Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Summary

Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.

Abstract

Podczas transkrypcji rodzące się RNA zaczyna parować zasad podczas wychodzenia z polimeraz RNA (Pols). To parowanie zasad umożliwia tworzenie struktur RNA, które mają istotny wpływ na ekspresję genów na poziomie przetwarzania, translacji i stabilności RNA. Ustalone metody badania struktury wtórnej RNA ograniczają się do dojrzałych transkrypcji, podczas gdy o stanach fałdowania wiadomo niewiele. Ponadto stosunkowo niższa obfitość (< 1%) oraz przejściowy charakter powstającego RNA komplikują jego izolację i charakteryzację. Śledzenie struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) wykorzystuje transkrypcyjne badania z biotyną-NTP i dimetylosiarczanem (DMS), aby jednocześnie uzyskać pozycję Pol i status parowania zasad w początkujących transkrypcjach. W Saccharomyces cerevisiae CoSTseq dostarcza informacji o sekwencji i strukturze blisko końca 3' powstających RNA transkrybowanych przez dowolne z trzech RNA Pol. Podczas transkrypcji biotyna-NTP wprowadzona w miejscu aktywnym skutecznie blokuje Pols. Następnie leczenie DMS metyluje niesparowane nukleotydy A, C i U. Późniejsze wzbogacenie biotyny i synteza cDNA za pomocą transkryptozy odwróconej przełączającej się szablonami umożliwiają sekwencjonowanie parowe oraz obliczanie reaktywności DMS w zależności od pozycji Pol. CoSTseq jest łatwo wykonywany równolegle z sondowaniem DMS (DMS-MaPseq), umożliwiając również przechwycenie złożonego dorosłego transkrypcji. Przedstawiono tutaj szczegółowy protokół dla równoległego CoSTseq i DMS-MaPseq, obejmujący transkrypcyjne run-on, przygotowanie biblioteki oraz analizę danych.

Introduction

RNA może fałdować się w struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe dzięki parowaniu zasad w cząsteczkach RNA, a te struktury mogą być dodatkowo kształtowane przez białka pełniące rolę chaperonów prowadzących fałdowanie RNA¹. Struktura RNA może być wysoce dynamiczna, gdzie komórkowe RNA mogą dopasowywać się do różnych struktur określonych przez krajobraz termodynamiczny, generując zespoły możliwych konformacji RNA². Dynamiczne zmiany konformacyjne mogą wpływać na regulację i ekspresję genów ^3,4. Z kolei RNA może również przyjmować bardzo preferowane struktury ściśle powiązane z jego funkcją, takie jak tRNA, małe jądrowe RNA i rRNA. Chociaż te przykłady podkreślają dojrzałe RNA o silnych rolach regulacyjnych, etapy przetwarzania RNA eukariotycznego często współwystępują z transkrypcją, w tym splicing pre-mRNA, rozszczepienie 3' na końcu oraz modyfikację RNA. Podobnie, fałdowanie RNA może zachodzić przed dojrzewaniem transkryptu, jak omawiano w innych miejscach⁵.

Chociaż sekwencja RNA może kodować strukturę wtórną, dokładne określenie często wymaga eksperymentalnej walidacji in vitro lub in vivo. Pojawienie się specyficznych dla struktury technik modyfikacji chemicznej, takich jak DMS-MaPseq (profilowanie mutacyjne dimetylosiarczanu z sekwencjonowaniem), utorowało drogę do określania wtórnej struktury komórkowego RNA z komórek żywych⁶. DMS jest wprowadzany do komórek i konkretnie metyluje ściany parowania zasad Watsona-Cricka: adenozynę, cytozynę oraz, w mniejszym stopniu, urydynę, które są dostępne tylko po niesparowaniu. Po modyfikacji przez DMS można użyć wysokiej jakości i wysoce procesowej transkryptozy odwrócnej, takiej jak termostabilna transkryptoza intronowa odwrotna grupy II (TGIRT)⁷, która koduje zmodyfikowane zasady jako mutacje w ostatecznej przygotowanej bibliotece cDNA. Mutacje te można następnie wykorzystać do wnioskowania dostępności RNA na poziomie nukleotydów. Chociaż jest to potężna technika, metody DMS-MaPseq i pokrewne były głównie wykorzystywane do badania dojrzałego RNA, które jest już w pełni złożone⁶.

Opracowano kilka metod badania początkowej regulacji i przetwarzania RNA. Globalne sekwencjonowanie run-on (GROseq) zostało opracowane, aby przezwyciężyć ograniczenia RNA-seq, które umożliwia pomiar poziomów RNA w komórkach w stanie stacjonarnym i tym samym dostarcza informacji uśredniających transkrypcję, przetwarzanie RNA oraz procesy degradacji wpływające na poziomy RNA. GROseq wykorzystywał bromouridynę do przebiegu jądrowego, gdzie polimeraza RNA (Pol) mogła dodawać nukleotydy do powstającego RNA z rozdzielczością dziesiątek zasad⁸. Precyzyjne sekwencjonowanie run-on (PROseq) zostało opracowane na podstawie tej metodologii, aby mapować RNA Pols na powstającym RNA w rozdzielczości par zasad, wykorzystując biotynę-NTP. Tutaj dodano biotinylowany NTP tam, gdzie Pol ostatnio wykryto na 3' końcu nowo zsyntetyzowanego RNA⁹.

Ostatnio Schärfen i in. opracowali i wykorzystali Co-transkrypcyjne Śledzenie Struktury Strukturalnej (CoSTseq), które wykorzystuje i adaptuje sondowanie biotynowe oraz DMS, umożliwiając określenie struktury RNA w początkujących transkrypcjach w S. cerevisiae¹⁰. CoSTseq umożliwia określenie struktury wtórnej RNA podczas aktywnej transkrypcji; protokół ten szczegółowo opisuje, jak jądrowy run-on jest łączony z sondowaniem DMS podczas eksperymentów CoSTseq. Ponieważ CoSTseq wymaga starannego obsługiwania podczas przygotowywania próbek oraz szczególnej uwagi na jakość danych podczas analizy CoSTseq, protokół ten opisuje najlepsze praktyki generowania odpowiednich bibliotek do sekwencjonowania parowanego na platformie Illumina. Protokół CoSTseq jednocześnie dostarcza RNA powstające i dojrzałe, z czego to drugie można analizować jako zbiór danych DMS-MaPseq, umożliwiając rygorystyczne porównanie RNA powstającego i dojrzałego (Rysunek 1). Eksperymentalnie wymagany jest dostęp do odczynników niezbędnych do utrzymania hodowli drożdży oraz przeprowadzania sond jądrowych i DMS, zgodnie z poniższym protokołem. Początkowy wynik RNA jest kluczowy dla sukcesu przygotowania biblioteki CoSTseq i analizy danych; Dlatego warunki wzrostu ustanowione przez odpowiednie inkubatory i podłoża są kluczowe dla zapewnienia odpowiedniej ilości materiału wyjściowego. Wreszcie, aby przeprowadzić analizę obliczeniową danych CoSTseq, idealny jest dostęp do klastra High-Performance Computing (HPC).

Rysunek 1: Przegląd połączonego przygotowania biblioteki CoSTseq i DMS-MaPseq z tej samej próbki biologicznej. (A) Permeabilizacja ściany komórkowej drożdży i błony jądrowej za pomocą sarkozylu umożliwia włączenie biotyny-NTP na 3' końcu rodzącego się RNA podczas reakcji jądrowej na przebieg. (B) DMS metyluje niesparowane reszty A i C (czasem U) na powstającym i dojrzałym RNA w komórce permeabilizowanej, a całkowite RNA jest pozyskiwane przez ekstrakcji fenol/chloroform. Powstające RNA jest następnie oczyszczane z całkowitego RNA przez magnetyczne kulki sprzężone ze streptawidyną; Ekstrakcja TRIzol uwalnia powstające RNA z kulek. Równolegle, supernatant kulkowy zawierający poliadenylowane mRNA może być wytrącony EtOH; z tego materiału mRNA może być izolowane przez oligo(dT) odciąganie kulek. MRNA poli A+ są fragmentowane przed przygotowaniem w bibliotece. (C) Do oddzielnego generowania cDNA z RNA powstającego lub dojrzałego stosuje się transkryptoazę przełączającą szablon, po czym następuje ligacja adapterów 5' i 3', aby wprowadzić UMI N₇ i kody kreskowe (szczegóły dotyczące CoSTseq patrz Rysunek 2 ). Należy zauważyć, że etapy transkrypcji wstecznej DMS-MaPseq i CoSTseq będą wykorzystywać odrębne adaptery heterodupleksowe z nawisami uzupełniającymi biotynę-NTP stosowaną w CoSTseq oraz N nawisów stosowanych w DMS-MaPseq. Minimalne cykle PCR są używane do wzmacniania w celu ograniczenia polaryzacji w bibliotece, a selekcja rozmiaru jest stosowana do usunięcia dimerów adaptera. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Protocol

UWAGA: Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie bufory wymienione w Tabeli 1 są przygotowane. Wszystkie odczynniki powinny być przygotowywane w wodzie wolnej od nukleazy. Zaleca się sterylizację buforów filtrem przy użyciu chemikaliów/odczynników niemolekularnej jakości do przygotowania buforu. Dla sekcji od 1 do 4 przygotuj wcześniej następujące dokumenty:

1. Przygotowanie materiałów i odczynników

1. Przygotuj roztwór 10% sarkozylu (v/v) co najmniej dzień wcześniej, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na całkowite rozpuszczenie. Sterylizuj jednorodny roztwór filtrem 0,22 μm. W dniu eksperymentu użyj 10% sarkosylu do przygotowania roztworu 0,5% sarkosylu i pozostawij go na lodzie do użycia.
2. Wstępne schładzanie ultrawirówek do 4 °C. W okapie wyparowym ustaw termomieszarkę na 30 °C i podgrzej aliquot 2,5x bufora sondowania struktury. Ten termomikser będzie używany do obróbki DMS później.
3. W okapie spalinowym ustaw blok grzewczy na 65 °C i podgrzej 650 μL kwasowego fenolu i chloroformu na reakcję do ekstrakcji RNA.
4. Mieszaj DTT z buforem transkrypcyjnym 2,5x, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM. Świeżo przygotować i wstępnie schłodzić roztwory hartujące i myjne do natychmiastowego użycia po zabiegu DMS (patrz Tabela 1).
5. Należy podać 40 μL 20% SDS do rurek w celu lizy drożdży przed ekstrakcją RNA. Przygotuj roztwór chlorku cynku (ZnCl2) o pojemności 100 mM i przefiltruj go przed użyciem.
6. Generuj szczepy drożdży delecyjne, wyczerpujące lub knock-in, które mogą być potrzebne do odpowiedzenia na konkretne pytania badawcze dotyczące parowania baz RNA w porównaniu do dzikiego szczepu drożdży pączkowych. Zawsze świeżo ożywiaj szczepy, narzucając paski na odpowiednią płytkę drożdżową (YPD, dropout lub antybiotyki). Rozpocznij hodowlę płynną z pojedynczej kolonii dzień przed rozpoczęciem eksperymentu. Więcej instrukcji dotyczących wzrostu i manipulacji szczepami drożdży można znaleźć w Schärfen i in., 2025.

2. Przygotowanie komórek drożdży do CoSTseq

1. Przygotowanie prehodowla: Uprawiaj szczep S. cerevisiae BY4741 w 50 mL podłoża YPAD aż komórki osiągną fazę średnią logariatusu (gęstość optyczna (OD) przy 600 nm = 0,6) w 30 °C przy potrząsaniu przy 200 obr./min. Jeśli to konieczne, rozcieńcz hodowlę do OD 0,2-0,3 i pozwól drożdżom osiągnąć 0,6 OD.
2. Zbieranie drożdży: Zbierz i odkręć 1,8 OD (~3 mL) kultury drożdżowej w stężeniu 2 500 x g przez 3 minuty w wcześniej schłodzonej wirówce (4 °C). Usuń supernatant do pojemnika na odpady. Płucz pellet, ponownie zawieszając 10 ml zimnej soli fosforanowej (PBS). Ponownie odkręcaj w dawce 2 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Pozbądź się supernatantu i trzymaj granulat drożdżowy na lodzie.
3. Permeabilizacja komórek drożdży: Ostrożnie ponownie zawiesijcie granulat drożdżowy w 10 mL zimnego 0,5% sarkosylu. Użyj pipettora P1000 do ponownego zawieszenia komórek i unikania powstawania bąbelków. Inkubuj na lodzie przez 20 minut, aby pobudzić permeabilizację. Rozpuszczać komórki drożdży przepuszczalne w ilości 400 x g przez 5 minut w 4 °C. Ponownie zawiesić komórki drożdży przepuszczalne w 100 μL wody wolnej od nukleazy.

UWAGA: Chociaż znakowanie DMS nie wymaga permeabilizacji ściany komórkowej, reakcja jądrowa na powierzchni wymaga permeabilizacji, aby biotinylowane nukleotydy dotarły do miejsca transkrypcji. Osiąga się to poprzez leczenie sarkosylem, które przepuszcza zarówno ścianę komórkową drożdży, jak i jej błonę jądrową. Ponadto leczenie sarkosylem ułatwia badanie ciągłe, zapobiegając nowym zdarzeniom inicjacyjnym transkrypcji oraz usuwając ujemne czynniki wydłużające Pol II i chromatynę^11,12. Delikatnie obchodzić się z próbkami i utrzymywać niską prędkość odśrodkową (400 x g), aby zapobiec pęknięciu komórek i wspierać skuteczną inkorporację biotyny do wydłużających się początkujących transkrypcji¹³.

3. Nuklearne rozbieganie i sondowanie DMS

UWAGA: Jądrowy rozbieg z biotyną-NTP wprowadza steryczną przeszkodę, która zatrzymuje RNA Pols w ich aktywnym miejscu i zapewnia biotynową rękę do selektywnego wzbogacania powstającego RNA. W zależności od pożądanej rozdzielczości, run-on jądrowy może być przeprowadzony przy użyciu jednego, dwóch lub wszystkich czterech biotynowo zbiotynowych rybonukleotydów⁹. Dla efektywności kosztowej opisany tutaj workflow wykorzystuje tylko jeden biotynowo-nukleotyd (tj. biotyna-CTP).

1. Przygotowanie reakcji jądrowej na koniec
   1. Przygotuj 2,5x bufor roboczy transkrypcji z świeżo dodanym 5 mM DTT oraz podgrzewanym buforem 2,5x do pomiaru struktury do 30 °C (patrz Tabela 1).
   2. W czystej probówce o pojemności 2 mL dodaj 120 μL buforu transkrypcyjnego 2,5x, 3,75 μL 10 mM ATP, 3,75 μL 10 mM GTP, 3,75 μL 10 mM UTP, 7,5 μL 1 mM Bio-CTP, 15 μL 10% sarkozylu i zwiększ objętość do 200 μL przy 46,25 μL wody wolnej od nukleazy.
   3. Dodaj 100 μL komórek do rurki i inkubuj w termomieszaku ustawionym na 30 °C przez 2 minuty, potrząsając z prędkością 500 obr./min.
      UWAGA: Ten krok jest bardzo pilny czasowo. Staraj się ograniczyć liczbę próbek, aby uzyskać wiarygodne dane. Najlepszą praktyką jest rozłożenie czasu między próbkami dla spójności.
2. Zabieg DMS: Po zakończeniu inkubacji szybko dodaj do probówki jednocześnie 200 μL podgrzanego buforu 2,5x do sondy struktury oraz 25 μL odczynnika DMS. Delikatnie wiruj w dwóch impulsach i kontynuuj inkubację na termomieszaczu przez 4 minuty w temperaturze 30 °C, potrząsając z prędkością 500 obr./min. Rozłóż 30 sekund między próbkami, żeby było spójne.
   UWAGA: Sondowanie DMS to natychmiastowa reakcja, która pozwala na wysoką rozdzielczość czasową¹⁴ w stanie parowania zasad RNA. Aby zapobiec ciągłej modyfikacji DMS, kluczowe jest natychmiastowe schłodzenie oznakowania DMS za pomocą silnego środka redukującego β-merkaptoetanolu. Ponadto pozostałe DMS utrudni odzyskiwanie RNA po ekstrakcji. Dodanie alkoholu izoamylowego nasyconego wodą przed wirowaniem może usunąć pozostałości nierozpuszczalnych DMS z pelletu komórkowego¹⁵. Ten etap jest bardzo pilny czasowo. Niezbędne jest korzystanie z ograniczonej liczby próbek, aby uzyskać wiarygodne dane.
   UWAGA: DMS to wysoce toksyczny, bezbarwny płyn o lekko cebulowym zapachu. Przy pracy z DMS wymagane są skrajne środki ostrożności. Bezpośredni kontakt i/lub wdychanie oparów może powodować martwicę oczu, jamy ustnej i dróg oddechowych, w tym poważne uszkodzenia narządów. Używaj ochronnych gogli, fartucha laboratoryjnego i odpowiednich rękawiczek. Podwójne rękawiczki, kiedy to możliwe, i natychmiast zmieniaj rękawice po ekspozycji lub po użyciu DMS. Wykonuj kroki związane z DMS pod osłoną oparową. Do utylizacji DMS używaj dedykowanych pojemników na odpady.
3. Hartowanie i pranie
   1. Przygotuj wcześniej bufory stop and wash, jak opisano w Tabeli 1 , i umieść w lodzie do czasu użycia. Zatrzymaj metylację DMS, dodając 1 mL bufora stop.
   2. Rozdziel próbki oznaczone DMS przez 5 minut przy 3 500 x g w przedchłodzonej wirówce. Usuwać odpady do odpowiedniego pojemnika na odpady.
   3. Dodaj 1 ml buforu do płukania do pelletu i ponownie zawiesinuj. Powtórz krok 3.3.2. Natychmiast przejść do ekstrakcji RNA. Nie zamrażaj granulatu drożdżowego.
4. Ekstrakcja chloroformem fenolowym
   1. Ponownie zawiesić drożdże znakowane DMS w 600 μL buforu lizy RNA, a następnie przenieść zawiesinę do probówek zawierających 40 μL 20% SDS. Inkubuj w 65 °C przez 30 sekund z potrząsaniami przy 950 obr./min.
   2. Dodaj 650 μL wcześniej podgrzanego kwasowego fenol:chloroformu do lizatu drożdżowego i kontynuuj podgrzewanie na termomieszaku przez 2 minuty w temperaturze 65 °C, potrząsając z prędkością 950 obr./min. Pozwól próbkom leżeć na lodzie przez 5 minut.
      UWAGA: W międzyczasie przełącz blok grzewczy lub termomieszarkę na temperaturę pokojową (RT).
   3. Wirówka w dawce 20 000 x g przez 3 minuty w RT.
   4. Przenieś górną warstwę do nowej rurki i dodaj 650 μL chloroformu. Na krótko Vortex. Ponownie wiruj i zbieraj wierzchnią warstwę w nowej rurce zawierającej 700 μL izopropanolu.
   5. Odwróć do wymieszania i inkubuj w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez 30 minut, pozwalając RNA wytrącić się. Wirować w dawce 20 000 x g przez 45 minut w 4 °C. Odrzuć supernatant. Przemyj pellet 750 μL 75% etanolu (EtOH).
      UWAGA: To jest punkt zatrzymania/pauzy w protokole. Próbki można zostawić w 75% EtOH przez noc w temperaturze -80 °C.
   6. Wiruj przez 3 minuty przy 20 000 x g i odrzucaj supernatant. Susz na powietrzu pellet RNA i rozpuszczaj go w 81 μL wody wolnej od nukleazy. Ilościowo określ wydajność RNA za pomocą spektrofotometru ustawionego na długość fali 260 nm. Do pomiaru należy nałożyć 1 μL powyższej zawieszki. Jeśli trzeba, rozcieńcz próbkę RNA. Aby przejść do kolejnego etapu, powinno być obecne co najmniej 80 μg całkowitego RNA.
      UWAGA: W razie potrzeby RNA znakowane DMS może być przechowywane w temperaturze -80 °C do 2 tygodni.

4. Powstające RNA (CoSTseq)

UWAGA: Całkowite RNA uzyskane z ekstrakcji fenol: chloroform zawiera dojrzałe RNA znakowane przez DMS oraz biotynowo zapoczątkowane RNA ze wszystkich trzech polimeraz. Aby oczyścić powstające RNA z całkowitego RNA, kolejne kroki obejmują wykorzystanie kropek streptawidyny do wzbogacenia biotinylowanego RNA. Ze względu na silne powinowactwo biotyny do streptawidyny (K_d = ^10-14 - ^10-15 M), przeprowadza się dwie kolejne ekstrakcje odczynnika RNA (patrz Tabela materiałów) w celu eluacji RNA z kulek streptawidyny. Należy zauważyć, że mniej niż 1% RNA drożdży to RNA rodzące, w zależności od warunków wzrostu¹⁶.

1. Biotynowy downdown
   1. Przygotowanie magnetycznych kulek Streptawidyny
      1. Przygotuj bufor do przemywania A i bufor B zgodnie z Tabelą 1 do składania. Homogenizuj magnetyczne kulki Streptawidyny poprzez wirowanie. Uzyskaj 44 μL ujednoliconych kulek magnetycznych na próbkę o łącznej masie 80 μg RNA.
         UWAGA: Skaluj dalej, mnożąc objętość przez liczbę próbek.
      2. Umieść kulki magnetyczne na magnetycznym stojaku i usuń roztwór do przechowywania. Ponownie zawiesij magnetyczne kulki w 1 mL bufora A przed myciem.
      3. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Magnetyzuj i usuń supernatant. Powtarzaj pranie. Przemyj 1 raz z 1 mL bufora do mycia przed myciem B. Zmagnetyzuj i usuń supernatant, a następnie szybko przejdź do etapu wiązania i mycia.
   2. Oprawianie i pranie
      1. Przygotuj bufor 2x wiążący, 1x bufor wiążący, bufor o wysokiej i niskiej ilości soli do płukania, jak pokazano w Tabeli 1.
      2. Ponownie zawiesić wcześniej umyte kulki, dodając dwukrotnie większą objętość (88 μL) bufora wiązającego 2x. Przenieś 80 μL kulek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 80 μL biotinylowanej próbki RNA.
      3. Obróć mieszankę kulek i próbki na rotatorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zbieraj przepływ zawierający dojrzałe RNA za pomocą etapu magnetycznego (przejdź do etapu wydzielania).
      4. Przepłucz kompleks RNA powstający w kulkach 500 μL buforu o wysokiej jakości soli 2x. Wykonaj jedno płukanie 500 μL 1x wiązania, a następnie jedno płukanie 500 μL buforu o niskiej zawartości soli.
2. Elution przez ekstrakcję odczynników RNA
   1. Podgrzej termomieszarkę do 60 °C. Schłodzić wirówkę zdolną osiągnąć prędkość 20 000 x g do 4 °C.
   2. Dodaj 300 μL odczynnika RNA (patrz Tabela materiałów) do kompleksu RNA powstającego w kulkach i zawiesij. Inkubuj na termomieszaczu przez 5 minut, ustawiony na 60 °C.
   3. Dodaj 60 μL chloroformu, wiruj i inkubuj przez 3 minuty w stanie RT. Wiruj w 14 000 x g przez 5 minut w wirówce wstępnie schładzonej.
   4. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki zbiorczej (~180 μL). Porzuć fazę organiczną, pozostawiając koraliki i pozostałą fazę wodną.
   5. Powtórz ekstrakcję, aby uzyskać końcową objętość 360 μL fazy wodnej w probówce.
   6. Do probówki zbiorczej i na krótko dodaj 360 μL chloroformu. Wiruj z 14 000 x g przez 5 minut w wirówce wstępnie schładzonej.
   7. Przenieś (około 350 μL) wierzchniej warstwy do świeżej rurki. Wytrącaj RNA, dodając 900 μL bezwzględnego EtOH oraz 1 μL współwydzielacza.
   8. Krótko zawiruj i pozwól na opady w temperaturze -20 °C przez 20 minut lub w nocy o -80 °C.
   9. W wirówce wstępnie schłodzonej wirówka wiruj w 20 000 x g przez 20 minut. Ostrożnie wyrzuć supernatant.
   10. Przemyj granulat 750 μL 75% EtOH, a następnie następuje kolejne zimne wirowanie w stężeniu 20 000 x g przez 5 minut.
   11. Susz granulat, aby usunąć pozostałości EtOH przez 10 minut. Rozpuszcz pellet RNA w 3,75 μL_H2O.
       UWAGA: Najskuteczniejszą metodą oceny pulldownu biotyny jest badanie punktowe eluowanego RNA, a następnie sondowanie za pomocą sprzężonego streptawidyny-HRP. Jednak takie podejście zużywa znaczną część materiału próbnego, pozostawiając niewystarczające materiały do przygotowania w bibliotece.
3. Wytrącenie nadmiaru
   1. Wytrącaj supernatant zawierający dojrzałe RNA, dodając 2,5-3 objętości EtOH. Pozwól, by opady występowały w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę.
   2. W schłodzonej wirówce obracaj przez 45 minut przy 20 000 x g. Ostrożnie zasysaj supernatant.
   3. Przemyj pellet RNA 0,5 mL 75% EtOH. Wysusz i rozpuść granulat w 50 μL wody wolnej od nukleazy. Umieść rurkę na bloku grzewczym w temperaturze 65 °C, aby poprawić rozpuszczanie pelletu RNA.
   4. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru w kolejnych etapach.

5. Dojrzałe RNA (DMS-MaPseq)

1. Selekcja Poly A
   UWAGA: Poliadenylowane dojrzałe RNA są oczyszczane za pomocą oligo(dT) pozyskiwania powinowactwa opartego na kulkach oligo(dT). Protokół ten jest zoptymalizowany do wykorzystania zestawu do oczyszczania mRNA DIRECT Dynabeads (patrz Tabela materiałów). Jako wstępne przygotowanie należy podgrzać 1 mL wody wolnej od nukleazy do 80 °C w celu elucii i ustaw blok grzewczy na 70 °C.
   1. Przygotowanie RNA do pulldownu poli-A: Przenieś 50 μg wytrąconego RNA i podnieś go do końcowej objętości 300 μL wodą wolną od nukleazy. Podgrzej RNA w temperaturze 70 °C przez 2 minuty, aby rozbić struktury wtórne i natychmiast umieścić je w lodzie. Krótko wymieszaj RNA z 300 μL buforu lizy/wiążącego i wiru.
   2. Przygotowanie kulek magnetycznych: Doprowadzić kulki magnetyczne do zawieszenia poprzez wirowanie przez co najmniej 30 sekund. Przenieś 100 μL zawieszonych kulek na próbkę do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mL. Magnetyzuj, aby usunąć bufor pamięci. Przepłucz kulki magnetyczne w równej objętości buforu lizy/wiązania, namagnesuj i wyrzuć supernatant.
   3. Oprawianie i pranie
      1. Dodaj 100 μL wcześniej umytych koralików do 600 μL przygotowanego RNA próbki. Obróć się nieprzerwanie na rotatorze przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Zbieraj koraliki, umieszczając je na magnetycznym stojaku i wyrzucaj przelew. Przemyj kulki 600 μL buforu A. Pipete do wymieszania.
      3. Zbierz ponownie kulki, aby wyrzucić wash. Przemyj kulki 300 μL buforu B. Pipette do wymieszania.
      4. Zbierz ponownie kulki, aby wyrzucić wash. Zmieszaj kulki z 90 μL ciepłej (80 °C) wody i pozwól na wiązanie, dodając 90 μL buforu lizy/wiązania. Powtórz krok 5.1.3.1-5.1.3.3.
   4. Elution: Zawiesić kulki w 30 μL ciepłej (80 °C) wodzie wolnej od nukleazy. Inkubuj w temperaturze 75 °C do 80 °C przez 2 minuty. Szybko poddaj kulki polu magnetycznemu i zbierz eluat do rurki wolnej od RNazy. Powtórz elucię i pobierz eluowane RNA.
2. Fragmentacja
   UWAGA: Fragmentacja mRNA może być przeprowadzona metodą enzymatyczną lub chemiczną. Do fragmentacji używa się chlorku cynku i ciepła. W przeciwieństwie do enzymów wymagających określonej sekwencji lub elementów strukturalnych, jony cynku działają jak kwas Lewisa, aktywując tlen 2' (nukleofil) i rozszczepiając szkielet fosfodiesteru. W rezultacie na niciach RNA^{produktu 17} powstają cykliczne estery fosforanowe o średnicy 5' OH i 2',3'.
   1. Nagrzej termocykler z temperaturą blokową ustawioną na 94 °C i temperaturą pokrywki na 105 °C. Włóż 54 μL eluowanego mRNA do rurki PCR.
   2. Dodaj 6 μL roztworu chlorku cynku o pojemności 100 mM (końcowe stężenie 10 mM), zawarj wir przez 2 sekundy i natychmiast inkubuj w temperaturze 94 °C przez 55 sekund na podgrzanym termocyklerze.
   3. Po zakończeniu inkubacji schłodź reakcję fragmentacyjną 6,6 μL 0,5 M EDTA (końcowe stężenie 50 mM), pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, i szybko umieścić probówki w lodzie. Przenieś zawartość do sterylnych probarek o pojemności 1,5 mL.
   4. Pozwalać na wytrącanie fragmentowanych mRNA z dodaniem 150 μL izopropanolu, 15 μL 3 M octana sodu, pH 5,2 oraz 1 μL współwytrącającego.
   5. Postaw w temperaturze -20 °C przez 30 minut. Wiruj z ciśnieniem 20 000 x g przez 45 minut w schłodzonej wirówce. Umyj granulat 75% EtOH i rozpuść w 15 μL wody wolnej od nukleazy.
3. Leczenie PNK
   UWAGA: Fragmentacja chemiczna ZnCl₂ generuje końce 5' i 3', nieodpowiednie dla ligacji¹⁷. W związku z tym, po chemicznej fragmentacji, RNA są poddawane leczeniu kinazą polinukleotydową (PNK), która fosforyluje 5' OH i defosforyluje końce fosforanów 3', które następnie mogą być poddawane adaptorom¹⁸.
   1. Dodaj 1 μL inhibitora rybonukleazy, 2 μL 10x buforu PNK oraz 2 μL T4 PNK. Inkubuj w 37 °C przez 60 minut. Zatrzymaj reakcję, dodając 30 μL wody wolnej od nukleazy, 50 μL buforu wiążącego RNA oraz 50 μL EtOH.
   2. Do usuwania zanieczyszczeń i koncentracji RNA stosuj metodę oczyszczania opartą na kolumnie spinowej. Można to zrobić, korzystając z komercyjnie dostępnego zestawu (zestaw do czyszczenia i koncentratora RNA, patrz Tabela materiałów). W skrócie: wymieszaj dwie objętości buforu wiążącego RNA z jedną objętością próbki, wymieszaj równą objętość tej mieszaniny ze 100% EtOH i załaduj do kolumny spinowej świeżą probówką zbiorczą. Przekręć tę próbkę i odrzuć przepływ. Kolumnę spinową przemyj 700 μL buforu RNA i raz 400 μL buforu RNA. Usuń przepływ przez niego. Obróć pustą kolumnę przez 1 minutę, aby zapewnić całkowite usunięcie bufora płukania.
   3. Elutuj RNA w 10 μL ciepłej wody wolnej od nukleazy.
      UWAGA: Wszystkie kroki wirowania wykonuj przy 10 000 - 16 000 x g w RT przez 30 s.

6. Reakcja transkrypcji wstecznej zmiany szablonu

UWAGA: Powstające RNA z biotynowego pulldownu (krok 4.2) oraz fragmentowane mRNA po leczeniu PNK (krok 5.3) poddawane są następującym krokom przygotowania bibliotecznego (patrz Rysunek 1 i Rysunek 2). Krótko mówiąc, przygotowany zostanie syntetyczny dupleks startowy z matrycą RNA/DNA (adapter heterodupleksowy R2 RNA/DNA), na którym może zachodzić przełączanie szablonów. Ten heterodupleks zapewnia krótką, komplementarną sekwencję, która umożliwia przełączanie szablonów przez odwrotną transkryptazę (RT) w celu zmiany nici, czyli zmiany nici z RNA na primer DNA, umożliwiając tym samym płynną syntezę cDNA z RNA do sekwencji adaptacyjnej. Tutaj stosuje się transkryptoazę odwrotną Induro, która została przetestowana i zoptymalizowana pod kątem tego protokołu. Inne transkryptazy odwrotne przełączające się szablonami mogą być używane do przygotowania biblioteki CoSTseq, jeśli jest to pożądane, ale wymagają optymalizacji przez użytkownika.

1. Sekwencje adapterów heterodupleksowych DNA/RNA
   UWAGA: Adaptery DNA/RNA heterodupleksowe używane do odwrotnej transkrypcji próbki DMS-MaPseq są takie same jak te wymienione w Xu i ^in.7 i cytowane przez Schärfen i ^in.10.
   1. Dla adaptera DNA/RNA heterodupleks, który będzie używany do odwrotnej transkrypcji próbki CoSTseq, należy użyć adaptera z literą 'G' w obszarze przewisu. Pozwoli to G wychwycić biotynę-C na końcu 3' RNA. Jeśli używasz innego biotynylowanego NTP, edytuj primera DNA heterodupleksowego, aby odpowiedni nukleotyd parujący był przewisłem (patrz Tabela 2).
   2. Dla adaptera DMS-MaPseq należy upewnić się, że istnieje pojedynczy przewis N, ponieważ koniec 3'-end będzie losowy po fragmentacji. Aby zobaczyć przegląd następujących kroków przygotowania biblioteki, zobacz Rysunek 2.
2. Przygotowanie hybrydy DNA/RNA do zamiany matrycy: Przygotuj 1 μM primerów R2 RNA i R2R DNA w buforze składającym się z 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 oraz 1 mM EDTA. Mieszankę spłonników inkubuj w temperaturze 82 °C przez 2 minuty, a następnie schładz do 25 °C z prędkością 0,1 °C/s. Zaleć mieszankę i zamroź na późniejsze użycie.
3. Transkrypcja wsteczna z przełączaniem szablonów
   1. Dodaj następujące odczynniki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej: 2 μL buforu reakcji 5x, 1 μL heterodupleksu DNA/RNA o pojemności 1 μM (dla próbki CoSTseq użyj heterodupleksu zawierającego pojedynczy przewis G; dla próbki DMS-MaPseq użyj heterodupleksu zawierającego losowy przewis N), 0,5 μL enzymu, 0,5 μL inhibitora RNazy, 3,75 μL próbki RNA (lub dodanie wody, aby uzyskać objętość 7,75 μL).
   2. Inkubuj tę mieszankę (bez dNTP) przez 30 minut w RT. Następnie dodaj 1,25 μL 10 mM dNTP do reakcji i zastosuj następujące warunki cykliczne w termocyklerze: 25 °C przez 10 minut, 42 °C przez 10 minut, 50 °C przez 10 minut, 55 °C przez 10 minut, 60 °C przez 30 minut, 65 °C przez 20 minut, 75 °C przez 15 minut.
   3. Dodaj 1 μL RNazy H i inkubuj w 37 °C przez 20 minut. Oczyścić reakcję PCR za pomocą metody oczyszczania DNA opartej na kolumnie, aby usunąć pozostałe startery, nukleotydy i enzymy. Elute w końcowym wolumie 20 μL.

Rysunek 2: Szczegółowa schematyczna prezentacja przygotowania biblioteki CoSTseq. Powstające RNA z biotinylowanym końcem 3'-endem jest inkubowane za pomocą adaptera przełączającego szablonu zawierającego przewis G, który jest komplementarny do biotyny-CTP. Dla fragmentowanego dojrzałego RNA (DMS-MaPseq) stosuje się adapter z N-przewisłem (patrz Rysunek 1). synteza cDNA odbywa się za pomocą wysoce procesowej transkryptozy odwróconej, takiej jak termostabilna intronowa transkryptoza grupy II (TGIRT), a następnie leczenie RNazą H, aby rozłożyć nici RNA. Następnie 5' ligaza DNA/RNA App łączy 5'-end (rA^pp) linkera N₇ UMI z 3' OH jednoniciowego cDNA. Adapter UMI N₇ posiada zablokowany koniec 3′, co zapobiega samoligacji między adapterami. Na koniec amplifikacja PCR jest wykonywana za pomocą starterów zawierających nakładające się obszary oraz 5′ zwisające z unikalnymi kodami kreskowymi Illumina i5 i i7 przypisanymi każdej próbce. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

7. Ligacja adaptera 5' do przygotowania ostatecznych bibliotek cDNA do sekwencjonowania tagów parowanych na końcu

1. Przygotowanie adaptera 5'-end
   1. Adenyluj adapter 5'-end za pomocą reakcji RNA opartej na ligazie (np. Mth RNA Ligase, wymieniona w Tabeli Materiałów) z użyciem następujących składników reakcji: 8 μL buforu reakcji reakcji adenylacyjnej 10x 5'-DNA, 8 μL 1 mM ATP, 100 μM R1R DNA (jest to primer TruSeq zawierający unikalny identyfikator molekularny lub UMI), 8 μL ligazy Mth RNA, 52 μL wody wolnej od nukleazy.
      UWAGA: Szczegóły dotyczące projektu adaptera UMI N₇ można znaleźć w Tabeli 2 i Rysunku 2.
   2. Inkubuj tę reakcję w 65 °C przez 1 godzinę, a następnie w 85 °C przez 5 minut. Przystąpić do oczyszczania produktu za pomocą wytrącenia EtOH lub metody oczyszczania DNA opartej na kolumnie spinowej z membraną krzemionkową, aby izolować cDNA, zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Do opadów EtOH DNA może być wytrącone w temperaturze -20 °C (minimum 20 min) przy użyciu octana sodu (pH 5,2) przy końcowym stężeniu 0,3 M oraz 2x-2,5x 95%-100% zimnego EtOH. Wiruj reakcję wytrąconą przez EtOH przez 15 minut z maksymalną prędkością w wirówce wstępnie schłodzonej (4 °C), myj granulat przy użyciu 70% EtOH, ponownie wiruj i susz na powietrzu. Ponownie zawiesić (lub eluować, jeśli używasz kolumny spinowej) pellet w 40 μL wody wolnej od nukleazy. Przechowuj w -20 °C przez dłuższy czas.
2. Ligacja adaptera 5'
   1. Dla pojedynczej objętości reakcji 20 μL dodaj następujące składniki do 10 μL cDNA: 2 μL 10x NE Buffer 1, 2 μL 50 mM MnCl_2, 2 μL 5' ligazy AppDNA/RNA, 4 μL 10 μM (100 ng/μL) adenylowanego adaptera z etapu 7.1.
   2. Inkubuj tę reakcję w 65 °C przez 1 godzinę, a następnie 3 minuty w 90 °C. Oczyść reakcję za pomocą zestawu do oczyszczania PCR minElute i eluować w końcowej objętości 20 μL wody wolnej od nukleazy.
3. Minimalne amplifikowanie bibliotek cDNA w PCR podczas testów pilotażowych
   1. Przed rozpoczęciem przygotuj zapas 10 μM indeksowych starterów zawierających unikalne kody kreskowe. Każda unikalna próbka CoSTseq lub DMS-MaPseq powinna mieć przypisany unikalny kod kreskowy dla płynnej analizy dalszej. Zobacz sekwencje pierwsze w Tabeli 2. Indywidualne zapalniki zawierające kody kreskowe do przodu i tyłu można łączyć w mieszance 1:1 i przechowywać jako premix kodów kreskowych.
   2. Używając 2 μL produktu PCR z kroku 7.2, dodaj 2,5 μL buforu PCR o wysokiej jakości (np. komercyjny bufor HiFi), 0,375 μL dNTP (10 mM), 0,75 μL premixu kodów kreskowych (lub 0,375 μL pojedynczych unikalnych primerów i5 i i7), 0,25 μL wysokowiernej polimerazy DNA do hot-startu (np. komercyjny enzym HiFi do gorącego startu), 6,625 μL wody wolnej od nukleazy.
   3. Inkubuj tę reakcję w 95 °C i powtarzaj [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] przez 23 cykle, zakończ inkubacją 1 minutą w 72 °C. Uruchom na żelu agarozowym o stężeniu 1%, aby ustalić optymalną liczbę cykli.
      UWAGA: Aby przetestować niższe warunki cykliczne, próbkę można przygotować na koniec niższego cyklu (np. po 15 lub 16 cyklach) i ułożyć na żelu agarozowym, aby porównać intensywność rozmazu z biblioteki cDNA na żelu agarozowym na różnych cyklach.
4. Ostateczny PCR do wzmacniania bibliotek
   1. Korzystając z 18 μL produktu PCR z kroku 7.2, dodaj z zestawu KAPA HiFi PCR: 22,5 μL buforu PCR o wysokiej jakości jakości, 3,375 μL dNTP (10 mM), 6,75 μL premixu kodów kreskowych (lub 3,375 μL indywidualnych primerów i5 i i7), 2,25 μL wysokiej jakości polimerazy DNA do hot-startu, oraz 59,625 μL wody wolnej od nukleazy.
   2. Inkubuj tę reakcję w temperaturze 95 °C i powtarzaj [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] dla liczby cykli określonych w kroku 7.3. Zakończ inkubację przez 1 minutę w temperaturze 72 °C.
5. Wybór rozmiaru
   1. Wykonaj wybór rozmiaru produktu PCR za pomocą oczyszczania opartego na kulkach paramagnetycznych (np. AMPure XP lub odpowiednik). Użyj 1,3x objętości kulek (np. do reakcji PCR 50 μL użyj 65 μL zawiesiny kulkowej) i dobrze wymieszaj, aż uzyskasz jednorodność. Pozwól, by kulki wiązały próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Ten stosunek próbki do kulek 1:1,3x umożliwia usuwanie dimerów adaptera starterów i zapewnia, że zachowane fragmenty DNA nie są mniejsze niż 150 bp ani większe niż 800 bp.
   2. Usuń supernatant bez naruszania koralików i przejdź do mycia koralików 80% EtOH zgodnie z protokołem producenta.
   3. Eluć końcowy produkt w 11 μL. Przeprowadzić 1 μL na żelu agarozowym, aby zweryfikować biblioteki. Prześlij gotowy produkt do sekwencjonowania.

8. Analiza danych

UWAGA: Pełny pakiet CoSTseq oraz kod analityczny są dostępne na GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq), a workflow analizy przedstawiono na Rysunku 3. Ten potok został zaprojektowany do obsługi zarówno danych sekwencjonowania CoSTseq, jak i DMS-MaPseq. CoSTseq wykorzystuje Snakemake, workflow bioinformatyczny, który łatwo równolegle analizę poprzez optymalizację liczby dostępnych rdzeni CPU¹⁹. Workflow jest definiowany przez plik Snake, który składa się z zestawu reguł ustalających analizy, które będą wykonywane. Nie ma potrzeby zmieniać pliku Snake dostępnego po zainstalowaniu pakietu GitHub.

1. Dostosuj plik konfiguracyjny (.yaml) z odpowiednimi ścieżkami do miejsca, gdzie przechowywane są surowe dane. W tych ustawieniach powinna znajdować się ścieżka do sekwencji adapterów oraz powiązane nazwy próbek. Zmień plik konfiguracyjny, aby przeprowadzić konkretne analizy zdefiniowane w pliku Snake.
2. Aby rozpocząć analizę, pobierz surowe odczyty z parowanym końcem w fastq.gz formacie. Odczyty procesowe wykonują się przy użyciu fastp²⁰ do przycinania sekwencji adapterów oraz filtra jakości dla odczytów z oceną Phred co najmniej 20. Dopasuj te odczyty do genomu referencyjnego za pomocą STAR²¹ , aby wygenerować pliki BAM.
3. Jako dodatkowe potwierdzenie, zwizualizuj pliki BAM generowane po uruchomieniu pipeline'u analizy CoSTseq w przeglądarce Integrated Genome Viewer (IGV). Korzystając z IGV, pliki BAM powinny być łatwo interpretowalne, aby pokazać odczyty wszystkich części interesujących nas genów, wskazując, że odczyty reprezentują powstające RNA. Jak można się spodziewać, odczyty dojrzałego RNA powinny wykazywać minimalne pokrycie w regionach intronowych (intronowych), ponieważ oczekuje się, że odczyty te pochodzą z dojrzałych i prawdopodobnie efektywnie splicowanych transkrypcji.
4. Użyj wyjścia fastp (plik .html, który można otworzyć w przeglądarce internetowej) dla szacunkowego procentu zduplikowanych odczytów. Należy zauważyć, że odczyty CoSTseq mogą być bardzo mocno duplikowane, co podkreśla krytyczność kolejnego kroku.
5. Korzystając z UMICollapse²², odczyty deduplikują, aby zwalić odczyty z identycznymi UMI i wyrównaniami, co pozwala zachować tylko unikalne odczyty i ogranicza błędy PCR. Powstałe pliki powinny być wolne od zduplikowanych odczytów i w formacie BAM, gdzie odczyty zgodne z rRNA będą oddzielone od tych powiązanych z genami nie-rRNA.
6. W przypadku ostatniego głównego komponentu modułowego potoku CoSTseq użyj niestandardowej implementacji Pythona do obliczenia liczby mutacji i pokrycia odczytu dla każdego nukleotydu. Funkcje opisujące tę implementację można znaleźć w kodzie źródłowym na GitHubie, a plik Snake szczegółowo opisuje dane wejściowe, wyjściowe, parametry i funkcje generujące te dane przechowywane w formacie .pkl.
   UWAGA: Istnieje wiele innych analiz, które można przeprowadzić za pomocą pipeline'u analizy CoSTseq, choć parametry mogą wymagać optymalizacji dla potrzeb analizy indywidualnej. Cenną metodą dostosowaną do CoSTseq jest HDProbe, pakiet R umożliwiający porównania częstości mutacji w całym genomie¹⁰. Krótko mówiąc, HDProbe wymaga danych ze wszystkich replikacji i może metodycznie kategoryzować istotne różnice w tempie mutacji w porównaniu do grupy kontrolnej. Dodatkowe typy analiz, które można przeprowadzić przez użytkownika, obejmują przewidywanie struktury oparte na eksperymentalnych reaktywnościach DMS. Można to wykonać za pomocą pakietu RNAstructure²³.

Rysunek 3: Etapy analizy i oczekiwane wyniki modułowego pipeline'u analizy CoSTseq. Kroki analizy, wskazujące zalecane użycie istniejących narzędzi oprócz gotowego do użycia pipeline'u analizy CoSTseq z oczekiwanymi plikami wyjściowymi i treścią. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Results

Ta sekcja przedstawia rzeczywiste wyniki uzyskane podczas implementacji workflow i analizy CoSTseq, zgodnie z opisem tego protokołu. Po pierwsze, ta sekcja opisuje oczekiwane wyniki po ocenie jakości pomyślnych przygotowań bibliotecznych przed i po sekwencjonowaniu. Przed sekwencjonowaniem badacze mogą wykorzystać test PCR oraz analizę TapeStation, aby potwierdzić obecność RNA po wzbogaceniu biotyn. Wskazuje to na pomyślną izolację powstającego RNA podczas przygotowań do biblioteki CoSTseq. Ocena jakości danych po sekwen...

Discussion

RNA zaczyna się składać współtranskrypcjonalnie z powodu szybszej kinetyki parowania zasad w porównaniu do szybkości syntezy 24,25,26,27. Nasza obecna wiedza na temat rodzącego się fałdowania RNA pochodzi z badań pojedyncząsteczkowych RNA prokariotycznych, sondowania in vitro lub metod in silico. W tym protokole prezentowany jest szczegółowy workflow CoSTseq; technika ta umożl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	Invitrogen	18330019
10mM Biotin-11-CTP	Nauki biologiczne Jena	NU-831-BIOX
10mM GTP	Invitrogen	18332015
10mM UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	New England Biolabs	B7001S	Użyte w kroku 7.2.1
10X fosforanowa sól fizjologiczna buforowana (PBS)	Gibco	70011-044
20% SDS	RPI	L23100-500
Kwas fenol: chloroform	Ambion	AM9722
Koraliki AMPure XP do wyboru rozmiaru	Beckman Coulter	A63880	Użyte do wyboru rozmiaru w kroku 7.5.1
Bacto Peptone	Gibco	211677
Ekstrakt drożdży bacto	Gibco	212750
Bicyna	Sigma Aldrich	B3876-100G
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
D-(+)-GLUKOZA	Sigma Aldrich	G5767-500G
DIFCO AGAR	BD DIFCO	214010
Siarczan dimetylo-siarczan	Sigma Aldrich	D186309-5ML
Dynabeads i handel; Koraliki MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65001	Stosowany do obniżania biotyny w sekcji 4.1
Dynabeads i handel; mRNA DIRECT™ Zestaw oczyszczający	Invitrogen	61011	Wykorzystywane do wyboru Poly A w sekcji 5.1
EDTA, pH 8, 0,5M	Sigma Aldrich	03690-100ML
Etanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	Współwydzielacz stosowany w krokach 4.2.7 i 5.2.4
Induro®   Transkryptaza odwrotna	New England Biolabs	M0681S	Enzym RT stosowany w kroku 6.3.1
Alkohol izoamylowy	Sigma Aldrich	W205710-1KG-K
Izopropanol	JT-BAKER	9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kit & nbsp;	Roche	07958889001	Wysokowierny DNA Pol stosowany w 7.3.2 i 7.4.1 w reakcjach PCR
Chlorek magnezu	Sigma Aldrich	SLCM2154
Zestaw do oczyszczania PCR MinElute	Qiagen	28004	Używany do oczyszczania DNA w krokach 6.3.3 i 7.2.2
Ligaza Mth RNA	New England Biolabs	M2611A
Oligo Clean & Koncentrator	Zymo Research	D4060	Zalecane do oczyszczania DNA Oligo w kroku 7.1.2
Octan potasu	Sigma Aldrich	236497-500G
Chlorek potasu	JT Baker	3040-01
Wodorotlenek potasu	Avantor	6984-04-01
RNA Clean & Clean & Koncentrator-5	Zymo Research	R1014	Zestaw do czyszczenia RNA stosowany w kroku 5.3.2 po leczeniu PNK
RNaseOUT™ Rekombinowany inhibitor rybonukleazy	Thermo Fisher Scientific	10777019	Inhibitor RNazy stosowany w kroku 5.3.1 podczas leczenia PNK
Sarkosyl	IBI Scientific	IB07080
Octan sodu	Jakość biologiczna	351-035-721
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S5150-1L
Wodorotlenek sodu	Macron	7708-10
SUPERase· In™ Inhibitor RNazy (20 U/μ L)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	Inhibitor RNazy stosowany w kroku 6.3.1
Polinukleotydowa kinaza T4	New England Biolabs	M0201S
Termostabilny 5' Ligaza DNA/RNA aplikacji	New England Biolabs	M0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1M	Thermo Scientific	J60202. K2
Triton X-100	TEKNOVA	T1105
TRIzol™ Odczynnik	Invitrogen	15596-026	Dla elucii RNA w sekcji 4.2; w sekcji 4 nazywana także "reagentem RNA"
β-merkaptoetanol	Sigma Aldrich	M6250-1L