Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących

160 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69892

⸱

22 maja 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

W tym artykule

Podsumowanie

Nie ma standardowego testu neutralizacji wirusa dostępnego dla wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV), niecytopatycznego wirusa RNA z dodatnią polaryzacją. Tutaj opisano test neutralizacji oparty na redukcji fluorescencji (FRNT) – oparty na ilościowym zważeniu białka kapsydu wirusa z oznaczeniem fluorescencyjnym do oceny skuteczności przeciwciał przeciwko HEV.

Streszczenie

Test neutralizacji wirusowej mierzy potencjał neutralizacji przeciwciała lub mieszaniny przeciwciał przeciwko odpowiedniemu wirusowi. Jest to wartościowa technika do oceny skuteczności kandydatów na szczepionki i przeciwciał neutralizujących opracowanych przeciwko wirusowi. Test neutralizacji z redukcją płytek (PRNT) jest popularną metodą do oceny tytru przeciwciał neutralizujących specyficznych dla wirusa. Jednak PRNT nie jest wykonalny w przypadku wirusów niecytopatycznych. Wirus zapalenia wątroby typu E (HEV) jest wirusem RNA o dodatnim ładunku, pojedynczego łańcucha, należącym do rodziny Hepeviridae. Jest główną przyczyną ostrej wirusowej hepatit w skali światowej. Nie wykazuje żadnego efektu cytopatycznego w hodowli komórek ssaków. Szczepionka przeciwko HEV jest dostępna w Chinach. Jednak szczepionki lub przeciwciała terapeutyczne przeciwko HEV nie są dostępne w większości świata. Kilka laboratoriów pracuje nad kandydatami na szczepionki przeciwko HEV. Test neutralizacji do oceny skuteczności szczepionek przeciwko HEV będzie bardzo przydatnym narzędziem dla badaczy. Opisujemy tu test neutralizacji z redukcją fluorescencji (FRNT) do oszacowania 50% tytru neutralizacji (NT50) przeciwciał przeciwko HEV. Przeciwciała przeciwko HEV z neutralizowanym ORF2 lub neutralizowany HEV IgG królika zostały użyte do zakażenia komórek Huh7, po czym przeprowadzono immunofluorescencyjne barwienie białka ORF2 wirusa. Liczba fluorescencyjnych pozytywnych komórek została określona w aplikacji ImageJ, a NT50 oszacowano na 2,1 x 103. Ta metoda może być zastosowana do oszacowania NT50 przeciwciał przeciwko HEV obecnych w surowicy myszy szczepionych, surowicy osób wyzdrowiałych z HEV oraz przeciwciałach przeciwko HEV produkowanych w laboratorium.

Wprowadzenie

Wirus zapalenia wątroby typu E (HEV) jest dodatnio-pasmowym, jednoniciowym wirusem RNA, który należy do rodziny Hepeviridae1,2. Zazwyczaj powoduje samoograniczające się ostre zapalenie wątroby, ale może powodować przewlekłe zapalenie wątroby u osób z obniżoną odpornością3,4. Kobiety w ciąży mają wysokie ryzyko rozwoju fulminancyjnego niewydolności wątroby, przy czym wskaźnik śmiertelności wzrasta do 30%5. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zgłosiła około 19,47 miliona przypadków ostrego zapalenia wątroby typu E (AHE) i 3450 zgonów spowodowanych przez HEV na całym świecie w 2021 roku6. HEV jest przenoszone w krajach rozwijających się głównie poprzez zanieczyszczoną żywność i wodę, z powodu złej sanitacji, podczas gdy sporadyczna infekcja zawodowa w krajach rozwiniętych jest związana z konsumpcją surowego lub niedostatecznie ugotowanego mięsa6. HEV jest klasyfikowany na osiem genotypów. Genotyp (g) 1- i g2- HEV zakaża wyłącznie ludzi. g3- i g4-HEV mają szerokie grono gospodarzy, takich jak ludzie, króliki, świnie, dziki i jelenie. g5- i g6-HEV zakażają dziki, podczas gdy g7- i g8-HEV zakażają wielbłądy. Pojedynczy przypadek ludzkiej transmisji g7-HEV został zgłoszony na Bliskim Wschodzie poprzez spożycie mięsa i mleka wielbłądów7,8. Infekcja HEV jest najczęstsza w krajach o niskim i średnim dochodzie. Kilka wodorodnych wybuchów chorób zostało zgłoszonych w endemicznych regionach Południowej i Południowo-Wschodniej Azji, Afryki i Meksyku, głównie spowodowanych przez infekcję g1- i mniej często g2-HEV. Sporadyczne przypadki infekcji zawodowej w krajach rozwiniętych w Europie i Azji Wschodniej są głównie spowodowane przez g3-HEV6,7.

Genom HEV to plus-pasmowa RNA o długości 7,2 kb zawierająca 7-metyloguaninową czapeczkę na końcu 5′, trzy otwarte ramki odczytu (ORF) i poliadenylowane końce 3’. ORF1 koduje białko niestrukturalne poliproteiny, złożone z siedmiu różnych domen: Metylotransferaza (Met), domena Y, papainowa proteaza cysteinowa (PCP), domena V, makrodoména (domena X), helikaza (Hel) i RNA-zależna polimeraza RNA (RdRp). ORF2 koduje białko kapsydu, odpowiedzialne za montaż kapsydu wirusa. ORF3 koduje fosfoproteinę, która działa jako wiroporina i pomaga w uwolnieniu wirusa9. Dodatkowa otwarta rama odczytu, ORF4, jest obecna w g1-HEV, która jest translatowana poprzez mechanizm niezależny od czapeczki, z użyciem wewnętrznego elementu przypominającego miejsce wejścia rybosomalnego, zlokalizowany w obrębie ORF1. Ekspresja ORF4 jest wzmacnana przez związki indukujące stres śródplazmatyczny. ORF4 ma być zaproponowany do promowania montażu kompleksu replikacyjnego g1-HEV10.

Mimo że HEV nie replikuje się skutecznie in vitro, niektóre szczepy wirusa, izolowane od pacjentów z zapaleniem wątroby E, zostały z powodzeniem propagowane w hepatocytach, linii komórek płuc i linii komórek nabłonkowych jelita grubego11. Jednakże trudno jest propagować wirusa mocno w hodowlach komórkowych. Zakażająca kopia cDNA g1-HEV (szczep Sar55) została użyta do badań in vitro, ale dotychczas nie udało się osiągnąć efektywnej produkcji i propagacji szczepów g1-HEV w hodowlach komórkowych. Niektóre szczepy g3- i g4-HEV rosną lepiej w hodowlach komórkowych12. Niemniej jednak, wyczyszczony wirus uzyskiwany z komórek przetransfekowanych in vitro przetranskrypcyjną i uczapeczkowaną RNA genomową HEV p6 nie jest wystarczający do wielu analiz. Co więcej, wszystkie cząsteczki HEV produkowane w hodowlach komórkowych są prawie otoczone otoczkami, co wpływa na ich zakaźność. W przeciwieństwie do tego, HEV znajdujący się w zanieczyszczonej żywności i wodzie nie ma otoczki i jest bardzo zakaźny. HEV obecny w kale pacjenta nie ma otoczki i jest częstym źródłem naturalnej infekcji. Dlatego użycie HEV wyczyszczonego z kału pacjenta zapewnia efektywną infekcję w systemie hodowlanym komórek ssaczych. Nasze wcześniejsze badania wykazały niezawodność wyczyszczonego g1-HEV z kału pacjenta w ilościowej ocenie replikacji wirusa w ludzkich komórkach hepatoma (Huh7). Wyczyszczony wirus przechowywany w -80 °C zachowuje zakaźność przez kilka lat i został wykorzystany w wielu niezależnych badaniach do oszacowania replikacji wirusowej10,13,14,15. To badanie zaprojektowało test neutralizacji HEV przy użyciu wyczyszczonego g1-HEV uzyskanego od pacjenta. Wirus został wyczyszczony, oznaczony, scharakteryzowany i przechowywany w alikwotach w -80 °C do przyszłego użycia w testach neutralizacji. P

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zezwolenie instytucjonalnego komitetu etycznego (IEC) zostało uzyskane w celu pobrania próbki kału od pacjenta zakażonego wirusem HEV przyjętego na Oddział Gastroenterologii, AIIMS, New Delhi. Pacjenci wzięli udział w badaniu po uzyskaniu pisemnej zgody. Szczegóły reagentów i wykorzystanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Izolacja i ilościowa ocena wirusa

  1. Z pacjentem zakażonym wirusem HEV, po uzyskaniu pisemnej zgody, pobrać próbkę kału do oczyszczenia wirusa.
  2. Resuspendować próbkę kału w buforze fosforanowym Dulbecco (DPBS) w stężeniu końcowym 10% (w/v) i wirować przez 1h w temperaturze 4 °C przy prędkości 7800 x g.
    ​UWAGA: Podczas pobierania próbki kału od pacjenta zakażonego wirusem HEV używać rękawic, a obszar roboczy wyczyścić 70% etanolem po zakończeniu pracy (wszystkie kroki wykonywać w szafie biobezpieczeństwa).
  3. Zebrać surowiec i przefiltrować przez filtr 0,45 μm.
  4. Dodać 8% PEG6000 przygotowane w 0,4 M NaCl do surowiczego surowca i inkubować przez 16 h w temperaturze 0 °C.
  5. Wirować próbkę przez 30 min w temperaturze 4 °C przy prędkości 18 000 x g.
  6. Odstawić surowiec i resuspendować osadu w 40 mL Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. Skoncentrować surowca do objętości 5 mL przez filtrację przepływową (TFF) za pomocą 30 kDa przepustki membranowej. Przefiltrować przez filtr 0,2 μm w szafie biobezpieczeństwa, wykonać alikwoty i przechowywać w temperaturze -80 °C. Użyć jednej alikwoty do izolacji całkowitego RNA i wykonania RT-qPCR.
  8. Użyć wielu rozcieńczeń plazmidu pSK-HEV2 [wektor pBluscript zawierający cDNA zakaźnej klonu g1-HEV (Genbank ID: AF444002.1)] (1 ng do 0,000001 ng DNA/reakcja w 10x rozcieńczeniu szeregowym) do wykreślenia krzywej standardowej do ilościowej oceny RNA wirusowego.
  9. Wykreślić wykres z ilością DNA pSK-HEV2 na osi X i odpowiadającymi wartościami Ct na osi Y. Z wykresu standardowego wyznaczyć stężenie RNA wirusowego.
  10. Ilościowo ocenić poziom RNA g1-HEV z wykresu standardowego i obliczyć liczbę kopii genomu wirusa według wzoru: Liczba kopii = ng*(liczba/mol) / bazy *(ng/g)*(g/mol baz).

2. Zakażenie komórek Huh7 g1-HEV

  1. Pobrać flakon T75 zawierający komórki Huh7. Pod mikroskopem sprawdzić, czy komórki są konfluencyjne i zdrowe.
  2. Wybrać medię za pomocą aspiratora (wszystkie kroki wykonywać w szafie biobezpieczeństwa). Dodać 10 mL DPBS, zetrzeć i wybrać.
  3. Dodać 1 mL 0,05% roztworu trypsyny, upewniając się, że jest równomiernie rozprowadzona na powierzchni.
  4. Inkubować w inkubatorze CO2 przez 30-60 s, aż komórki będą w 90% odczepione.
  5. Dodać 5 mL pełnego medium, równomiernie rozprowadzić na całej powierzchni T75 i wielokrotnie pipetować, aby uzyskać jednorodną populację pojedynczych komórek wolną od agregatów.
  6. Przenieść zawiesinę komórek do 50 mL szybkiego probierka stożkowego, wirować przez 5 min w temperaturze pokojowej przy prędkości 200 x g.
  7. Wybrać medię hodowlane z probierka stożkowego w szafie biobezpieczeństwa.
  8. Dodać 5 mL pełnego medium do probierka, aby zawiesić komórki w jednorodnej zawiesinie poprzez delikatne pipetowanie.
  9. Pobrać 10 μL zawiesiny komórek i umieścić na szkiełku do liczenia komórek. Policzyć komórki w 4 kwaterach, obliczyć średnią/mL.
  10. Zasiewać 0,5 x 106 komórek/dołka w płytce 6-dołkowej w 2 mL DMEM (uzupełnione o 10% FBS).
  11. Następnego dnia usunąć medię, przepłukać 1 mL DPBS i dodać 50 μL wirusa g1-HEV (równoważne 4,5 x 104 kopiom genomu oczyszczonego g1-HEV) w 1 mL serum-wolnego medium (SFM).
  12. Inkubować komórki w inkubatorze CO2 5% w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  13. Przepłukać komórki 500 μL DPBS, a następnie dodać 2 mL pełnego medium (DMEM uzupełnione o 2% FBS).
  14. Inkubować komórki przez 72 h w inkubatorze CO2 5% w temperaturze 37 °C.
  15. Przeprowadzić dalsze badania.

3. Badanie RT-qPCR

  1. Usunąć medię wzrostowy z płytki 6-dołkowej (z kroku 2.15) i przepłukać komórki 1 mL DPBS.
  2. Dodać 1 mL TRI Reagent bezpośrednio do płytki 6-dołkowej w celu lizy komórek. Kilkukrotnie pipetować lizat w górę i w dół, a następnie przenieść do 1,5 mL mikroprobierka do wirowania.
    UWAGA: TRI reagent jest toksyczny w przypadku wdechni

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zakażenie komórek Huh7 wirusem g1-HEV i charakterystyka wirusa

Wirus g1-HEV wyizolowano z próbki kału w serii etapów, zgodnie z przedstawionym schematem (Rysunek 1A). Liczbę kopii genomu oczyszczonego g1-HEV oszacowano za pomocą RT-qPCR, a następnie wirusa przechowywano w temperaturze -80 °C. Aby potwierdzić infekcję wirusową i replikację, komórki Huh7 zainfekowano 1,8 × 104 ekwiwalentów kopii genomu z oczyszczonego zapasu g1-HEV przez ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

FRNT to metoda oparta na immunobarwieniu służąca do oszacowania potencjału neutralizującego przeciwciał. Została zastosowana do oszacowania wartości NT50 dla przeciwciał przeciwko wielu wirusom, w tym wirusowi dengue (DENV), koronawirusowi odpowiedzialnemu za ciężki ostre zespół oddechowy -2 (SARS-CoV-2) oraz wirusowi japońskiego zapalenia mózgu (JEV)23,24,25. W tej metodzie wirus jest inkubiowany z przeciwciałem test...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badanie to było częściowo sfinansowane z grantu Biotechnology Industry Research Assistance Council, Departament Biotechnologii, Rząd Indii, przyznanego MS, S i BN. Badania w laboratorium MS są wspierane przez grant rdzenny z Translational Health Science and Technology Institute. SA jest wspierany przez stanowisko Project Research Scientist finansowane przez Indian Council of Medical Research, Rząd Indii. UB jest wspierany przez Senior Research Fellowship z Departament Biotechnologii, Rząd Indii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning 3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNASyntetyzowany na zamówienie przez Genscript i charakteryzowany w naszym laboratorium14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

Bibliografia

  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Front Microbiol. 7, 1419(2016).
  3. Kamar, N., et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients. N Engl J Med. 358 (8), 811-817 (2008).
  4. Purcell, R. H., Emerson, S. U. Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease. J Hepatol. 48 (3), 494-503 (2008).
  5. Nimgaonkar, I., Ding, Q., Schwartz, R. E., Ploss, A. Hepatitis E virus: Advances and challenges. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 96-110 (2018).
  6. Hepatitis E. , WHO. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e (2025).
  7. Songtanin, B., et al. Hepatitis E virus infections: Epidemiology, genetic diversity, and clinical considerations. Viruses. 15 (6), 1389(2023).
  8. Lee, G. H., et al. Chronic infection with camelid hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and milk. Gastroenterology. 150 (2), 355-357 (2016).
  9. Zhou, Z., Xie, Y., Wu, C., Nan, Y. The hepatitis E virus open reading frame 2 protein: Beyond viral capsid. Front Microbiol. 12, 739124(2021).
  10. Nair, V. P., et al. Endoplasmic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E virus. PLoS Pathog. 12 (4), e1005521(2016).
  11. Meister, T. L., et al. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Res. 163, 34-49 (2019).
  12. Fu, R. M., Decker, C. C., Dao Thi, V. L. Cell culture models for hepatitis E virus. Viruses. 11 (7), 608(2019).
  13. Kaushik, N., et al. Zinc salts block hepatitis E virus replication by inhibiting the activity of viral RNA-dependent RNA polymerase. J Virol. 91 (21), 10-1128 (2017).
  14. Gupta, J., et al. Antiviral activity of zinc oxide nanoparticles and tetrapods against the Hepatitis E and Hepatitis C viruses. Front Microbiol. 13, 881595(2022).
  15. Ansari, S., et al. Network controllability analysis reveals the antiviral potential of Etravirine against hepatitis E virus infection. mSystems. 10 (9), e00438-25(2025).
  16. Gremmel, N., et al. Hepatitis E virus neutralization by porcine serum antibodies. J Clin Microbiol. 61 (11), e00373-23(2023).
  17. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Sci Rep. 6 (1), 25141(2016).
  18. Liu, C., et al. An optimized high-throughput neutralization assay for hepatitis E virus (HEV) involving detection of secreted Porf2. Viruses. 11 (1), 64(2019).
  19. Meng, J., Dubreuil, P., Pillot, J. A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E. J Clin Microbiol. 35 (6), 1373-1377 (1997).
  20. Emerson, S. U., et al. Putative neutralization epitopes and broad cross-genotype neutralization of Hepatitis E virus confirmed by a quantitative cell-culture assay. J Gen Virol. 87 (3), 697-704 (2006).
  21. Deshmukh, T. M., et al. Immunogenicity of candidate hepatitis E virus DNA vaccine expressing complete and truncated ORF2 in mice. Vaccine. 25 (22), 4350-4360 (2007).
  22. Gupta, J., et al. Expression, purification and characterization of the hepatitis E virus like-particles in the Pichia pastoris. Front Microbiol. 11, 141(2020).
  23. Guo, J., et al. Fluorescence Reduction Neutralization Test: A novel, rapid, and efficient method for characterizing the neutralizing activity of antibodies against dengue virus. Curr Issues Mol Biol. 47 (3), 140(2025).
  24. Bewley, K. R., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays. Nat Protoc. 16 (6), 3114-3140 (2021).
  25. Islam, M. D., et al. Neutralizing antibodies against the Japanese encephalitis virus are produced by a 12ákDa E coli expressed envelope protein domain III (EDIII) tagged with a solubility-controlling peptide. Vaccine. 56, 127143(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test neutralizacjineutralizacja wirusaskuteczność przeciwciałocena szczepionkibarwienie immunofluorescencyjnebiałko ORF2komórki Huh7
Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.