- Perrot A, et al. Minimal residual disease negativity using deep sequencing is a major prognostic factor in multiple myeloma. Blood. 2018;132(23):2456-64.
- de Tute RM, et al. Minimal residual disease after autologous stem-cell transplant for patients with myeloma: Prognostic significance and the impact of lenalidomide maintenance and molecular risk. J Clin Oncol. 2022;40(25):2889-900.