Sekwencjonowanie transkryptomu zidentyfikowało patogenne chhemokiny w hubach miażdżycowych

Podsumowanie

Celem tego badania jest analiza mechanizmów ukrytych u podstaw czynników zapalnych związanych z płytkami miażdżycowymi (AP) za pomocą sekwencjonowania RNA. Wyniki zidentyfikowały kluczowe geny zapalne CCL3, CCL4 i CXCL1 w AP. Chemokiny te mogą pobudzać miażdżycę, wspierając gromadzenie makrofagów M0 i jednocześnie hamując ochronne komórki odpornościowe, co ujawnia potencjalne cele terapeutyczne.

Streszczenie

Płytka miażdżycowa (AP) to rodzaj zapalnej choroby proliferacyjnej tkanki włóknistej, która powstała po uszkodzeniu komórek śródbłonka i komórek mięśni gładkich w ścianie tętnice, co może prowadzić do różnych stopni niedrożności krążenia sercowo-naczyniowego i mózgowo-naczyniowego. Jednak skuteczne podejścia terapeutyczne ukierunkowane na stan zapalny do tej pory w dużej mierze nie powiodły, co sugeruje, że potrzebne są dalsze wnioski. W tym badaniu celem było przeanalizowanie zmian transkryptomicznych związanych z czynnikiem zapalnym w AP za pomocą sekwencjonowania RNA (RNA-seq). RNA-seq przeprowadzono na próbkach pacjentów z AP (n = 11) oraz osób kontrolnych (n = 3). Geny różnicowo ekspresyjne (DEG) zostały zidentyfikowane za pomocą Metascape, następnie przeprowadzono analizę wzbogacenia szlaku KEGG za pomocą pakietu clusterProfiler w oprogramowaniu R, analizę infiltracji immunologicznej za pomocą CIBERSORT oraz sieć interakcji białko-białko (PPI) w bazie danych STRING. Geny hubów w sieci PPI zostały zidentyfikowane za pomocą wtyczki CytoHubba. W grupie AP zidentyfikowano łącznie 3713 DEG, w tym 2097 genów zwykłych regulacji i 1616 obniżonych regulacji. Wyniki wykazały, że DEG były głównie wzbogacone o szlaki immunologiczne i zapalne. Trzy czynniki związane ze zapaleniem – CCL3, CCL4 i CXCL1 – zostały uznane za główne geny hubowe w procesie patologicznym AP. Analiza infiltracji immunologicznej wykazała odrębne mikrośrodowisko u AP, charakteryzujące się znaczącym wzrostem makrofagów M0 oraz redukcją liczby komórek CD8⁺ T, aktywowanych komórek NK oraz spoczynkowych komórek tucznych w AP. Podsumowując, te ustalenia proceduralne opisują różniczkową ekspresję CCL3, CCL4 i CXCL1 oraz ich związek ze zmienionym składem komórek odpornościowych w AP, podkreślając trzy chemokiny jako potencjalnych kandydatów do dalszych badań mechanistycznych.

Wprowadzenie

Choroby sercowo-naczyniowe (CVD) stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi na całym świecie¹. Wraz z nasileniem się globalnego trendu starzenia się populacji, rośnie również częstość zachorowań na^CVD. Wśród nich płytka miażdżycowa (AP) jest jedną z głównych przyczyn CVD³. AP to przewlekła choroba zapalna, charakteryzująca się stopniowym gromadzeniem lipidów w tętnicach oraz tworzeniem blaszek⁴. AP jest powszechną podstawą dla zdarzeń sercowo-naczyniowych i mózgowo-naczyniowych i obejmuje głównie duże i średnie tętnice, prowadzące do niedokrwienia i urazów, a także jest głównym czynnikiem powodującym choroby sercowo-naczyniowe i śmierć^5. Ze względu na brak widocznych objawów we wczesnych stadiach, AP zwykle jest zaawansowane w momencie diagnozy, co skutkuje wysoką śmiertelnością⁶. Leczenie AP koncentruje się na czynnikach ryzyka, w tym na czynnikach modyfikowalnych, takich jak niska aktywność fizyczna, siedzący tryb życia, palenie, problemy ze zdrowiem psychicznym^{7 oraz} otyłość i cukrzyca typu 2 spowodowane dietą wysokotłuszczową, a także na czynnikach niemodyfikowalnych, takich jak geny, wiek i płeć⁸. Najnowsze badania wykazały, że zespół metaboliczny, homocysteinemia, hiperurycemia oraz oporność trzustki są ważnymi czynnikami ryzyka wystąpienia i rozwoju miażdżycy ^9,10.

Teorie związane z patogenezą AP obejmują głównie teorie infiltracji lipidów, stanu zapalnego, reakcji stresu oksydacyjnego, infekcji oraz interakcji między czynnikami genetycznymi a środowiskowymi^11,12. Wśród nich zapalenie i stres oksydacyjny są uznawane za główną patogenezę AP i uczestniczą we wszystkich procesach od powstania przez rozwój aż po degradację AP¹³. Nagłe uszkodzenie niestabilnej płytki AP, aktywacja płytek krwi i zakrzepica są ważnym patogenem zawału mięśnia sercowego i udaru krwotocznego¹⁴. Dzięki ciągłym badaniom stwierdzono, że AP zawierają nie tylko lipidy, ale także wiele komórek zapalnych¹⁵. Palenie palenia, nadciśnienie, zaburzenia lipidów, hiperinsulinemia, hiperglikemia, wysoki poziom kwasu moczowego i inne szkodliwe bodźce powodują, że białe krwinki i komórki śródbłonkowe nieustannie uwalniają rozpuszczalne cząsteczki adhezji i różne cytokiny oraz sprzyjają przyleganiu monoocytów do komórek śródbłonka naczyniowego. Nagromadzone chemokiny prowadzą dalej do migracji monocytów do przestrzeni podśródbłonkowej i ich różnicowania się w makrofagi, które następnie fagocytują bogate w cholesterol utlenione lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) w tkance, przekształcając się w komórki piankowe i inicjując powstawanie lipidowych smugów¹⁶. Wczesne patologiczne uszkodzenia AS, czyli smużek lipidowych, składają się głównie z makrofagów i limfocytów T, które są typową zmianą zapalną¹⁷. Dlatego różne komórki zapalne i ich produkty biorą udział w inicjacji i postępie AP¹⁸. Jednak krajobraz zapalny AP jest złożony i obejmuje wiele znanych, a potencjalnie nieznanych czynników. Tradycyjne podejścia genów kandydatów mogą nie uchwycić pełnego spektrum czynników zapalnych.

Aby rozwiązać to ograniczenie, zastosowaliśmy sekwencjonowanie RNA (RNA-seq), bezstronną metodę transkryptomiczną o wysokiej przepustowości. To podejście jest szczególnie odpowiednie w badaniach generujących hipotezy, gdzie kluczowe czynniki molekularne nie są z góry zdefiniowane. W przeciwieństwie do metod opartych na genach kandydatskich lub mikromacierzach, RNA-seq oferuje szerszy zakres dynamiczny, wyższą czułość oraz możliwość wykrywania nowych transkrypcji bez wcześniejszego projektowania sond^19,20. Te cechy sprawiają, że jest szczególnie odpowiedni do wykrywania sygnatur związanych ze stanem zapalnym u AP, gdzie podstawa molekularna pozostaje niedo do końca scharakteryzowana.

W tym badaniu przeprowadzono RNA-seq w celu analizy mechanizmów ukrytych czynników zapalnych związanych z AP. Do przesiewu serii DEG użyto narzędzi bioinformatycznych wykorzystujących różne algorytmy. Następnie przeprowadzono analizę wzbogacenia (WGCNA, szlak KEGG, mcode, GSEA, analiza genów hub) oraz analizę sieci interakcji białko-białko (PPI). Wyniki tego badania przyczyniają się do lepszego zrozumienia molekularnego mechanizmu patologicznego leżącego u podstaw zapalnych AP i odgrywają ważną rolę w poszukiwaniu nowych biomarkerów.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Ludowego w Liaocheng (numer zatwierdzenia: 2023014) i zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Wszyscy uczestnicy uzyskali świadomą zgodę. Formularze świadomej zgody podpisywali wszyscy pacjenci lub ich rodziny.

Pacjenci i próbki

Badanie to przeanalizowało retrospektywnie 11 pacjentów z ciężką stenozą tętnicy szyjnej, którzy przeszli endarterektomię szyjnej w Dziale Neurochirurgii Naczyniowej w Liaocheng People's Hospital, prowincja Shandong, Chiny, od stycznia 2023 do grudnia 2023 roku. Pacjenci ci byli zaliczani do grupy AP. Diagnoza stenozy tętnicy szyjnej opierała się na danych obrazowych, takich jak CTA lub angiografia mózgowa. Kryteria włączenia do grupy AP to: (1) wiek od 50 do 80 lat; (2) tomografia komputerowa, angiografia/angiografia cyfrowego odejmowania, potwierdzona jest zwężenie śródczaszkowej tętnicy szyjnej wewnętrznej ≥70%; (3) przed rozpoczęciem zmodyfikowanego wyniku Skali Rankina ≤ 1; (4) świadomą zgodę uzyskaną od pacjenta lub jego przedstawiciela prawnego. Kryteria wykluczenia to: (1) choroby zapalne lub immunologiczne; (2) obecność zaburzeń psychiatrycznych; (3) obecność nowotworów złośliwych; (4) ciąża, laktacja lub potencjał płodny. Dopasowany wiek Pacjenci z ciężkim urazem mózgu, którzy przeszli dawstwo narządów w tym samym szpitalu w tym samym okresie, zostali wybrani do grupy kontrolnej (NA; Kontrola normalna, n = 3). Uczestnicy z obu grup byli dopasowani pod kątem wieku, płci i wskaźnika masy ciała, aby wyeliminować czynniki zakłócające. Kryteria włączenia dla grupy kontrolnej to: (1) wiek między 50 a 80 lat; (2) brak historii choroby wieńcowej, stenozy tętnicy szyjnej lub innych chorób naczyniowych ogólnoustrojowych; (3) świadomą zgodę uzyskaną od prawnego przedstawiciela pacjenta. Próbki intymnej tętnicy szyjnej i płytki nazębnej pobrano z grupy AP podczas endarterektomii szyjnej, natomiast próbki intymnej aorty pobrano od grupy kontrolnej po dawce narządów. Tkanki naczyniowe i płytkowe były przechowywane w zbiornikach z ciekłym azotem do dalszych badań. Charakterystyki wyjściowe pacjentów z AP przedstawiono w Tabeli 1.

Przygotowanie próbki

Całkowita ekstrakcja RNA została wyekstrahowana za pomocą odczynnika TRIzol zgodnie z zaleceniami producenta. Stężenie i czystość RNA oceniano za pomocą spektrofotometru Nanodrop ND-2000 przy 260 nm i 280 nm (stosunek A260/A280 między 1,8 a 2,0). Integralność RNA oceniono za pomocą elektroforezy żelu 2% agarozowego przy napięciu 100 V przez 30 minut. Wartości integralności RNA (RIN) uzyskano za pomocą bioanalizatora Agilent 2100 (próbki z RIN ≥ 7,0 użyto do analizy końcowej). Wszystkie procedury obsługi próbek i ekstrakcji RNA wykonywano w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Odpady TRIzol zostały utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi niebezpiecznych odpadów chemicznych.

Sekwencjonowanie RNA

Po obróbce DNazą I całkowitego RNA, mRNA zostało wzbogacone za pomocą magnetycznych kulek oligo D(T), a następnie rozbite na krótkie fragmenty w temperaturze 94 °C przez 5 minut. Powstałe fragmenty mRNA służyły jako szablon, a losowy oligonukleotyd jako primer. CDNA pierwszej nici zostało zsyntetyzowane za pomocą systemu transkryptazy odwrotnej M-MuLV w temperaturze 42 °C przez 50 minut, po czym nastąpiła degradacja nici RNA za pośrednictwem RNazy H. Synteza drugiej nici została przeprowadzona przy użyciu dNTP w układzie polimerazy DNA I. Dwuniciowe cDNA zostało oczyszczone, końce naprawione, a następnie ogońcone nawiasem "A", aby ułatwić ligację adaptera. Koraliki AMPure XP zostały wykorzystane do wyboru fragmentów cDNA o masie 250-300 bp, które następnie były amplifikowane za pomocą PCR. Następnie wzmocnione produkty zostały oczyszczone, aby stworzyć ostateczną bibliotekę. Sekwencjonowanie biblioteczne wykonywano na platformie Illumina HiSeq z parowaną długością odczytu 150 bp. Dla kontroli jakości danych (QC) surowe dane zawierające sekwencje adaptorów lub bazy niskiej jakości były filtrowane za pomocą własnych skryptów. Ze względu na błędy sekwencjonacyjne, które mogą powstać w przypadku instrumentu, jakość danych oceniano poprzez analizę rozkładu wskaźników błędów sekwencjonowania (wskaźnik błędów < 1% uznano za akceptowalny). Dodatkowo ustalono rozkład treści GC. Wszystkie procedury sekwencjonowania wykonywano w temperaturze otoczenia, chyba że zaznaczono inaczej. Odczynniki zawierające niebezpieczne chemikalia (np. bufory DNazy I) zostały utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego dotyczącego biobezpieczeństwa.

Progi kontroli jakości i rozwiązywanie problemów

Użyto tylko próbek o RIN ≥ 7.0 oraz bibliotek o rozmiarze fragmentów 250–300 bp. Wymagano minimum 14 milionów surowych odczytów na próbkę przy Q30 ≥ 98%. Niską wydajność biblioteki rozwiązano poprzez zwiększenie liczby cykli PCR do 18, ale preferowano 15 cykli, aby utrzymać wskaźnik duplikatów poniżej 15%.

Screening DEG

Oceniliśmy rozkład poziomów ekspresji genów w różnych próbkach. Do weryfikacji wiarygodności eksperymentu i odpowiedniości doboru próbek wykorzystano korelację między próbkami poziomów ekspresji genów. Zastosowano analizę głównych komponentów (PCA) do oceny różnic między grupami oraz reprodukcji wewnątrzgrupowej. DEG zostały zidentyfikowane za pomocą bazy danych Metascape online (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1). DEG zostały zdefiniowane jako te z |log₂(zmiana foldu) | > 1 i wartość p.-wartość < 0,05, które uznano za statystycznie istotne. Wszystkie analizy bioinformatyczne były przeprowadzane z użyciem domyślnych parametrów, chyba że zakreślono inaczej. Jako pośredni punkt kontrolny powtarzalności generowano wykresy PCA, aby potwierdzić, że próbki grupowane są grupami, a nie partiami.

Analiza wzbogacenia Encyklopedii Genów i Genomów w Kioto (KEGG)

Analiza KEGG (http://www.genome.jp/) to systematyczne podejście do oceny funkcji genów w celu odkrycia biologicznych szlaków regulacyjnych. Artykuł ten po raz pierwszy uzyskał oficjalny identyfikator genu różnicowego do konwersji symboli z org.Hs.eg (wersja 3.12.0). Analiza ścieżek KEGG została przeprowadzona za pomocą pakietu clusterProfiler w oprogramowaniu R (wersja 4.2.0). P. < 0,05 uznano za istotne statystycznie. Efektem pośrednim było stworzenie uporządkowanej listy wzbogaconych szlaków z odpowiadającą liczbą genów i skorygowanymi wartościami p.

Analiza sieci PPI

Do budowy sieci PPI i genu klucza ekranowego wykorzystano bazę danych STRING (wersja 11.0, https://string-db.org/). Tylko interakcje z łącznym wynikiem powyżej 0,9 zostały zachowane jako statystycznie istotne. Sieć została zwizualizowana i przeanalizowana za pomocą Cytoscape (wersja 3.10.1), otwartoźródłowego narzędzia bioinformatycznego zaprojektowanego do eksploracji sieci oddziaływania molekularnych. Geny hubów w sieci PPI zostały zidentyfikowane za pomocą wtyczki CytoHubba (wersja 0.1).

Gen hubu

Najpopularniejsze 20 kluczowych genów zostało wybranych przez wtyczkę CytoHubba. Czerwony oznacza wysoki poziom genu. Analiza bioinformatyczna genów hubów przeprowadzona przez bazę danych Metascape Online (wersja 3.5, http://metascape.org/gp/index) w celu analizy 20 genów hubów wcześniej. Wzbogacenie genów zostało zidentyfikowane w następujących klasach ontologicznych: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. Wszystkie geny w genomie służą jako tło wzbogacenia. Przeanalizowano pozycje o p. < 0,05, minimalnej liczbie 3 i współczynniku wzbogacenia > 1,5.

Metoda analizy statystycznej

Do analizy danych użyto oprogramowania statystycznego SPSS 25.0. Dane liczenia wyrażano jako częstotliwość lub procent, a porównanie między grupami testowano za pomocą testu chi-kwadrat. Dane pomiarowe były zgodne ze średnią ± odchyleniem standardowym rozkładu normalnego, a do porównania między grupami zastosowano test T. s. < 0,05 uznano za istotną różnicę.

Wyniki

Analiza danych RNA-seq genów różnicowych w płytkach miażdżycowych

Do przygotowania biblioteki użyto tylko próbek z RIN ≥ 7.0. Wszystkie 14 próbek (11 AP, 3 kontrolne) przekroczyło ten próg. Wszystkie próbki zostały zsekwencjonowane w jednej partii; dlatego nie było konieczne żadne dostosowanie efektu wsadowego. Średnio generowano 16,8 miliona surowych odczytów na próbkę; Po jakościowym filtrowaniu zachowano 16,5 miliona czystych odczytów (98%), z czego 91% zostało unikalnie przypisanych do ludzkiego genomu referencyjnego (HG38). Analiza DEG wykazała, że u pacjentów z blaszkami miażdżycy w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 1A) odnotowano 2097 genów z wyższą regulacją i 1616 obniżonych (|log2FC| >1, P <0,05). Mapa ciepła 20 najwyżej zregulowanych i obniżonych genów różnicowo ekspresowanych została pokazana na Rysunku 1B. Sekwencjonowanie RNAseq transkryptomu ujawniło korelacje próbek (Rysunek 1C). Korelację między współekspresyjnymi modułami genowymi a fenotypami analizowała WGCNA (Rysunek 1D). Analiza PCA wykazała istotną różnicę między grupą NA a AP (P.< 0,05) (Rysunek 1E).

Analiza wzbogacania genów różnicowych metodą KEGG

Analiza wzbogacenia szlaków KEGG za pomocą pakietu clusterProfiler w oprogramowaniu R (wersja 4.2.0) została przeprowadzona oddzielnie na genach różnicowo ekspresowanych w grupie chorobowej (Rysunek 2A,B). Wyniki wykazały, że te geny były istotnie wzbogacone w szlaki związane z odpornością i stanem zapalnym, takie jak linia komórkowa hematopoetyczne, reumatoidalne zapalenie stawów, ogniskowa adhezja, sygnalizacja integrina oraz szlak sygnalizacyjny chemokinowy.

Analiza GSEA

Analiza GSEA wykazała, że geny rdzeniowe w grupie eksperymentalnej były głównie wzbogacone na górze, co pokazuje tendencję do upregulacji (Rysunek 3A). Geny podstawowe w grupie kontrolnej były głównie wzbogacone na dole, wykazując trend spadkowy (Rysunek 3B). Podsumowując, geny zapalne były zwiększo-regulowane w grupie eksperymentalnej (ASA), a obniżone w grupie kontrolnej (NA).

Analiza sieci PPI

W sieci PPI analizowanej za pomocą bazy danych STRING (wersja 11.0) węzły dzielące ten sam identyfikator klastra zwykle znajdują się blisko siebie. Jak pokazano na rysunku 4A, to skupienie wykazało, że odpowiadające im geny są przede wszystkim zaangażowane w regulację aktywacji komórek, odpowiedzi zapalnej i aktywacji komórek. Rysunek 4B przedstawił tę samą sieć oznaczoną wartościami p, gdzie klastry zawierające więcej genów wykazują bardziej istotne wartości p.

Identyfikacja genów hubów i analiza infiltracji komórek odpornościowych

DEG zostały wybrane do analizy mcode i wyników analizy, które są głównie związane z receptorami acetylocholiny (Rysunek 5 i Tabela 2). Analiza genów hubów z użyciem wtyczki CytoHubba w Cytoscape zidentyfikowała 20 najważniejszych genów hubów, z których większość była powiązana z odpornością i stanem zapalnym (Rysunek 6A, lewy panel). Dziesięć głównych genów hubowych składało się z CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 i CCR5 (rysunek 6A, prawy panel). Przecięcie genów hub z genami panelu zapalnego olink 92 ujawniło 5 powszechnych genów, w tym CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 i CCL4 (Rysunek 6B). Analiza CIBERSORT wykazała istotne różnice w infiltracji komórek odpornościowych pomiędzy grupą chorobową a zdrowymi kontrolami. W porównaniu z grupą kontrolną, grupa chorobowa wykazywała znacząco wyższy udział makrofagów M0 (p < 0,05) (Rysunek 6C). Natomiast odsetek komórek T CD8, aktywowanych komórek NK oraz większości komórek spoczynkowych był istotnie niższy w grupie chorej (s. < 0,05 dla wszystkich) (Rysunek 6C).

Analiza funkcjonalna genów hubów

Dalej przeanalizowaliśmy biologiczną funkcję genu Hub przy użyciu bazy metascape, wykazując, że geny te są głównie powiązane ze szlakiem sygnalizacyjnym pośredniczonym przez cytokiny oraz sygnalizacją pośredniczącą przez wapń (Rysunek 7A i Tabela 3). Sygnatury typu komórkowego zostały następnie wykorzystane do wzbogacenia czynników regulacyjnych transkrypcji genu hub, wykazując, że geny hub są głównie powiązane z komórką gao grubego jelita grubego 24W C11 paneth podobną do panethu, cui rozwijającym się makrofagiem serca C8 oraz neurotypami manno śródmózgowia hmgl (rysunek 7B). Analiza wzbogacania chorób w bazie DisGeNET wykazała, że geny hubowe były powiązane ze zmianami skóry, infekcjami wirusem Epsteina-Barra oraz zapaleniem mózgu typu tick-bome (Rysunek 7C). Analiza wzbogacania cech tkanek w bazie PaGenBase wykazała, że geny hubów były głównie wzbogacone w śledzionie, krwi i płucach (Rysunek 7D). Ponadto analiza bazy danych TRRUST wykazała, że RELA i NFKB1 są głównymi czynnikami transkrypcyjnymi regulującymi geny hubów (rysunek 7E).

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:

Macierz przetworzonej liczby jest udostępniona jako pliki uzupełniające (Plik Uzupełniający 1 i Plik Uzupełniający 2). Wszystkie pozostałe dane są w pełni przedstawione w artykule. Surowe dane sekwencjonowania są dostępne od autora korespondencyjnego na rozsądną prośbę.

Rysunek 1: Analiza DEG. (A) Zdrowe blaszki i miażdżyce, różnicowa mapa genów wulkanu, podregulowana 2097, obniżona 1616 (|log2FC| > 1, P.< 0.05). (B) Mapa ciepła 20 najwyżej i obniżonych genów różnicowo ekspresowanych. (C) Analiza korelacji próbnych. (D)WGCNA analizowała korelację między współekspresyjnymi modułami genowymi a fenotypami. (E) analiza PCA (grupa NA była istotnie inna niż grupa AP). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Analiza KEGG. Analiza wzbogacenia szlaku KEGG została przeprowadzona oddzielnie dla genów różnicowo ekspresowanych w grupie chorobowej z podwyższoną (A) i obniżoną (B). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Analiza GSEA. (A) Analiza GSEA wykazała, że geny rdzeniowe w grupie eksperymentalnej były głównie wzbogacone na górze, co pokazuje tendencję wzrostu. (B) W grupie kontrolnej geny podstawowe były głównie wzbogacone na dole i wykazywały tendencję spadkową. Podsumowując, geny zapalne były zwiększo-regulowane w grupie eksperymentalnej (AP), a obniżone w grupie kontrolnej (NA). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Schemat sieci PPI. (A) Kolorowane według ID klastra, gdzie węzły o tym samym ID klastra zwykle znajdują się blisko siebie. (B) Kolorowanie wartościami P, gdzie elementy zawierające więcej genów mają bardziej istotne wartości P. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: analiza mcode DEGs. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Analiza genów hubu. (A) Top 20 hub genów (lewy panel) oraz top 10 hub gen (prawy panel) uzyskane metodą obliczenia stopni za pomocą wtyczki CytoHubba w Cytoscape, które są głównie powiązane z odpornością i stanem zapalnym. (B) Przecięcie genów hub i panelu zapalnego olink 92 geny zidentyfikowało 5 genów przecięcia. (C) Algorytm CIBERSORT został użyty do porównania obfitości infiltracji 22 podzbiorów komórek odpornościowych pomiędzy grupami AP i NA. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 7: Analiza bioinformatyczna genów hubów. (A) Funkcjonalna adnotacja genów hubów z wykorzystaniem bazy danych Metascape. (B) Analiza wzbogacenia regulatorów transkrypcji związanych z genami hubowymi opartą na sygnaturach typu komórkowego. (C) Analiza wzbogacenia chorób genów hubów przeprowadzona z użyciem bazy DisGeNET. (D) Tkankowo specyficzne wzorce ekspresji genów hubowych zidentyfikowane za pomocą bazy PaGenBase. (E) Transkrypcyjną sieć regulacyjną genów hubów analizowana przy użyciu bazy danych TRRUST. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

MCODE	IDŹ	Opis	Dziennik10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Wysoce przepuszczalne na wapń nikotynowe receptory acetylocholinowe	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Presynaptyczne receptory nikotynowej acetylocholiny	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Wysoce wapniowe postsynaptyczne receptory nikotynowe acetylocholinowe	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Kanały potasowe w tandemowej domenie porowej	-10.3
MCODE_2	DALEJ:0030322	Stabilizacja potencjału błonowego	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Faza 4 – potencjał spoczynkowy błony	-9.7

Tabela 1: Podstawowe cechy pacjentów z AP

MCODE	IDŹ	Opis	Dziennik10(P)
MCODE_1	DALEJ:0030322	Wysoce przepuszczalne na wapń nikotynowe receptory acetylocholinowe	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	Presynaptyczne receptory nikotynowej acetylocholiny	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	Wysoce wapniowe postsynaptyczne receptory nikotynowe acetylocholinowe	-16.7

Tabela 2: Analiza wzbogacenia MCODE dla DEG.

MCODE	IDŹ	Opis	Dziennik10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Wysoce przepuszczalne na wapń nikotynowe receptory acetylocholinowe	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Presynaptyczne receptory nikotynowej acetylocholiny	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Wysoce wapniowe postsynaptyczne receptory nikotynowe acetylocholinowe	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Kanały potasowe w tandemowej domenie porowej	-10.3
MCODE_2	DALEJ:0030322	Stabilizacja potencjału błonowego	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Faza 4 – potencjał spoczynkowy błony	-9.7

Tabela 3: Analiza wzbogacenia genu huba w MCODE.

Plik uzupełniający 1: Kontrola ekspresji genów (n=3).Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Pacjenci (n=10) gen podstawowej tabeli.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wraz z ciągłym pogłębianiem badań nad AP, nowe cytokiny są stale wykrywane w AP, a stan zapalny stał się ważnym czynnikiem w powstawaniu i rozwoju AS^21,22. Aktywacja albuminy może zerwać połączenie między komórkami śródbłonka a macierzą intymną naczynia naczyniowego i sprzyjać odklejaniu komórek śródbłonka od części naczyń intymnych. Wywołane uszkodzenie naczynia intymnego^23,24. Stan zapalny wywołuje oksydacyjne modyfikacje LDL-C, a zmodyfikowane LDL-C z kolei prowadzi do procesu zapalnego w bliskim obszarze tętnice, przyspieszając tym samym powstawanie AP²⁵. Niestabilne płytki mogą ostatecznie pęknąć i powodować ACS przy użyciu przyczyn wewnętrznych i zewnętrznych²⁶. Podczas pęknięcia płytki makrofagi, komórki mięśni gładkich naczyniowych (VSMC) oraz limfocyty wydzielają czynniki zapalne, takie jak interleukina leukocytów-1 (IL-1), IL-6, czynnik adhezji międzynaczyniowej-1 oraz czynnik adhezji międzykomórkowej-1. Równocześnie ekspresja integriny leukocytowej (CD11b/CD18), receptora na monocytach i granulocytach, wzrasta o^27,28. Jednak molekularny mechanizm zapalenia prowadzącego do powstawania AP pozostaje do dalszych badań.

Występowanie i rozwój AP wywołanego przez stan zapalny to złożony przebieg działania wieloczynnikowego, wielogenowej zmiany oraz choroby wieloetapowej, szczególnie ściśle związany z nieprawidłową ekspresją wielu genów. W tym badaniu analiza RNA-Seq oraz bioinformatyka wykazała, że pomiędzy zdrowymi tkankami kontrolnymi a AP, wykres wulkanu DEG wykazał 2097 genów zwykłych i 1616 obniżonych. Dalsza analiza wzbogacenia DEG przeprowadzona przez KEGG wykazała, że DEG były głównie wzbogacone o szlaki immunologiczne i zapalne. Analiza genów hub zidentyfikowała 10 najważniejszych genów hubów, w tym CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 i CCR5. Przecięcie genów hub z panelem zapalnym olink 92 wykazało 5 wspólnych genów, w tym CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 i CCL4. Wyniki te sugerują, że czynniki związane ze stanem zapalnym CCL3, CCL4 i CXCL1 mogą odgrywać kluczową rolę w procesie patologicznym AP. Analiza infiltracji immunologicznej wykazała odrębne mikrośrodowisko charakteryzujące się znaczącym wzrostem makrofagów M0 oraz redukcją liczby komórek CD8⁺ T, aktywowanych komórek NK oraz spoczynkowych komórek tucznych w płytkach nazębnych.

Makrofagi M0 stanowią niezaangażowaną grupę, która łatwo internalizuje utleniany LDL i różnica się w komórki piankowe, co jest kluczowym wydarzeniem we wczesnej aterogenezie²⁹. Zwiększony udział makrofagów M0 obserwowany w grupie chorobowej wskazuje na nagromadzenie tych komórek prekursorowych w mikrośrodowisku płytki. CCL4, produkowany głównie przez aktywowane makrofagi i limfocyty T, pełni rolę trwałego bodźca, który podtrzymuje aktywację makrofagów za pośrednictwem szlaku sygnalizacyjnego NFκB, wspiera ekspresję cząsteczek adhezji oraz indukuje metaloproteinazę matrycową-2 i -9, ułatwiając tym samym przejście makrofagów M0 do stanu pro-aterogicznego i bezpośrednio zaburzając stabilność płytki^{nazębnej 30}. Zmniejszony udział komórek T CD8⁺ może odzwierciedlać supresję podzbiorów komórek T za pośrednictwem CCL3. Komissarov i in. wykazali, że migracja limfocytów T do ludzkich blaszek miażdżycowych zachodzi głównie przez oś³¹ CCR5-CCL3. Ponadto Döring i ^in.32 odkryli niekanoniczną ścieżkę, dzięki której CCL17 sygnalizuje przez CCR8, indukując ekspresję CCL3, co z kolei tłumi różnicowanie regulacyjnych limfocytów T; genetyczna ablacja CCL3 w komórkach CD4⁺ T zwiększała wyniki Treg FoxP3⁺ i ograniczała miażdżycę, podczas gdy podawanie CCL3 pogłębiało chorobę i ograniczało różnicowanie Treg. Ta zmiana prawdopodobnie zmniejsza ateprotekcyjne regulatory komórek T CD8⁺, jednocześnie promując patogenne efektorowe limfocyty T, co skutkuje netto spadkiem udziału komórek T CD8⁺ zaobserwowanym w naszej analizie. Zmniejszenie aktywowanych komórek NK i spoczynku komórek tucznych prawdopodobnie odzwierciedla zmiany w stanie aktywacji, a nie całkowitą utratę tych populacji. Bonaccorsi i ^in.33 poinformowali, że objawowe płytki szyjne wykazują zwiększoną infiltrację komórek NK i produkcję IFN-γ, co bezpośrednio łączy aktywację komórek NK z kliniczną niestabilnością płytki. W przypadku komórek tucznych Wezel i ^in.34 wykazali, że chemokiny uwalniane z aktywowanych komórek tucznych, szczególnie CXCL1, indukują rekrutację neutrofili przez oś CXCL1/CXCR2, co nasila trwającą odpowiedź zapalną i sprzyja progresji i destabilizacji blaszki nazębnej. W związku z tym zmniejszony odsetek aktywowanych komórek NK i spoczynkowych komórek tucznych prawdopodobnie odzwierciedla ich aktywację, degranulację lub wyczerpanie w środowisku płytkowym zapalnym, a nie rzeczywiste wyczerpanie liczbowe.

Istnieje kilka ograniczeń tego badania. Po pierwsze, to badanie opiera się wyłącznie na sekwencjonowaniu transkryptomu i jest ograniczone przez niewielką wielkość próby. Poza ograniczoną wielkością próby, należy zwrócić uwagę na kilka ograniczeń technicznych protokołu RNA-seq. Bulk RNA-seq maskuje heterogeniczność komórkową; Potrzebne są podejścia jednokomórkowe, aby rozróżnić specyficzną dla typu komórki ekspresję CCL3, CCL4 i CXCL1. Computational Immune Deconvolution (CIBERSORT) dostarcza jedynie szacunków, a nie bezpośrednich pomiarów. Obfitość RNA nie zawsze koreluje z poziomem białka; wymagana jest walidacja ortogonalna. Przyszłe badania powinny uwzględnić te ograniczenia poprzez wykorzystanie transkryptomiki pojedynczej komórki, większych i niezależnych kohort oraz ortogonalnej walidacji białek.

Podsumowując, przedstawione wyniki podkreśliły ważną rolę czynników zapalnych w procesie patofizjologicznym AP. Ponadto zidentyfikowaliśmy geny hubowe CCL3, CCL4 i CXCL1, które mogą tworzyć skoordynowaną sieć chemokinową napędzającą miażdżycę poprzez promowanie akumulacji makrofagów M0, tłumienie ochronnych podzbiorów limfocytów T oraz zmianę stanów aktywacji komórek NK i tucznych. Ogólnie rzecz biorąc, te wyniki podkreślają trzy chemokiny jako kluczowe regulatory mikrośrodowiska immunologicznego blaszki nazębnej oraz potencjalne cele terapeutyczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
TRIzol	Invitrogen	15596026CN	Ekstrakcja RNA
Nanodrop ND-2000 spektrofotometr	Thermo Fisher Scientific	ND2000	Wykrywanie stężenia RNA
Agilent 2100 bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Kontrola jakości RNA
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	Sekwencjonowanie transkryptomu
Magnetyczne koraliki Oligo D (T)	New England Biolabs	S1550S	Wzbogacenie RNA