Artykuł metodologiczny

Wielozwierzęce obrazowanie rezonansu magnetycznego do pomiarów guza w myszych modelach raka trzustki

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69927

⸱

3 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Biomedical Imaging, Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten wykorzystuje wielokomorowe łóżko do równoległego rezonansu magnetycznego (MRI) do czterech zwierząt do wykrywania guzów gruczolakoraka trzustki w genetycznie modyfikowanych modelach myszy. Ten protokół MRI wielozwierzęcy jest szybki i opłacalny w wykrywaniu i pomiarze guzów, ułatwiając selekcję zwierząt do badań przedklinicznych oraz podłużne monitorowanie wzrostu guzów.

Streszczenie

Zaawansowane metody obrazowania in vivo , takie jak rezonans magnetyczny (MRI), są kluczowymi narzędziami badawczymi do skutecznego wykrywania guzów w przedklinicznych modelach myszy. MRI dostarcza szczegółowych informacji anatomicznych dotyczących lokalizacji i wielkości guza. Jednak ta metoda obrazowania jest kosztowna i czasochłonna. Aby pokonać tę barierę dostępu bez utraty jakości obrazowania, wdrożono protokół MRI dla wielu zwierząt. Protokół ten wykorzystuje wkład do łóżka czterokomorowego do uzyskania wysokorozdzielczych wielozwierzęcych anatomicznych skanów MRI w trakcie jednej sesji akwizycji. Jednoczesne wyobrażanie sobie wielu myszy skraca czas i koszty tego zabiegu. Protokół ten opisuje wielozwierzęcy proces MRI zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności wykrywania guzów i monitorowania podłużnego guza w genetycznie modyfikowanym modelu mysim napędzanym Kras, p53-deleted (KPC) gruczolakoraka przewodowego trzustki. Ten dobrze ugruntowany, klinicznie istotny model KPC dostarczył bezcennych informacji na temat molekularnych mechanizmów leżących u podstaw raka trzustki, postępu guza oraz oporności na leczenie. Jako dowód koncepcji protokół ten jest stosowany w celu weryfikacji terapeutycznych korzyści standardowego środka chemioterapeutycznego gemcytabiny w modelu KPC. Krótko omówiono przyszłe zastosowania tego projektu badań przedklinicznych sterowanych MRI, aby ocenić skuteczność terapeutyczną terapii skojarzonych.

Wprowadzenie

Gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) pozostaje jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów. Pomimo umiarkowanej poprawy przeżywalności w ostatnich latach, wskaźnik przeżycia przez 5 lat wynosi nadal tylko 13%1. W większości przypadków PDAC wykrywa się w zaawansowanym stadium, często obejmującym miejscową inwazję lub odległe przerzuty, co utrudnia leczenie. Choroba jest biologicznie zróżnicowana i charakteryzuje się wysoce inwazyjnymi komórkami nowotworowymi, gęstym desmoplasticznym stromem oraz słabą unaczynieniem 2,3,4. To złożone mikrośrodowisko nowotworowe nadal utrudnia pełne scharakteryzowanie składników komórkowych i niekomórkowych wpływających na postęp choroby. Aby temu przeciwdziałać, potrzebne są skuteczne modele przedkliniczne, które wiernie naśladują postęp choroby u ludzi i desmoplazję.

Różne modele myszy mogą być wykorzystywane do badania biologii postępu nowotworu i oceny skuteczności nowych terapii 5,6. Model myszy (GEMM) sterowany genetycznie sterowany KRas spontanicznie rozwija guzy trzustki, które odzwierciedlają wiele cech patofizjologicznych i molekularnych ludzkich PDAC 3,7,8,9,10,11. W szczególności model KPC sterowany Krasem, usunięty z p53 (LSL-KrasG12D; p53lox/+; Pdx1-Cre) to dobrze scharakteryzowany PDAC GEMM 7,8,9. Obrazowanie nowotworów jest ważnym elementem badań przedklinicznych. Wykrywanie i pomiar wielkości guzów umożliwiają selekcję zwierząt do badań przedklinicznych, podłużne monitorowanie wzrostu guza i postępu choroby oraz ocenę odpowiedzi na leczenie.

Zaawansowane metody obrazowania in vivo, takie jak ultrasonografia (US), bioluminescencja (BLI), tomografia komputerowa (CT), obrazowanie fluorescencyjne (FLI), tomografia emisyjna pozytonowa (PET) oraz rezonans magnetyczny (MRI), mogą być stosowane do obrazowania nowotworów w modelu KPC oraz podobnych modelach PDAC 12,13,14,15,16. Jednak obrazowanie nowotworów w modelu KPC może być wyzwaniem, a każda z tych metod obrazowania ma unikalne zalety i ograniczenia. Technologie obrazowania optycznego, takie jak bioluminescencja (BLI) i ultradźwięki (USA), są nieinwazyjne i opłacalne. Jednak ich ograniczona rozdzielczość przestrzenna, szczególnie w przypadku narządów wewnętrznych, może prowadzić do słabej korelacji z objętością guza 12,15,17,18. Bioluminescencja wymaga genetycznie modyfikowanych komórek wyrażających sygnał lucyferazy, który również zależy od dostarczania substratu, przepływu krwi i natlenienia tkanek. Tomograf komputerowy zapewnia szybkie obrazowanie przy minimalnych artefaktach ruchu, ale słabym kontrastie tkanek miękkich bez środków kontrastowych. Jodowany kontrast może powodować toksyczność u myszy. Obrazowanie fluorescencyjne wymaga środków kontrastowych/sond fluorescencyjnego, a autofluorescencja z narządów jamy brzusznej zmniejsza wrażliwość.

Ze względu na ograniczenia związane z innymi metodami obrazowania, rezonans magnetyczny (MRI) jest powszechnie uważany za najbardziej niezawodną metodę oceny głęboko osadzonych guzów, oferując lepszy kontrast tkanek miękkich oraz czułość molekularną na wewnętrzne struktury anatomiczne 13,14,15,19 . Jednak standardowe protokoły preklinicznego MRI wiążą się z wysokimi kosztami operacyjnymi i długimi czasami pozyskiwania, co może stanowić przeszkodę dla wielu laboratoriów badawczych. MRI wielozwierzęce może przezwyciężyć tę barierę dostępu, skracając czas przygotowania zwierząt przed badaniem (znieczulenie), czas skanowania oraz powrót zwierząt do powrotu do zdrowia po badaniu. Protokół ten pokazuje techniczną wykonalność obrazowania guzów PDAC (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4) oraz wykorzystanie wyników obrazowych do rekrutacji zwierząt do leczenia chemioterapeutycznego gemcytabiną (Rysunek 5). Guzy PDAC wykazują wiele wrodzonych mechanizmów, które przyczyniają się do oporności na chemioterapię standardową (SOC). takie jak gemcytabina, gemcytabina/nab-paklitaksel lub FOLFIRINOX 2,3,4. Protokół ten zapewnia odpowiednią i solidną platformę do oceny nowych leków terapeutycznych oraz chemioterapii SOC w celu znalezienia obiecujących kombinacji 20,21,22,23,24,25,26,27, które mogą poprawić odpowiedź na leczenie u pacjentów.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych na Uniwersytecie Stanowym Michigan. Wszystkie procedury dotyczące żywych zwierząt są zgodne z ustalonymi wytycznymi, które zapewniają dobrostan i humanitarne traktowanie zwierząt. Protokół ten opisuje użycie i sposób leczenia modelu myszy KPC w PDAC: LSL-K-Ras G12D (Krastm4Tyj); p53lox/lox (Trp53tm1Brn); Pdx1-Cre (Pdx1-cre6Tuv)9.

1. Przygotowanie zwierząt do wyobrażania sobie

  1. Przed użyciem należy zapewnić prawidłową weryfikację genotypu myszy KPC. Transportować eksperymentalne myszy z ośrodka zwierzęcego do ośrodka obrazowania.
  2. Znieczulaj do czterech myszy w podgrzewanej, szczelnej komorze indukcyjnej z 1,5-2% izofluranem i 0,8-2 L/min tlenu. Potwierdź znieczulenie, stosując szkodliwy bodziec (szczypanie palców u stóp).
  3. Nałóż okulisty lubrykant na oba oczy każdej myszy, aby zapobiec wysychaniu rogówki.

2. Zestaw stołu MRI z wieloma zwierzętami

  1. Umieść dwie znieczulone myszy w pozycji brzusznej na dolnej części (lewej i prawej) wkładki do stołu drukowanej w 3D, która jest przymocowana do standardowego uchwytu PET/MRI z pojedynczym szczurem dostarczonym przez dostawcę. Upewnij się, że zwierzęta są ustawione z prostymi kręgosłupami i kończynami.
    UWAGA: Do drukowania wkładek stołu użyto drukarki 3D (Plik Uzupełniający 1 i Plik Uzupełniający 2).
  2. Podłącz wlot powietrza w podwoziu dostawcy z nosowymi stożkami za pomocą rurek (średnica wewnętrzna 1/16", średnica zewnętrzna 1/8") oraz złączek luer (np. 7 x 1/16" męskie, 2 x 1/16" żeńskie, 2 złącza żeńsko-żeńskie, 2 złącza T gniazdo do gniazda).
  3. Zabezpiecz głowę myszy w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie (1,5-2% izofluranu, 0,8-2 L/min tlenu). Okryj dół górną częścią wkładek stołu drukowanych w 3D (Rysunek 2B).
  4. Umieść pozostałe dwie znieczulone myszy w pozycji brzusznej na górnej części (po lewej i prawej) wkładki do łóżka wydrukowanej w 3D.
  5. Zabezpiecz głowę myszy w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie (1,5-2% izofluranu, 0,8-2 L/min tlenu).
  6. Przyklej podkładkę do monitorowania oddechu na lewym górnym rogu myszy. Upewnij się, że podkładka monitorująca znajduje się na wysokości brzucha, a nie klatki piersiowej, aby mierzyć oddech bez sygnału z bicia serca.
  7. Ustaw poziom izofluranu tak, aby utrzymywał tempo oddechu 30-40 uderzeń na minutę przez cały skan, zazwyczaj 1,5-2%. Jeśli ślad oddechowy nie jest widoczny lub amplituda jest zbyt niska, upewnij się, że poduszka jest mocno przymocowana taśmą i że wszystkie połączenia w rurze są dobrze dokręcone.
  8. Przykryj łóżko, aby ukończyć komorę MRI z wieloma zwierzętami (Rysunek 2B).
    UWAGA: Dostarczone przez dostawcę łóżko PET/MRI dla pojedynczego szczura jest wyposażone w cyrkulujące ciepłe powietrze, aby utrzymać temperaturę ciała zwierząt (~35-37 °C). Do czterech myszy można zeskanować jednocześnie za pomocą wkładek drukowanych w 3D. Dokładne ustawienia temperatury ciepłej wody, a także szybkości wlotu powietrza i wylotów powietrza, zależą od konfiguracji na każdym miejscu, w tym odległości od sali kontrolnej do MRI. Można je ustawić w każdym miejscu za pomocą serii pilotażowych skanów, podczas których temperatura jest monitorowana przez cały czas, a następnie standaryzowana dla każdego badania.

3. Konfiguracja presskanu i kalibracja obrazowania

  1. Upewnij się, że myszy znajdują się w środku cewki MRI wzdłuż, ustawiając czerwony laser ze środkiem wielokomorowego stołu przed umieszczeniem uchwytu w otworze.
  2. Przypisz etykietę skanowi, używając identyfikatora myszy i daty skanowania w następującym formacie: Strain, Mouse ID, Scan Date.
  3. Ustaw skan FLASH ważony T1 z jednym cięciem osiowym, dwoma koronalnymi i dwoma cięciami strzałkowymi, aby zwizualizować myszy w czterokomorowym łóżku i zdefiniować obszar obrazowania przy użyciu następujących ustawień: TR/TE 50/2,4 ms, 2 średnie, kąt odwrócenia 20°, rozdzielczość 0,313 mm, grubość 1 mm kawałka, czas skanowania 13 s.
  4. Sprawdź, czy całe ciało myszy jest w polu widzenia i czy myszy są proste. Jeśli nie, powtórz kroki pozycjonowania myszy i/lub przesuń łóżko myszy do lub z otworu.
    UWAGA: Parametry te opierały się na specyfikacji używanego systemu MRI. Parametry te można dostosowywać w razie potrzeby, aby zoptymalizować akwizycję obrazu zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi i/lub możliwościami systemu MRI.

4. Wielozwierzęce obrazowanie rezonansu magnetycznego

  1. Ustaw sekwencję szybkiego echa obrotu T2 z następującymi parametrami: Czas powtórzenia (TR): 3 200 ms, Czas echa: 46 ms, Liczba średnich: 10, Rozdzielczość w płaszczyźnie: 300 x 300 μm, Liczba krojów koronalnych: 14, Szczelina wewnątrzskrojowa: 0,3 - 0,7 mm, Tłumienie tłuszczu: włączone, Czynnik rzadki: 8, Pakiety przekrojowe: 2, Całkowity czas akwizycji obrazu: 14 min.
  2. Kliknij na środek (translacja) i krawędź (obrót) żółtych i zielonych pól na obrazku lokalizatora, aby dostosować pozycję pakietu splatów w razie potrzeby i zoptymalizować pokrycie regionu trzustki i innych narządów brzusznych dla górnej i dolnej grupy zwierząt.
  3. Przed przystąpieniem do skanowania upewnij się, że wszystkie cztery myszy są prawidłowo ustawione w łóżku dla wielu zwierząt.
  4. Monitoruj oddech podczas sekwencji obrazowania i w razie potrzeby dostosowuj poziom izofluranu.
  5. Po zakończeniu badania MRI sprawdź, czy jakość obrazu jest odpowiednia. Szukaj artefaktu ruchu, który objawia się rozmyciem, jeśli mysz poruszyła się podczas skanowania. Sprawdź pełne pokrycie brzucha. Jeśli trzeba, przestaw myszy i powtórz skan.

5. Odzyskiwanie myszy

  1. Po zakończeniu i weryfikacji badania należy usunąć łóżko z systemu MRI.
  2. Otwórz górę łóżka wielokomorowego. Usuń monitor oddechowy z lewego górnego górnego myszy i przenieś zwierzęta z góry i dołu wydrukowanych wkładek 3D do klatki regeneracyjnej.
  3. Umieść zwierzęta w klatce regeneracyjnej nad podkładką grzewczą o temperaturze 37 °C, aby postać rekonwalestezja była ponastawiona.
  4. Monitoruj częstość oddechu i ruchy, aby zapewnić pełną regenerację po znieczuleniu przed powrotem myszy do domowych klatek. Objawy powrotu do zdrowia to normalne oddychanie i ruch (chodzenie).

6. Przetwarzanie i analiza plików z zakresu obrazowania rezonansu magnetycznego

  1. Eksportuj obrazy DICOM z oprogramowania MRI do programu do analizy obrazów, aby przyciąć obrazy z jednego obrazu z czterema myszy do jednego obrazu dla każdej myszy.
  2. W oprogramowaniu otwórz obraz dla najwyższego zestawu zwierząt w module Widok. Automatyczne ustawienia okien/poziomu są wystarczające, ale można je dostosować w ogólnej zakładce sterowania obrazem , aby myszy były widoczne. W zakładce VOI ręcznie narysuj obszerne pole wokół prawego górnego rogu myszy, używając obiektu analitycznego sześcianu; następnie przycinaj obraz wokół tego pola z zakładki Masking and Contouring operations. Podczas zapisywania nowego pliku edytuj metadane DICOM i nazwę pliku na właściwy identyfikator myszy; Następnie powtórz dla myszy w lewym górnym górnym rogu, używając tego samego obrazu, otwórz obraz dla dolnego zestawu myszy i powtórz zwrot z inwestycji (ROI) – przycinanie i zapisywanie.
    UWAGA: VOI nie musi być precyzyjne.
  3. Użyj oprogramowania MRI do analizy obrazów przechowywanych w plikach DICOM.
  4. Przeanalizuj obrazowe przekroje obrazowe od grzbietowej do brzusznej lub brzusznej do grzbietowej. Zlokalizować śledzionę i żołądek, aby ustalić odpowiedni kontekst do identyfikacji guzów trzustki i/lub trzustki.
  5. Zdefiniuj "obszar zainteresowania" (ROI), rysując linię na granicy guza i wykonuj półautomatyczną segmentację, aby obliczyć objętość guza. Zwróć uwagę na cysty płynów i inne hiperchromatyczne znaleziska (Rysunek 3 i Rysunek 4).
    UWAGA: Do analizy plików DICOM należy używać przeglądnika MRI.

7. Leczenie gemcytabiną

  1. Wykonuj cotygodniowe badania MRI zwierząt KPC, aż do momentu zaczątku powstawania guza i wykrycia (objętość ≥20 mm3). Przed skanowaniem upewnij się, że myszy są w dobrym stanie zdrowia (brak nadmiernej utraty wagi, oznak niepokoju, trudności z oddychaniem i/lub dyszenia).
  2. Ustal schemat leczenia po spełnieniu kryteriów dotyczących guza.
    UWAGA: W grupie leczonej gemcytabina była podawana dootrzewnowkowo (i.p.) w dawce 100 mg/kg dwa razy w tygodniu.
    UWAGA: Gemcytabina jest cytotoksycznym środkiem chemioterapeutycznym. Obchod należy z odpowiednim środkiem ochrony osobistej (PPE), w tym rękawicami i fartuchem laboratoryjnym. Utylizacja skażonych strzykawek i materiałów zgodnie z instytucjonalnymi protokołami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.
  3. Wykonuj badania MRI (po sekcjach 1-6) raz w tygodniu, aby monitorować reakcję guza na gemcytabinę.
  4. Ofiarować zwierzęta, gdy guz spełnia kryteria eutanazji na podstawie pomiarów objętości z analizy MRI (Sekcja 6) i/lub innych objawów.
  5. Podczas badania MRI u myszy leczonych przez rezonans magnetyczny umieść barierę ochronną, aby zapobiec potencjalnemu przeniesieniu środka chemioterapeutycznego poprzez wydalanie. Podczas i po stosowaniu gemcytabiny należy przestrzegać dobrych praktyk higieny osobistej. Uwolnić się od pustych strzykawek do pojemnika na ostre środki chemioterapeutyczne.
  6. Po zakończeniu prac spryskuj cały sprzęt do znieczulenia, łóżka MRI oraz wszystkie powierzchnie robocze etanolem w 70%. Umieść chemicznie skażone bariery ochronne i rękawiczki używane podczas obrazowania w plastikowej torbie, zwiąż torbę i umieść w beczce z włókna do spalenia.
  7. Umów sesje obrazowe przed kolejną rundą leczenia, aby zminimalizować ekspozycję na środek chemioterapeutyczny.
    UWAGA: W zależności od tempa wzrostu guza i schematu leczenia można uwzględnić częstotliwość wykonywania rezonansu co dwa tygodnie. Reakcje na leczenie kinetyką nowotworową można ocenić za pomocą obrazowania podłużnego (Rysunek 5).

Wyniki

Zwierzęta KPC rozwijają guzy trzustki po 12 tygodniu życia9 lat. Za pomocą wielokomorowego łóżka MRI rozpoczęto przesiewowe nowotwory myszy KPC w wieku 10 tygodni życia. Umożliwiło to rekrutację zwierząt z guzami o wielkości około 200 mm3 do przedklinicznego badania z leczeniem gemcytabiną. Zaobserwowano różnice w kinetyce guzów oraz różnice w jego prezentacji. Większość guzów KPC wykazywała solidny wzór wzrostu z jednym lub dominującym celem (Rysunek 4A), co ułatwiało rekrutację zwierząt do leczenia i oceny objętości guza. Jednak zaobserwowano także zwierzęta z wieloma małymi guzami litymi rozproszonymi po całej trzustce (Rysunek 4A). Niektóre przypadki PDAC mogą również wykazywać wewnątrzguzowe zmiany torbielowate wypełnione płynem, towarzyszące zmianom torbielowatym nienowotworowym oraz zatrzymaniu płynu spowodowanym zablokowaniem kanałów pęcherzyka żółciowego i/lub trzustki. (Rysunek 4A).

Po rekrutacji zwierzęta zostały losowo przydzielone do dwóch grup eksperymentalnych: grupy kontrolnej, która nie otrzymała leczenia, oraz grupy leczonej, która otrzymała dootrzewnowe (i.p.) podawanie gemcytybiny w dawce 100 mg/kg dwa razy w tygodniu. Spośród 23 uprawnionych zwierząt, 4 samice i 7 samców zostały przydzielone do grupy kontrolnej, a 6 samic i 6 samców do grupy leczonej. Cotygodniowe badania MRI wykonywano przy użyciu systemu wielozwierzęcego łóżka (rysunek 5A), co pozwoliło nam nieustannie monitorować zmiany kinetyki wzrostu guzów zarówno w grupie kontrolnej, jak i leczonej (Rysunek 5B).

Przetworzone dane obrazowe pokazują, że guzy w modelu KPC leczonym gemcytabiną miały wolniejszy wzór wzrostu w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną (rysunek 5C), co wiązało się ze statystycznie istotnym (test log rank, p = 0,04) wzrostem całkowitego przeżycia leczonej kohorty (rysunek 5D). Mediana przeżycia dla nieleczonej KPC wynosiła 20 tygodni, podczas gdy grupa leczona wykazała przedłużenie mediany przeżycia o ponad 23 tygodnie (rysunek 5D).

Rysunek 1
Rysunek 1: Przepływ pracy w procesie wielozwierzęcego rezonansu magnetycznego, przetwarzaniu i analizie obrazów. Kluczowe etapy protokołu MRI dla wielu zwierząt są podkreślone: od przygotowania do preskanu po badania przedkliniczne pod kierunkiem obrazowym. Do 4 zwierząt jest znieczulonych w komorze indukcyjnej (przygotowanie preskany) i przygotowywanych do umieszczenia w łóżku wielozwierzęcym (wielozwierzęcy zestaw MRI). Obraz preskany zwierząt w konfiguracji 2 x 2 (2 w górnej komorze, 2 w dolnej komorze), po której następuje skan rezonansu magnetycznego (obrazowanie MR). Dane obrazowe każdego zwierzęcia są zapisywane jako osobne pliki i analizowane niezależnie (analiza obrazu). Do wyboru zwierząt do badań przedklinicznych oraz monitorowania odpowiedzi na leczenie (badania przedkliniczne) wykorzystuje się wyszukiwanie obrazów i rozmiar guza. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2
Rysunek 2: Kluczowe kroki dla rezonansu magnetycznego dla wielu zwierząt od ustawienia do skanowania. (A) Panel górny, montaż niestandardowego systemu łóżka MRI dla wielu zwierząt. Specjalnie zaprojektowane wkładki do stołu drukowanego w 3D z wbudowanymi portami znieczulającymi mieszczą się w standardowym uchwytie łóżka PET/MRI z pojedynczym ratem. Dolny panel, te wkłady drukowane w 3D dzielą stół na dwie komory, umożliwiając jednoczesne obrazowanie do czterech zwierząt: zwierząt 1 i 2 na górze wkładu oraz zwierząt 3 i 4 na dolnej wstawce. Pokazano wkładki poprzeczne i zmodyfikowane z drukarki 3D z przeglądarki STL. (B) Sekwencyjne umieszczanie myszy w wielokomorowym łóżku MRI (od góry do dołu). Górny obraz, dwa zwierzęta umieszczone w pozycji brzusznej na dolnej części (po lewej i prawej) wydrukowanej wkładki 3D, która znajduje się wewnątrz dostarczonego przez dostawcę stołu PET/MRI. Na środkowym obrazie, pozostałe dwie myszy umieszczone są w pozycji brzusznej na górnej części (lewej i prawej) wydrukowanej w 3D wstawce; Mysz umieszczona po lewej stronie górnej wkładki ma dołączony monitor oddechowy. Dolny obraz: ukończony zestaw czterech zwierząt z okładką na górze. Wszystkie zwierzęta mają głowy zabezpieczone w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie (1,5-2% izofluranu, 0,8-2 L/min tlenu). Ostateczne umiejscowienie wszystkich czterech zwierząt w łóżku MRI z podaniami znieczulenia, podgrzewaczem ciepłej wody oraz systemem monitorowania parametrów życiowych, umożliwiającym skanowanie MRI i pozyskiwanie danych wszystkich zwierząt podczas jednej sesji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3
Rysunek 3: Zbieranie i przetwarzanie danych z wielozwierzęcych badań MRI. (A) Reprezentatywny widok (płaszczyzna przyśrodkowa) początkowego badania MRI wszystkich czterech zwierząt. (B) Skanowanie MRI (płaszczyzna grzbietowa) wszystkich czterech myszy w wielokomorowym łóżku: dwóch myszy umieszczonych na dole (3, 4) oraz dwóch na górze (1, 2) wydrukowanych w 3D wstawkach. (C) Ostateczny plik MRI w wysokiej rozdzielczości każdego pojedynczego skanu myszy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4
Rysunek 4: Różnorodne prezentacje guzów PDAC: zintegrowane MRI i analiza histologiczna. (A) Reprezentatywne zdjęcie MRI (płaszczyzna grzbietowa) ilustrujące anatomiczną zmienność guzów PDAC (od lewej do prawej): prawidłowa trzustka, guzy wieloogniskowe z płynem wypełnionymi zmianami torbielowatymi oraz masa guza litego. Narządy anatomiczne są oznaczone kolorami w następujący sposób: żołądek (żółty), śledziona (zielony), guz (fioletowy), nagromadzenie płynu spowodowane zablokowaniem przewodów (niebieski). Biały pasek skali = 1 cm. (B) Histologiczne przekroje guzów barwionych H&E obok klas komórek opartych na komputerowo wytrenowanych nakładkach klasyfikatorów, podkreślających cechy histopatologiczne guzów zgodne z wynikami MRI. Obszar guza (T) jest zaznaczony na czarno dla wszystkich próbek, gdy guz jest obecny. Klasy komórek są pokazane kolorowo: prawidłowa tkanka trzustkowa (szara), guz (czerwony) oraz komórki odpornościowe (żółte). pasek skali = 0,5 cm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Rysunek 5
Rysunek 5: Zastosowanie rezonansu magnetycznego wielozwierzęcego do rekrutacji zwierząt i monitorowania wzrostu guzów podczas leczenia gemcytabiną. (A) Oś czasu projektu eksperymentalnego: Zwierzęta (14+ tygodni) zostały zrekrutowane po tym, jak badanie MRI wykazało guz ≥ 200 mm3. Myszy z grupy leczonej otrzymywały gemcytabinę (100 mg/kg, dożylnie, dołka) aż do osiągnięcia kryteriów eutanazji. W trakcie eksperymentu wykonywano badania MRI dla wszystkich zwierząt, aby monitorować kinetykę wzrostu guzów. (B) Reprezentatywne obrazy MRI (płaszczyzna grzbietowa) pokazujące postęp guza u jednego zwierzęcia z nieleczonej i jednego z grupy leczonej, od dnia 0 do ostatniego dnia eksperymentu (punkt końcowy przeżycia). Biały pasek skali = 1 cm (C,D) Wykresy ilustrujące kinetykę wzrostu guza (C, n = 4 [2 F, 2 M] vs. 4 [2 F, 2 M]) oraz ogólną przeżywalność (D, n = 11 [4 F, 7 M] vs. 12 [6 F, 6 M]) w grupie kontrolnej nieleczonej i leczonej. Istotność statystyczna dla krzywych przeżycia Kaplana-Meiera została określona testem Log-rank (Mantel-Cox) (* p < 0,05). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Plik uzupełniający 1: Plik STL do druku 3D dolnej wkładki z wbudowanymi portami znieczulającymi, która mieści się w standardowym uchwycie łóżka PET/MRI z pojedynczym szczurem. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik STL do druku 3D górnej wkładki z wbudowanymi portami znieczulającymi, która mieści się w standardowym uchwycie łóżka PET/MRI z pojedynczym szczurem. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten wykorzystuje standardowe łóżko PET/MRI z pojedynczym szczurem dostarczone przez producenta, zmodyfikowane o specjalnie wykonane wkładki drukowane w 3D, które umożliwiają jednoczesne skanowanie do czterech myszy (Rysunek 1). Ta konfiguracja wielozwierzęca znacznie skraca nie tylko kosztowny czas badania MRI, ale także cały czas trwania zabiegu. Umożliwia to równoległe przygotowanie (znieczulenie, ustawianie w łóżku i ładowanie łóżka), skanowanie i odzyskiwanie czterech zwierząt podczas jednej sesji, w porównaniu do dodatkowego czasu potrzebnego na przygotowanie, skanowanie i powrót do zdrowia każdego zwierzęcia indywidualnie w czterech oddzielnych sesjach. Zestaw obejmuje także indywidualne stożki nosowe do kontrolowanego podawania znieczulenia każdemu zwierzęciu, dedykowany monitoring kluczowy dla jednego zwierzęcia oraz zintegrowane możliwości ogrzewania utrzymujące temperaturę ciała wszystkich skanowanych myszy (Rysunek 2). Wkładki drukowane w 3D zapewniają spójne ustawienie zwierząt i poprawiają spójność segmentacji. Monitorowanie oddechu w czasie rzeczywistym umożliwia ciągłą ocenę i dostosowanie znieczulenia podczas skanowania, minimalizując tym samym artefakty ruchu.

Protokół ten został użyty do wykrywania i podłużnego monitorowania postępu guza trzustki w modelu KPC (Rysunek 5A-C) leczonym środkiem chemioterapeutycznym gemcytabiną, pełniąc rolę badania przedklinicznego potwierdzającego koncepcję. Gemcytabina, samodzielnie lub w połączeniu, jest leczeniem pierwszego lub drugiego wyboru dla pacjentów z miejscowym lub przerzutowym rakiem trzustki 28,29,30. Wyniki te dotyczące zwierząt leczonych gemcytabiną są zgodne z wcześniejszymi raportami, które również wykazały korzyść w przeżyciu31. Co ważniejsze, protokół ten zapewnia odpowiednią i solidną platformę do badania terapii kombinowanych nowymi lekami terapeutycznymi i chemioterapią SOC w modelu KPC lub podobnych modelach PDAC. Terapie te mogą obejmować inhibitory małych cząsteczek, immunoterapię, siRNA, modulatory aktywności mikroRNA oraz inne terapeutyczne oligonukleotydy przeciwko kluczowym celom molekularnym 20,21,22,23,24,25,26,27. Terapie te mogą również obejmować genetycznie modyfikowane cele, aby zrozumieć ich interakcję z chemioterapią SOC lub innymi terapiami na wczesnym etapie rozwoju 9,20,32.

Chociaż głównym celem tego protokołu jest obrazowanie trzustki i innych narządów jamy brzusznej, protokół wielozwierzęcy oraz opisane sekwencje MRI mogą być stosowane do anatomicznej charakterystyki innych myszy modeli nowotworów, takich jak rak piersi i glejak, lub innych chorób nerek i/lub wątroby33. Znamy inne protokoły opisujące wielozwierzęce badanie MRI18,34. Na przykład Dazai i in. opisali neuroanatomiczne badanie MRI do siedmiu myszy18. Chociaż takie rozwiązanie umożliwia obrazowanie mózgu siedmiu zwierząt, nie pozwala na indywidualną kontrolę znieczulenia i temperatury dla każdej myszy. Ich komora chowalna jest przeznaczona dla myszy ważących mniej niż około 32 g; Dla kontrastu, nasze wielokomorowe łóżko obsługuje szerszy zakres rozmiarów ciała myszy. W zależności od zamierzonego organu, czasu skanowania i rozdzielczości, protokół Dazaia i in. może zapewniać pewne zalety w porównaniu z opisanym tutaj.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te były częściowo wspierane przez grant CA258314 National Cancer Institute R01 oraz grant MSU Tetrad Initiative for Interdisciplinary Research z 2024 roku dla LFS. Jesteśmy wdzięczni Programu Precyzyjnego Zdrowia MSU Tissue Analysis Core, Instytutowi Ilościowych Nauk i Inżynierii Zdrowia MSU/Zaawansowanemu Ośrodku Obrazowania Molekularnego, Zasobów Zwierzęcych kampusu MSU, Laboratorium Diagnostycznego Weterynaryjnego MSU oraz Centrum Analizy i Mapowania Elementów Ilościowych MSU (QBEAM) za ich wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
drukarka 3D  StratasysJ750 Dla wkładów do łóżka MRI z wieloma zwierzętami
Gemcitabine HClApexBioA1402-500Do zastrzyków z ip 
HOROSHOROShttps://horosproject.org/Do analizy MRI
IzofluranCovetrus11695067772Do znieczulenia myszy
Vaporizer izofluranowySOMNI ScientificVS6002Do znieczulenia myszy
Strzykawki insulinowe U-100 w dużej dawceBD14-826-79Do zastrzyków z ip 
Złącza rurowe luer lock, nylonowe proste korki, z kolcem na rurę o średnicy 1/16" x 7McMaster51525K521Do montażu stołu MRI z udziałem wielu zwierząt
Złącza rur luer lock, wtyczka, dla rury o profilu 1/16" z pręgowym ID2McMaster7466N11Do montażu stołu MRI z udziałem wielu zwierząt
Złącze luer męskie na męskie x2SAIMMLDo montażu stołu MRI z udziałem wielu zwierząt
System monitorowania i osłon dla małych zwierząt zgodnych z MRSAIIModel 1030monitoruj zwierzęta podczas rezonansu magnetycznego
Adapter stołu MRIBrukerT150743Komponent stołu MRI dostarczony przez dostawców
Cewka MRI, średnica 72 mmBrukerT20209V3cewka MRI dostarczona przez dostawców
Szczur średni w kołysce wielomodalnejBrukerT151629Platforma MRI dostarczona przez dostawców
smar okulistyczny & nbsp;Covetrus75848Do stosowania podczas znieczulenia
Oprogramowanie ParaVision 360Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/paravision-360.htmlDo analizy MRI
PMOD 4.2Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/pmod.htmlDo analizy MRI
przedkliniczny system MRI  BrukerBioSpec 70/30Do rezonansu magnetycznego
Stratasys Vero Przezroczysta żywicaStratasysRGD810Do produkcji łóżek MRI z udziałem wielu zwierząt
Złącza T-to-Socket-to-Socket, rurka Luer Lock x2McMaster51525K443Do łóżka MRI z wieloma zwierzętami 
rurka (średnica wewnętrzna 1/16", średnica zewnętrzna 1/8")BrukerT12330Do montażu stołu MRI z udziałem wielu zwierząt

Bibliografia

  1. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  2. Lafaro, K. J., Melstrom, L. G. The paradoxical web of pancreatic cancer tumor microenvironment. Am J Pathol. 189 (1), 44-57 (2019).
  3. Kleeff, J., et al. Pancreatic cancer. Nat Rev Dis Primers. 2, 16022(2016).
  4. Collisson, E. A., Bailey, P., Chang, D. K., Biankin, A. V. Molecular subtypes of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (4), 207-220 (2019).
  5. Grimm, J., Potthast, A., Wunder, A., Moore, A. Magnetic resonance imaging of the pancreas and pancreatic tumors in a mouse orthotopic model of human cancer. Int J Cancer. 106 (5), 806-811 (2003).
  6. Ireson, C. R., Alavijeh, M. S., Palmer, A. M., Fowler, E. R., Jones, H. J. The role of mouse tumour models in the discovery and development of anticancer drugs. Br J Cancer. 121 (2), 101-108 (2019).
  7. Westphalen, C. B., Olive, K. P. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer. Cancer J. 18 (6), 502-510 (2012).
  8. Cook, N., Olive, K. P., Frese, K., Tuveson, D. A. K-ras-driven pancreatic cancer mouse model for anticancer inhibitor analyses. Methods Enzymol. 439, 73-85 (2008).
  9. Schipper, J., et al. Loss of microRNA-21 leads to profound stromal remodeling and short survival in K-ras-driven mouse models of pancreatic cancer. Int J Cancer. 147 (8), 2265-2278 (2020).
  10. Uprety, D., Adjei, A. A. KRAS: from undruggable to a druggable cancer target. Cancer Treat Rev. 89, 102070(2020).
  11. Buscail, L., Bournet, B., Cordelier, P. Role of oncogenic KRAS in the diagnosis, prognosis and treatment of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (3), 153-168 (2020).
  12. Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106(2009).
  13. Farr, N., et al. Noninvasive characterization of pancreatic tumor mouse models using magnetic resonance imaging. Cancer Med. 6 (5), 1082-1090 (2017).
  14. Yin, T., Liu, Y., Peeters, R., Feng, Y., Ni, Y. Pancreatic imaging: current status of clinical practices and small animal studies. World J Methodol. 7 (3), 101-107 (2017).
  15. Rojas, J. D., et al. Validation of a combined ultrasound and bioluminescence imaging system with magnetic resonance imaging in orthotopic pancreatic murine tumors. Sci Rep. 12 (1), 102(2022).
  16. Vohra, R., et al. Evaluation of pancreatic tumor development in KPC mice using multiparametric MRI. Cancer Imaging. 18 (1), 41(2018).
  17. Serkova, N. J., et al. Preclinical applications of multi-platform imaging in animal models of cancer. Cancer Res. 81 (5), 1189-1200 (2021).
  18. Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse neuroanatomical magnetic resonance imaging. J Vis Exp. (48), e2497(2011).
  19. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  20. Sempere, L. F., Powell, K., Rana, J., Brock, A. A., Schmittgen, T. D. Role of non-coding RNAs in tumor progression and metastasis in pancreatic cancer. Cancer Metastasis Rev. 40 (1), 1-20 (2021).
  21. Smith, E. S., et al. Clinical applications of short non-coding RNA-based therapies in the era of precision medicine. Cancers (Basel). 14 (6), 1588(2022).
  22. Sempere, L. F., Keto, J., Fabbri, M. Exosomal microRNAs in breast cancer towards diagnostic and therapeutic applications. Cancers (Basel). 9 (7), 71(2017).
  23. Sempere, L. F., Azmi, A. S., Moore, A. MicroRNA-based diagnostic and therapeutic applications in cancer medicine. Wiley Interdiscip Rev RNA. 12, e1662(2021).
  24. Nakisa, A., et al. Tumor-associated carbohydrate antigen 19-9 (CA 19-9), a promising target for antibody-based detection, diagnosis, and immunotherapy of cancer. ChemMedChem. 19 (24), e202400491(2024).
  25. Miller, A. L., Garcia, P. L., Yoon, K. J. Developing effective combination therapy for pancreatic cancer: an overview. Pharmacol Res. 155, 104740(2020).
  26. Dreyer, S. B., Beer, P., Hingorani, S. R., Biankin, A. V. Improving outcomes of patients with pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 22 (6), 439-456 (2025).
  27. Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 17 (2), 108-123 (2020).
  28. Koltai, T., et al. Resistance to gemcitabine in pancreatic ductal adenocarcinoma: a physiopathologic and pharmacologic review. Cancers (Basel). 14 (10), 2486(2022).
  29. Casper, E. S., et al. Phase II trial of gemcitabine (2,2′-difluorodeoxycytidine) in patients with adenocarcinoma of the pancreas. Invest New Drugs. 12 (1), 29-34 (1994).
  30. Moore, M. Activity of gemcitabine in patients with advanced pancreatic carcinoma: a review. Cancer. 78 (3 Suppl), 633-638 (1996).
  31. Ho, T. T. B., et al. Combination of gemcitabine and anti-PD-1 antibody enhances the anticancer effect of M1 macrophages and the Th1 response in a murine model of pancreatic cancer liver metastasis. J Immunother Cancer. 8 (2), e001367(2020).
  32. Kempinska, K., et al. Genetic ablation of microRNA-10b improves treatment outcomes in mouse models of pancreatic cancer. Cancer Res. 84 (6 Suppl), Abstract 467 (2024).
  33. Fan, J., et al. Species-specific hepatic uptake of [64Cu]Cu-EOB-NOTA, a newly designed hepatospecific PET agent. Mol Imaging Biol. 27 (3), 305-312 (2025).
  34. Ramirez, M. S., Esparza-Coss, E., Bankson, J. A. Multiple-mouse MRI with multiple arrays of receive coils. Magn Reson Med. 63 (3), 803-810 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

MRI wieloosobniczemodele raka trzustkipomiar guzamodel mysi KPCobrazowanie przedklinicznemonitorowanie guzaleczenie gemcytabinąobrazowanie anatomiczneocena objętości guza
Wielozwierzęce obrazowanie rezonansu magnetycznego do pomiarów guza w myszych modelach raka trzustki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.