Zautomatyzowane ultrarozcieńczone pomiary samoskorupy dla identyfikacji przeciwciał o korzystnych właściwościach roztworów o wysokich stężeniach

Podsumowanie

Tu opisujemy wysokowydajną adaptację testu stabilności koloidalnej przeciwciał w skali laboratoryjnej, aby generować duże zbiory danych i wspierać prognozy nadające się do AI/ML w zakresie rozwijalności.

Streszczenie

Jednym z kluczowych wyzwań w inżynierii przeciwciał jest opracowanie analitycznych metod przesiewowych do oceny stabilności koloidalnej, zapewniających, że produkty biologiczne są odpowiednie do formułowania i podawania w wysokich stężeniach. Charge-stabilized self-interaction nanoparticle spectroscopy (CS-SINS), zmodyfikowana wersja konwencjonalnej affinity-capture self-interaction nanoparticle spectroscopy (AC-SINS), została dostosowana jako solidna ocena stabilności koloidalnej do przewidywania zachowania roztworów o wysokich stężeniach. Metoda ta umożliwia kluczowe decyzje dotyczące rozwijalności we wczesnym stadium poprzez identyfikację problemów ze stabilnością koloidalną przed zainwestowaniem znacznych zasobów, znacznie zmniejszając tempo wykluczenia w dalszej części procesu i przyspieszając terminy selekcji kandydatów. Badanie to pokazuje, że test integruje się bezproblemowo z istniejącymi procesami odkrywania i może być przeprowadzany równolegle z typowymi testami na wczesnym etapie ze względu na minimalne wymagania dotyczące próbek, dostarczając cenny dane do przewidywania zachowania w wysokich stężeniach bez kompromisu dla innych wysiłków charakteryzacyjnych. Wykazano, że rutynowe pomiary dynamicznego rozpraszania światła (DLS), oprócz zmiany długości fali rezonansu plasmonowego, mogą poprawić niezawodność opisanej tutaj metody HTP. Razem antycypowano, że walidacja krzyżowa za pomocą pomiarów DLS i zautomatyzowanych programów analitycznych ułatwi niezawodną selekcję kandydatów do terapii przeciwciała o różnych modalnościach.

Wprowadzenie

W rozwoju i formule terapijnych przeciwciał opalescencja i lepkość są kluczowymi kwestiami przy tworzeniu produktu komercyjnego zorientowanego na pacjenta^{1,2,3,4,5,6,7,8}. Klasycznie, duże ilości białka są potrzebne do bezpośredniego obserwowania tych właściwości w wysokich stężeniach, co skutecznie uniemożliwia optymalne zidentyfikowanie liderów w wczesnych etapach odkrycia przeciwciał, gdzie dostępność białka jest ograniczona. Wiarygodne zidentyfikowanie tych zjawisk jest kluczowe dla ocen rozwijalności, aby zmniejszyć ryzyko niekorzystnego zachowania w roztworach o wysokich stężeniach^{1,2,3,4,5,6,7,8}. Z tego powodu istnieje znaczne zainteresowanie wysokowydajnymi metodami o niskiej koncentracji, które przewidują niekorzystne zachowanie roztworów w wysokich stężeniach^{9,10,11,12,13,14,15,16}. Jedna z takich metod, kD-DLS, okazała się wiarygodna w przewidywaniu właściwości wysokich stężeń, ale nie spełnia wymogów niskiego zużycia białka i wysokiej wydajności wczesnych etapów przepływu pracy^12,13.

Ostatnio, ultraniskie zużycie oparte na złotym nanocząsteczkach badanie znane jako CS-SINS wykazało silną korelację z wynikami eksperymentów kD-DLS i jest stosunkowo skuteczne w przewidywaniu niekorzystnych właściwości roztworów w wysokich stężeniach¹⁶. Te cechy sprawiają, że CS-SINS jest idealnym kandydatem do rozwoju jako narzędzie do wysokowydajnego przesiewania. Badanie CS-SINS wykorzystuje przeciwciało uchwytujące zimowane na powierzchniach nanocząstek złota, aby zakotwiczać kandydatów przeciwciał via ich regiony Fc, pozostawiając ramiona Fab dostępne do interakcji w roztworze. Ta konfiguracja oznacza, że interakcje Fab-Fab dominują w mierzonym sygnale samoagregacji, co jest korzystne, ponieważ badania wskazują, że domeny Fab w znacznym stopniu przyczyniają się do cech samoagregacji mAb, prawdopodobnie z powodu właściwości powierzchni regionu determinanty dopełniacza (CDR)^{17,18,19,20,21,22,23}. Ta mechaniczna podstawa sprawia, że CS-SINS jest dobrze przystosowany do przewidywania ryzyka stabilności koloidalnej istotnego dla formuł o wysokich stężeniach. Alternatywne metody HTP, w tym standup monolayer adsorption chromatography (SMAC), podejście oparte na kolumnie chromatografii wykluczającej wielkość (SEC), które naśladuje samoagregację z generyczną fazą stacjonarną oraz chromatografia krzyżowa (CIC), wymagają przygotowania kolumny i dużych próbek^{17,24,25,26,27}.

Opisany tutaj metodę szczegółowo opisuje zweryfikowaną płytkowo konfigurację badania CS-SINS i umożliwia przesiewanie HTP poprzez automatyzację laboratorium i analizę, łącząc zalety istniejących metod i poprawiając wiarygodność wyników. To badanie pokazuje również, jak różne typy próbek dają wysokiej jakości wyniki z powodu natury wzbogacania samointerakcji w badaniu, ustanawiając, że metoda jest niezależna od źródeł białka. Ponadto rozważamy, jak wcześniejsze komunikacja właściwości koloidalnych do zespołów projektowych może dodatkowo wspierać strategiczną wieloskładnikową projektowanie leków przeciwciałowych^{28,29,30,31,32,33,34}.

Badanie właściwości roztworów o wysokich stężeniach jest zwykle wykonywane w dół strumienia w kampaniach wyboru wieloskładnikowych kandydatów, po wyborze lidera i zakończeniu inżynierii (Rysunek 1A). Wczesne przewidywanie tych właściwości stało się możliwe dzięki takim metodom jak CS-SINS, które wymagają kilku mikrogramów próbki, przewidując zatem ryzyko stabilności koloidalnej z ultracieńkimi pomiarami¹⁶. Wprowadzenie wczesnego przesiewania rozwijalności (Rysunek 1A), gdy zbiornik kandydatów jest duży, i równoległych kampanii generowania

Protokół

Rysunek 2 przedstawia przygotowanie koniugacji nanocząstek, Rysunek 3 przedstawia przepływ pracy w całości, Rysunek 4 przedstawia proces automatyzacji laboratoryjnej, a Rysunek 5 zawiera diagram potoku analizy danych. Reagenty i użyte sprzęty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie buforów

UWAGA: Tydzień 1 (przygotowanie próbek)

1. Przygotuj histydynę (10 mM), pH 6,0 (bufor próbki i assay).
   UWAGA: Te kroki są wykonywane w 1. dniu.
   1. Rozpuść 5 mM L-histydyny monohydrochlorku monohydratu i 5 mM L-histydyny w ultraczystej wodzie. Dodając kwas solny kroplowo podczas mieszania, osiągnij pH 6,0 zgodnie z kalibrowanym miernikiem pH.
   2. Przefiltruj roztwór przez filtr o wielkości porów 0,22 μm w próżni i odbieraj filtratem do sterylnego pojemnika.
   3. Zmierzyć przewodność do celów kontroli jakości i upewnić się, że odczyt wynosi około 500 μS/cm.
2. Przygotuj octan potasu (20 mM), pH 4,3 (bufor koniugacji mAb capture).
   1. Rozpuść octan potasu w ultraczystej wodzie i ustaw pH na 4,3 z kwasem octowym czystym.
   2. Wysterylizuj roztwór przez filtrację próżniową przez filtr o wielkości porów 0,22 μm zgodnie z opisem w kroku 1.1.2.
3. Przygotuj poli-L-lizynę.
   1. Przygotuj 5 mg/mL roztwór stężony w ultraczystej wodzie i przechowuj w -20°C aż do użycia.

2. Dializa wszystkich próbek (kandydatów mAb)

UWAGA: Wykonaj te kroki w dniach 2-5.

1. Wstępnie namacz 100 μL lub 300 μL dializatory w 10 mM histydyny, pH 6,0, przez 5 min.
2. Przenies wszelkie próbki (50-100 μL) do kaset dializowych. Zanurz kasetki w buforze 10 mM histydyny, pH 6,0 (700 mL na pudełko), dodaj szelki do zbiorników, umieść zbiorniki na magnestycznych płytach mieszających i inkubuj w 4°C przez 2 h 15 min.
3. Przeprowadź siedem wymian buforów z 10 mM histydyny, pH 6,0, co 2 h 15 min, lub wykonaj cztery nocne wymiany buforów, aby zapewnić dokładne usunięcie soli z próbek.
4. Pobierz próbki, przenieś je do czystych pojemników matrycowych i przechowuj w 4°C aż do wykonania assayu CS-SINS.
5. Zmierzyć stężenia próbek i odnotować informacje o polidyspersji po dializie. Oblicz poprawione stężenia przez podzielenie wartości surowej absorbancji przy 280 nm przez absorbancję przy 280 nm dla roztworu 1 mg/mL.
6. Przygotuj plik wejściowy handlera płynów z adresami dołeczków i stężeniami (μg/mL), włączając kontrole.

3. Wymiana buforu mAb capture (Rysunek 2, krok 1)

UWAGA: Wykonaj te kroki w 1. dniu tygodnia 2 (assay).

1. Usuń bufor przechowywania z kolumn odsolających 2 mL przez wyśrodkowanie przez 2 min przy 1000 x g w temperaturze pokojowej. Przygotuj dwie kolumny odsolające na każde 700 μL mAb capture wymaganego. Po każdym kroku wyśrodkowania zarzuć przepływ.
2. Wypłucz kolumny trzy razy z 1 mL buforu octanu potasu 20 mM, pH 4,3. Wyśrodkuj kolumny przez 2 min przy 1000 x g podczas każdego mycia.
3. Dodaj 700 μL mAb capture (kozi przeciw ludzkiemu Fcγ-specyficzne przeciwciało) do każdej kolumny i eluj do świeżego 15 mL probówki przez wyśrodkowanie przez 2 min przy 1000 x g .
4. Zbierz odsolony eluat, zastosuj go do drugiej zrównoważonej kolumny odsolającej i wyśrodkuj przez dodatkowe 2 min przy 1000 x g .
5. Połącz wszystkie eluowane próbki.
6. Zmierzyć stężenie roztworu mAb capture po odsolnieniu, jak opisano w dniach 2-5, krok 2.5.
7. Rozcieńczyć stężony roztwór mAb capture do 0,8 mg/mL buforem octanu potasu 20 mM, pH 4,3 i odłożyć do użycia.

4. Przygotowanie stężonego roztworu poli-L-lizyny

1. Rozcieńczyć małą alikwotę stężonego roztworu poli-L-lizyny do 2,66 mg/mL ultraczystą wodą.

5. Stężenie nanocząstek złota (Rysunek 2, krok 2)

1. Przygotuj 1,2 mL alikwoty zawiesiny stężonej w 1 mL probówkach lub 4,8 mL alikwoty w 5 mL probówkach, używając mikroprobówek z polipropylenu zawierających 20 nm nanocząstki złota. Wyśrodkuj przy 21130 x g przez 6 min.

Wyniki

Rysunek 6 przedstawia wyniki, Rysunek uzupełniający 3A pokazuje przykładowy wynik CS-SINS z surowego i oczyszczonego próbki, Rysunek uzupełniający 3B przedstawia zmienność sygnału między dołkami w różnych dniach, Rysunek uzupełniający 4 zawiera wyniki z procesu walidacji płytki, a Rysunek uzupełniający 5 opisuje obliczenie normalizacji dla obu odczytów CS-SINS.

Co ważne, próbki były pobierane ze zgłoszonymi stężeniami co najmniej 55 µg/mL po dializie do 10 mM histydyny o pH 6,0, dla wykonalności testu, ponieważ jest to minimalne stężenie zapasowe (minimum 6 µg na próbkę) i stworzono nowe identyfikatory dziecięce. Łącznie było 70 oczyszczonych próbek i 20 surowych próbek ekspresji, każda reprezentująca typy próbek na różnych punktach wykonalności (oczyszczone na etapie optymalizacji prowadzenia i 1- lub 2-stopniowe oczyszczenie surowego materiału z etapu identyfikacji prowadzenia, podkreślone na Rysunku 1A). Surowy materiał był generowany z w pełni zautomatyzowanego systemu ekspresji ssaków, Platforma Ekspresji i Oczyszczania Białek (PEPP; GNF, San Diego, CA, USA). Kontrole pochodzą z materiału komercyjnego i zostały wcześniej zweryfikowane jako posiadające maksymalne lub minimalne wartości lepkości, kD-DLS i CS-SINS. Świeże alikwoty są przechowywane w temperaturze -80°C, a nowa alikwota jest używana do każdego testu.

Rysunek 6A,B przedstawia średnie spektralne i DLS wskaźniki przedstawione według typu próbki, a wykresy słupkowe wyświetlają paski błędów (odchylenie standardowe) z pasującymi kodem kolorów. Normalizacja jest obliczana przez skrypt poprzez podzielenie różnicy między próbkami a wartościami kontroli ujemnej (obliczona wartość lambda max przez przesunięcie spektralne lub średnią arytmetyczną Z, średnica hydrodynamiczna w nm) przez różnicę między kontrolami (Rysunek uzupełniający 5). Rysunek 6C przedstawia spektralne wskaźniki w porównaniu z wskaźnikami DLS, co przedstawia wyraźną korelację między podejściami analitycznymi. Tabela 1 zawiera identyfikatory, adresy dołków, typ próbki, spektralne wskaźniki i wskaźniki DLS wraz z ich odchyleniami standardowymi do odniesienia. Granica dla ryzyka stabilności koloidalnej (niezależnie od odczytu spektralnego lub DLS) dla monospecyficznego IgG to wartość wyższa niż 0,35 (wskazana przez zieloną kropkowaną linię na Rysunku 6A,B, 6/70 (z wyłączeniem kontroli powtórzeń) oczyszczonych próbek oceniono jako wysokiego ryzyka, podczas gdy 64/70 oceniono jako niskie dla oczyszczonego materiału. Co ważne, oczekujemy, że granica będzie wyższa dla formatów multispecyficznych. Dla surowych próbek ekspresji, 2/20 próbek oceniono jako wysokie, podczas gdy 18/20 oceniono jako niskie. Dla przetestowanych tutaj oczyszczonych materiałów, surowa ekspresja rodziców partii podzbioru została również przesiewiona i przyniosła podobne wyniki (przedstawione na Rysunku uzupełniającym 3A), co wskazuje na reprezentatywną naturę testu przy skalowaniu (oczyszczaniu) kandydatów białek z niezależnych partii. Mimo ograniczonej liczby próbek, należy zauważyć, że błąd standardowy może być wyższy dla surowych próbek PEPP niż dla oczyszczonych próbek. Korzyść z przeprowadzania CS-SINS na późniejszych etapach zapewnia, że ortogonalne oceny mogą być przeprowadzane z testami wymagającymi więcej białka do analizy, takimi jak pomiary lepkości i kD-DLS, podczas gdy korzyść z przeprowadzania CS-SINS we wczesnych ekranach wykonalności prewencyjnie zwraca uwagę na ryzyko stabilności koloidalnej, co potencjalnie może wpłynąć na ostateczny zbiór kandydatów do prowadzenia (Rysunek 1B). Graniczne kandydaci z wysokimi błędami mogą zostać potwierdzeni jako wysokiego lub niskiego ryzyka za pomocą testów znajdujących się dalej w łańcuchu.

Ze względu na małą naturę wykrywanych przesunięć plazmonowych, opisano alternatywny odczyt, aby wzmocnić pewność w teście, co rozszerza zakres dynamiczny, co może okazać się szczególnie przydatne w przypadku braku wysokiej jakości czytnika płytek do wykrycia drobnych zmian. Odczyt DLS odróżnia skupianie się na nanocząstkach od zależności od właściwości spektralnych nanocząstek; jednak oba opisy mają podobne zakresy błędów standardowych i są niewielkie w stosunku do ich pomiarów. Wydaje się, że próbki bardziej podatne na odczyty błędów będą miały wyższy błąd (lub będą "modalne" i nie będą raportować wyniku przez DLS), ale wartości CS-SINS w zakresie roboczym testu mają rozkłady z niskim błędem. Porównując wartości DLS do wartości wskaźników spektralnych, rozkład błędów jest ciaśniejszy dla wyników DLS pobrane z próbek surowych niż dla wskaźników spektralnych; jednak to miało znaczenie tylko dla jednego kandydata, który spadł poniżej granicy jako wynik DLS, ale nie jako wynik spektralny. Może to okazać się

Dyskusja

Ten protokół reprezentuje kilka kluczowych modyfikacji oryginalnej metody CS-SINS¹⁶. Co ważne, zoptymalizowana proporcja PLL:IgG i bufor histydynowy zostały zachowane z oryginalnego badania¹⁶. Co najważniejsze, test został przystosowany do platformy robotycznego obsługi płynów, aby umożliwić przetwarzanie HTP (do 352 próbek w 1 dniu zamiast ~20), co zmniejsza czas obsługi i poprawia reproduktywalność poprzez zautomatyzowane przetwarzanie płynów. System robotyczny jest kompatybilny z formatami płyt, w tym z odbiciem na nowe formaty, takie jak płyta 384-dołkowa, oraz różnymi rodzajami sprzętu laboratoryjnego. Programy mogą działać niezależnie, a przepływ od początku do końca zapewnia czytelne wyniki z dużym objętością próbki z ulepszoną reproduktywalnością w warunkach ograniczających próbki. Pomiary DLS zostały również włączone jako ortogonalne odczyty przesunięcia spektralnego z bardziej optymalnym współczynnikiem Z niż interpretacje przesunięcia spektralnego (0,998 wobec 0,648), co jest szczególnie przydatne dla próbek o granicznych wynikach spektralnych lub dużych odchyleniach standardowych oraz opisuje interpretację przesunięcia plasmonu w celu zwiększenia zakresu dynamicznego widocznego z wyjścia czytnika płyt. Sugeruje się, że laboratoria bez dostępu do wysokiej klasy czytników płyt wielofunkcyjnych mogą używać DLS do niezawodnego wykonywania CS-SINS. Aby zapobiec potencjalnej zmienności z czasem na płycie 384-dołkowej, przeprowadzono rozległą weryfikację płyt (Rysunek uzupełniający 4) poprzez umieszczenie kontroli zarówno na początku, jak i na końcu płyty, co potwierdza minimalne efekty czasu skanowania. Ponadto wykazano, że surowe próbki PEPP dają wyniki porównywalne z czystym materiałem (Rysunek 6, uzupełniający Rysunek 3A), rozszerzając zastosowanie metody na wcześniejsze etapy odkrywania, gdzie czysty białko nie jest dostępne, co nie było wcześniej zgłaszane. Dane w uzupełniającym Rysunku 3 wskazują na niezawodność próbek między źródłami, ale także wskazują na minimalną zmienność testu z dnia na dzień, ponieważ dane zostały zebrane i znormalizowane z różnych zestawów danych. Bardziej szczegółowo, uzupełniający Rysunek 3B przedstawia całkowitą powierzchnię pod krzywą dla wszystkich dołków z odpowiednich płyt eksperymentalnych (kolorowo szkodowane, aby pasować do płyty z tego samego eksperymentu na uzupełniającym Rysunku 3A), aby pokazać oczekiwaną, ale minimalną zmienność w obrębie tego samego eksperymentu i w różnych dniach z różnymi preparatami kul. Na wczesnym etapie odkrywania metody takie jak kD-DLS i podejścia oparte na kolumnach (SMAC, CIC) nie są możliwe z powodu wyższych wymagań dotyczących zużycia próbek i niezdolności do przetwarzania surowego materiału^{12,13,24,25,26,27}; CS-SINS wyjątkowo umożliwia przesiewowe badanie stabilności koloidalnej na tym etapie z jedynie 6 µg na próbkę, która może być jednostopniowo oczyszczana. Wreszcie, skrypt do dostosowywania krzywych został zaktualizowany, aby pomieścić dostrajanie niewielkich przesunięć lambda max i umożliwić lepsze zarządzanie plikami oraz automatyczne raportowanie danych do wewnętrznych baz danych.

Typowe scenariusze rozwiązywania problemów obejmują: (1) wysokie odchylenia standardowe w wynikach spektralnych lub DLS, często wskazujące na niekompletne mieszanie nanocząstek (krok 7.6) lub agregację próbki - w takich przypadkach zaleca się wykonanie sprawdzenia jakości na próbkach dializowanych za pomocą DLS, aby upewnić się o integralności po dializie i domyślne stosowanie wyników spektralnych jako standardowego odczytu; (2) wielomodalne dystrybucje DLS lub nieudane odczyty DLS, zwykle spowodowane istniejącą przedtem agregacją próbki lub zanieczyszczeniem kurzem - filtrowanie przez filtry 0,22 µm przed dializą może to złagodzić; (3) różnice między wynikami spektralnymi a DLS, co jest zazwyczaj przypisywane zakrzywionym pomiarom DLS (prawdopodobnie z powodu wysokiej polidyspersji, która pojawiłaby się w zakresie normalnym-wysokim według wyników spektralnych); (4) niekonsekwentne wartości dodatniego kontrola, zwykle wynikające z niewłaściwego przechowywania nanocząstek lub zdegradowanego mAb uchwytu; świeże alikwoty przechowywane w -80 °C powinny być używane dla każdego testu (nie przechowywane w 4 °C przez więcej niż kilka dni).

Niektore ograniczenia testu obejmują potrzebę czasu na dokładne dializowanie próbek i przygotowywanie nanocząstek sprzężonych pół-manualnie dzień przed testem; jednak, czas dializy jest równy niezależnie od wielkości zestawu próbek. W odniesieniu do ryzyka zatykania końcówek, końcówki do obsługi płynów monitorują zmiany ciśnienia podczas aspiracji, a odpowiednie błędy pojawiają się podczas działania. Podczas fazy rozwoju metody sprawdzamy pliki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5.0 mL, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Goat antihuman Fcγ-specific antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Gold nanoparticles (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 mL Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidine hydrochloride buffer sample (10 mM, pH = 6.0, sample and assay buffer)	Sigma	H8125; H6034	Prepare final concentration of 5 mM per reagent in ultra-pure water, adjust pH to 6.0, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Matrix ScrewTop Tubes sample (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 or MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 kDa, 96 pcs. in deep well plate (12 cartridges), sealing sheet) and dialysis reservoir/box (low volume dialysis cassettes)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Microcentrifuge tubes pure polypropylene (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	Prepare a 5 mg/mL stock solution in ultra-pure water
Positive and negative Controls (1 mg/mL dialyzed into 10 mM Histidine, pH 6)	Internally-produced commercial antibodies	N/A	~2 nm spectral shift and DLS size of 250-300 nm for positive control; negligible spectral shift and DLS size comparable to buffer only control
Potassium acetate buffer capture (20 mM, pH = 4.3, mAb conjugation buffer)	Fisher Scientific	P171-500	Prepare final concentration of 10 mM reagent in ultra-pure water, adjust pH to 4.3 with acetic acid, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Zeba desalting columns (2 mL, 5 mL, or 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893