Artykuł metodologiczny

Ocena wpływu tymochinonu na sygnalizację Keap-1/Nrf-2, stres oksydacyjny oraz zachowania szczurów

251 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69924

⸱

13 marca 2026

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten pokazuje, jak oceniać wpływ tymochinonu na szlak Keap-1/Nrf-2, biomarkery stresu oksydacyjnego oraz wyniki behawioralne w modelu szczura z podprzewlekłą ekspozycją na deltametrynę.

Streszczenie

Najnowsze osiągnięcia w badaniach nad ekspozycją na pestycydy zwiększyły zainteresowanie strategiami ochrony opartymi na antyoksydantach. Tymochinon (TQ), bioaktywny związek pochodzenia roślinnego, wykazuje działanie ochronne przeciwko różnym toksycznym czynnikom. Badanie opisuje protokół oceny wpływu TQ na parametry stresu oksydacyjnego, szlak sygnalizacyjny Keap-1/Nrf-2 oraz wyniki behawioralne u szczurów narażonych na niską dawkę Deltametryny (DTM). Tutaj 24 dorosłe samce szczurów Wistar albino (250 ± 20 g) zostały losowo przydzielone do czterech grup (n = 6 na grupę): kontrola, TQ, DTM oraz DTM+TQ. DTM (1,28 mg/kg) i TQ (10 mg/kg) były podawane nietragastrycznie przez 30 dni. Masa ciała była monitorowana przez cały czas badania. Aktywność lokomotoryczna i zachowania podobne do lęku oceniano za pomocą testu na otwartym polu 31 dnia, a zachowania podobne do depresji za pomocą testu wymuszonego pływania w 32. dniu. Pod koniec okresu eksperymentalnego pobrano tkanki osocza i mózgu do analiz biochemicznych, histopatologicznych i molekularnych. Markery stresu oksydacyjnego, w tym malondialdehyd, całkowity tlenek azotu, glutation i grupy sulfhydrylowej, zostały zmierzone w próbkach osocza i kory mózgowej. Poziomy ekspresji białka 1 (Keap-1) powiązanego z ECH podobnym do Kelcha oraz czynnika erytroida 2 (Nrf-2) zostały przeanalizowane przy użyciu Western blottingu i immunohistochemii. Protokół ten zapewnia kompleksowe i powtarzalne podejście do badania neurotoksyczności wywołanej pestycydami oraz modulacyjnych efektów związków przeciwutleniaczych.

Wprowadzenie

Insektycydy są szeroko stosowane w rolnictwie i środowisku domowym do zwalczania szkodników; Jednak przewlekła ekspozycja na niskie dawki może prowadzić do zanieczyszczenia środowiska i negatywnych skutków zdrowotnych zarówno u ludzi, jak i zwierząt. Taka ekspozycja, szczególnie poprzez skażoną żywność i wodę, wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zaburzeń neurologicznych i innych toksyczności ogólnoustrojowych1.

Pyretroidy w dużej mierze zastąpiły insektycydy organofosforowe ze względu na surowsze regulacje dotyczące tych ostatnich oraz ich stosunkowo niższą toksyczność dla ssaków. DTM, piretroid typu II zawierający grupę α-cyjano, jest jednym z najczęściej stosowanych insektycydów na świecie i uważany jest za bardzo skuteczny przeciwko owadom2. Mimo to badania eksperymentalne wykazały, że ekspozycja na DTM wywołuje stres oksydacyjny i neurotoksyczność w modelach zwierzęcych 3,4.

DTM to silnie lipofilowy związek, który łatwo przekracza barierę krew-mózg i zakłóca funkcjonowanie neuronów poprzez przedłużenie otwierania kanałów sodowych zależnych od napięcia. Efekt ten prowadzi do powtarzających się wyładowań neuronalnych, zwiększonego napływu sodu wewnątrzkomórkowego oraz zwiększonej generacji reaktywnych form tlenu, co ostatecznie prowadzi do uległości oksydacyjnej, stanów zapalnych i zmian behawioralnych, szczególnie w wrażliwych obszarach mózgu, takich jak hipokamp i kora mózgowa1. W związku z rosnącym zaniepokojeniem neurotoksycznością wywołaną pestycydami, coraz większą uwagę zwraca się na ochronne strategie oparte na antyoksydantach, pochodzące z naturalnych źródeł. TQ, główny bioaktywny składnik olejku eterycznego Nigella sativa, wykazujesilne właściwości antyoksydacyjne, przeciwzapalne i neuroprotekcyjne. Kilka badań wykazało jego korzystne działanie przeciwko chemicznie wywołanemu stresowi oksydacyjnym oraz procesom neurodegeneracyjnym 5,6,7,8,9.

Jednym z głównych mechanizmów leżących u podstaw ochronnych efektów TQ jest modulacja szlaku sygnalizacyjnego Keap-1/Nrf-2. Ten szlak odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy redoksowej komórkowej poprzez regulację ekspresji enzymów antyoksydacyjnych i detoksykcyjnych. W warunkach stresu oksydacyjnego represja Nrf-2 wywołana przez Keap-1 ulega ulgi, co pozwala Nrf-2 przenieść się do jądra i aktywować ekspresję genów zależną od antyoksydacyjnego elementuodpowiedzi 9.

Ponieważ ekspozycja na DTM wywołuje zmiany na poziomie molekularnym, biochemicznym, histologicznym i behawioralnym, jedno podejście analityczne nie jest wystarczające, by uchwycić pełny zakres jego neurotoksycznych efektów. Dlatego protokół ten integruje oceny behawioralne, analizy biomarkerów stresu oksydacyjnego, ocenę histopatologiczną oraz molekularne badania szlaku Keap-1/Nrf-2, aby zapewnić kompleksowe i powtarzalne ramy do badania neurotoksyczności wywołanej pestycydami oraz modulacyjnych efektów związków przeciwutleniaczych, takich jak TQ.

Podsumowanie dowodów powyżej podkreśla potrzebę zintegrowanego podejścia eksperymentalnego, aby wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw neurotoksyczności wywołanej DTM oraz ocenić potencjalne interwencje ochronne. Łącząc oceny behawioralne z analizami biochemicznymi, histopatologicznymi i molekularnymi szlaku Keap-1/Nrf-2, obecny protokół umożliwia wielowymiarową ocenę uszkodzeń neuronów związanych ze stresem oksydacyjnym. Interpretacja wyników eksperymentalnych w ramach tego mechanistycznego ramy podkreśla, jak TQ moduluje sygnalizację redoks, łagodzi uszkodzenia tkanek i poprawia wyniki behawioralne w kontekście podprzewlekłej ekspozycji na DTM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Lokalny Komitet Etyki ds. Eksperymentów Instytucjonalnych zatwierdził protokół eksperymentalny pod numerem rejestracyjnym 68429034/35. Całkowity czas trwania badania wynosił 32 dni. Przed eksperymentami zwierzęta były przyzwyczajane do standardowych warunków laboratoryjnych. Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono w ścisłej zgodności z instytucjonalnymi i międzynarodowymi wytycznymi etyki zwierząt. Materiały eksperymentalne użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

UWAGA: Odpady chemiczne i biologiczne zostały utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa laboratoryjnego i gospodarowania odpadami. Kwasy, zasady i rozpuszczalniki organiczne były zbierane w osobnych, oznakowanych pojemnikach i dostarczane do instytucjonalnej jednostki odpadów niebezpiecznych. Materiały biologiczne i skażone materiały zużywalne zostały zebrane w pojemnikach zagrożonych zagrożeniem, sterylizowane i przekazane do odpowiedniego obiektu instytucjonalnego w celu ostatecznej utylizacji.

1. Projektowanie eksperymentalne

  1. Zdobądź 24 dorosłe samce szczurów Wistar Albino o wadze 250 ± 20 g z Laboratorium Eksperymentów Zwierzęcych. Każdego szczura trzymaj osobno w klatkach w temperaturze 24 ± 2 °C w ramach 12-godzinnego cyklu światła/ciemności , z dostępem do standardowego jedzenia szczurów i wody z kranu.
  2. Losowo podziel zwierzęta na cztery grupy (n = 6 na grupę): Grupa 1: Kontrola (C), Grupa 2: TQ, Grupa 3: DTM, Grupa 4: DTM + TQ.
  3. Rozpuszczaj DTM (98% czystości) w oleju kukurydzianym i podawaj w dawce 1,28 mg/kg przez dolotlotkę przez 30 dni.
  4. Rozpuszczaj TQ w dawce 10 mg/kg w oleju kukurydzianym i podawaj przez gavage dobrzuszkowe przez 30 dni. Przygotowuj wszystkie roztwory leków świeżo codziennie i podawaj w łącznej objętości 1 mL/kg.
  5. W grupie leczenia łączonego podaj TQ bezpośrednio po DTM. Podawaj grupie kontrolnej wyłącznie olej kukurydziany, aby uwzględnić stres związany z gavage.
    UWAGA: Dawka DTM została wybrana na podstawie wcześniejszej literatury w celu wywołania stresu oksydacyjnego bez wywoływania zachorowalności i odpowiada około 1/100 LD501.

2. Pomiar masy ciała

  1. Zmierz masę ciała w dniach 1, 10, 20 i 30 badania (Rysunek 1).

3. Parametry behawioralne

  1. Przeprowadzaj wszystkie testy behawioralne w ustandaryzowanych warunkach, aby zapewnić spójność. Nagraj zarówno Test Pływania Przymusowego (FST), jak i Test Otwartego Pola (OFT) za pomocą kamery z góry, która zapewnia pełny widok urządzenia testowego. Utrzymuj oświetlenie na poziomie około 100–150 luksów. Zdefiniuj nieruchomość jako brak aktywnego ruchu, z wyjątkiem minimalnych ruchów niezbędnych do utrzymania postawy i oddychania. Oczyść wszystkie areny testowe 70% etanolem między zwierzętami, aby zapobiec wpływom węchu.
  2. FST
    1. Wykonaj FST w 32. dniu, aby ocenić zachowania podobne do depresji. Przeprowadź 15-minutową sesję przedtestową 24 godziny przed 5-minutową sesją testową, aby przyzwyczaić zwierzęta do środowiska wodnego i zminimalizować stres wywołany nowością. Nie wykonuj oceny behawioralnej podczas sesji przedtestowej.
    2. Indywidualnie umieszczaj szczury w cylindrycznych pojemnikach (średnica: 35 cm, wysokość: 50 cm) zawierających 30 cm wody, utrzymywane w temperaturze 25 ± 1 °C przez 5 minut.
    3. Rejestruj czas pływania, wspinaczki i nieruchomości za pomocą kamery wideo. Określ parametry behawioralne w sekundy z nagrań wideo10.
    4. Zdefiniuj zachowania następująco:
      Nieruchomość: Traktuj zwierzę jako nieruchome, gdy unosi się bez aktywnych ruchów, wykonując tylko minimalne ruchy potrzebne, by utrzymać głowę nad wodą.
      Pływanie: Zdefiniuj pływanie jako aktywny ruch poziomy po całym cylindrze z skoordynowanymi ruchami wszystkich czterech łap.
      Wspinaczka: Zdefiniuj wspinaczkę jako energiczne ruchy przednich łap skierowanych w górę przeciwko ścianie cylindra, podczas gdy zwierzę pozostaje w pozycji pionowej.
    5. Jeśli zwierzę pozostaje całkowicie nieruchome, oceniaj zachowanie jako nieruchome zgodnie z wcześniej ustalonymi kryteriami.
    6. Nie stosuj stymulacji zewnętrznej ani korekty kursu podczas sesji testowej. Pozwól zwierzęciu zachowywać się swobodnie przez całe 5 minut, chyba że jest konieczna interwencja ze względów bezpieczeństwa (np. ryzyko utonięcia).
  3. OFT
    1. Wykonaj OFT w dniu 31, aby ocenić aktywność lokomotoryczną i zachowania podobne do lęku11. Rejestruj pojedyncze ruchy przez 5 minut na arenie o wymiarach 90 x 35 cm, podzielonej na 24 równe jednostki czarnymi liniami.
    2. Określ następujące parametry zachowań z nagrań wideo prowadzonych przez badacza niewidzącego przydziału grup:
      Liczba przekroczeń wszystkimi czterema łapami (aktywność lokomotoryczna)
      Czas spędzony w strefach centralnych i peryferyjnych (zachowania podobne do lęku)
    3. Jeśli zwierzę pozostaje całkowicie nieruchome, zapisz zachowanie jako nieruchomość i nie przypisz żadnych przejść przez ten okres.
    4. Nie stosuj stymulacji zewnętrznej, zmiany pozycji ani korekty kursu podczas sesji testowej.
    5. Pozwól zwierzęciu zachowywać się swobodnie przez całe 5 minut, chyba że interwencja jest konieczna ze względów bezpieczeństwa.
    6. Oczyść arenę 70% etanolem między zwierzętami, aby wyeliminować sygnały węchowe.

4. Ocena markerów stresu oksydacyjnego

  1. Wszystkie zabiegi wykonaj w dniu 32. Głęboko znieczulaj szczury domięśniową ksylazyną (5 mg/kg) i ketaminą (45 mg/kg). Potwierdź głęboką znieczulenie przez brak odruchu wycofania pedałów. Pobrać około 3–5 ml krwi poprzez nakłucie serca do rurek pokrytych EDTA.
  2. Całkowita eutanazja przez wykrwawienie pod głębokim znieczuleniem i potwierdzenie śmierci przed pobraniem tkanek. Próbki krwi w wirówce w dawce 3000 x g przez 10–15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie pobieraj osocze bez naruszania białego płaszcza i przechowuj alikwoty w temperaturze −80 °C. Szybko rozcinaj mózg na lodzie. Oddzielenie lewej półkuli mózgu i hipokampa do analiz biochemicznych oraz natychmiastowe zamrażanie w ciekłym azocie (−80 °C). Umocuj prawą półkulę mózgu w 10% neutralnej buforowanej formalinie do oceny histologicznej.
  3. Analizy stresu oksydacyjnego plazmy
    1. Peroksydacja lipidów w osocze (test TBARS)
      1. Próbki plazmy z wirówek (3 000 x g, 10 min, 4 °C). Wymieszaj 0,5 mL osocza z 1 mL odczynnika TCA–TBA–HCl (15% kwas trichlorooctowy (TCA), 0,375% kwas tiobarbiturowy (TBA), 0,25 N kwas solny (HCl)). Wiruj w 1000 x g przez 10 minut, a następnie przelej supernatant do szklanych rurek. Dodaj 50 μL 0,02% butylowanego hydroksytoluenu (BHT), aby zapobiec sztucznemu utlenianiu.
      2. Podgrzewaj w temperaturze 100 °C przez 15 minut, schłodz do temperatury pokojowej, wiruj w 1000 x g przez 10 minut i mierz absorpcję supernatantów przy 532 nm10. Oblicz stężenie MDA za pomocą prawa Beera–Lamberta
        ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1, l = 1 cm i wyraża się jako nmol/mL plazma.
    2. Poziomy tiolu w osocze (RSH)
      1. Wymieszaj 0,5 mL osocza z buforem Tris-HCl (100 mM, pH 8,2) zawierającym 1% siarczanu sodu dodecylowego (SDS) oraz 2 mM etylendiaminetetraoctowego kwasu octowego (EDTA). Inkubuj 5 minut w temperaturze 25 °C i wiruj (3 000 x g, 10 min, 4 °C). Używaj supernatantu do analizy.
      2. Dodaj 0,3 mM 5,5′-ditiobis-(2-nitrobenzoenowy kwas DTNB) i inkubuj w 37 °C przez 15 minut. Zmierz absorpcję przy 412 nm10. Oblicz stężenia RSH za pomocą ε = 13 600 M⁻1 cm⁻1 i ekspresuj jako μmol/L w osoczu.
    3. Poziomy NOx w osoczu (reakcja Griessa)
      1. Deproteinuj osocze za pomocą 0,3 M wodorotlenku sodu (NaOH) i 5% siarczanu cynku (ZnSO₄). Wirówka w dawce 20 000 x g przez 5 minut i pobiera supernatant.
      2. Przygotuj roztwory azotanów (100, 10 i 1 mmol/L) i generuj standardową krzywą (1–100 μmol/L). Załaduj 100 μL supernatantu (studni duplikacyjnych) do mikropłyty.
      3. Dodaj 100 μL chlorku wanadu (III) (VCl₃), następnie 50 μL sulfanilamidu i 50 μL N-(1-naftylu) etylendiaminy. Inkubuj 30–45 minut w temperaturze pokojowej i mierz absorpcję na 540 nm10. Określ stężenia NOx na podstawie krzywej standardowej i wyrazi je jako μmol/L w osoczu.
  4. Analizy stresu oksydacyjnego tkanek
    1. Do wszystkich analiz biochemicznych należy użyć około 100 mg tkanki lewej półkuli mózgu.
    2. Peroksydacja lipidów tkanek (test TBARS)
      1. Ujednolicaj tkanki (1:10 w/v) w lodowatym 10% TCA. Dodaj taką samą objętość 0,67% TBA i podgrzej w temperaturze 100 °C przez 15 minut. Schłodzić i wirować (3 000 x g, 10 min, 4 °C)10. Zmierz absorpcję supernatantów na 535 nm. Oblicz MDA używając ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1 i wyrazić jako nmol/g tkanki mokrej.
    3. Poziomy glutationu w tkankach (GSH)
      1. Ujednolicaj tkankę w 10% TCA (1:10 w/v) i wirówce (3000 x g, 10 min, 4 °C). Wymieszaj 0,5 mL supernatantu z 2 mL roztworu DTNB (0,4 mg/mL w 1% cytrynianie sodu)10. Natychmiast zmierz absorpcję na 412 nm. Oblicz GSH używając ε = 13 600 M⁻1 cm⁻1 i wyrazić jako μmol/g tkanki mokrej.
    4. Poziomy NOx w tkankach (reakcja Griessa)
      1. Ujednolicaj tkankę w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (1:5 w/v) i wirówce (2000 x g, 5 min). Odtłuszczaj supernatant z 0,3 M NaOH i 5% ZnSO₄. Wirówka (3 000 x g, 20 min) i pobierz przezroczysty supernatant.
      2. Przygotuj standardy azotanów (1–100 μmol/L). Załaduj 100 μL supernatantu do studni duplikatowych. Dodaj odczynniki VCl₃ i Griessa, jak opisano powyżej. Inkubuj 45 minut w 37 °C i mierz absorpcję przy 540 nm10. Określ stężenia na podstawie krzywej standardowej i wyrazisz jako tkankę μmol/g.
        UWAGA: Procedury z udziałem niebezpiecznych chemikaliów, w tym TCA, HCl, NaOH oraz rozpuszczalników organicznych, były wykonywane w certyfikowanym okapie chemicznym. Przez wszystkie eksperymenty stosowano odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE), taki jak fartuchy laboratoryjne, rękawice odporne na chemikalia, okulary ochronne oraz, w razie potrzeby przyłbice na twarz. Wszystkie chemikalia były traktowane zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego oraz odpowiednimi kartami bezpieczeństwa materiałów (MSDS).

5. Określanie poziomów Keap-1 i Nrf-2 za pomocą analizy zachodniej plamki

  1. Pociąć tkankę hipokampa na kawałki po 50 mg i umieścić w rurkach homogenizacyjnych zawierających 500 μL buforu RIPA z dodatkiem koktajlu inhibitorów proteazy.
  2. Dodaj odpowiednią ilość kulek magnetycznych i ujednolic w 1000 x g przez dwa cykle. Wirówka w 14 000 x g przez 10 minut w 4 °C.
  3. Przelej supernatant do czyszczących rurek mikrowirówek i ponownie wiruj w tych samych warunkach. Trzymaj próbki na lodzie i określaj stężenia białka.
  4. Mierz stężenia białek za pomocą fluorometru z zestawem Protein BR Assay Kit, zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Przygotuj żele 10% SDS–PAGE do elektroforezy. Dostosuj stężenie białka do 30 μg/μL.
  6. Dodaj 4x bufora Laemmli w proporcji 3:1 i uzupełnij 10% β-merkaptoetanolu. Podgrzewanie próbek w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie krótko wirowanie.
  7. Załaduj 5 μL markera białka i 30 μg białka na tor. Uruchom żele na 110 V przez 60–90 minut.
  8. Aktywuj membrany PVDF w 100% metanolu przez 3–5 minut, następnie wyrównuj w buforze transferowym 1× na 10 minut w temperaturze pokojowej przed transferem.
  9. Zwilż papiery filtracyjne i gąbki z buforem transferowym i starannie złóż kanapkę transferową, zapewniając całkowite usunięcie pęcherzyków powietrza. Transfer białka wykonuje za pomocą mokrego systemu transferu przy napięciu 100 V przez 90 minut przy 4 °C (stałe napięcie).
  10. Blokuj błony w 3% albuminie surowicy bydłej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na orbitalnym shakerze. Inkubować błony przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w 3% BSA (Keap-1 i Nrf-2, 1:3 000; β-aktyna, 1:1 000).
  11. Myj membrany 5 razy przez 5 minut z 1 × soli fizjologicznej z buforem Tris-buffer i detergentem Tween 20 0,1% (TBS-T). Inkubuj z przeciwciałem wtórnym (1:15 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  12. Membrany przemywaj zgodnie z opisem i inkubuj z podłożem o zwiększonej chemiluminescencji (ECL) (np. podłożem HRP na bazie luminolu) zgodnie z instrukcjami producenta (mieszając równe ilości odczynników A i B tuż przed użyciem). Nałóż wystarczającą ilość podłoża, aby całkowicie pokryć powierzchnię błony (około 1 mL na membranę) i inkubuj przez 1–2 minuty w temperaturze pokojowej.
  13. Wykrywanie sygnałów chemiluminescencyjnych za pomocą cyfrowego systemu obrazowania wyposażonego w wykrywanie chemiluminescencji (nie wymaga specyficznej długości fali wzbudzenia, ponieważ emisja światła powstaje w reakcji HRP–luminol). Wykonuj zdjęcia za pomocą automatycznych ustawień ekspozycji, jednocześnie dbając o pasma bez nasycenia. Utrzymuj identyczne parametry naświetlania dla wszystkich próbek w obrębie tej samej plamy.
  14. Wykonaj analizę densytometryczną za pomocą oprogramowania do analizy obrazów przy identycznych parametrach wyboru ROI, odejmowania tła i normalizacji. Normalizuj intensywności pasmowe Keap-1 i Nrf-2 do odpowiadającego białka housekeeping β-aktyny. Eksportuj znormalizowane wartości jako .csv pliki do analizy statystycznej.

6. Analiza histopatologiczna

  1. Utrwal prawą półkulę mózgu 10% neutralną formaliną przez 72 godziny. Suszyć przez serię stopniowego etanolu (70%–100%), osadzić w parafinie i kroić w 5 μm.
    Pobierz przecięcia mózgu koronnego na poziomie kory hipokampa i entorhina zgodnie z współrzędnymi stereotaksyjnymi zdefiniowanymi w Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press). Użyj interaktywnego przeglądarki atlasu mózgu szczurów (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas, aby zweryfikować i udoskonalić lokalizację anatomiczną11.
  2. Przygotować cztery kolejne przekroje koronne (o grubości 5 μm) z tkanki mózgowej osadzonej w parafinie przy użyciu standardowych procedur histologicznych. Barwić wycinki hematoksyliną i eozyną (H&E) zgodnie z konwencjonalnymi protokołami12. Zbadaj wszystkie preparaty pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 200×. Upewnij się, że ocena histologiczna jest przeprowadzana przez ślepego badacza, aby zminimalizować błędy obserwatora13.
    UWAGA: Ten zabieg zapewnił spójne porównania anatomiczne między grupami.
  3. Półilościowo oceniaj utratę neuronów, obrzęk komórkowy, jądrową pignozę, infiltrację zapalną oraz zatkanie naczyniowe w 10 losowych polach na sekcję.
  4. Oblicz średnie wyniki dla każdego parametru w każdej grupie. Kryteria oceny były następujące: 0 (brak, <5%), 1 (łagodny, <33%), 2 (umiarkowany, 33–66%) oraz 3 (ciężki, >66%; Tabela 1).

7. Analiza immunohistochemiczna reaktywności Nrf-2 i Keap-1 w hipokampie i korze otorinalnej

  1. Przygotuj przekroje o grubości 5 μm z hipokampa i kory entorhinalnej i zamontuj je na szklanych szkiełkach.
  2. Odparaffinuj i nawodnij fragmenty, a następnie płucz sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) w temperaturze pokojowej.
  3. Inkubuj fragmenty z nadtlenkiem wodoru 3% przez 5 minut, aby zablokować aktywność endogennej nadoksydazy. Sekcje płukania z PBS
  4. Wykonaj pobieranie antygenów, podgrzewając szkiełka w buforze cytrynianu sodu (pH 6,0) przez 10–15 minut. Pozwól szkiełkom ostygnąć przez 30 minut, potem umyj PBS.
  5. Ponownie inkubuj sekcje z 3% nadtlenkiem wodoru przez 15 minut, aby zapewnić całkowite zahamowanie nadoksydazy. Przemyj sekcje PBS.
  6. Stosuj roztwór blokujący przez 10 minut, aby zmniejszyć wiązanie niespecyficzne. Inkubuj przekroje przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko Nrf-2 (rozcieńczenie 1:100) i Keap-1 (rozcieńczenie 1:200). Po inkubacji przemyj te fragmenty PBS.
  7. Inkubuj sekcje odpowiednim przeciwciałem wtórnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj sekcje PBS.
  8. Na przekroje nałóż streptawidynę–nadoksydazę i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze (utrzymuj wilgotność względną 95–100% za pomocą szczelnego pudełka inkubacyjnego zawierającego nawilżony papier filtracyjny). Po inkubacji przemyj te fragmenty PBS.
  9. Stosuj chromogen DAB i monitoruj rozwój koloru pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 100×. Zatrzymaj reakcję, płucząc szkiełka wodą z kranu.
  10. Preparaty kontrbarwuj hematoksyliną rozcieńczoną w stosunku 1:9 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dokładnie przepłucz PBS i wodę destylowaną. Zamontuj sekcje za pomocą stałego nośnika montażowego.
  11. Obejrzyj zabarwione fragmenty pod mikroskopem świetlnym. Uchwyć fotomikrografie z powiększeniem ×400 z 16 reprezentatywnych pól na przekrój.
  12. Ilościowo określić immunoreaktywność Nrf-2 i Keap-1 za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Rejestruj i analizuj dane ilościowe do dalszej analizy statystycznej.
  13. Do analizy immunohistochemicznej otwórz obrazy w ImageJ i skalibruj za pomocą narzędzia Set Scale. Przekonwertuj wszystkie obrazy na 8-bitową skalę szarości, aby standaryzować pomiary intensywności. Ręcznie zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) dla obszarów pozytywnie barwionych i sąsiadujących regionów tła i zapisz je w Menedżerze ROI.
  14. Ilościowo określ intensywność barwienia za pomocą spójnej dekonwolucji kolorów H-DAB, a następnie wyznacz identyczne parametry progowe dla wszystkich próbek. Zmierz średnią wartość szarości, gęstość optyczną oraz procent dodatniej powierzchni.
  15. Do analizy komórkowej segmentuj obrazy progowe za pomocą narzędzia Watershed oraz ilościowo określaj dodatnie komórki za pomocą Analyze Particles. Wszystkie dane zostały wyeksportowane jako .csv pliki do analizy statystycznej.

8. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj analizy statystyczne w wersji SPSS 29.0. Wprowadź surowe dane w zakładce Widok danych, gdzie każdy wiersz reprezentuje pojedyncze zwierzę i zmienne zdefiniowane w zakładce Widok zmiennych; grupa eksperymentalna była kodowana jako zmienna kategoryczna (Control, TQ, DTM i DTM+TQ).
  2. Oceń normalność danych za pomocą testu Shapiro–Wilka, wybierając Analizuj > Statystyki opisowe > Eksploruj, przypisując zmienne wynikowe do Listy Zależnej i grupy do Listy Czynników oraz włączając wykresy normalności w testach. Dla zmiennych rozkładu normalnego przeprowadź porównania grupowe za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) za pomocą Analyze > Compare Means > One-Way ANOVA, z włączoną statystyką opisową oraz testem Levene'a na jednorodność wariancji w sekcji Opcje.
  3. Gdy wykryto istotny główny efekt, zastosuj test post hoc Tukeya w menu Post Hoc, aby zidentyfikować różnice grupowe parowo. Wykorzystaj wyniki testów Levene'a, aby potwierdzić jednorodność wariancji (p > 0,05).
  4. Dla danych oceniających histopatologicznie, które nie spełniały założeń parametrycznych, należy przeprowadzić analizę nieparametryczną za pomocą testu Kruskal–Wallis, wybierając Analizuj > Testy Nieparametryczne > Dialogi Legacy > K Independent Samples, a następnie test post hoc Dunna z korekcją Bonferroniego z wykorzystaniem modułu testowego Independent Samples.
  5. Eksportuj wyniki statystyczne i tabele podsumowujące jako .xls lub .csv plików, wyniki wyrażano jako średnią ± odchyleniu standardowym (SD), a wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomiary masy ciała
Masa ciała była rejestrowana w dniach 1, 10, 20 i 30. Szczury z grup C i TQ wykazywały stopniowy wzrost masy ciała w okresie eksperymentalnym, bez istotnych różnic między tymi grupami w 30. dniu. Dla porównania, szczury narażone na DTM wykazały znaczący spadek masy ciała w porównaniu z grupą kontrolną. Współpodawanie TQ osłabiło utratę masy ciała związaną z DTM. W okresie badania nie zaobserwowano śmiertelności (Rysunek 1).

Oceny ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to wykazuje, że podprzewlekła ekspozycja doustna na DTM powoduje stałe zmiany behawioralne, biochemiczne, molekularne i histologiczne u szczurów, a TQ skutecznie łagodzi te efekty, gdy jest podawane równocześnie. Poprzez integrację standaryzowanych testów behawioralnych z profilowaniem stresu oksydacyjnego, analizą szlaków sygnalizacji Keap-1/Nrf-2 oraz oceną histologiczną, protokół zapewnia solidne i powtarzalne ramy do oceny neurotoksyczności wywołanej pestycydami oraz neuroprotekcji opartej na antyoksydacjach....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów ani konkurujących interesów finansowych.

Podziękowania

Badania te nie otrzymały żadnego zewnętrznego finansowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoenowy kwas inny)Thermo Scientific    69-78-3 
Wirówka stołowa NF048Nü ve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, Stany Zjednoczone7D2C10
Rozwiązanie BSA  Proteintech, Stany Zjednoczone)66201-1-Ig
Butylowany hydroksytoluenSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatö r Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM   Bayer TR01426058O
Hematoksylina– eosin Bio OpticaW01030708
Kwas solnyMerck7647-01-0
Image J program NIH; Waszyngton, USAhttps://imagej.net/ij/
Zestaw do barwienia immunohistochemicznego Lab VisionTM UltraVisionTM System Detekcji Dużej Objętości: antypoliwalentnyHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Niemcyhttps://www.leicabiosystems
.com/histologia-sprzęt/mi
krotomy/histocore-autocut/
mikroskop świetlny Nikon, Eclipse  Ni-U, 940728
N-(1-naftyl)etylendiaminaThermo Scientific  1465-25-4
Czytnik Nano mikropłytBMG LABTECHSPECTROstar Nano
sól fizjologiczna z buforem fosforanowym MerckP4417
Przeciwciała pierwotne Keap-1 ProteintechNumer katalogu 10503-2-AP, 1:200
Przeciwciała pierwotne Nrf-2 ProteintechNr katalogowy 16396-1-AP, 1/100
Zestaw do testów białek qubitowych BR ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
Cytrynian soduMerck03-04-6132
Siarczan dodecylosiarczan soduThermo Scientific  151-21-3
Wodorotlenek soduMerck1310-73-2
Azotan soduMerck7631-99-4
Streptawidyna nadoksydaza  Thermo Scientific  SHRP248-B
SulfanilamidThermo Scientific    63-74-1 
kwas tiobarbiturowy  Merck504-17-6
TQ CAYMAN  490-91-5
Kwas trójkarbalilowy, 99%Chemikalia termonaukowe  139360500
Kwas trichlorooctowyChemikalia termonaukowe76-03-9
Tris-HClThermo Scientific    1185-53-1 
Chlorek wanadu(III)Sigma Aldrich7718-98-1
Podłoże chemiluminescencyjne West Pico PLUS oraz iBright 750 System naukowy Thermo Fisherhttps://www.clinxsci.com/product
/mini_chemiluminescence_imagi
ng_system?gad_source=1& gad
_campaignid=16224184202& gbr
aid=0AAAAAoN6UOOtoB8UD0d
eumBAMD8Xi-1l-& gclid=CjwKCAj
wgeLHBhBuEiwAL5gNEXtK2CNS
LS1GqllMuNgkrFYDaW7yK585njQ
jFja485Fkwj9lRUEKDBoCgLoQA
vD_BwE
Roztwór siarczanu cynkuMerck7733-02-0

Bibliografia

  1. Ogut, E., et al. Protective effects of syringic acid on neurobehavioral deficits and hippocampal tissue damages induced by sub-chronic deltamethrin exposure. Neurotoxicol. Teratol. 76, 106839(2019).
  2. Souza, M. F., et al. anxiety-like behavioral impairments associated with brain-derived neurotrophic factor and dopaminergic imbalance after inhalational exposure to deltamethrin. Brain Res Bull. 181, 55-64 (2022).
  3. Chandra, N., Jain, N. K., Sondhia, S., Srivastava, A. B. Deltamethrin induced toxicity and ameliorative effect of alpha-tocopherol in broilers. Bull Environ Contam Toxicol. 90 (6), 673-678 (2013).
  4. Sharma, P., Jan, M., Singh, R. Deltamethrin toxicity. Int J Biol Stud Res. 2 (2), 91-107 (2013).
  5. Abdulbaki, H., Al-Deeb, M. A. Neuroprotective effects of ferulic acid and thymoquinone against deltamethrin-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Adv Life Sci. 10 (2), 289-297 (2023).
  6. Ince, S., Kucukkurt, I., Demirel, H. H., Turkmen, R., Sever, E. Thymoquinone attenuates cypermethrin induced oxidative stress in Swiss albino mice. Pestic Biochem Physiol. 104, 229-235 (2012).
  7. Hafez, E., El-Atrash, A., Massoud, A., Attia, M. The impact of the organophosphate insecticide "Malathion" on rat and the possible ameliorating role of "Thymoquinone". Egypt J Exp Biol (Zool.). 13 (2), 309-318 (2017).
  8. Imam, A. L., et al. Orally administered Thymoquinone mitigates cypermethrin-induced dentate gyrus oxidative stress, preventing GABAergic interneuron degeneration and memory impairment in rats via the Nrf2/ARE pathway. Mol Neurobiol. 61, 20(2024).
  9. Dong, J., et al. Thymoquinone Prevents Dopaminergic Neurodegeneration by Attenuating Oxidative Stress Via the Nrf2/ARE Pathway. Front Pharmacol. 14 (11), 615598(2021).
  10. Kuzay, D., Dileköz, E., Özer, Ç Effects of thymoquinone in a rat model of reserpine-induced depression. Braz J Pharm Sci. 58, e19847(2022).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
  12. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , 7th ed, Churchill Livingstone. (2013).
  13. Klopfleisch, R. Multiparametric and semiquantitative scoring systems for the evaluation of mouse model histopathology. BMC Vet Res. 9, 123(2013).
  14. Brocardo, P. S., et al. Anxiety- and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders: Protective effects of voluntary physical exercise. Neuropharmacology. 62, 1607-1618 (2012).
  15. Arora, D., et al. Evaluation and physiological correlation of plasma proteomic fingerprints for deltamethrin-induced hepatotoxicity in Wistar rats. Life Sci. 160, 72-83 (2016).
  16. Zaki, S. M., Algaleel, W. A. A., Imam, R. A., Soliman, G. A., Ghoneim, F. M. Nano curcumin versus curcumin in amelioration of deltamethrin induced hippocampal damage. Histochem Cell Biol. 154, 157-175 (2020).
  17. Zhang, J., et al. Exposure to deltamethrin in adolescent mice induced thyroid dysfunction and behavioral disorders. Chemosphere. 241, 125118(2020).
  18. Ahmed, W. M. S., Abdel-Azeem, N. M., Ibrahim, M. A., Helmy, N. A., Radi, A. M. Neuromodulatory effect of cinnamon oil on behavioural disturbance, CYP1A1, İnos transcripts and neurochemical alterations induced by deltamethrin in rat brain. Ecotoxicol Environ Saf. 209, 111820(2021).
  19. Khalifa, A. G., et al. Deltamethrin and Its Nanoformulations Induce Behavioral Alteration and Toxicity in Rat Brain through Oxidative Stress and JAK2/STAT3 Signaling Pathway. Toxics. 10, 303(2022).
  20. Khalil, H. M. A., et al. Selenium nanoparticles impart robust neuroprotection against deltamethrin-induced neurotoxicity in male rats by reversing behavioral alterations, oxidative damage, apoptosis, and neuronal loss. Neurotoxicology. 91, 329-339 (2022).
  21. Lazarinia, C. A., Florioa, J. C., Lemonicab, I. P., Bernardi, M. M. Effects of prenatal exposure to deltamethrin on forced swimming behavior, motor activity, and striatal dopamine levels in male and female rats. Neurotoxicol. Teratol. 23, 665-673 (2001).
  22. Takasaki, I., et al. Type II pyrethroid deltamethrin produces antidepressant-like effects in mice. Behav Brain Res. 257, 182-188 (2013).
  23. Ramachandran, S., Thangarajan, S. A novel therapeutic application of solid lipid nanoparticles encapsulated thymoquinone (TQ-SLNs) on 3-nitroproponic acid induced Huntington’s disease-like symptoms in wistar rats. Chem Biol Interact. 256, 25-36 (2016).
  24. Ramachandran, S., Thangarajan, S. Thymoquinone loaded solid lipid nanoparticles counteracts 3-Nitropropionic acid induced motor impairments and neuroinflammation in rat model of Huntington’s disease. Metab Brain Dis. 33, 1459-1470 (2018).
  25. Firdaus, F., Zafeer, M. F., Ahmad, M., Afzal, M. Anxiolytic and antiinflammatory role of thymoquinone in arsenicinduced hippocampal toxicity in Wistar rats. Heliyon. 4, e00650(2018).
  26. Abu-Elfotuh, K., et al. The protective effect of thymoquinone or/and thymol against monosodium glutamate-induced attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD)-like behavior in rats: Modulation of Nrf2/HO-1, TLR4/NF-?B/NLRP3/caspase-1 and Wnt/?-Catenin signaling pathways in rat model. Biomed. Pharmacother. 155, 113799(2022).
  27. Eker, A., Eraslan, G. Single and combined effect of chrysin and N-acetylcysteine against deltamethrin exposure in rats. Food Chem. Toxicol. 196, 115191(2025).
  28. Tekeli, M. Y., Eraslan, G., Bayram, L. Ç, Sarıca, Z. S. Effect of diosmin on lipid peoxidation and organ damage against subacute deltamethrin exposure in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 28, 15890-15908 (2021).
  29. Armstrong, L. E., et al. Effects of Developmental Deltamethrin Exposure on White Adipose Tissue Gene Expression. J Biochem Mol Toxicol. 27 (2), 165-171 (2013).
  30. Shi, W., Zhang, D., Wang, L., Sreeharsha, N., Ning, Y. Curcumin synergistically potentiates the protective effect of sitagliptin against chronic deltamethrin nephrotoxicity in rats: Impact on pro-inflammatory cytokines and Nrf2/Ho-1pathway. J Biochem Mol Toxicol. 33, e22386(2019).
  31. Li, M., et al. Protective effects of thymol on deltamethrin-induced toxicity of Channa argus in association with the NF-κB/Nrf2/p53 pathway. Aquaculture. 559, 738429(2022).
  32. Li, H., Shi, N., Wu, S., Huang, X. Effect of deltamethrin on production of free radical and transcription factor Nrf2 in rats' brain tissue. Chin. J. Ind. Hyg. Occup. Dis. 27 (10), 593-596 (2009).
  33. Li, H. Y., Wu, S. Y., Ma, Q., Shi, N. The pesticide deltamethrin increases free radical production and promotes nuclear translocation of the stress response transcription factor Nrf2 in rat brain. Toxicol Ind Health. 27 (7), 579-590 (2011).
  34. Aboubakr, M., et al. Antioxidant and Anti-Inflammatory Potential of Thymoquinone and Lycopene Mitigate the Chlorpyrifos-Induced Toxic Neuropathy. Pharmaceuticals (Basel). 14, 940(2021).
  35. Abdel-Daim, M. M., et al. Thymoquinone and diallyl sulfide protect against fipronil-induced oxidative injury in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 25, 23909-23916 (2018).
  36. Qadri, M. M., et al. Thymoquinone Ameliorates Carfilzomib-Induced Renal Impairment by Modulating Oxidative Stress Markers, Inflammatory/Apoptotic Mediators, and Augmenting Nrf2 in Rats. Int J Mol Sci. 24, 10621(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wp yw tymochinonuekspozycja na deltametrynstrategie przeciwutleniaj ceocena behawioralnatest otwartej przestrzenitest wymuszonego p ywaniawestern blottingimmunohistochemia

Powiązane artykuły