Hydrożele poliakrylamidowego ZrOH do przestrzennie rozdzielonych próbek karboksylanów wydzielanych z korzeni rosnących w glebie

Summary

W tym protokole szczegółowo opisujemy zastosowanie hydrożeli wodorotlenkowych z poliakrylamidowym cyrkonem (hydrożeli ZrOH) jako nieniszczącej, in-situ metody pobierania próbek karboksylanów wydzielanych z korzeni korzeniowych z nienaruszonych korzeni uprawianych w glebie na różnych etapach rozwoju roślin. Przedstawia również późniejsze lokalizowane mapowanie i ilościowe określenie tych karboksylanów za pomocą chromatografii jonowej – spektrometrii mas (IC-MS).

Abstract

Pobieranie próbek i wiarygodne ilościowe określenie wydzielin korzeniowych z niezakłóconych korzeni roślin uprawianych w glebie pozostają wyzwaniem. Opracowaliśmy także nieniszczącą metodę pobierania próbek, 2D mapowania i ilościowania siedmiu karboksylanów (oczekiwa, cytrynian, fumaran, mleczan, malat, szczawiacz, sukcynian) wydzielanych z korzeni roślin hodowanych w ryzoboxach. Opisana tutaj metoda wykorzystuje hydrożele wodorotlenkowe z poliakrylamidowym cyrkonem (hydrożele ZrOH), które pobierają wszystkie testowane karboksylany i mogą być eluowane z wydajnością od 95,3% ± 3,12% do 111% ± 1,99%. Hydrożele ZrOH mają wysoką zdolność wiązania karboksylanów, do 1,82 μmol ^cm-2, w zależności od pH roztworu i gatunku karboksylanu, co jest stężeniem wyższym niż zwykle dostępne w ryzosferze. Ponadto związane karboksylany na hydrożelach ZrOH pozostają stabilne i mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C przed analizą. Do tego zastosowania rośliny uprawia się w wypełnionych ziemią ryzoboxach, które umożliwiają łatwy dostęp przy minimalnym zakłóceniu systemu korzeniowego. Aby pobrać pobieranie karboksylanów uwalnianych przez korzenie, hydrożele ZrOH są starannie aplikowane na obszar zainteresowania przez 24 godziny. Po wyjęciu hydrożeli ZrOH są one cięte w celach mapowania, a kawałki żelu są eluowane do dalszej analizy karboksylanowej (np. za pomocą chromatografii jonowej i spektrometrii mas). Nasze wyniki wskazują, że hydrożele ZrOH są skuteczne w wychwytywaniu i określaniu stężeń karboksylanów w ryzosferze. Nowością tej metody jest zdolność do pobierania próbek wychodów korzeniowych z nienaruszonych korzeni roślin uprawianych w glebie, a także możliwość pobierania próbek w czasie rzeczywistym, w porównaniu do tradycyjnych metod (hybrydowe podejście glebowo-hydroponiczne), które często są destrukcyjne i pozwalają na jednorazowe pobieranie próbek. Co najważniejsze, umożliwia generowanie ilościowych, wysokorozdzielczych, milimetrowych obrazów 2D, co ułatwia wizualizację wydzieliny karboksylanowej wzdłuż osi korzenia oraz jej przestrzenny rozkład w ryzosferze. Dodatkowo ta metoda ułatwia pobieranie próbek wysięków korzeniowych na różnych etapach wzrostu w trakcie cyklu wzrostu.

Introduction

Korzenie roślin wydzielają różne związki do ryzosfery, kształtując ich właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne¹. Gdy rośliny są narażone na stres abiotyczny i biotyczny, szczególnie wywołuje się wydalanie korzeni. Wychody korzeniowe mogą faktycznie wpływać na dostępność i mobilizację składników odżywczych/metali, społeczności i aktywność mikroorganizmów, stabilność agregatów glebowych oraz na obronę roślin przed patogenami bezpośrednio lub pośrednio ^1,2,3. Do najważniejszych wydzielin korzeniowych należą karboksylany ze względu na ich rolę w rozpuszczaniu składników odżywczych (w tym fosforu (P), żelaza (Fe), miedzi (Cu) i cynku (Zn)), tolerancji na metale ciężkie oraz wzmocnieniu użyteczności mikroorganizmów w ryzosferze 2,3,4,5).

Warto zauważyć, że wydzielane karboksylany to cytrynian, mleczan, szczawian, malat, sukcynian oraz fumarian ^6,7,8. Na przykład cytrynian odgrywa kluczową rolę w pozyskiwaniu fosforu poprzez mobilizację fosforu wiązanego z Fe lub tlenkami glinu (Al) (wodorowrotlin) ^7,9. Jednak dokładne pobieranie próbek i ilościowe określenie wydzielin korzeniowych z roślin uprawianych w glebie pozostaje wyzwaniem eksperymentalnym, głównie ze względu na trudności w uzyskaniu fizycznego dostępu do niezakłóconych systemów korzeniowych uprawianych w glebie oraz w uzyskaniu próbek wydzieliny korzeniowej^10,11. Dodatkowo, wydzielane związki szybko ulegają degradacji mikroorganizmów (w ciągu minut do godzin)¹² i silnie adsorbują się^{do powierzchni} minerałów ^{glebowych1,10}. Kolejnym wyzwaniem w badaniach wydzieliny korzeniowej jest monitorowanie wydzieliny w czasie, ponieważ większość metod zbierania zakłóca korzenie lub wymaga zbioru roślin hodowanych w glebie, co utrudnia ponowną ocenę tego samego korzenia ^1,11. Dlatego dokładne pobieranie próbek, ilościowa i monitorowanie wychodów korzeniowych wymagają techniki rejestrującej zmienność przestrzenną i ułatwiającej powtarzane pobieranie próbek podczas wzrostu roślin¹¹.

W obecnym badaniu przedstawiamy nieniszczącą, in-situ metodę początkowo opracowaną dla cytrynianu przez Tiziani i ^in.12, która została następnie udoskonalona i zastosowana do pobierania próbek, precyzyjnej lokalizacji przestrzennej oraz ilościowej identyfikacji sześciu dodatkowych karboksylanów (oczekiwa, fumarian, mleczan, malat, szczawian i sukcynian) wydzielanych z nienaruszonych korzeni roślin uprawianych w glebie w ryzoboksach. Metoda wykorzystuje hydrożele poliakrylamidowe na bazie cyrkonowego (hydrożele ZrOH) do pobierania wydzielin^{korzeniowych 13}. Hydrożele ZrOH wykazują silną zdolność wiązania anionów (w tym karboksylanów), które łatwo eluują 12,13,14. Hydrożele ZrOH (1) umożliwiają pobieranie próbek karboksylanów korzeniowych z korzeni roślin uprawianych w glebie poprzez po prostu umieszczenie hydrożelu na systemie korzeniowym z minimalnym zakłóceniem, (2) zapewniają skuteczną ochronę związanych karboksylanów przed mineralizacją mikroorganizmów przez co najmniej 6 tygodni, (3) zachowane jest rozmieszczenie przestrzenne karboksylanów w ryzosferze po przywiązaniu do żelu, oraz (4) umożliwiają mapowanie dwuwymiarowe karboksylanów¹² w skali mm.

Istniejące metody pobierania próbek wycisku korzeniowego klasyfikuje się jako techniki oparte na glebie pochodzące z roślin uprawianych w glebie (np. mycie korzeni lub hybryda glebowo-hydroponiczna, urządzenia do zbierania wydzieliny glebowo-korzeniowej (SOIL-REC), mikro przysawki, papier filtracyjny/arkusze agarowe, pułapki wydzieliny oraz technika RHIZOtest) lub metody pobierania wydzielin hydroponicznych. Metoda mycia korzeni lub hybrydowego podejścia glebowo-hydroponicznego polega na starannym usunięciu całej rośliny z gleby, przemyciu systemu korzeniowego, a następnie zanurzeniu w roztworze pobierającym próbki w celu zebrania wydzielin korzeniowych¹⁵. Jest to najczęściej stosowana metoda pobierania próbek wydzielin z roślin uprawianych w glebie ze względu na swoją prostotę. Jednak wyciąganie korzeni z gleby wiąże się z ryzykiem utraty włoski korzeniowych i drobniejszych. Ponadto konieczne jest dokładne oczyszczenie korzeni, które może je uszkodzić, obniżyć jakość i ilość wysięków korzeniowych oraz uniemożliwić pobieranie próbek z rozdzieleniem czasowym ^8,11. Metoda SOIL-REC polega na uprawie roślin w specjalnie zaprojektowanym systemie ryzoboxowym, z korzeniami rosnącymi pomiędzy dwoma porowatymi siateczkami nylonowymi (≤ 30 μm) oraz zbieraniem wysięków korzeniowych za pomocą narzędzia do zbierania wysięków korzeniowych^16,17. Takie podejście chroni system korzeniowy, minimalizuje zanieczyszczenie gleby i umożliwia powtarzane zbieranie wysięków korzeniowych. Jednak ma skomplikowany układ (z niewielką liczbą replikacji), wyższe rozcieńczenie wydzielin z większych wolumenów używanych do próbkowania, a mimo to wymaga optymalizacji, ponieważ jego replikowalność jest trudna, a między replikacjami⁸ występują ogromne różnice.

Stosowanie małych kawałków żywic, arkuszy żelu agarowego lub papieru filtracyjnego zdolnego do równowagi z otaczającym roztworem lub adsorbowanie wydzielin na interesujących segmentach korzeni dostępnych, nienaruszonych korzeni uprawianych w glebie (np. za pomocą ryzoboxów lub okien korzeniowych)^18,19. Metoda ta umożliwia pobieranie próbek w czasie oraz częściowe pomiary lokalnego składu wysięków, choć o niskiej rozdzielczości przestrzennej. Z drugiej strony jest podatny na artefakty mineralizacji mikroorganizmów i trudny w obsłudze. Podobnie pułapki wydzielinowe są używane do pobierania próbek wydzielin korzeniowych z poszczególnych segmentów korzeniowych, gdzie pojedynczy korzeń jest uwięziony w poziomych bocznych komorach, a szczelnie z pleksiglasu zawierają roztwór próbkowania, które są lokalnie umieszczone⁸. Metoda ta jest stosowana zarówno do korzeni hydroponicznych, jak i uprawianych w glebie i umożliwia lokalne pobieranie próbek¹². Jednak zbierane są niewielkie ilości, pobieranie próbek w czasie jest niemal niemożliwe, a izolowanie pojedynczych korzeni jest podatne na obciążenia mechaniczne, co może wpływać na metabolizm korzeni i wydzielinę⁸. Mikro przyssawki służą do zbierania roztworu glebowego w ryzosferze, umożliwiając pobieranie próbek in-situ z korzeni uprawianych w glebie²⁰. Jednak zbierane są niewielkie objętości, pobieranie próbek jest częściowo rozdzielane czasowo, a wydobywaczki są podatne na adsorpcję i degradację mikroorganizmów¹⁶. Technika RHIZOtest polega na hydroponicznym hodowaniu korzeni w małych cylindrach, z dnem przykrytym nylonową siatką o grubości 30 μm, a następnie przeniesieniu ich na tarczę glebową, umożliwiającą wymianę substancji rozpuszczonych między korzeniem a glebą ^8,21,22. Wysięki są zbierane przez zanurzenie maty korzeniowej w roztworze pobierającym próbki. Ta metoda utrzymuje kontakt z korzeniami i glebą, ale wykorzystuje sztuczne warunki wzrostu. Jest ograniczony do eksperymentów krótkoterminowych i nie zawiera próbkowania z rozwiązywaniem czasowym. Spośród tych metod do określania przestrzennych wzorców wydzieliny można stosować jedynie żywice, arkusze żelu agarowego, papier filtracyjny, pułapki wydzieliny oraz mikroprzyssawki.

Metody pobierania wydzielin hydroponicznego obejmują techniki hydroponiki i półhydroponiki. Hydroponika to często stosowana i prosta metoda zbierania wysięków korzeniowych, w której rośliny są uprawiane w roztworze odżywczym, a następnie zastępowany roztworem pobierającym próbki (H₂O, CaSO₄, CaCl₂, micropur), aby uzyskać próbki wydzieliny^15,23. Metoda jest prosta i wywiera minimalne obciążenia mechaniczne na korzenie. Jest wysoce powtarzalna i w razie potrzeby sterylna, co zwiększa jakość wycinaków korzeniowych i umożliwia pobieranie próbek w czasie ^5,16. Niemniej jednak jest to wysoce sztuczny system, który może zmieniać fizjologię, morfologię roślin (np. rozwój włosków korzeniowych) oraz procesy wydzielania korzeni ^6,15. W półhydroponiczej rośliny uprawia się na szklanych koralikach, piasku lub wermikulicie z nieustannie przesiąkającym roztworem odżywczym, a wysięki zbiera się w roztworze przeciekającym ^8,18. To podejście jest nieco mniej sztuczne w porównaniu do hydroponiki i pozwala na próbkowanie w czasie rozdzielenia. Jednak system jest niemal całkowicie nasycony wodą, dlatego wymaga roślin tolerujących częściowo beztlenowe warunki.

W porównaniu z alternatywnymi podejściami, metoda hydrożelu ZrOH oferuje kilka zalet. Hydrożele ZrOH umożliwiają pobieranie próbek wydzielin korzeniowych w kulturze glebowej (w warunkach bliskich naturalnym) przy minimalnym zakłóceniu systemu korzeniowego, pobieranie próbek w czasie w cyklu życiowym rośliny oraz możliwość zbierania wydzielin korzeniowych przez ponad 24 godziny dzięki zmniejszonej degradacji mikroorganizmów i wysokiej zdolności wiązania karboksylanów¹². Ponadto do pobierania próbki/konserwacji hydrożeli nie jest potrzebny żaden biocyd (np. mikropur, NaN₃), który może mieć wpływ na instrument analityczny w dłuższej perspektywie i zakłócać analizę chemiczną. Dzieje się tak, ponieważ karboksylany są chemicznie związane z hydrożelem ZrOH. Ponadto próbki mogą być przechowywane przez kilka tygodni do miesięcy przed analizą, dzięki czemu wiele próbek można pobrać z jednego zestawu eksperymentalnego¹², co można przypisać właściwościom antybakteryjnym Zr w hydrożelu ^24,25. Dodatkowo, hydrożele ZrOH umożliwiają mapowanie w rozdzielczości milimetrowej 2D wydzielonych związków i innych anionów w ryzosferze, z możliwością pobierania próbek całego systemu korzeniowego 12,14,26. Hydrożele ZrOH zajmują mniej miejsca do przechowywania w lodówce (4 °C) w porównaniu do dużych objętości wymaganych przez klasyczne metody, które zazwyczaj przechowywane są w zamrażarce (-20 °C). Głównym ograniczeniem jest przyzwyczajenie się do produkcji wysokiej jakości hydrożeli ZrOH z minimalną ilością lub bez pęcherzyków powietrza, a także fakt, że rhizoboxy pozostają systemami sztucznego środowiska uprawy. Kolejnym ograniczeniem jest to, że metoda została opracowana tylko dla siedmiu karboksylanów (oczekiwa, cytrynian, fumaran, mleczan, malan, sukcynian i szczawian)¹², sulfonamidów (sulfadiazyna, sulfametazyna, sulfachloropyryrydazyna i klindamycyna)²⁷ oraz anionów nieorganicznych (siarczki i oksyaniony P, V-wanadu, As-arsenu, se-selenu, Mo-molibdenu, Sb-antymonu)14,26,28,29. Hydrożel ZrOH był również stosowany w połączeniu z zawieszonym odczynnikiem cząstek – kwasem iminodioctowym do pobierania próbek in situ oraz mapowania kationów (Al, Fe, Ca-wapń, Mg-magnez, Mn-mangan, Ni-nikel i Zn-Cynk) w ryzosferze 28,29,30.

Oferujemy tutaj metodę opartą na hydrożelu ZrOH, umożliwiającą pobieranie karboksylanów w glebie i przestrzennie rozdzielone, in-situ. Przedstawiamy szczegółowy opis przeprowadzenia eksperymentu z ryzoboksem, w tym pobieranie próbek i mapowanie 2D wyeksudatu korzeniowego za pomocą techniki hydrożelu ZrOH. Obejmuje przygotowanie hydrożelu, wypełnianie ryzoboksu, uprawę roślin, aplikację hydrożelu, pobieranie i cięcie, elucję karboksylanową z hydrożelu oraz analizę, a następnie następuje generowanie obrazów 2D. Dodatkowo zawiera notatki dotyczące kluczowych kroków, takich jak analiza karboksylanów za pomocą chromatografii jonowej-spektrometrii mas (IC-MS).

Protocol

1. Przygotowanie hydrożelu ZrOH

UWAGA: Do przygotowania żelu wymagane są czyste środowisko i materiały, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Do przygotowywania roztworów, płukania żelem i nawadniania używaj wyłącznie wody laboratoryjnej klasy I (≤18 MΩ·cm) dla zapewnienia jakości. Upewnij się, że pojemniki na toksyczne odpady (ciekłe i stałe) są już umieszczone w okapie przed rozpoczęciem przygotowania hydrożelu. Przed rozpoczęciem przygotowywania żeli rozgrzej piekarnik do około 42─45 °C przez godzinę. Szczegóły dotyczące materiałów i chemikaliów znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zespołu szkła
   1. Przygotuj kąpiel kwasową 10% (w/v) HNO₃, dodając 153,8 mL 65% HNO₃ do 846,2 mL laboratoryjnej wody klasy I w okapie oparowym.
   2. Mocz szklane płytki (6,1 x 17 cm), pęsetę, teflonowe podkładki w kształcie U (0,25 mm lub 0,4 mm) oraz plastikowe klipsy w kąpieli kwasowej przez co najmniej 4 godziny.
   3. Wyjmij szklane płytki, pęsetę, plastikowe klipsy i dystansy teflonowe z kąpieli kwasowej, a następnie umyj co najmniej trzy razy wodą laboratoryjnej klasy I. Następnie pozwól im dokładnie wyschnąć na powietrzu w laminarnym lub czystym stole.
      UWAGA: Szklane talerze powinny być przygotowane tego samego dnia co przygotowanie żelu i unikać suszenia papierem, aby zminimalizować zanieczyszczenia.
   4. Umieść podkładkę w kształcie litery "U" na suchej szklanej płytce, dodaj drugą i przymocuj je razem za pomocą klipsów. Przesuń szklane płyty o około ~1 mm, aby ułatwić pipetowanie (patrz Rysunek 1A).
   5. Umieść szklaną płytkę na czystej folii plastikowej pod maską filmową przed odlaniem roztworu żelowego.
2. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego³¹
   1. Roztwór żelowy: Przygotuj roztwór żelowy o pojemności 100 mL przez mieszanie żelowego crosslinkera 15 mL Diffusive Gradients in Thin Films (DGT) z wodą laboratoryjnej klasy I o pojemności 47,5 mL w czystej plastikowej fiolce, a następnie dodaj 37,5 ml roztworu akryloamidu (40%). Dokładnie wymieszaj mieszankę przy dodawaniu każdego roztworu. Roztwór żelowy można przechowywać w lodówce (4 °C) przez co najmniej trzy miesiące.
      UWAGA: Upewnij się, że pipeta waży odpowiednie ilości każdego roztworu i używaj wyłącznie roztworu akrylamidu bez bisakrylamidu, ponieważ po umieszczeniu w buforze 2-(N-morfolino)-kwasu etansulfonowego (MES) wytwarza się miękkie żele.
   2. Przygotuj roztwór 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS), rozpuszczając 0,1 g APS w 1 g_H2O. Przygotowuj roztwór świeży każdego dnia i upewnij się, że jest całkowicie rozpuszczony przed użyciem.
   3. Przygotuj koktajl żelowy, mieszając 4 mL roztwór żelowy z 28 μL 10% APS, a następnie dodaj 10 μL 99% N,N,N'N'-Tetrametyloetylendiaminy (TEMED) w czystych plastikowych fiolkach. Wymieszaj po dodaniu każdego roztworu. Roztwór można przygotować na maksymalnie 3 żele, ponieważ mieszanina szybko polimeryzuje. Objętość koktajlu można dostosować w zależności od wielkości płyt i dystansów, które mają być użyte.
      UWAGA: Unikaj pęcherzyków i piany podczas mieszania różnych odczynników.
   4. Powoli pipetuj mieszankę żelową między zespołem szklanej płyty od środka, jak pokazano na rysunkach 1B,C ²⁶. Jeśli obecne są pęcherzyki powietrza, usuń je, delikatnie przechylając szklaną część lub stukając długopisem w szklane płytki.
      UWAGA: Aby uzyskać żele wolne od bąbelków, unikaj używania porysowanych szklanych płytek i przechowuj je w kąpieli kwasowej po użyciu, myjąc je tylko przed kolejnym użyciem, zamiast przechowywać w workach polietylenowych. Użyj pipety o pojemności 1 mL lub 5 ml z małym końcówką, aby odlewać żel i powoli nakładać koktajl żelowy od środka, aby rozprowadził się równomiernie, przechylając płytki pod kątem 45°.
   5. Włóż zestaw do nagrzanego piekarnika i utrzymuj temperaturę na poziomie 42─46 °C przez co najmniej godzinę, aby żel całkowicie stwardniał (bez kapania płynu).
   6. Delikatnie dźwignij zespół za pomocą czystej, wolnej od rdzy żyletki z narożników i zmyj żele z płyt szklanych wodą laboratoryjnej klasy I w butelce do mycia (Rysunek 1D–F). Aby łatwo usunąć żel, namocz go w wodzie na kilka minut, a następnie zmij do 1-litrowej zlewki z wodą laboratoryjnej klasy I.
      UWAGA: Unikaj wyciągania żelu pęsetą, bo może się przykleić do płytki, może to prowadzić do odkształcenia żelu. Po polimeryzacji wszelkie widoczne pęcherzyki zwykle znajdują się pomiędzy żelem a płytką szklaną, a nie wewnątrz samego żelu, który staje się widoczny po usunięciu płyty.
   7. Wymień wodę co najmniej 3–4 razy w ciągu 24 godzin od nawodnienia (najlepiej co 2 godziny po przygotowaniu), aby zmyć pozostałe chemikalia polimeryzacyjne. Poprzez wielokrotne uzupełnianie wody podczas nawodniania, zanieczyszczenia, takie jak niezareagowane odczynniki, są dyfundowane i obniża pH, zapobiegając gromadzeniu się ładunku w żelu.
   8. Przechowuj żele w wodzie laboratoryjnej klasy I (przez krótki czas około 24 godzin) lub 0,01 mol ^L-1 NaCl lub NaNO₃ w lodówce (4 °C), jeśli arkusze żelu nie są od razu używane do opadania ZrOH. Te żele można przechowywać w NaCl do miesiąca przed opadami.
      UWAGA: Zalecamy wytrącenie żeli bezpośrednio po polimeryzacji, aby zminimalizować zanieczyszczenia mogące pojawić się podczas mycia.
3. Wytrącanie żeli ZrOH¹⁴
   1. Rozpuścić 3,22 g oktahydratu dwuchlorku cyrkonu (ZrOCl_{2,8H 2}O) w 40 mL laboratoryjnej wody klasy I w plastikowej zlewce o pojemności 250 mL.
   2. Umieść do 4 arkuszy żelu i napełnij do 100 mL. Alternatywnie, rozpuścić 1,66 g ZrOCl_{2,8H 2O}w 20 mL laboratoryjnej wody klasy I, dodać 2 żele i napełnić do 50 mL.
   3. Namocz arkusze żelowe przez co najmniej 2 godziny, aby zapewnić równomierne rozłożenie Zr w żelach.
   4. Przelej każdy żel do 100 mL 0,05 mol ^L-1-2 -(N-morfolino)-kwasu etansulfonowego (MES) buforowanego przy pH 6,7 (pH korygowane o 1 mol ^L-1 NaOH) w celu wytrącenia. Delikatnie mieszaj żel pęsetą przez pierwsze 30-60 sekund, aby uzyskać jednorodne wytrącanie.
   5. Delikatnie potrząśnij na potrząsaczce płytowej z częstotliwością ≤100 obr./min przez 40 minut, aby uzyskać pełne wytrącenie Zr(OH)₄ w żelu.
      UWAGA: Wolniejsze tempo wstrząsania jest preferowane, aby żele się nie przyklejały do siebie.
   6. Umieść żele w wodzie laboratoryjnej klasy I w zlewce o pojemności 1─2 L na 24 godziny, aby usunąć jony Cl^- i podmieniać wodę co najmniej 3 razy co 2 godziny w odstępach^{32 godziny}. Dokładne usunięcie jonów Cl^- można sprawdzić, mierząc przewodność roztworu płuczącego lub przeprowadzając test chlorkowy.
   7. Żel przechowuje się w 0,03 mol ^L-1 NaNO₃ lub NaCl, ale NaCl jest preferowany do eksperymentów glebowych, ponieważ azotany szybko zwiększają aktywność mikroorganizmów glebowych i są głównym składnikiem odżywczym roślin^13,32.
   8. Hydrożele ZrOH były testowane do 60 tygodni (przechowywane w lodówce w temperaturze 4 °C) i wykazano, że zachowują swoje właściwości oraz dobrą wydajność (±10% wartości docelowych)³².
4. Cięcie żelem
   1. Umyj nieporysowaną płytkę z pleksi, pęsetę i ostrą, wolną od rdzy żyletkę. W przypadku braku płyty z pleksi można użyć dowolnej grubej i mocnej szklanej płyty.
   2. Zwilż płytę z pleksi wodą laboratoryjnej klasy I, aby ułatwić rozprowadzenie arkuszy hydrożelu ZrOH.
   3. Rozłóż arkusz hydrożelu ZrOH na płytce pleksi za pomocą pęsety, dbając o to, by leżała płasko i nie pojawiała się pęcherzyka. Zidentyfikuj obszary z otworami w arkuszach; Te miejsca należy unikać podczas cięcia.
   4. Precyzyjnie tnij arkusze hydrożelu ZrOH ostrą żyletką do pożądanego rozmiaru. Usunięcie wody z płyty po cięciu pomaga wyraźnie zobaczyć wycięte fragmenty.
      UWAGA: Aby ułatwić identyfikację boków do mapowania 2D, zalecamy wycinanie kawałków hydrożelu ZrOH w prostokątny trapez, z najdłuższą stroną umieszczoną w lewym górnym rogu.
   5. Przechowuj hydrożele ZrOH w wodzie laboratoryjnej klasy I (do przechowywania krótkotrwałego i tuż przed aplikacją żelu) lub w 0,03 mol ^L-1 NaNO₃/NaCl do długotrwałego przechowywania (>24 h).

2. Konfiguracja eksperymentu Rhizobox

UWAGA: Rośliny uprawiane są w kryzoboxach wypełnionych glebą, które różnią się kształtem. Zalecamy stosowanie kłączowych pudełek wyposażonych w otwory na dole lub z tyłu, aby ułatwić podlewanie i zapewnić równomierny rozprowadz wody (patrz Rysunek Uzupełniający 1). Szczegóły dotyczące materiałów i chemikaliów znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Określenie wypełniania rhizobox i zdolności zatrzymywania wody²⁶
   1. Przesij ziemię wysuszoną na powietrzu za pomocą sita o średnicy 2 mm i ujednolic glebę. Zalecamy stosowanie gleby o średniej fakturze, ale można też stosować glebę piaszczystą lub gliniastą, pod warunkiem stosowania określonych technik obsługi (np. typ ryzoboxa, napełnianie, otwieranie i podlewanie).
   2. Zważ wszystkie elementy pudełka (pustego) wraz z zaciskami i folią plastikową oraz zapisz wagę (patrz Ilustracja Uzupełniająca 2C). Dodaj 2–3 dodatkowe ryzoskrzynki do wymaganej liczby do określenia pojemności zatrzymywania wody (WHC).
   3. Oszacuj masę suchej gleby potrzebną do wypełnienia ryzoboksu. Zazwyczaj ryzobox wypełnia się do 2 cm poniżej góry. Zalecana gęstość objętości wynosi około 1,0–1,4 g ^cm-3.
   4. W zależności od rodzaju ryzoboxa i wygody jego obsługi, ostrożnie wypełnij go suchą ziemią. Podczas i po nasypaniu glebę można wyrównać za pomocą płaskiej płyty bez jej zagęszczenia. Lekko nawilżona gleba może być również użyta do wypełniania ryzoboksu, utrzymując strukturę gleby, zwłaszcza w przypadku gleb o drobnej lub ciężkiej glinie (szczegółowy opis zobacz Wagner i ^in.26 ).
   5. Alternatywnie, jeśli rhizobox jest wypełniony od góry, przymocuj folię plastikową na rhizobox, przykryj ją przednią płytą, a następnie zaciskaj (patrz Rysunek Uzupełniający 2A–D).
   6. Dla wygody zamontuj membranę jądrową podczas procesu napełniania i upewnij się, że leży płasko na powierzchni. Błona jądrowa jest potrzebna przy pobieraniu próbek z wydzielin korzeniowych.
   7. Zapisz ciężar ryzoboksów wypełnionych ziemią razem z klamrami. Oblicz masę suchej gleby (m_{suchej gleby}) dla każdego kłącza, odejmując masę pustych kłączek od tych wypełnionych glebą, i zapisz wagę.
   8. Zdolność do przechowywania wody ustala się najpierw przez nasycenie ryzoboxów wodą dejonizowaną, a następnie pozwolenie na odpływ przez ~8 godzin. Zważ ryzoboxy i oblicz masę wody (m_w), odejmując wagę wypełnionych glebą rhizoboxów zarejestrowanych w kroku 2.1.7 od obecnej wagi. Następnie wyznaczamy WHC (g ^g-1) dzieląc m_w przez m_{suchej gleby}, co daje stosunek.
      UWAGA: Nie używaj rhizoboxów używanych do wyznaczania WHC do rzeczywistego mapowania, ponieważ nasycenie wodą może prowadzić do anaerobii, a tym samym do artefaktów redoks.
   9. Optymalna zawartość wody dla większości roślin podczas wzrostu powinna być utrzymywana na poziomie 50%─60% WHC (czyli współczynnik WHC, f_WHC = 0,5─0,6), w zależności od typu gleby i gatunku rośliny. Oszacuj ilość wody, którą należy dodać (m_{w dodać}) do każdego kryzoboksa następująco: m_{w add} = WHC x f_{WHC x} m_{sucha gleba}.
   10. Podlej rhizobox przed sadzeniem dodatkiem. Jeśli podlewasz przez otwory, dodaj 5-10 ml wody na powierzchnię.
   11. Zapisz masę podlewanych ryzoboxów, które są niezbędne do podlewania roślin podczas wzrostu roślin.
2. Uprawa i zarządzanie roślinami^12,26
   1. Sterylizuj nasiona przed kiełkowaniem lub sadzeniem. Powszechną praktyką jest umieszczenie ich w 70% etanolu na 3 minuty, a następnie w 1% NaClO przez 15 minut, aby zapobiec rozwojowi grzybów. Następnie opłucz nasiona wodą dejonizowaną (około 6─7 razy).
   2. Przedkiełkowanie nasion pomiędzy papierami filtracyjnymi lub rolkami kiełkującymi zwilżonymi wodą lub 0,05 mmolem L⁻¹ CaSO₄ , aż do wyłonięcia się korzenia.
   3. Przenieś jedną sadzonkę do każdego ryzoboksa, umieść blisko przedniej płyty, przykryj trochę ziemi, a następnie dodaj trochę wody.
   4. Owinąć rhizoboxy folią aluminiową, aby zapobiec fotochemicznej redukcji w ryzosferze, zapobiec rozwojowi glonów i innych mikroorganizmów fotosyntetycznych, a także uniknąć obciążania korzeni pod wpływem światła. Alternatywnie dostępne są czarne przednie płyty, które nie przepuszczają światła, które mogą zastąpić folię aluminiową.
   5. Umieść rhizoboxy na stojaku, aby były przechylone w komorze wzrostu lub szklarni z kontrolowaną temperaturą, wilgotnością względną i intensywnością światła. Zalecamy przechylenie o 25°─35°.
   6. Podlewaj kłącza grawitacyjne co najmniej 2─3 razy w tygodniu, w zależności od potrzeb roślin. Robi się to poprzez ważenie ryzoboxów, dodając wodę, aby zrekompensować różnicę od wagi zapisanej w kroku 1.2.11. Jednak gdy biomasa rośliny jest znacząca, a zapotrzebowanie na wodę wzrasta, należy ją uwzględnić, a objętość podlewania odpowiednio dostosować.
   7. Specyficzne praktyki zarządzania uprawami (np. nawożenie) są realizowane zgodnie z warunkami eksperymentalnymi, charakterystyką gleby, uprawianymi gatunkami roślin oraz obowiązującymi potrzebami w zakresie zwalczania chorób i szkodników podczas wzrostu roślin.
   8. Okres wzrostu i pobieranie próbek wysięków korzeniowych w dużej mierze zależą od wielkości kłączek, gatunków roślin oraz celów badania.

3. Pobieranie wydzieliny korzeniowej ^12,26

UWAGA: Tutaj podajemy szczegóły dotyczące niedestrukcyjnego pobierania próbek wyeksudatów korzeniowych. Upewnij się, że wszystkie wymagane materiały są przygotowane przed pobieraniem próbek, a eksperymentalne puste materiały są uwzględniane podczas pobierania. Szczegóły dotyczące materiałów i chemikaliów znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Powoli podwiejdź zawartość wody w ryzoboxach do 90%─95% WHC (80% dla roślin bardzo wrażliwych na stres tlenowy) dziennie lub co najmniej 2 godziny przed pobraniem próbki. Można to dokładnie uzyskać, najpierw obliczając ilość wody do dodania (m_{w dodanie}) w kroku 2.1.9 przy użyciu 90%─95% WHC, a następnie ponownie obliczając całkowitą wagę ryzoboksu, wilgotnej gleby oraz szacunkowo masę rośliny. Używając wagi, dodaj wodę dejonizowaną, aż kłączowy box osiągnie przeliczoną wagę.
2. Rozwiń folię Al z ryzoboxa, zidentyfikuj i narysuj interesujący obszar na przedniej tablicy. Ten etap jest wymagany tylko wtedy, gdy pobierane są tylko segmenty korzeniowe lub młode rośliny.
3. Wytnij folię plastikową i hydrożel ZrOH (patrz krok 1.3) na określone wymiary, zgodnie z obszarem zainteresowania i rozmiarem kryzoboksa. Jeśli membrana nukleoporowa nie została zamontowana podczas procesu wypełniania, przyciąć ją do pożądanych wymiarów, nieco większych niż hydrożel ZrOH.
4. Umieść rhizoboxy na płaskim podstawie z wyjmowaną przednią płytką skierowaną do góry i ostrożnie je otwórz (patrz Rysunek 2A). Powoli wyjmuj folię plastikową, upewniając się, że korzenie i gleba nie zostaną naruszone.
5. Umieść linijkę na interesującym się obszarze i zrób zdjęcia o wysokiej rozdzielczości, które będą potrzebne do dalszego przetwarzania danych. Linijka służy jako odniesienie do dokładnego określenia rozmiaru bezpośrednio na podstawie obrazu podczas obróbki, zwłaszcza jeśli trzeba pobrać wiele ryzoboksów.
6. Dodaj niewielką ilość wody do docelowego obszaru korzenia, aż na powierzchni pojawi się cienka warstwa wody (patrz Rysunek 2B). Wyższa zawartość wilgoci (preferowane 90%–95% WHC lub 80% dla upraw bardzo wrażliwych na stres tlenowy) w glebie ułatwia dobry kontakt gleby z żelem podczas pobierania próbek. Wyższa zawartość wilgoci jest konieczna, aby zapewnić stały przepływ cząsteczek na hydrożel.
7. Umieść wcześniej przeciętą błonę jądrową bezpośrednio na powierzchni gleby/obszarze korzenia i upewnij się, że leży płasko na granicy gleby z korzeniem (patrz Rysunek 2C).
8. Umieść hydrożel ZrOH bezpośrednio i jak najbardziej płasko na błonie jądrowej w interesującym go obszarze i zrób zdjęcie razem z linijką umieszczoną po lewej stronie hydrożelu ZrOH (patrz Rysunek 2D). Linijka może pomóc określić rozmiar hydrożelu ZrOH, a w przypadku zmian właściwości podczas pobierania próbek także obszar próbki oraz zidentyfikować boki podczas długotrwałego przechowywania (>1 rok).
9. Chroń hydrożel ZrOH przed przednią płytą, nakładając plastikową folię na hydrożel ZrOH (patrz Rysunek 2D).
10. Delikatnie zamknij kłączowy kłącz, aby ograniczyć ruch hydrożelu ZrOH. Minimalne ruchy hydrożelu ZrOH podczas zamykania ryzoboxa można również osiągnąć poprzez przymocowanie żelowej kanapki (błona jądrowa + hydrogel ZrOH + folia plastikowa) do czystej przedniej płyty ryzoboxa za pomocą winylowej taśmy izolacyjnej, jak opisali Wagner i in.²⁶.
11. Owiń rhizobox ponownie folią aluminiową i włóż z powrotem do komory wzrostu/szklarni na 24 godziny. Wychody korzeniowe można zbierać przez dłuższy lub krótszy okres, pod warunkiem że żel nie wysycha oraz w zależności od warunków eksperymentalnych i celów badań.
12. Po okresie aplikacji delikatnie otwórz kłączowy środek, ostrożnie usuń taśmę i membranę oraz wyjmij hydrożel. Włóż hydrożel do sterylnego, szczelnego worka, dodaj kilka kropel wody przed zamknięciem, a następnie przechowuj w lodówce (4 °C) do czasu analizy. Przechowuj żele bez przepustków w podobny sposób jak kontrolę. Do celów mapowania 2D podnieś hydrogel ZrOH razem z plastikową folią i zaznacz górę.
13. Usuń korzenie i określ parametry morfologiczne korzenia, jego masę świeżą oraz suchą masę do normalizacji danych z eksudatów, jeśli nie przeprowadzi się eksperymentów z rozdzielczością czasową.
14. Zamknij křkobox i umieść go z powrotem w komorze klimatycznej lub szklarni, jeśli przeprowadzono badania o rozdzielczości czasowej.

4. Elution i pomiar karboksylatów¹²

UWAGA: Do przygotowania pustych i standardów wymagane są świeże laboratoryjne wody klasy I oraz standardy analityczne wysokiej czystości. Jako zapewnienie jakości należy stosować certyfikowane standardy kontroli jakości. Upewnij się, że roztwory (próbki i standardy) są wolne od cząstek, filtrując próbki przez filtry nylonowe o średnicy 0,2 μm lub 0,45 μm przed analizą, aby zapobiec zatkaniu rur. Szczegóły dotyczące materiałów i chemikaliów znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Wyjmij załadowane i puste hydrożele ZrOH z lodówki, zmierz wymiary linijką, a następnie oblicz objętość każdego z nich, używając grubości 0,4 mm dla dystansu 0,25 mm i 0,64 mm dla dystansu 0,4 mm. Do mapowania 2D pocij hydrożele ZrOH na pożądany rozmiar czystą żyletką. Pamiętaj, że dolna granica to około 2 x 2 mm ze względu na trudności w cięciu mniejszych kawałków i obsłudze odpowiednich objętości elucii.
   UWAGA: Zamiast linijki użyj papieru milimetrowego (milimetrowego) po jednej stronie płyty z pleksi używanej do cięcia, co ułatwia cięcie hydrożeli ZrOH na niemal idealne kawałki. Grubość hydrożeli ZrOH potwierdzona przy użyciu zacisku werniera.
2. Umieść hydrożele ZrOH lub kawałki hydrożelu ZrOH w plastikowych fiolkach, eluuj je, dodając 0,5 mol ^L-1 NaOH według proporcji 1 mL eluentu na 0,196 cm³ ZrOH hydrożelu i potrząsaj na potrząsce przez 24 godziny przy 150 obr./min.
3. Jeśli objętość elucii jest niska w przypadku bardzo małego (np. 2 x 2 mm) kawałka hydrożelu ZrOH, należy dodać wodę laboratoryjnej klasy I wagowo, aby uzyskać 45-60 μL, w zależności od minimalnej objętości potrzebnej dla metody analitycznej stosowanej do ilościowej analizy karboksylanów (na przykład IC-MS potrzebuje co najmniej 45 μL próbki do autopróbkowania), w zależności od instrumentu). Zanotuj dokładną ilość wody dodaną, aby objętość wyniosła 45-60 μL, ponieważ będzie to wymagane do obliczenia współczynnika rozcieńczenia i rzeczywistego stężenia.
4. Przefiltruj próbki (filtry nylonowe 0,2 μm lub 0,45 μm) i przelewaj je do fiolek. Zalecamy używanie plastikowych fiolek IC o pojemności 1,5 mL, ponieważ można je zamrażać bez uszkodzenia. Fiolki o pojemności 330 μL można również stosować do mniejszych objętości, ale należy zachować ostrożność, aby nie pojawiały się pęcherzyki powietrza.
5. Ilościowo określ karboksylany w roztworze elucijnym za pomocą preferowanej metody analitycznej (np. IC-MS, HPLC). Zalecamy ich rozdzielenie za pomocą układu scalonego połączonego z wykrywaniem SM. Alternatywnie, wysokowydajna lub ultra-wydajna chromatografia cieczowa (HPLC lub UHPLC) może być stosowana w połączeniu z różnymi detektorami, w tym zaawansowanymi detektorami MS (np. time-of-flight lub Orbitrap) lub spektrofotometrycznymi.
6. Po zakończeniu pomiaru próbki wraz ze standardami można przechowywać w zamrażarce. Zalecamy przechowywanie wszystkich roztworów zawierających karboksylany w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 rok. Na okresy przechowywania dłuższe niż 1 rok można przygotować i zmierzyć świeże standardy jako kontrolę jakości.
7. Oblicz całkowitą ilość każdego karboksylanu w całkowitej objętości eluatu (tj. objętość NaOH + objętość hydrożelu + dodana woda), a następnie znormalizuj według masy korzenia lub powierzchni korzenia oraz pomnóż przez współczynniki efektywności elucii: 0,94 dla oczkowanego, 1,00 dla cytrynianu, 0,90 dla fumarianu, 1,02 dla mleczanu, 1,05 dla szczawianu i 1,00 dla sukcynianu (patrz Tabela Uzupełniająca 1). Upewnij się, że czynniki rozcieńczenia są uwzględnione, jeśli były wykonywane podczas elucii i pomiaru.

5. Mapowanie 2D

UWAGA: Nie istnieje specjalne oprogramowanie do tworzenia obrazów 2D danych wydzieliny. Mapowanie można wykonać w Microsoft Excel i Pythonie.

1. Wstaw dane uzyskane w kroku 4.7 z każdego kawałka żelu do odpowiadającej mu komórki w siatce 2D (wiersze x kolumny). Siatka jest generowana na podstawie zdjęć wykonanych z korzeni podczas próbkowania (patrz krok 4.1).
2. Zdefiniuj rozmiar siatek i sprawdź, czy dane się zgadzają.
3. Wybierz skalę kolorów i określ kody kolorów reprezentujące najniższe i najwyższe wartości.
4. Określ zakres danych numerycznych dla legendy, aby upewnić się, że dokładnie odpowiada wybranej skali.
5. Stwórz mapę ciepła i upewnij się, że nie ma ona etykiet ani linii siatki. Mapę ciepła można łatwo stworzyć w R Software, korzystając z przykładowego R Script podanego w Pliku Uzupełniającym 1.
6. Przetworz obraz i umieść je obok zdjęcia korzeni uzyskanych podczas próbki, aby móc zinterpretować przestrzenny rozkład karboksylanów.
   UWAGA: Obecnie mapowanie można również wykonywać za pomocą narzędzi sztucznej inteligencji. Procedura jest prosta: wystarczy skopiować i wkleić siatkę numeryczną z Excela do czatu, a następnie poprosić o mapę cieplną z pożądanymi wymiarami żelowych elementów i skalą kolorów dla legendy. Pamiętaj, że efekt nie zawsze będzie idealny za pierwszym razem, ale powtarzanie procesu zwykle daje dokładne rezultaty. To podejście oferuje przewagę znacznie szybszego niż metody manualne.

Results

Metoda hydrożelu ZrOH została początkowo opracowana do pobierania trytryninu z korzeni roślin uprawianych w glebie i z powodzeniem zastosowana do ustalenia przestrzennego rozkładu wydzieliny¹¹. Przed wdrożeniem tej metody dla innych karboksylanów scharakteryzowaliśmy hydrożele ZrOH, aby upewnić się, że są odpowiednie do stosowania także z innymi karboksylanami (patrz Tabela Uzupełniająca 1). Dodatkowo eluowaliśmy i analizowaliśmy załadowane przechowywane hydrożele ZrOH z eksperymentu z ryzobox przeprowadzonym w 2019 roku. Hydrożele ZrOH mogą pochłaniać 100% ilości naładowanej w ciągu 5 godzin (~0,2 μmol, 10 mL) dla oczekiwanianu, cytrynianu, fumarianu, mleczanu, malanianu, szczawianu i sukcynianu, stosując te same parametry elucji ustalone przez Tiziani i ^in.12 (1 mL, 0,5 mol ^L-1 NaOH). Hydrożele ZrOH mogą wiązać do 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol ^cm-2 karboksylanów (patrz Tabela Uzupełniająca 1), znacznie więcej niż stężenia (często w zakresie nmol) zwykle występujące w ryzosferze. Ponadto hydrożele ZrOH bogate w karboksylan pozostają stabilne i mogą być przechowywane przez kilka tygodni przed analizą, minimalizując tym samym degradację mikroorganizmów podczas i po pobieraniu próbek.

Wyniki na Rysunku 3 pokazują dwuwymiarową wizualizację przestrzennego rozkładu cytrynianu wzdłuż korzenia klastrowego rośliny Lupinus albus L (łubin) uprawianej w glebie ubogiej w P. Mapa zawiera 48 indywidualnych pomiarów wykonanych na kawałkach żelu o wymiarach 5 x 2 mm, w które żel ZrOH został pocięty w sierpniu 2025 roku po pobieraniu próbek cytrynianu w sierpniu 2019 roku. Wyraźnie widać, że hydrożele ZrOH skutecznie pochłaniały wydzielany cytrynian, z mierzalnymi wynikami nawet na małym żelu (0,10^cm2), bez potrzeby wstępnego stężenia eluata. Najwyższe wskaźniki wydzieliny cytrynianu odnotowano w regionach korzenia skupiska (do 2,8 nmol ^cm-2 żelu ^h-1), co przekłada się na 67,2 nmol ^cm-2 żelu w dniu ^1, natomiast najniższe odsetki zaobserwowano na kawałkach żelu mających kontakt wyłącznie z glebą. Korzenie klastrów miały długość od 0,2 mm do 15,6 mm, a całkowita długość wynosiła 250 mm. Wyniki te potwierdzają przydatność hydrożeli do pobierania karboksylanów uwalnianych przez korzenie przez 24 godziny. Hydrożele ZrOH były również w stanie wiązać inne karboksylany, takie jak mleczan, fumarian, malat i szczawian, oprócz cytrynianu (Tabela 1). Wykrycie większości karboksylanów z hydrożeli ZrOH, przechowywanych w temperaturze 4 °C przez 6 lat, sugeruje minimalną degradację karboksylanów. Jednak trwają eksperymenty mające na celu zebranie znacznie większej ilości informacji na temat siedmiu testowanych karboksylanów z różnych gatunków roślin.

Rysunek 1: Kluczowe kroki przygotowania żelu poliakrylamidowego. (A) Wyrównanie zespołu płyty szklanej z przesunięciem ~1 mm. (B) odlewanie żelowe oraz (C) równomierne rozprowadzanie roztworu żelowego na płycie od środka płyty. (D) Dźwignia szklanej płytki żyletką z rogu. (E) Moczenie żeli, żeby pomóc odłączyć je od szklanej płyty. (F) Zmywam żel do zlewki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Pobieranie próbek wydzieliny korzeniowej z fragmentu systemu korzeniowego roślin uprawianych w ryzoboxach z użyciem hydrożeli ZrOH. (A) Otwórz Rhizobox po zdjęciu przedniej płyty i plastiku. (B) Odpowiednie zwilżenie granicy gleby z korzeniem przy użyciu wody dejonizowanej w butelce do mycia. (C) Membrana trawiąca śladem nukleporowego przyczepiona do wilgotnej warstwy gleby z korzeniem. (D) Rhizobox z hydrożelem ZrOH nałożonym na interesujący obszar, pokryty folią plastikową zapewniającą ochronę przed przednią płytą. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Pobieranie próbek wydzieliny korzeniowej z użyciem hydrożelu ZrOH oraz obraz dwuwymiarowy w skali milimetrowej wydzieliny cytrynianu. (A) Zdjęcie hydrożelu ZrOH nałożonego na obszar korzeniowy zainteresowania podczas pobierania próbek, aby wygenerować siatki używane do mapowania. (B) Obraz dwuwymiarowy w skali milimetrowej pokazujący rozkład szybkości wydzielania cytrynian (nmol cm^–2 żel h^–1) białego korzenia skupiska Lupinus albus L. (lupin) rosnącego w glebie ubogiej w fosfor. Każda siatka reprezentuje kawałek żelu o wymiarach 5 x 2 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Zakład	Leczenie	Oczekiwa	Cytrynian	Fumarate	Mleczan	Malate	Szczawian	Zwięzłe
	gleby mg P kg-1	NMOL CM-2 H-1
Lupin	50		0.02	0.21	0.15		0.06
Lupin	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
Lupin	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
Lupin	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
Ryż (Nerica4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

Tabela 1: Wskaźniki wydzielania oczeki, cytrynianu, fumarianu, mleczanu, malatu, szczawianu i sukcynianu roślin Lupinus albus L. (lupin) i Oryza sativa L. (ryż) uprawianych w glebie poddawanej glebie o masie 0, 50 i 250 mg P ^kg-1 . LOQ to granica ilościowości

Tabela uzupełniająca 1: Parametry elucii NaOH (1 mL, 0,5 mol ^L-1) (efektywność elucji i współczynnik korekcji) oraz pojemność hydrożelu ZrOH dla siedmiu karboksylanów. Dane to średnie ± odchylenia standardowe średniej (n = 4 dla efektywności elucji i pojemności poszczególnych karboksylanów oraz n = 40 dla mieszaniny karboksylanów). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Ilustracja uzupełniająca 1: Schematyczne przedstawienie zalecanego ryzoboxa dla łatwiejszego podlewania. Rhizobox składa się z ramy typu rhizobox wyposażonej w równomiernie rozmieszczone otwory na podanie u dna i z tyłu, umożliwiające równomierne rozprowadzanie wody podczas podlewania, oraz zdejmowaną, przezroczystą płytę przednią do monitorowania wzrostu korzeni podczas eksperymentu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy rysunek 2: Proces montażu rizoboxów i wypełniania gleby. (A) Oklej otwory z tyłu ramy rhizobox taśmą klejącą. (B) Przymocuj (błonę jądrową), a następnie plastikową folię do przedniej lub otwartej strony ramy Rhizobox (upewnij się, że jest wystarczająco ciasna i płaska). (C) Załóż przednią płytę i zaciskaj kłącz. (D) Wypełnij ryzobox, przechylając go do przodu, tak aby drobniejsze cząstki spadły na zdejmowaną powierzchnię, aby uzyskać gładką powierzchnię, jak na zdjęciu. (E) Alternatywnie, wypełnij przykrytą ramę ryzobox (A) od strony otwartej, wypoziomuj ją zdejmowaną płytą, a następnie przykryj membraną nukleoporową, folią plastikową i przednią płytą. (F) Ostateczne przygotowanie Rhizobox, podlewane i zasiane. Alternatywna procedura wypełniania została przedstawiona w Wagner i in. (2020). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Plik zawiera szczegóły dotyczące skryptu R używanego do generowania mapy cieplnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Opisana tutaj metoda pobierania próbek karboksylanowych wykorzystuje hydrożele ZrOH, dla których niezbędne jest odpowiednie przygotowanie i obsługa żelu. Do obsługi hydrożeli ZrOH zalecamy utrzymywanie ich wilgotności kilkoma kroplami laboratoryjnej wody. Podczas przygotowania ważne jest, aby żel odlewać szybko po przygotowaniu mieszanki żelowej (krok 1.1.3) i upewnić się, że między szklanymi płytkami nie powstają pęcherzyki. Szczególnie istotne są pęcherzyki znajdujące się w centrum hydrożelu ZrOH, ponieważ mogą zakłócać pobieranie próbek. Natomiast pęcherzyki na krawędziach można usunąć przez przycięcie żelu przed aplikacją. Ponadto karboksylany uwalniane z korzeni wiążą się z wytrąconym ZrOH w hydrożelach, co sprawia, że równomierne rozłożenie Zr podczas wytrącenia jest niezbędne. Nierównomierne rozmieszczenie Zr w żelu może prowadzić do bocznej dyfuzji karboksylanów, co zniekształca ich przestrzenny rozkład i osłabia wiarygodność lokalizacji^{2D 26}. Równomierny rozkład Zr można uzyskać, zanurzając żele poliakrylamidu w roztworze ZrOCl₂·8H_2Ona dłużej niż 2 godziny w szerszej zlewce oraz umieszczając mniej żeli¹² (krok 1.2.3). Ponadto rozkład Zr można zweryfikować za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM, S-3400N II, Hitachi, Japonia), zgodnie z zaleceniami Guana i ^in.14, którzy opracowali hydrożele ZrOH. Jednak SEM nie jest wykonalną standardową procedurą dla dużych próbek.

Kolejnym kluczowym krokiem jest wypełnienie ryzoboksów, aplikacja błony jądrowej oraz podlewanie przed aplikacją żelem do pobierania próbek karboksylanowych. Należy zachować szczególną ostrożność przy wypełnianiu i obsłudze gleb piaszczystych lub ciężkich gliniastych, aby zapewnić równomiernie gładką powierzchnię, co jest niezbędne do prawidłowego kontaktu żelowego, a jednocześnie utrzymania dobrze przepuszczalnych warunków. Gładka powierzchnia jest również niezbędna do prawidłowego przyczepienia błony jądrowej. Kluczowe jest zapewnienie dobrego kontaktu między korzeniem a hydrożelem ZrOH, zapewniając, że błona jądrowa prawidłowo przylega do powierzchni gleby przy minimalnych pęcherzykach powietrza. Przed aplikacją żelu ZrOH kluczowe jest również odpowiednie nasącenie gleby, aby hydrożel ZrOH mógł być mocno przymocowany, płaski i wilgotny, aby zachować jego integralność podczas pobierania próbek. Podczas cięcia żelu do 2D mapowania karboksylanowego uzyskanie precyzyjnych cięć milimetrowych może być wyzwaniem; Dlatego zalecamy nie schodzić poniżej rozdzielczości 2 x 2 mm. Dodatkowo, ponieważ żele kurczą się podczas suszenia, ważne jest, aby po próbce były wilgotne, aby zachować ich integralność (krok 3.12). Obecna metoda została zaadaptowana przez Tiziani i ^in.12 , którzy zalecili stosowanie NaN₃ jako inhibitora mikroorganizmów, aby zapobiec degradacji karboksylanów. W tym protokole nie stosujemy żadnych inhibitorów mikroorganizmów, które są powszechnie stosowane do pobierania próbek wydzielin korzeniowych (NaN₃ lub micropur, materiał na bazie AgCl₃)²³, ze względu na ich ingerencję w metody analityczne i potencjalny wpływ na system IC-MS.

Do tej pory metoda ta została zweryfikowana wyłącznie dla siedmiu karboksylanów (oczekicz, cytrynian, fumarian, mleczan, malan, szczawian, sukcynian), podczas gdy wyrzut korzeniowy składa się ze złożonej mieszaniny związków (np. fenoli, aminokwasów, węglowodanów i karboksylanów). Te inne ważne związki nie są obecnie uwzględniane w metodzie, podobnie jak hydrożele ZrOH nie zostały scharakteryzowane pod kątem ich pobierania próbek. Obecność innych oksyanionów w glebie (takich jak fosforany, azotany) może wpływać na pobieranie, pojemność i ewolencję karboksylanów, a także na ilościowe pomiary karboksylanów w IC lub HPLC. Dodatkowo, pobieranie próbek bardzo dużych całych systemów korzeniowych z większych roślin (np. drzew czy krzewów) może być bardzo trudne ze względu na trudności w produkcji bardzo dużych hydrożeli ZrOH (>30 cm). Jest to jednak problem we wszystkich obecnych technikach pobierania próbek wydzieliny⁸. Kolejnym ograniczeniem jest użycie ryzoboxów. Chociaż wzrost roślin w ryzoboxach jest znacznie bardziej realistyczny niż w systemach hydroponicznych⁸, pozostaje to sztuczne rozwiązanie, z ograniczoną trójwymiarową przestrzenią na rozwój korzeni³³. Co więcej, pobieranie próbek odbywa się na powierzchni 2D, co teoretycznie może prowadzić do utraty karboksylanów wydzielanych w innych kierunkach, które nie mają kontaktu z żelami. Jednak to ograniczenie można złagodzić dzięki dyfuzji, większej zdolności wiązania hydrożeli ZrOH dla karboksylanów oraz wysokiej zawartości wody w glebie ryzosfery podczas aplikacji. Jednak do ustalenia tych aspektów potrzebne są dodatkowe weryfikacje.

Metoda hydrożelu ZrOH polegająca na pobieraniu próbek karboksylanów uwalnianych z korzeni oferuje kilka zalet w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami (tj. podejściem hybrydowym glebowo-hydroponicznym oraz hydroponicznym). To nowatorskie podejście umożliwia pobieranie próbek in-situ karboksylanów z niezakłóconych systemów korzeniowych uprawianych w glebie, pobieranie próbek w czasie (Santner, Mühlbacher i in., dane niepublikowane) oraz mapowanie 2D w skali mm. Ponadto hydrożele ZrOH można stosować na korzeniach co najmniej przez 24 godziny^{i 12} godzin. Ponadto powinno być możliwe powtarzane pobieranie próbek tego samego segmentu korzeniowego przez dłuższe okresy rozdzielczości czasowej. Metoda ta jest znacznie lepiej rozwinięta i scharakteryzowana niż podobne metody, takie jak stosowanie papierów filtrujących⁸. Pobieranie próbek przez długi czas jest możliwe przy użyciu hydrożeli ZrOH ze względu na wysoką pojemność żelową dla karboksylanów, na przykład najniższą przy 0,44 μmol ^cm-2 ± 0,04 μmol cm⁻² żelu dla malat do najwyższych 1,66 μmol ^cm-2 ± 0,10 μmol cm⁻² dla sukcynanu przy pH 4,00 z łączną wartością 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol cm⁻² gdy karboksylany są zmieszane (patrz Tabela Uzupełniająca 1). Pominięcie kroku płukania korzeni (który zwykle trwa 20–30 minut na roślinę) w metodzie hybrydy glebowo-hydroponicznej znacząco zmniejsza uszkodzenia systemu korzeniowego i związane z tym uprzedzenia, co daje bardziej realistyczne i reprezentatywne dane.

Co istotne, załadowane hydrożele ZrOH nie wymagają specjalnych warunków przechowywania, a jedynie chłodnictwa, i do tej pory nie zauważyliśmy potrzeby prekoncentracji po elucii w naszych dotychczasowych zastosowaniach. Hydrożele ZrOH wiążą także inne aniony, które są eluowane w tych samych warunkach i mogą być analizowane za pomocą IC^14,34. Pozwala to powiązać wydzielinę karboksylanów z przestrzennym rozkładem składników odżywczych w ryzosferze²⁹.

Podsumowując, to nowatorskie podejście polegające na pobieraniu próbek karboksylanów uwalnianych z korzeni jest fundamentalnym krokiem w badaniach ryzosfery. Ponieważ karboksylany odgrywają kluczową rolę w mobilizacji i pozyskiwaniu składników odżywczych roślin (np. P, Fe)^35,36, a także w rekrutacji pożytecznych mikroorganizmów, metoda ta może być stosowana do przesiewania odmian pod kątem cech korzeniowych i hodowli roślin.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanol	Sigma-Aldrich		70%
Kwas szczawiowy	Sigma-Aldrich	194131-250G	98%
kwas transakonitowy	Sigma-Aldrich	122750-25G	98%
Oktahydrat tlenku dichlorku cyrkonu (ZrOCl2 & razy; 8H2O, 98%)	Thermo Scientific	A12342.22	98%
Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich	C83155-500G	99%
Azotan sodu	VWR Chemicals	Numer działki: 19H224150	100%
Kwas azotowy (HNO3)	Sigma-Aldrich	Numer CAS: 7697-37-2	>65% dla analizy EMSURE® Reag. Ph Eur, ISO
Kwas fumarowy	Sigma-Aldrich	240745-100G	>99%
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S8045-500G	≥ 98%
Persiarczan amonu (APS_(NH4)2S2O8)	Thermo Scientific	201531000	≥ 98,0%, ekstra czysta, do elektroforezy
Kwas succynowy	Sigma-Aldrich	S3674-100G	≥ 99%
Bufor 2-(N-morfolino)-kwasu etansulfonowego (MES)	Sigma-Aldrich	M8250-250G	≥ 99.5%
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	71376-1KG	≥ 99.5%
Łącznik krzyżowy	DGT Research Ltd (Lancaster, Wielka Brytania)	na	2%, pochodna agarozy
Płyta lub pozioma shaker			Dowolny
Chromatografia jonowa lub IC-MS	Thermo Fischer Scientific	na	Każda wysokowydajna lub ultrawydajna chromatografia cieczowa (HPLC lub UHPLC) może być stosowana w połączeniu z różnymi detektorami, w tym zaawansowanymi detektorami MS (np. time-of-flight lub Orbitrap) lub spektrofotometrycznymi detektorami
pH miernik			Można użyć dowolnej laboratoryjnej elektrody pH
Piekarnik	Segregator	na	Można użyć dowolnego małego piekarnika utrzymującego określoną temperaturę, najlepiej mniejszego.
Nylon filters_13 mm 0,45 & mikro; M	Technologia filtrów GVS	Numer działki: 7135431	Można też używać większych filtrów nylonowych, ale preferowane są mniejsze, ponieważ objętość eluate jest niewielka.
Dihydrat siarczanu wapnia	Sigma-Aldrich	C3771-1KG /numer CAS: 10101-41-4	Można również używać CaSO4.
Roztwór akrylamidu, 40%	G-Biosciences	786-508	Nie używaj roztworu akryloamidowego wymieszanego z nimi; Bisakrylamid. Toksyczny związek, z którym należy obchodzić się ostrożnie w warstwie oparów.
Rhizoboxy	https://www.rhizosphere.com/	na	Nasze rhizoboxy są wykonywane na zamówienie zgodnie z projektem Rhizosphere.com
Zestaw fiolki polipropylenowej, 1,5 mL	Thermo Scientific	79812	Plastikowe fiolki IC są preferowane, ponieważ można je zamrażać bez tłuczenia. 330 & mikro; Można też użyć L, ale należy zachować ostrożność, aby nie pojawić się pęcherzyk powietrza
Kwas cis-akonitowy	Thermo Scientific	A16010.06	Technologia. 85%
N,N,N',N'- TETRAMETYLOENIAMIMINA (TEMED)	Sigma-Aldrich	Numer działki: BCBN1173V	Toksyczny związek, z którym należy obchodzić się ostrożnie
Fiolki PP o pojemności 250 mL	Sarstedt	Lot Nr:2406082
Folia aluminiowa	Lokalny supermarket	na
Beakers_1 L/ 2 L
Zaciski	Lokalny magazyn	na
Szklana płytka (6,1 x 17 x 0,4 cm)	Lokalny magazyn	na
L-(-)-kwas jabłkowy	Sigma-Aldrich	M6413-25G
Standard mleczanowy dla IC	Sigma-Aldrich	07096-100ML
Ławka laminarnego przepływu
Kwas L-mlekowy bezwodny	Thermo Scientific	L13242.14
Nuclepore Track-etch Membrane_0.2 & mikro; m	Cytiva	Numer działki: A29983896
Folia plastikowa/plastikowe torby	Lokalny magazyn	na
Plastikowe pęsety	Semadeni	602
Płyta z pleksi	Lokalny magazyn	na
Fiolki PP 30 mL	Aptaca spa	Numer działki: 250552
PTFE spacer_0,25/0,4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
Żyletki	Lokalny magazyn	na
Władca	Lokalna księgarnia	na
Podchloryn sodu (NaClO)	Odczynniki CARLO ERBA	Numer CAS: 7681-52-9
Syringes_1 mL	HENKE SASS WILK (HENKE-JET)	Numer działki: 22A17C8
Winylowa taśma izolacyjna	Lokalny magazyn	na