Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Summary

Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.

Abstract

Podczas transkrypcji rodzące się RNA zaczyna parować zasad podczas wychodzenia z polimeraz RNA (Pols). To parowanie zasad umożliwia tworzenie struktur RNA, które mają istotny wpływ na ekspresję genów na poziomie przetwarzania, translacji i stabilności RNA. Ustalone metody badania struktury wtórnej RNA ograniczają się do dojrzałych transkrypcji, podczas gdy o stanach fałdowania wiadomo niewiele. Ponadto stosunkowo niższa obfitość (< 1%) oraz przejściowy charakter powstającego RNA komplikują jego izolację i charakteryzację. Śledzenie struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) wykorzystuje transkrypcyjne badania z biotyną-NTP i dimetylosiarczanem (DMS), aby jednocześnie uzyskać pozycję Pol i status parowania zasad w początkujących transkrypcjach. W Saccharomyces cerevisiae CoSTseq dostarcza informacji o sekwencji i strukturze blisko końca 3' powstających RNA transkrybowanych przez dowolne z trzech RNA Pol. Podczas transkrypcji biotyna-NTP wprowadzona w miejscu aktywnym skutecznie blokuje Pols. Następnie leczenie DMS metyluje niesparowane nukleotydy A, C i U. Późniejsze wzbogacenie biotyny i synteza cDNA za pomocą transkryptozy odwróconej przełączającej się szablonami umożliwiają sekwencjonowanie parowe oraz obliczanie reaktywności DMS w zależności od pozycji Pol. CoSTseq jest łatwo wykonywany równolegle z sondowaniem DMS (DMS-MaPseq), umożliwiając również przechwycenie złożonego dorosłego transkrypcji. Przedstawiono tutaj szczegółowy protokół dla równoległego CoSTseq i DMS-MaPseq, obejmujący transkrypcyjne run-on, przygotowanie biblioteki oraz analizę danych.

Introduction

RNA może fałdować się w struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe dzięki parowaniu zasad w cząsteczkach RNA, a te struktury mogą być dodatkowo kształtowane przez białka pełniące rolę chaperonów prowadzących fałdowanie RNA¹. Struktura RNA może być wysoce dynamiczna, gdzie komórkowe RNA mogą dopasowywać się do różnych struktur określonych przez krajobraz termodynamiczny, generując zespoły możliwych konformacji RNA². Dynamiczne zmiany konformacyjne mogą wpływać na regulację i ekspresję genów ^3,4. Z kolei RNA może również przyjmować bardzo preferowane struktury ściśle ....

Protocol

UWAGA: Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie bufory wymienione w Tabeli 1 są przygotowane. Wszystkie odczynniki powinny być przygotowywane w wodzie wolnej od nukleazy. Zaleca się sterylizację buforów filtrem przy użyciu chemikaliów/odczynników niemolekularnej jakości do przygotowania buforu. Dla sekcji od 1 do 4 przygotuj wcześniej następujące dokumenty:

1. Przygotowanie materiałów i odczynników

1. Przygotuj roztwór 10% sarkozylu (v/v) co najmniej dzień wcześniej, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na całkowite rozpuszczenie. Sterylizuj jednorodny roztwór filtrem 0,22 μm. W dniu eksperyme....

Results

Ta sekcja przedstawia rzeczywiste wyniki uzyskane podczas implementacji workflow i analizy CoSTseq, zgodnie z opisem tego protokołu. Po pierwsze, ta sekcja opisuje oczekiwane wyniki po ocenie jakości pomyślnych przygotowań bibliotecznych przed i po sekwencjonowaniu. Przed sekwencjonowaniem badacze mogą wykorzystać test PCR oraz analizę TapeStation, aby potwierdzić obecność RNA po wzbogaceniu biotyn. Wskazuje to na pomyślną izolację powstającego RNA podczas przygotowań do biblioteki CoSTseq. Ocena jakości danych po sekwen.......

Discussion

RNA zaczyna się składać współtranskrypcjonalnie z powodu szybszej kinetyki parowania zasad w porównaniu do szybkości syntezy 24,25,26,27. Nasza obecna wiedza na temat rodzącego się fałdowania RNA pochodzi z badań pojedyncząsteczkowych RNA prokariotycznych, sondowania in vitro lub metod in silico. W tym protokole prezentowany jest szczegółowy workflow CoSTseq; technika ta umożl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	Invitrogen	18330019
10mM Biotin-11-CTP	Nauki biologiczne Jena	NU-831-BIOX
10mM GTP	Invitrogen	18332015
10mM UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	New England Biolabs	B7001S	Użyte w kroku 7.2.1
10X fosforanowa sól fizjologiczna buforowana (PBS)	Gibco	70011-044
20% SDS	RPI	L23100-500
Kwas fenol: chloroform	Ambion	AM9722
Koraliki AMPure XP do wyboru rozmiaru	Beckman Coulter	A63880	Użyte do wyboru rozmiaru w kroku 7.5.1
Bacto Peptone	Gibco	211677
Ekstrakt drożdży bacto	Gibco	212750
Bicyna	Sigma Aldrich	B3876-100G
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
D-(+)-GLUKOZA	Sigma Aldrich	G5767-500G
DIFCO AGAR	BD DIFCO	214010
Siarczan dimetylo-siarczan	Sigma Aldrich	D186309-5ML
Dynabeads i handel; Koraliki MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65001	Stosowany do obniżania biotyny w sekcji 4.1
Dynabeads i handel; mRNA DIRECT™ Zestaw oczyszczający	Invitrogen	61011	Wykorzystywane do wyboru Poly A w sekcji 5.1
EDTA, pH 8, 0,5M	Sigma Aldrich	03690-100ML
Etanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	Współwydzielacz stosowany w krokach 4.2.7 i 5.2.4
Induro®   Transkryptaza odwrotna	New England Biolabs	M0681S	Enzym RT stosowany w kroku 6.3.1
Alkohol izoamylowy	Sigma Aldrich	W205710-1KG-K
Izopropanol	JT-BAKER	9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kit & nbsp;	Roche	07958889001	Wysokowierny DNA Pol stosowany w 7.3.2 i 7.4.1 w reakcjach PCR
Chlorek magnezu	Sigma Aldrich	SLCM2154
Zestaw do oczyszczania PCR MinElute	Qiagen	28004	Używany do oczyszczania DNA w krokach 6.3.3 i 7.2.2
Ligaza Mth RNA	New England Biolabs	M2611A
Oligo Clean & Koncentrator	Zymo Research	D4060	Zalecane do oczyszczania DNA Oligo w kroku 7.1.2
Octan potasu	Sigma Aldrich	236497-500G
Chlorek potasu	JT Baker	3040-01
Wodorotlenek potasu	Avantor	6984-04-01
RNA Clean & Clean & Koncentrator-5	Zymo Research	R1014	Zestaw do czyszczenia RNA stosowany w kroku 5.3.2 po leczeniu PNK
RNaseOUT™ Rekombinowany inhibitor rybonukleazy	Thermo Fisher Scientific	10777019	Inhibitor RNazy stosowany w kroku 5.3.1 podczas leczenia PNK
Sarkosyl	IBI Scientific	IB07080
Octan sodu	Jakość biologiczna	351-035-721
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S5150-1L
Wodorotlenek sodu	Macron	7708-10
SUPERase· In™ Inhibitor RNazy (20 U/μ L)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	Inhibitor RNazy stosowany w kroku 6.3.1
Polinukleotydowa kinaza T4	New England Biolabs	M0201S
Termostabilny 5' Ligaza DNA/RNA aplikacji	New England Biolabs	M0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1M	Thermo Scientific	J60202. K2
Triton X-100	TEKNOVA	T1105
TRIzol™ Odczynnik	Invitrogen	15596-026	Dla elucii RNA w sekcji 4.2; w sekcji 4 nazywana także "reagentem RNA"
β-merkaptoetanol	Sigma Aldrich	M6250-1L