Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowy model szczura ciężkiej zakrzepicy zatoki żylnej mózgu ustanowiony przez połączenie półligacji, chlorku żelaza i trombiny

323 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69961

⸱

13 lutego 2026

 , 
1Department of Emergency, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, The People's Hospital of Qingxian

W tym artykule

Podsumowanie

Nowatorski model szczura ciężkiej zakrzepicy zatok żylnych mózgu (CVST), który powstaje przez półligację połączoną z chlorkiem żelaza i trombiną, może skuteczniej naśladować mechanizm patofizjologiczny ciężkiego CVST u ludzi.

Streszczenie

Zakrzepica zatoki żylnej mózgu (CVST) to odrębny typ udaru, który dotyka głównie młode osoby, zwłaszcza kobiety w ciąży. Około 60% pacjentów z CVST rozwija zawał lub krwotok żylny lub krwotoku, który definiuje się jako ciężki CVST. Obecnie stosuje się różne metody zarówno w kraju, jak i za granicą, aby indukować CVST w modelach zwierzęcych. Jednak modele te nie oddają w pełni mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw ciężkiego CVST, co ogranicza badania podstawowe nad tym schorzeniem. Nowatorski model szczura o ciężkim CVST można ustalić poprzez półligację w połączeniu z chlorkiem żelaza i trombiną. Półligację osiągnięto poprzez pomiar przepływu krwi w mózgu (CBF) w interesującym obszarze (ROI) przed i po podwiązaniu zatoki strzałkowej górnej (SSS) za pomocą perfusion Speckle Imager (PSI). Półligacja SSS wywołuje stagnację krwi w zatoce żylnej. Miejscowe zastosowanie chlorku żelaza na powierzchni SSS prowadzi do uszkodzenia śródbłonka, natomiast bezpośrednie wstrzyknięcie trombiny do zatoki powoduje miejscowy stan hiperkrzepnięcia. To podejście skutecznie naśladuje trzy kluczowe składniki powstawania zakrzepicy: stazę, uszkodzenie śródbłonka oraz nadkrzepliwość. Powstały model wykazuje znaczne obciążenie zakrzepowe obejmujące jednocześnie wiele zatok żylnych. Wywołany zakrzep pozostaje stabilny przez co najmniej tydzień. Barwienie 2,3,5-tryfenylotrazolium chlorkiem (TTC) pokazuje, że model ten może konsekwentnie powodować zawał mózgu żylny na dużej powierzchni, utrzymujący się do 7 dni. Model ten może nawet wywołać napady padaczkowe u szczurów, czego wcześniejsze modele nie były w stanie osiągnąć. Zaburzenie bariery krew-mózg zaobserwowano przy użyciu barwienia Evans Blue (EB). Dlatego model ciężkiego CVST opracowany poprzez półligację połączoną z podawaniem chlorku żelaza i trombiny dokładniej odzwierciedla patofizjologiczny przebieg ciężkiego CVST u ludzi, wykazując stabilność i niezawodność.

Wprowadzenie

Zakrzepica zatoki żylnej mózgu (CVST) to odrębna forma zaburzeń naczynia mózgowego, która różni się od udaru tętnictwowego. Występuje częściej u młodszych osób 1,2, szczególnie u kobiet w ciąży3, a jego częstość stale rośnie w ostatnich latach. Badanie epidemiologiczne przeprowadzone w Australii wskazuje, że roczna częstość występowania CVST waha się od 13,0 do 15,7 przypadków na milion osób4. W Stanach Zjednoczonych częstość CVST wykazuje tendencję wzrostową wraz z wiekiem. Niemniej jednak, szczytowy wiek wystąpienia u kobiet jest niższy niż u mężczyzn w wieku5 lat. W latach 2021–2023 u 43 na milion pacjentów odwiedzających oddziały ratunkowe w Stanach Zjednoczonych zdiagnozowano CVST6. W środowiskach klinicznych najczęściej obserwowaną postacią jest tromboza zatok mnoga, stanowiąca około 57,14% wszystkich przypadków. Następnie występują zatoka strzałkowa górna (SSS; 16,19%), zatoka poprzeczna (11,43%) oraz zatoka egiczna (8,57%)4. Główne objawy kliniczne to ból głowy, któremu może towarzyszyć padaczka, zaburzenia świadomości oraz ogniskowe objawy neurologiczne 7,8,9. Jednak te przejawy nie są konkretne. Około 60% pacjentów z CVST rozwija zawał żylny lub krwotok mózgu, który jest klasyfikowany jako ciężki CVST10,11. Chociaż leczenie CVST obejmuje terapię przeciwzakrzepową i interwencje chirurgiczne, śmiertelność w przypadku ciężkiego CVST utrzymuje się na poziomie 34,2%9. Ta wysoka śmiertelność może wynikać z faktu, że podstawowe mechanizmy patofizjologiczne ciężkiego CVST nie są jeszcze w pełni poznane. Odpowiedni model zwierzęcy ciężkiej CVST jest zatem niezbędnym narzędziem eksperymentalnym do badania jego patogenezy, progresji patofizjologicznej oraz potencjalnych strategii terapeutycznych12.

Obecnie metody indukcji modeli zwierzęcych CVST można ogólnie podzielić na następujące typy: trwała ligacja13,14, indukcjachemiczna 15,16,17, podejścia interwencyjne 18,19, implantacja samodzielnie wykonanych przeszczepów 20,21,22 oraz elektrokoagulacja dwubiegunowa 23,24. Zakrzep indukowany przez wcześniejsze modele zwierzęce trwał krótko i nie był w stanie jednocześnie wywołać wielu zakrzepów zatok żylnych oraz zawału żylnego mózgu na dużej powierzchni. Dlatego opracowanie ciężkiego modelu CVST, który obejmuje jednocześnie wiele zatok żylnych, stało się pilnym priorytetem. Metoda półligacji w połączeniu z chlorkiem żelaza i trombiną może ustanowić nowy model szczura o ciężkim CVST. Ponadto nowatorski model ciężkiej CVST dokładniej symuluje ludzki proces patofizjologiczny ciężkiego CVST poprzez trzy kluczowe aspekty: obciążenie zakrzeplem zatokowo-żyłnym, zawał żylny mózgu oraz zaburzenie bariery krew-mózg. Model ten jest stosowany w badaniach nad mechanizmami patofizjologii i strategiami leczenia ciężkiego CVST. Ten nowy model szczura może być w przyszłości wykorzystywany do badania mechanizmu patofizjologicznego ciężkiego CVST.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet ds. Eksperymentów na Zwierzętach i Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Medycznego Stolicy (AEEI-2020-119) w Pekinie, Chiny, i przeprowadzono go zgodnie z przepisami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt tej instytucji.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Losowo przypisz zdrowe dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (SD), o średniej masie ciała 300 ± 10 g, do grupy eksperymentalnej lub grupy pozorowanej operacji. Wszystkie zwierzęta były utrzymywane na naprzemiennym, 12-godzinnym cyklu światła i ciemności, z dostępem do jedzenia i wody ad libitum.

2. Zastosowanie PSI

  1. Stosuj PSI do ciągłego monitorowania zmian w przepływie krwi mózgowej (CBF) w SSS szczurów przez cały proces modelowania. Wybierz stały obszar kołowy w SSS jako obszar zainteresowania (ROI). Monitorując zmiany w CBF lub ROI podczas operacji, można określić zakończenie półligacji oraz skuteczność indukcji zakrzepa.

3. Ustanowienie modelu szczura z ciężkim CVST

  1. Znieczulanie szczurów za pomocą 5% enfluranu, z mieszanką gazową składającą się z 70% podtlenku azotu i 30% tlenu dostarczanego za pomocą maski znieczulonej. Utrzymuj stężenie enfluranu w zakresie 1%-2% przez cały zabieg. Ułóż znieczulone szczury w pozycji leżącej z głowami zamocowanymi na linii środkowej, używając ramy stereotaksyjnej. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C przez cały zabieg chirurgiczny, używając termostatycznej poduszki grzewczej.
  2. Wykonaj 1,5 cm podłużne nacięcie wzdłuż linii środkowej części czaszki szczura. Rozciąć tkankę podskórną, aby odsłonić leżącą pod spodem czaszkę.
  3. W ramach mikroskopowej wizualizacji wykonaj podłużne okno czaszkowe (10 x 4 mm) między bregmą a lambdą za pomocą szybkiej wiertarki dentystycznej. Odsłonięcie SSS i obustronnej kory mózgowej, przy jednoczesnym zachowaniu integralności mięśnia twardego. Podczas wiercenia czaszki stopniowo chłodzić wiertło zwykłą solą fizjologiczną, aby zapobiec uszkodzeniom termicznym kości twardej i kory mózgowej.
  4. Po ekspozycji na SSS oceń CBF zwrotu z inwestycji w SSS za pomocą PSI i zapisz odpowiednie dane. Pół-ligatuj SSS w rostralnym i kaudalnym stylu 8-0 Szwy poliamidowe pod mikroskopową obserwacją.
    UWAGA: Podczas ligowania SSS siła powinna być umiarkowana i nie nadmierna. W przeciwnym razie efekt półligacji nie może zostać osiągnięty. Podwiązywanie powinno być wykonane w jednej ciągłej procedurze. Powtarzające się próby ligacji mogą skutkować perforacją SSS, co zaszkodzi skuteczności wytwarzania modeli.
  5. Wykorzystaj PSI do oceny CBF ROI zlokalizowanego na ligacie SSS, potwierdzając, że CBF zmniejszył się do około 50% tego poziomu przed półligacją. Systematycznie zapisuj wyniki.
  6. W warunkach chronionych przed światłem zanurz 7 mm nitkę jedwabną 3-0 w 40% chlorku żelaza i użyj jej do przykrycia powierzchni miejsca wiązania SSS przez 5 minut. Po usunięciu jedwabnej nici umyj pole zwykłą solą fizjologiczną.
  7. Wstrzyknąć 0,1 mL roztworu trombiny (500 U/mL) do jamy zatokowej segmentu podwiązanego za pomocą mikroinjektora w ciągu 1 minuty. Powtórz zastrzyk dwa kolejne razy, co daje łączną dawkę trombiny 150 U. Refluks trombinowy do przestrzeni zewnątrzoponowej nie prowadził do słabej zakrzepicy.
    1. Aby ułatwić wstrzyknięcie trombiny do SSS, delikatnie zgiąć igłę mikrowtryskiwacza przed włożeniem. Ta regulacja pozwala lepiej kontrolować kąt igły podczas nakłucia i pomaga zapobiegać niezamierzonemu przebiciu przez SSS.
  8. Ponownie oceń CBF zwrotu z inwestycji na podstawie PSI po wstrzyku trombiny. Upewnij się, że wyniki potwierdzają istotne zmniejszenie CBF w porównaniu do tego po półligacji, co wskazuje na pomyślną indukcję zakrzepicy. Systematycznie rejestruj dane do dalszej analizy.
  9. Zamknąć okno kostne woskiem, a następnie zszyć nacięcie. Po zabiegu chirurgicznym podaj ketoprofen (5 mg/kg) każdemu szczurowi, aby złagodzić ból pooperacyjny.
  10. W grupie z fikcyjną operacją wykonuj się wyłącznie kraniotomię, bez dodatkowych zabiegów chirurgicznych.

4. Obciążenie zakrzepicą zatoki żylnej i zawał mózgu

  1. Oceń obciążenie zakrzepicą zatoki żylnej w trzech momentach: 1 dzień, 2 dni i 7 dni po założeniu modelu. Składaj ofiary szczurów i wykonuj infuzję serca z normalną solą fizjologiczną w różnych momentach.
  2. Wykonaj kraniotomię, aby wizualnie ocenić zakres zatrucia żyłnego. Wyizoluj zakrzep i poddaj się analizie ilościowej. Wyciąć tkankę mózgową i podzielić ją na 2 mm przekroje koronalne.
  3. Zanurz plasterki w 2% roztworze TTC i inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby ułatwić barwienie. Następnie wizualnie ocenić zawał żylny mózgu i ilościowo określić objętość zawału za pomocą oprogramowania ImageJ do dalszej analizy statystycznej.
    Objętość zawału = powierzchnia zawału w mm kwadratowych x grubość [2 mm]

5. Zakłócenie przepuszczalności bariery krew-mózg (BBB)

  1. Drugiego dnia po operacji losowo wybiera się szczury zarówno z grupy modelowej, jak i z grupy fikcyjnej operacji i podaje się dożylne zastrzyk 2% błękitu Evansa (EB) przez żyłę ogonową.
  2. Po 2 godzinach pomyślnego podania zastrzyku należy uśpić szczury i przekręcić sólą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) przez lewą komorę. Pobierz tkanki mózgowe i podziel je na plastry o grubości 2 mm, aby ocenić zakres penetracji EB.

6. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadzaj analizy statystyczne z użyciem oprogramowania SPSS 17.0. Dane pomiarowe przedstawiają jako średnią ± odchylenia standardowego. Do porównań grupowych stosuj jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) lub niezależny test t próbek.
  2. Do analizy zmiennych ciągłych mierzonych w wielu punktach czasowych w tej samej grupie, stosuj powtarzane miary ANOVA do oceny różnic między grupami w różnych punktach czasowych. Wartość p poniżej 0,05 uznano za istotną statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Proces modelowania
Rysunek 1A przedstawia SSS szczura, oznaczony strzałką. Rostralny i ogon SSS zostały półligowane (Rysunek 1B), po czym nałożono nici nasączoną chlorkiem żelaza na powierzchnię obszarów podwiązanych (Rysunek 1C). Następnie trombina została wstrzyknięta do podwiązanych segmentów, aby wywołać zakrzepicę. Obszar oznaczony strzałką, gdzie wstrzyknięto trombinę, stał się (Rysu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nowatorski model szczura o ciężkim CVST, skonstruowany przez półligację połączoną z chlorkiem żelaza i trombiną, może tylko symulować stagnację krwi i uszkodzenie śródbłonka, ale także stan hiperkrzepnięcia krwi, czyli symuluje trzy elementy powstawania zakrzepicy25. Co jeszcze bardziej ekscytujące, model szczura opracowany tą metodą jest zdolny do wykazywania napadów padaczkowych. Napady padaczkowe stanowią istotną manifestację kliniczną u pacjentów z CVST, występując w około 12% do 31,9% przypad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Instytutowi Krytycznych Chorób Mózgu na Capital Medical University za ich wsparcie techniczne. Badanie to zostało wsparte przez Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (nr 7182064).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,3,5-tryfenyltetrazolowy chlorekSigma-Aldrich
40% chlorek żelaza Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Chiny
Evans blue Sigma-Aldrich
Poduszka grzewcza Aparat Harvarda Holliston, MA, USA50-7061-f, 
Wiertarka dentystyczna o dużej prędkości & nbsp;Saeshin, Busan, Korea PołudniowaStrong-207B
Laserowy miernik plamkowy i nbsp;System PSI PeriCam, Szwecja
MikroskopCarl Zeiss, Inc., Berlin, Niemcy
Szew poliamidowy Fabryka mikroaparatur Ningbo Chenghe, Chiny
Rama stereotaksycznaDavid Kopf Instruments, Tujunga, Kalifornia, USA
TrombinaChang Chun Lei Yunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny

Bibliografia

  1. Silvis, S. M., de Sousa, D. A., Ferro, J. M., Coutinho, J. M. Cerebral venous thrombosis. Nat Rev Neurol. 13 (9), 555-565 (2017).
  2. Ferro, J. M., Aguiar de Sousa, D. Cerebral venous thrombosis: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 19 (10), 74(2019).
  3. Kashkoush, A. I., et al. Cerebral venous sinus thrombosis in pregnancy and puerperium: A pooled, systematic review. J Clin Neurosci. 39 (5), 9-15 (2017).
  4. Devasagayam, R., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis Incidence Is Higher Than Previously Thought: A Retrospective Population-Based Study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  5. Payne, A. B., et al. Epidemiology of cerebral venous sinus thrombosis and cerebral venous sinus thrombosis with thrombocytopenia in the United States, 2018 and 2019. Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12682(2022).
  6. Ruderman, A., Hogan, A., Epley, C., Courtney, D. M., Milman, B. Epidemiology of Cerebral Venous Sinus Thrombosis: 2021-2023. Cureus. 17 (10), e93654(2025).
  7. Singh, R. J., Saini, J., Varadharajan, S., Kulkarni, G. B., Veerendrakumar, M. Headache in cerebral venous sinus thrombosis revisited: exploring the role of vascular congestion and cortical vein thrombosis. Cephalalgia. 38 (3), 503-510 (2018).
  8. Mahale, R., et al. Acute seizures in cerebral venous sinus thrombosis: what predicts it. Epilepsy Res. 123 (7), 1-5 (2016).
  9. Luo, Y., Tian, X., Wang, X. Diagnosis and treatment of cerebral venous thrombosis: a review. Front Aging Neurosci. 30 (1), 102(2018).
  10. Kowoll, C. M., et al. Severe cerebral venous and sinus thrombosis: Clinical course, imaging correlates, and prognosis. Neurocritical care. 25 (3), 392-399 (2016).
  11. Stam, J., Majoie, C. B. L. M., van Delden, O. M., van Lienden, K. P., Reekers, J. A. Endovascular thrombectomy and thrombolysis for severe cerebral sinus thrombosis: A prospective study. Stroke. 39 (5), 1487-1490 (2008).
  12. Yenigün, M., Jünemann, M., Gerriets, T., Stolz, E. Sinus thrombosis: do animal models really cover the clinical syndrome. Ann Transl Med. 3 (10), 138(2015).
  13. Frerichs, K. U., et al. Cerebral sinus and venous thrombosis in rats induces long-term deficits in brain function and morphology--evidence for a cytotoxic genesis. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (2), 289-300 (1994).
  14. Li, G., et al. A new thrombosis model of the superior sagittal sinus involving cortical veins. World Neurosurg. 82 (1/2), 169-174 (2014).
  15. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  16. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306 (10), 39-49 (2015).
  17. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neurosci Lett. 662 (1), 205-212 (2018).
  18. Wang, J., et al. A new model of reversible superior sagittal sinus thrombosis in rats. Brain Res. 1181 (11), 118-124 (2007).
  19. Wang, J., et al. Development of a new model of transvenous thrombosis in the pig superior sagittal sinus using thrombin injection and balloon occlusion. J Neuroradiol. 37 (2), 109-115 (2010).
  20. Yang, H., Meng, Z., Zhang, C., Zhang, P., Wang, Q. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes. J Neurosci Methods. 203 (1), 130-135 (2012).
  21. Bourrienne, M. C., et al. A Novel Mouse Model for Cerebral Venous Sinus Thrombosis. Transl Stroke Res. 12 (6), 1055-1066 (2021).
  22. Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
  23. Sakaki, T., Kakizaki, T., Takeshima, T., Miyamoto, K., Tsujimoto, S. Importance of prevention of intravenous thrombosis and preservation of the venous collateral flow in bridging vein injury during surgery: an experimental study. Surg Neurol. 44 (2), 158-162 (1995).
  24. Cokluk, C., Aydin, K., Yemisci, M., Colakoglu, S., Kaplan, S. Cortical anastomotic veins occlusion in the rat including the assessment of cerebral swelling. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 203-210 (2006).
  25. Kyrle, P. A., Eichinger, S. Deep vein thrombosis. Lancet. 365, 1163-1174 (2005).
  26. Lindgren, E., et al. Acute symptomatic seizures in cerebral venous thrombosis. Neurology. 95 (12), e1706-e1715 (2020).
  27. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J Vis Exp. (115), e54479(2016).
  28. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  29. Duan, J., et al. Identifying Biomarkers Associated with Venous Infarction in Acute/Subacute Cerebral Venous Thrombosis. Aging Dis. 12 (1), 93-101 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ci ka CVSTwstrzykni cie trombinyzatoka sagitalna g rnaylny zawa m zgubariera krew m zgbarwienie TTC

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.