Method Article

Test neutralizacji fluorescencji przeciwciał neutralizujących miana przeciwciał neutralizujących przez wirusa wirusa zapalenia wątroby E E

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie istnieje standardowy test neutralizacji wirusa dla wirusa zapalenia wątroby E (HEV), niecytopatycznego wirusa z dodatnim łańcuchem RNA. Tutaj opisano test neutralizacji redukcji fluorescencji (FRNT) oparty na ilościowym określeniu fluorescencyjnego białka wirusowego kapsydu do oceny skuteczności przeciwciał przeciw HEV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test neutralizacji wirusa mierzy potencjał neutralizujący przeciwciało lub mieszaninę przeciwciał przeciwko odpowiedniemu wirusowi. Jest to cenna technika oceny skuteczności kandydatów na szczepionki oraz przeciwciał neutralizujących opracowanych przeciwko wirusowi. Test neutralizacji redukcji blaszki miażdżycyjnej (PRNT) jest popularną metodą oceny miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla wirusów. Jednak PRNT nie jest możliwe w przypadku wirusów niecytopatycznych. Wirus wirusa zapalenia wątroby E (HEV) to wirus jednoniciowego RNA o pozytywnym sensie, należący do rodziny Hepeviridae. Jest to główna przyczyna ostrego wirusowego zapalenia wątroby na całym świecie. Nie wykazuje żadnego efektu cytopatycznego w hodowli komórek ssaków. W Chinach dostępna jest szczepionka przeciwko HEV. Jednak szczepionki lub terapeutyczne przeciwciała przeciwko HEV nie są dostępne w większości świata. Kilka laboratoriów pracuje nad kandydatami na szczepionki przeciwko HEV. Test neutralizujący do pomiaru skuteczności szczepionek przeciwko HEV będzie bardzo przydatnym narzędziem dla badaczy. Tutaj opisujemy test neutralizacji redukcji fluorescencji (FRNT), mający na celu oszacowanie miany neutralizacji 50% (NT 50) przeciwciał przeciw HEV. Do zakażenia komórek Huh7 zastosowano anty-HEV zneutralizowany ORF2, czyli rabbit IgG-neutralizowany HEV, a następnie wykonano barwienie immunofluorescencyjne wirusowego białka ORF2. W aplikacji ImageJ zidentyfikowano fluorescencyjne komórki pozytywne, a NT50 oszacowano na 2,1 x 103. Metoda ta może być stosowana do oszacowania NT50 przeciwciał przeciw HEV obecnych w surowicy zaszczepionych myszy, w surowicy odzyskanej po HEV oraz w laboratorium przeciwciałach przeciw HEV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus wirusa zapalenia wątroby E (HEV) to wirus jednoniciowego RNA o pozytywnym sensie, należący do rodziny Hepeviridae 1,2. Zazwyczaj powoduje samoograniczające się ostre zapalenie wątroby, ale może powodować przewlekłe zapalenie wątroby u osób z obniżoną odpornością 3,4. Kobiety w ciąży są narażone na wysokie ryzyko rozwoju niewydolności wątroby z fulminatem, a śmiertelność wzrasta nawet do 30%5. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zgłosiła około 19,47 miliona przypadków ostrego zapalenia wątroby typu E (AHE) oraz 3450....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskano zgodę komisji etyki instytucjonalnej (IEC) na pobranie próbki kału od pacjenta zakażonego HEV przyjętego do Oddziału Gastroenterologii AIIMS w Nowym Delhi. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów biorących udział w badaniu. Szczegóły dotyczące odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja i ilościowość wirusa

  1. Za świadomą zgodą pobierz próbkę kału od pacjenta zakażonego HEV w celu oczyszczenia wirusa.
  2. Ponownie zawiesić próbkę kału w soli buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco przy stężeniu końcowym 10% (w/v) i wirować w 7800 x g przez 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie komórek Huh7 g1-HEV oraz charakterystyka wirusa

G1-HEV został wyizolowany z próbki kału za pomocą serii kroków, jak pokazano (Rysunek 1A). Liczba kopii genomu oczyszczonego g1-HEV została oszacowana za pomocą RT-qPCR, a następnie przechowywano ją w temperaturze -80 °C. Aby potwierdzić infekcję wirusową i replikację, komórki Huh7 zostały zainfekowane 1,8 × 10 kopiamigenomu 4 oczyszczonego zapasu g1-HEV przez 72 godziny, a nastę.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT to metoda oparta na immunodbarwieniu do szacowania potencjału neutralizującego przeciwciał. Był używany do szacowania wartości NT50 przeciwciał przeciwko wielu wirusom, w tym wirusowi dengi (DENV), koronawirusowi z ciężkim ostrym zespołem oddechowym (SARS-CoV-2) oraz wirusowi zapalenia mózgu japońskiego (JEV)23,24,25. W tej metodzie wirus jest inkubowany za pomocą przeciwciała testowego (surowictwa), po czym nast.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te zostały częściowo sfinansowane z grantu od Biotechnology Industry Research Assistance Council, Departamentu Biotechnologii rządu Indii, przyznanego MS, S i BN. Badania w laboratorium MS są wspierane przez podstawowy grant od Translational Health Science and Technology Institute. SA jest wspierany przez stanowisko Project Research Scientist finansowane przez Indian Council of Medical Research, rząd Indii. UB jest wspierane przez starsze stypendium badawcze z Departamentu Biotechnologii rządu Indii.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL mikrofugowych probówekAxygenMCT-150-C
Naczynie do hodowli komórek z 12 dołkamiCorning3512
Wstrząsająca inkubator 37 stopniThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-fenylindolAbcamAB104139DAPI
Rurka wirówkowa 50 mLFalcon352070
Naczynie hodowli komórek 6-dołkowyCorning  3516
Alexa mąka 594 przeciwciało wtórne IgGThermo ScientificA-11012
Przeciwciało anty-ORF2GenskryptNASpecjalnie zsyntetyzowane przez Genscript i scharakteryzowane w naszym laboratorium14
Przeciwciało IgG przeciw królikomGenskryptNA
Albumina surowicy bydlęcejHIMEDIAMB083BSA
Mikroskop konfokalnyOlympusFV3000
DMEM, wysoki poziom glukozyHIMEDIAAL007A
Serum bydlęce płodoweGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband i współautorzy, NIH, USA)
Normalne surowiczki kozyHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydHIMEDIAGRN3660PFA
Fosforanowa puforowa sól fizjologiczna pH 7,4HIMEDIATL1006PBS
Polietylenglikol 6000SIGMA81255PEG6000
Zestaw sondy SOLIScript 1-stepSOLIS BIODYNE08-57-00250
Odczynnik TRICentrum Badań MolekularnychTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Fron....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells
Video Coming Soon

Related Articles