Method Article

Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma standardowego testu neutralizacji wirusa dostępnego dla wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV), niecytopatycznego wirusa RNA z dodatnią polaryzacją. Tutaj opisano test neutralizacji oparty na redukcji fluorescencji (FRNT) – oparty na ilościowym zważeniu białka kapsydu wirusa z oznaczeniem fluorescencyjnym do oceny skuteczności przeciwciał przeciwko HEV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test neutralizacji wirusowej mierzy potencjał neutralizacji przeciwciała lub mieszaniny przeciwciał przeciwko odpowiedniemu wirusowi. Jest to wartościowa technika do oceny skuteczności kandydatów na szczepionki i przeciwciał neutralizujących opracowanych przeciwko wirusowi. Test neutralizacji z redukcją płytek (PRNT) jest popularną metodą do oceny tytru przeciwciał neutralizujących specyficznych dla wirusa. Jednak PRNT nie jest wykonalny w przypadku wirusów niecytopatycznych. Wirus zapalenia wątroby typu E (HEV) jest wirusem RNA o dodatnim ładunku, pojedynczego łańcucha, należącym do rodziny Hepeviridae. Jest główną przyczyną ostrej wirusowej hepatit w skali światowej. Nie wykazuje żadnego efektu cytopatycznego w hodowli komórek ssaków. Szczepionka przeciwko HEV jest dostępna w Chinach. Jednak szczepionki lub przeciwciała terapeutyczne przeciwko HEV nie są dostępne w większości świata. Kilka laboratoriów pracuje nad kandydatami na szczepionki przeciwko HEV. Test neutralizacji do oceny skuteczności szczepionek przeciwko HEV będzie bardzo przydatnym narzędziem dla badaczy. Opisujemy tu test neutralizacji z redukcją fluorescencji (FRNT) do oszacowania 50% tytru neutralizacji (NT50) przeciwciał przeciwko HEV. Przeciwciała przeciwko HEV z neutralizowanym ORF2 lub neutralizowany HEV IgG królika zostały użyte do zakażenia komórek Huh7, po czym przeprowadzono immunofluorescencyjne barwienie białka ORF2 wirusa. Liczba fluorescencyjnych pozytywnych komórek została określona w aplikacji ImageJ, a NT50 oszacowano na 2,1 x 103. Ta metoda może być zastosowana do oszacowania NT50 przeciwciał przeciwko HEV obecnych w surowicy myszy szczepionych, surowicy osób wyzdrowiałych z HEV oraz przeciwciałach przeciwko HEV produkowanych w laboratorium.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus zapalenia wątroby typu E (HEV) jest dodatnio-pasmowym, jednoniciowym wirusem RNA, który należy do rodziny Hepeviridae1,2. Zazwyczaj powoduje samoograniczające się ostre zapalenie wątroby, ale może powodować przewlekłe zapalenie wątroby u osób z obniżoną odpornością3,4. Kobiety w ciąży mają wysokie ryzyko rozwoju fulminancyjnego niewydolności wątroby, przy czym wskaźnik śmiertelności wzrasta do 30%5. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zgłosiła około 19,47 miliona przypadków ostrego zapalenia wątroby typu E (AHE) i 3450 zgonów spowodowanych przez HEV na całym świecie w 2021 roku6. HEV jest przenoszone w krajach rozwijających się głównie poprzez zanieczyszczoną żywność i wodę, z powodu złej sanitacji, podczas gdy sporadyczna infekcja zawodowa w krajach rozwiniętych jest związana z konsumpcją surowego lub niedostatecznie ugotowanego mięsa6. HEV jest klasyfikowany na osiem genotypów. Genotyp (g) 1- i g2- HEV zakaża wyłącznie ludzi. g3- i g4-HEV mają szerokie grono gospodarzy, takich jak ludzie, króliki, świnie, dziki i jelenie. g5- i g6-HEV zakażają dziki, podczas gdy g7- i g8-HEV zakażają wielbłądy. Pojedynczy przypadek ludzkiej transmisji g7-HEV został zgłoszony na Bliskim Wschodzie poprzez spożycie mięsa i mleka wielbłądów7,8. Infekcja HEV jest najczęstsza w krajach o niskim i średnim dochodzie. Kilka wodorodnych wybuchów chorób zostało zgłoszonych w endemicznych regionach Południowej i Południowo-Wschodniej Azji, Afryki i Meksyku, głównie spowodowanych przez infekcję g1- i mniej często g2-HEV. Sporadyczne przypadki infekcji zawodowej w krajach rozwiniętych w Europie i Azji Wschodniej są głównie spowodowane przez g3-HEV6,7.

Genom HEV to plus-pasmowa RNA o długości 7,2 kb zawierająca 7-metyloguaninową czapeczkę na końcu 5′, trzy otwarte ramki odczytu (ORF) i poliadenylowane końce 3’. ORF1 koduje białko niestrukturalne poliproteiny, złożone z siedmiu różnych domen: Metylotransferaza (Met), domena Y, papainowa proteaza cysteinowa (PCP), domena V, makrodoména (domena X), helikaza (Hel) i RNA-zależna polimeraza RNA (RdRp). ORF2 koduje białko kapsydu, odpowiedzialne za montaż kapsydu wirusa. ORF3 koduje fosfoproteinę, która działa jako wiroporina i pomaga w uwolnieniu wirusa9. Dodatkowa otwarta rama odczytu, ORF4, jest obecna w g1-HEV, która jest translatowana poprzez mechanizm niezależny od czapeczki, z użyciem wewnętrznego elementu przypominającego miejsce wejścia rybosomalnego, zlokalizowany w obrębie ORF1. Ekspresja ORF4 jest wzmacnana przez związki indukujące stres śródplazmatyczny. ORF4 ma być zaproponowany do promowania montażu kompleksu replikacyjnego g1-HEV10.

Mimo że HEV nie replikuje się skutecznie in vitro, niektóre szczepy wirusa, izolowane od pacjentów z zapaleniem wątroby E, zostały z powodzeniem propagowane w hepatocytach, linii komórek płuc i linii komórek nabłonkowych jelita grubego11. Jednakże trudno jest propagować wirusa mocno w hodowlach komórkowych. Zakażająca kopia cDNA g1-HEV (szczep Sar55) została użyta do badań in vitro, ale dotychczas nie udało się osiągnąć efektywnej produkcji i propagacji szczepów g1-HEV w hodowlach komórkowych. Niektóre szczepy g3- i g4-HEV rosną lepiej w hodowlach komórkowych12. Niemniej jednak, wyczyszczony wirus uzyskiwany z komórek przetransfekowanych in vitro przetranskrypcyjną i uczapeczkowaną RNA genomową HEV p6 nie jest wystarczający do wielu analiz. Co więcej, wszystkie cząsteczki HEV produkowane w hodowlach komórkowych są prawie otoczone otoczkami, co wpływa na ich zakaźność. W przeciwieństwie do tego, HEV znajdujący się w zanieczyszczonej żywności i wodzie nie ma otoczki i jest bardzo zakaźny. HEV obecny w kale pacjenta nie ma otoczki i jest częstym źródłem naturalnej infekcji. Dlatego użycie HEV wyczyszczonego z kału pacjenta zapewnia efektywną infekcję w systemie hodowlanym komórek ssaczych. Nasze wcześniejsze badania wykazały niezawodność wyczyszczonego g1-HEV z kału pacjenta w ilościowej ocenie replikacji wirusa w ludzkich komórkach hepatoma (Huh7). Wyczyszczony wirus przechowywany w -80 °C zachowuje zakaźność przez kilka lat i został wykorzystany w wielu niezależnych badaniach do oszacowania replikacji wirusowej10,13,14,15. To badanie zaprojektowało test neutralizacji HEV przy użyciu wyczyszczonego g1-HEV uzyskanego od pacjenta. Wirus został wyczyszczony, oznaczony, scharakteryzowany i przechowywany w alikwotach w -80 °C do przyszłego użycia w testach neutralizacji. P

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zezwolenie instytucjonalnego komitetu etycznego (IEC) zostało uzyskane w celu pobrania próbki kału od pacjenta zakażonego wirusem HEV przyjętego na Oddział Gastroenterologii, AIIMS, New Delhi. Pacjenci wzięli udział w badaniu po uzyskaniu pisemnej zgody. Szczegóły reagentów i wykorzystanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Izolacja i ilościowa ocena wirusa

  1. Z pacjentem zakażonym wirusem HEV, po uzyskaniu pisemnej zgody, pobrać próbkę kału do oczyszczenia wirusa.
  2. Resuspendować próbkę kału w buforze fosforanowym Dulbecco (DPBS) w stężeniu końcowym 10% (w/v) i wirować przez 1h w temperaturze 4 °C przy prędkości 7800 x g.
    ​UWAGA: Podczas pobierania próbki kału od pacjenta zakażonego wirusem HEV używać rękawic, a obszar roboczy wyczyścić 70% etanolem po zakończeniu pracy (wszystkie kroki wykonywać w szafie biobezpieczeństwa).
  3. Zebrać surowiec i przefiltrować przez filtr 0,45 μm.
  4. Dodać 8% PEG6000 przygotowane w 0,4 M NaCl do surowiczego surowca i inkubować przez 16 h w temperaturze 0 °C.
  5. Wirować próbkę przez 30 min w temperaturze 4 °C przy prędkości 18 000 x g.
  6. Odstawić surowiec i resuspendować osadu w 40 mL Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. Skoncentrować surowca do objętości 5 mL przez filtrację przepływową (TFF) za pomocą 30 kDa przepustki membranowej. Przefiltrować przez filtr 0,2 μm w szafie biobezpieczeństwa, wykonać alikwoty i przechowywać w temperaturze -80 °C. Użyć jednej alikwoty do izolacji całkowitego RNA i wykonania RT-qPCR.
  8. Użyć wielu rozcieńczeń plazmidu pSK-HEV2 [wektor pBluscript zawierający cDNA zakaźnej klonu g1-HEV (Genbank ID: AF444002.1)] (1 ng do 0,000001 ng DNA/reakcja w 10x rozcieńczeniu szeregowym) do wykreślenia krzywej standardowej do ilościowej oceny RNA wirusowego.
  9. Wykreślić wykres z ilością DNA pSK-HEV2 na osi X i odpowiadającymi wartościami Ct na osi Y. Z wykresu standardowego wyznaczyć stężenie RNA wirusowego.
  10. Ilościowo ocenić poziom RNA g1-HEV z wykresu standardowego i obliczyć liczbę kopii genomu wirusa według wzoru: Liczba kopii = ng*(liczba/mol) / bazy *(ng/g)*(g/mol baz).

2. Zakażenie komórek Huh7 g1-HEV

  1. Pobrać flakon T75 zawierający komórki Huh7. Pod mikroskopem sprawdzić, czy komórki są konfluencyjne i zdrowe.
  2. Wybrać medię za pomocą aspiratora (wszystkie kroki wykonywać w szafie biobezpieczeństwa). Dodać 10 mL DPBS, zetrzeć i wybrać.
  3. Dodać 1 mL 0,05% roztworu trypsyny, upewniając się, że jest równomiernie rozprowadzona na powierzchni.
  4. Inkubować w inkubatorze CO2 przez 30-60 s, aż komórki będą w 90% odczepione.
  5. Dodać 5 mL pełnego medium, równomiernie rozprowadzić na całej powierzchni T75 i wielokrotnie pipetować, aby uzyskać jednorodną populację pojedynczych komórek wolną od agregatów.
  6. Przenieść zawiesinę komórek do 50 mL szybkiego probierka stożkowego, wirować przez 5 min w temperaturze pokojowej przy prędkości 200 x g.
  7. Wybrać medię hodowlane z probierka stożkowego w szafie biobezpieczeństwa.
  8. Dodać 5 mL pełnego medium do probierka, aby zawiesić komórki w jednorodnej zawiesinie poprzez delikatne pipetowanie.
  9. Pobrać 10 μL zawiesiny komórek i umieścić na szkiełku do liczenia komórek. Policzyć komórki w 4 kwaterach, obliczyć średnią/mL.
  10. Zasiewać 0,5 x 106 komórek/dołka w płytce 6-dołkowej w 2 mL DMEM (uzupełnione o 10% FBS).
  11. Następnego dnia usunąć medię, przepłukać 1 mL DPBS i dodać 50 μL wirusa g1-HEV (równoważne 4,5 x 104 kopiom genomu oczyszczonego g1-HEV) w 1 mL serum-wolnego medium (SFM).
  12. Inkubować komórki w inkubatorze CO2 5% w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  13. Przepłukać komórki 500 μL DPBS, a następnie dodać 2 mL pełnego medium (DMEM uzupełnione o 2% FBS).
  14. Inkubować komórki przez 72 h w inkubatorze CO2 5% w temperaturze 37 °C.
  15. Przeprowadzić dalsze badania.

3. Badanie RT-qPCR

  1. Usunąć medię wzrostowy z płytki 6-dołkowej (z kroku 2.15) i przepłukać komórki 1 mL DPBS.
  2. Dodać 1 mL TRI Reagent bezpośrednio do płytki 6-dołkowej w celu lizy komórek. Kilkukrotnie pipetować lizat w górę i w dół, a następnie przenieść do 1,5 mL mikroprobierka do wirowania.
    UWAGA: TRI reagent jest toksyczny w przypadku wdechni

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcja komórek Huh7 g1-HEV i charakterystyka wirusa

g1-HEV zostało izolowane z próbki kału za pomocą serii kroków, jak pokazano ( Rysunek 1A ). Liczbę kopii genomu oczyszczonego g1-HEV oszacowano za pomocą RT-qPCR, a następnie przechowywano w temperaturze -80 °C. Aby potwierdzić infekcję wirusową i replikację, komórki Huh7 zainfekowano 1,8 × 104 równoważnikami kopii genomu oczyszczonego surowicy g1-HEV przez 72 h, a następnie zastosow...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT to metoda oparta na immunobarwieniu służąca do oszacowania potencjału neutralizującego przeciwciał. Została zastosowana do oszacowania wartości NT50 dla przeciwciał przeciwko wielu wirusom, w tym wirusowi dengue (DENV), koronawirusowi odpowiedzialnemu za ciężki ostre zespół oddechowy -2 (SARS-CoV-2) oraz wirusowi japońskiego zapalenia mózgu (JEV)23,24,25. W tej metodzie wirus jest inkubiowany z przeciwciałem test...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to było częściowo sfinansowane z grantu Biotechnology Industry Research Assistance Council, Departament Biotechnologii, Rząd Indii, przyznanego MS, S i BN. Badania w laboratorium MS są wspierane przez grant rdzenny z Translational Health Science and Technology Institute. SA jest wspierany przez stanowisko Project Research Scientist finansowane przez Indian Council of Medical Research, Rząd Indii. UB jest wspierany przez Senior Research Fellowship z Departament Biotechnologii, Rząd Indii.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning 3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNASyntetyzowany na zamówienie przez Genscript i charakteryzowany w naszym laboratorium14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Front Microbiol. 7, 1419(2016).
  3. Kamar, N., et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients. N Engl J Med. 358 (8), 811-817 (2008).
  4. Purcell, R. H., Emerson, S. U. Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease. J Hepatol. 48 (3), 494-503 (2008).
  5. Nimgaonkar, I., Ding, Q., Schwartz, R. E., Ploss, A. Hepatitis E virus: Advances and challenges. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 96-110 (2018).
  6. Hepatitis E. , WHO. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e (2025).
  7. Songtanin, B., et al. Hepatitis E virus infections: Epidemiology, genetic diversity, and clinical considerations. Viruses. 15 (6), 1389(2023).
  8. Lee, G. H., et al. Chronic infection with camelid hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and milk. Gastroenterology. 150 (2), 355-357 (2016).
  9. Zhou, Z., Xie, Y., Wu, C., Nan, Y. The hepatitis E virus open reading frame 2 protein: Beyond viral capsid. Front Microbiol. 12, 739124(2021).
  10. Nair, V. P., et al. Endoplasmic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E virus. PLoS Pathog. 12 (4), e1005521(2016).
  11. Meister, T. L., et al. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Res. 163, 34-49 (2019).
  12. Fu, R. M., Decker, C. C., Dao Thi, V. L. Cell culture models for hepatitis E virus. Viruses. 11 (7), 608(2019).
  13. Kaushik, N., et al. Zinc salts block hepatitis E virus replication by inhibiting the activity of viral RNA-dependent RNA polymerase. J Virol. 91 (21), 10-1128 (2017).
  14. Gupta, J., et al. Antiviral activity of zinc oxide nanoparticles and tetrapods against the Hepatitis E and Hepatitis C viruses. Front Microbiol. 13, 881595(2022).
  15. Ansari, S., et al. Network controllability analysis reveals the antiviral potential of Etravirine against hepatitis E virus infection. mSystems. 10 (9), e00438-25(2025).
  16. Gremmel, N., et al. Hepatitis E virus neutralization by porcine serum antibodies. J Clin Microbiol. 61 (11), e00373-23(2023).
  17. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Sci Rep. 6 (1), 25141(2016).
  18. Liu, C., et al. An optimized high-throughput neutralization assay for hepatitis E virus (HEV) involving detection of secreted Porf2. Viruses. 11 (1), 64(2019).
  19. Meng, J., Dubreuil, P., Pillot, J. A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E. J Clin Microbiol. 35 (6), 1373-1377 (1997).
  20. Emerson, S. U., et al. Putative neutralization epitopes and broad cross-genotype neutralization of Hepatitis E virus confirmed by a quantitative cell-culture assay. J Gen Virol. 87 (3), 697-704 (2006).
  21. Deshmukh, T. M., et al. Immunogenicity of candidate hepatitis E virus DNA vaccine expressing complete and truncated ORF2 in mice. Vaccine. 25 (22), 4350-4360 (2007).
  22. Gupta, J., et al. Expression, purification and characterization of the hepatitis E virus like-particles in the Pichia pastoris. Front Microbiol. 11, 141(2020).
  23. Guo, J., et al. Fluorescence Reduction Neutralization Test: A novel, rapid, and efficient method for characterizing the neutralizing activity of antibodies against dengue virus. Curr Issues Mol Biol. 47 (3), 140(2025).
  24. Bewley, K. R., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays. Nat Protoc. 16 (6), 3114-3140 (2021).
  25. Islam, M. D., et al. Neutralizing antibodies against the Japanese encephalitis virus are produced by a 12ákDa E coli expressed envelope protein domain III (EDIII) tagged with a solubility-controlling peptide. Vaccine. 56, 127143(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells

Related Articles