Analiza spektralna Ramana wspomagana uczeniem maszynowym nanosensora ssDNA-SWCNT reagującego na serotoninę dla poprawy selektywności wobec dopaminy

Summary

Protokół opisuje analizę spektralną Ramana nanosensora SWCNT owiniętego w ssDNA, umożliwiając lepsze selektywne pomiary serotoniny względem dopaminy przy wsparciu modelu uczenia maszynowego.

Abstract

Serotonina (5-hydroksytryptamina, 5-HT) odgrywa kluczową rolę w neuromodulacji, jednak obecne metody wykrywania mają trudności z zapewnieniem w czasie rzeczywistym wykrywania 5-HT o wysokiej czułości i selektywności. Wcześniej opracowaliśmy nanosensor serotoniny w bliskiej podczerwieni (nIRHT), który składa się z nanorurek węglowych owiniętych w ssDNA, które wrażliwie wykrywają 5-HT. Jednak odpowiedź fluorescencyjna nIRHT nie jest w stanie rozróżnić 5HT od dopaminy (DA), co ogranicza jej praktyczne zastosowania. W tym badaniu spektroskopia Ramana w połączeniu z uczeniem maszynowym pokonuje to wyzwanie selektywności. Cechy spektralne w paśmie G wykazały wyraźne sygnatury wiązania 5HT i DA z nIRHT, przy czym DA powodowała większe tłumienie pasma G. Zastosowaliśmy różnicowego Ramana (ΔRaman) do izolacji specyficznych dla analitu zmian widmowych oraz trenowaliśmy trzy modele uczenia maszynowego do klasyfikacji. Model losowego lasu z ΔRaman osiągnął optymalną wydajność z dokładnością 95,8%, znacząco przewyższając modele wykorzystujące surowe widma Ramana. Podejście to wykazało poprawę swoistości, z pomijalnymi odpowiedziami na acetylocholinę, GABA i glutaminian, oraz osiągnęło limit wykrywania 0,1 μM odpowiedni do zastosowań fizjologicznych. To podejście oparte na Ramanie przekształca nieselektywny czujnik fluorescencji nIRHT w platformę zdolną do solidnej dyskryminacji neuroprzekaźników, pokonując problemy selektywności w molekularnym wykrywaniu opartym na nanorurkach węglowych (SWCNT).

Introduction

Serotonina (5-hydroksytryptamina, 5-HT) to kluczowy neuroprzekaźnik regulujący nastrój, funkcje poznawcze, sen i apetyt, z dysfunkcjami powiązanymi z depresją, lękiem i innymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi¹. Monitorowanie dynamiki serotoniny w systemach biologicznych w czasie rzeczywistym pozostaje trudne ze względu na milisekundową skalę transmisji synaptycznej oraz złożone środowisko chemiczne tkanki nerwowej². Pomimo znaczących postępów w technologiach wykrywania neuroprzekaźników, osiągnięcie wysokiej czułości i selektywności molekularnej wobec serotoniny nadal stanowi poważne wyzwania analityczne.

Obecne metody wykrywania serotoniny obejmują zarówno tradycyjne techniki analityczne, jak i nowe platformy nanosensorów. Wysokowydajna chromatografia cieczowa z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ED) pozostaje złotym standardem, osiągając granice wykrywalności 0,056 nM przy doskonałej powtarzalności³. Jednak HPLC wymaga intensywnego przygotowania próbki i 15-30 minut analizy, co wyklucza monitorowanie w czasie rzeczywistym⁴. Szybka cykliczna voltametria (FSCV) umożliwia rozdzielczość czasową poniżej sekundy na mikroelektrodach z włókna węglowego, ale cierpi na zanieczyszczenia elektrod i ograniczoną selektywność między neuroprzekaźnikami strukturalnie podobnymi ^5,6. Najnowsze osiągnięcia w genetycznie kodowanych czujnikach fluorescencji, w tym iSeroSnFR⁷ i GRAB-5HT⁸, osiągają niezwykłą czułość i zakres dynamiczny, ale wymagają modyfikacji genetycznej tkanek docelowych, co ogranicza tłumaczenie kliniczne.

Jednościenne nanorurki węglowe (SWCNT) wyłoniły się jako obiecujące platformy do wykrywania neuroprzekaźników bez oznakowania⁹. Funkcjonalizowane DNA SWCNT wykazują modulację fluorescencji w bliskiej podczerwieni (nIR) po wiązaniu analitu, co umożliwia wykrywanie w przezroczystym oknie tkankowo (900-1400 nm)^10,11. Grupa Landry'ego opracowała czujnik nIRHT poprzez systematyczną ewolucję ligandów przez wykładnicze wzbogacenie (SELEC), przesiewając ~10^unikalnych sekwencji ssDNA w celu identyfikacji konstruktów reagujących na serotoninę¹². Czujnik ten osiąga czułość mikromolarną z 200% wzmocnieniem fluorescencji po wiązaniu serotoniny, działając niezależnie od utleniania dopaminy lub serotoniny. Aby wykluczyć interferencję oksydacyjną, nasze wcześniejsze badanie potwierdziło stabilność tych rozwiązań neuroprzekaźników; Analizy UV-Vis i NMR nie wykazały zmian oksydacyjnych ani nowych powstawania pików w porównaniu z czystym 5HT¹². Ponadto krótki czas inkubacji i neutralne warunki pH stosowane w systemie mają zapobiegać znaczącemu powstawaniu chinonów. Podobnie grupa Strano była pionierem molekularnego rozpoznawania fazy korony (CoPhMoRe), wykazując, że SWCNT owinięte w (GT)₁₅ wykrywają dopaminę przy stężeniu 11 nM¹³. Nasza grupa niedawno rozwinęła tę dziedzinę dzięki optymalizacji sterowanej uczeniem maszynowym, osiągając 2,5-krotną poprawę czułości dzięki wysokoprzepustowemu przesiewowi systematycznie zmutowanych sekwencji¹⁴.

Pomimo tych postępów, istnieje fundamentalne ograniczenie w niewystarczającej selektywności między serotoniną a dopaminą. Oba neuroprzekaźniki zawierają pierścienie aromatyczne i łańcuchy etylaminowe, różniące się tylko jedną grupą hydroksylową¹⁵. Obecne czujniki SWCNT oparte na fluorescencji zazwyczaj osiągają wskaźniki selektywności poniżej 5:1, co jest niewystarczające do rozróżniania współuwalnianych neuroprzekaźników w środowiskach synaptycznych¹⁶. To wyzwanie selektywności jest szczególnie istotne, biorąc pod uwagę, że serotonina i dopamina często współlokalizują się w obszarach mózgu odpowiedzialnych za nagrodę i motywację¹⁷.

Spektroskopia Ramana dostarcza uzupełniających informacji chemicznych poprzez analizę trybów drgań kompleksu SWCNT-analyt¹⁸. Pasmo G (~1580 cm⁻¹) SWCNT dzieli się na komponenty G⁺ i G⁻, z częstotliwościami wrażliwymi na adsorpcję molekularną i domieszkowanie elektronowe¹⁹. Poprzednie badanie wykazało, że niekowalencyjne środki powierzchniowo czynne na SWCNT wywołują wyraźne zmiany widma Ramana w paśmie G²⁰.

W tej pracy demonstrujemy analizę spektralną Ramana sensora nIRHT wspomaganą uczeniem maszynowym, aby osiągnąć większą selektywność między serotoniną a dopaminą. Systematycznie charakteryzowaliśmy odpowiedzi Ramana zależne od stężenia od 0,01 do 100 μM, ujawniając odrębne odciski palców spektralnych dla każdego neuroprzekaźnika. Trzy modele uczenia maszynowego — konwolucyjne sieci neuronowe (CNN), maszyna wektorów wsparcia (SVM) oraz las losowy (RF) — zostały wytrenowane na zbiorach danych spektralnych w celu klasyfikacji tożsamości analitów. Co istotne, wprowadzamy różnicowe przetwarzanie Ramana, które usuwa sygnały bazowe, aby wyizolować cechy specyficzne dla analitu. Zoptymalizowany model RF z przetwarzaniem DR osiąga dokładność klasyfikacji 95,8%, co stanowi znaczący postęp w rozróżnianiu molekularnym. To podejście multimodalne łączące wrażliwość fluorescencji nIR z chemiczną specyficznością Ramana tworzy ścieżkę do selektywnego monitorowania serotoniny w czasie rzeczywistym w złożonych środowiskach biologicznych.

Protocol

1. Funkcjonalna produkcja nanosensorów SWCNT nIRHT z funkcjonalizacją ssDNA

1. Połącz 1 mg jednościennych nanorurek węglowych (SWCNT), 100 μL 1 mM E6#9 ssDNA oraz 900 μL 1x fosforan-buforowanej soli fizjologicznej (PBS) w probówce o pojemności 1,5 mL.
   UWAGA: Suchy proszek SWCNT może stanowić zagrożenie wdychania. Obchodzić się z proszkiem wewnątrz certyfikowanego chemicznego kaptura i nosić odpowiedni sprzęt ochronny, w tym maskę i rękawiczki.
2. Rozproszyj mieszankę za pomocą sonikatora do kąpieli przez 5 minut. Sonikuj mieszankę za pomocą sonikatora z końcówką wyposażoną w sondę o średnicy 3 mm o amplitudzie 50% przez 30 minut w kąpieli lodowej.
3. Wirówka roztworu sonikowanego w ilości 21 500 x g przez 1 godzinę, aby wytrącić nierozproszone SWCNT. Ostrożnie pobierz 850 μL supernatantu i przelej go do nowej rurki.
4. Zmierz absorpcję zebranej zawiesziny SWCNT przy długości fali 632 nm. Oblicz stężenie za pomocą współczynnika wymierania SWCNT wynoszącego 0,036 (mg/L)⁻¹ cm⁻¹. Ostatni roztwór czujnika nIRHT przechowuj w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.

2. Pomiar widm Ramana

1. Załaduj 90 μL dyspersji 10 mg/L nIRHT do płyty z 96 dołami. Zmierz widmo Ramana czujnika w buforze PBS za pomocą źródła wzbudzenia laserowego o średnicy 532 nm. Ustaw to nagrane widmo jako punkt odniesienia.
   UWAGA: Kluczowe jest ścisłe utrzymywanie mocy lasera na poziomie 10 mW i długości fali 532 nm podczas badania żywych próbek biologicznych. Wyższa moc lasera może wywołać poważną fototoksyczność i osłabić żywotność komórek. Laser 532 nm o mocy 10 mW stosowany w tym protokole został dobrze ugruntowany jako bezpieczny i nieniszczący do analizy żywych komórek, zachowując czułe organelle²¹ oraz elektrofizjologiczną aktywność neuronów pierwotnych²² , jednocześnie zapewniając solidne pozyskiwanie sygnału Ramana.
2. Każdy roztwór sensorowy o pojemności 90 μL (10mg/L) należy dodać 10 μL roztworu analitu, aby osiągnąć końcowe stężenia 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 i 100 μM. Poczekaj 5 minut po dodaniu analitu, aby zapewnić odpowiednią inkubację.
3. Zmierz widma Ramana inkubowanych próbek. Przygotuj próbki w trzech egzemplarzach dla każdego stężenia i powtarzaj kroki od 2.1 do 2.2, aby zapewnić powtarzalność.

3. Analiza danych oparta na uczeniu maszynowym

1. Zbuduj zbiór danych z łącznie 208 widm Ramana, obejmujących 77 odpowiedzi dopaminowych (DA), 76 serotoninowych (5HT) oraz 47 odpowiedzi grup kontrolnych (PBS).
2. Wykonaj odejmowanie tła w paśmie G danych widmowych. Normalizuj dane odejmowane przez tło na podstawie szczytu pasma G+.
3. Zastosuj filtr mediany, aby zmniejszyć szum w znormalizowanych widmach. Izoluj zmiany widmowe (ΔRaman) poprzez odejmowanie znormalizowanego widma kontrolnego od każdego spektrum poddawanego analizie.
4. Opracować konwolucyjną sieć neuronową (CNN), las losowy (RF) oraz model maszyny wektorowej wsparcia (SVM) do klasyfikacji trójczoręcznej 5HT, DA lub sterowania.
5. Podziel cały zbiór danych na zestawy treningowe, walidacyjne i testowe, stosując stosunek 6:2:2.
6. Konfiguruj architekturę CNN z trzema warstwami konwolucji 1D wykorzystującymi funkcję aktywacji ReLU oraz maksymalnym rozmiarem puli 2, a następnie dwoma w pełni połączonymi warstwami.
7. Konfiguruj SVM za pomocą jądra Radial Basis Function (RBF) do klasyfikacji nieliniowej.
8. Konfiguruj model RF przy użyciu domyślnych hiperparametrów.
9. Trenuj zbudowane modele za pomocą 5-krotnej walidacji krzyżowej. Oblicz średnie wskaźniki wydajności dla wszystkich 5 warstw, aby zapewnić statystyczną wiarygodność.
10. Wybierz model, który zapewnia najwyższą dokładność danych walidacyjnych do analizy końcowej.
11. Oceniaj wybrany model na zbiorze testowym, aby zweryfikować jego zdolność uogólnienia.
12. Określ pośredni limit wykrywania (LOD), wykluczając kolejno dane z zestawu treningowego, które znajdują się poniżej progu stężenia 0,1 μM.
13. Przetestuj wytrenowany model na całym zakresie stężeń, w tym stężeniach poniżej kryteriów, aby ustalić ostateczny LOD.

Results

Nanosensor SWCNT (nIRHT) E6#9 funkcjonalny ssDNA, wcześniej opracowany metodologią SELEC, wykazuje odwracalne wzmocnienie fluorescencji nIR po wiązaniu 5HT, umożliwiając obrazowanie 5HT in vitro i ex vivo¹² w czasie rzeczywistym. Sekwencja E6#9 (5'-CCCCCCAGACCAGACAGCACCCCCCCCC-3') owija się wokół SWCNT, tworząc miejsca wiązania dla 5HT. Jednak ten sensor nie wykazuje specyficzności: zarówno 5-HT, jak i DA powodują porównywalny wzrost intensywności (rysunek 1B...

Discussion

Analiza spektralnograficzna Ramana zapewniła istotne zwiększenie specyficzności czujnika nIRHT, co nie było możliwe przy konwencjonalnej odpowiedzi fluorescencyjnej. Zaobserwowaliśmy, że DA indukuje bardziej wyraźne tłumienie pasma G⁻ (1570 ^cm-1) w porównaniu do 5HT. Te różnicowe sygnatury prawdopodobnie wynikają z różnych orientacji molekularnych i geometrii wiązania na powierzchni SWCNT. Konkretnie, katecholowa część DA prawdopodobnie tworzy silniejsze interakcje π-π z powierzchnią SWCNT, indukując większą p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	Nanointegris
iDus1.7 InGaAs	ANDOR	DU490A-1,9
Ramantouch	Nano Photon
Vibra Cell 130	SONICS