Kriosekcja syntetycznych implantów biokompatybilnych z użyciem żywicy utwardzalnej UV, do zwiększonej analizy immunofluorescencji

Summary

Praca ta przedstawia protokół kriosekcjonacji wykorzystujący stabilizację żywicą utwardzalną UV, aby zachować integralność interfejsu implantu z tkanką, jednocześnie zachowując dostępność antygenów, umożliwiając niezawodną, wysokorozdzielczą analizę immunofluorescencji syntetycznych implantów polimerowych.

Abstract

Histologiczna ocena syntetycznych, biokompatybilnych implantów stanowi poważne wyzwania techniczne ze względu na niezgodność konwencjonalnych metod przetwarzania tkanek z właściwościami fizykochemicznymi tych materiałów. Obecne podejścia wykorzystujące całkowite osadzenie żywicy zapewniają wystarczającą zachowanie struktury, ale poważnie ograniczają dostępność epitopów, co ogranicza zastosowania immunohistochemiczne niezbędne do charakteryzacji odpowiedzi immunologicznych gospodarza. Natomiast konwencjonalne osadzanie parafiny wykazuje słabą przyczepność do syntetycznych podłoży i ogranicza selekcję przeciwciał do kompleksowego profilowania immunologicznego. Standardowe protokoły kriosekcjonacji zwiększają kompatybilność immunohistochemiczną poprzez poprawę zachowania antygenów; Jednak metody te często skutkują niewystarczającą integralnością strukturalną preparatów zawierających implanty, co obniża ocenę morfologiczną i jakość przekroju. Aby sprostać tym ograniczeniom, opracowano nowy protokół przetwarzania, który wykorzystuje żywicę utwardzalną UV, umożliwiającą selektywną stabilizację konstrukcji tkanek implantowych przed kriosekcją. Metoda ta wykorzystuje żywicę fotopolimeryzowalną, która zapewnia wsparcie mechaniczne, jednocześnie zachowując dostępność epitopów i determinanty antygenowe, które zazwyczaj są utrudnione przez pełną polimeryzację żywicą. Protokół umożliwia powtarzalne generowanie wysokiej jakości przekrojów o optymalnej grubości do oceny immunofluorescencji, osiągając lepszą zachowalność strukturalną w porównaniu ze standardowym mrożonym cięciem bez rozległego sieciowania ograniczającego penetrację przeciwciał w konwencjonalnych próbkach osadzonych w żywicy. To podejście stanowi praktyczne, opłacalne rozwiązanie histologicznego przetwarzania implantów syntetycznych, oferując rozszerzone możliwości analityczne oceny biokompatybilności oraz ułatwiające szczegółową charakterystykę lokalnych odpowiedzi immunologicznych na styku implantów z tkanką.

Introduction

Mikroskopia immunofluorescencyjna to kluczowa technika analityczna w badaniach medycyny regeneracyjnej, ułatwiająca wizualizację architektury tkanek i składu komórkowego za pomocą przeciwciał sprzężonych z fluoroforami. Metodologia ta integruje molekularną specyficzność rozpoznawania immunochemicznego z czułością i wszechstronnością detekcji fluorescencji, umożliwiając szczegółową obserwację rozkładów celów komórkowych w mikrośrodowiskach tkankowych. Podejścia immunofluorescencji obejmują zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie metody znakowania, przy czym protokoły immunofluorescencji pośredniej zapewniają wzmocnienie sygnału poprzez wtórne systemy przeciwciał sprzężone z różnorodnymi fluoroforami obejmującymi widmo widzialne i bliskie podczerwieni¹. Wrodzona zdolność tej metodologii do jednoczesnego wykrywania wielu celów poprzez separację spektralną ułatwia kompleksową charakterystykę fenotypową heterogenicznych populacji komórkowych oraz ich relacji przestrzennych w złożonych mikrośrodowiskach tkankowych².

Możliwości techniczne mikroskopii immunofluorescencyjnej wykraczają poza konwencjonalną lokalizację białek i obejmują ilościowe zastosowania analityczne, w tym pomiary intensywności fluorescencji, analizy kolokalizacyjne oraz oceny rozkładu przestrzennego, kluczowe dla zrozumienia funkcji komórkowej i organizacji tkanek³. W kontekście badań nad biokompatybilnością implantów, analiza immunofluorescencji dostarcza kluczowych informacji na temat odpowiedzi immunologicznych gospodarza, w tym reakcji ciał obcych, kaskad zapalnych oraz procesów integracji tkanek, które decydują o akceptacji lub odrzuceniu implantu na poziomie komórkowym i molekularnym⁴.

Pomyślna implementacja protokołów immunofluorescencji wymaga starannego rozważenia metod przetwarzania tkanek, które zachowują integralność morfologiczną, jednocześnie zachowując sygnał fluorescencjonujący i minimalizując autofluorescencję tła. Tradycyjny wybór ośrodka osadzonego zależy od typu tkanki, wymagań analitycznych w dalszej fazie oraz konkretnych antygenów, które są przedmiotem zainteresowania. W przypadku materiałów syntetycznych i implantów obecna literatura zaleca przede wszystkim całkowite osadzenie żywicy w celu utrzymania stabilności strukturalnej podczas procedur przekrojowania⁵. Jednak takie podejście wiąże się ze znacznymi ograniczeniami ze względu na zapotrzebowanie na specjalistyczne ultramikrotomy i łopatki do sekcjonowania bloków z żywicy polimeryzowanej, co stanowi znaczne inwestycje w sprzęt i wiedzę techniczną. Osadzanie parafiny, zapewniając odpowiednie wsparcie strukturalne dla sekcjonowania, wprowadza zmiany konformacyjne w determinantach antygenowych podczas utrwalania i przetwarzania poprzez rozległe odwodnienie, utwardzanie chemiczne oraz infiltrację rozpuszczalnikami organicznymi, które mogą denaturować białka i maskować epitopy. Przetwarzanie parafiny powoduje również wewnętrzne zakłócenia autofluorescencji, które utrudniają wykrywanie sygnałów i analizę ilościową. Te zmiany wymagają procedur pobierania antygenów, zazwyczaj obejmujących pobranie epitopów indukowanych przez ciepło (HIER) lub proteolityczne indukowane pobieranie epitopów (PIER), aby przywrócić dostępność przeciwciał⁶. Pomimo tych interwencji wiele komercyjnie dostępnych przeciwciał pozostaje niekompatybilnych z próbkami osadzonymi w parafinie, a trudne warunki pobierania mogą dodatkowo obniżać jakość sygnału fluorescencyjnego i wprowadzać artefakty fotobielenia.

Kriosekcja oferuje alternatywną metodologię przetwarzania do zastosowań immunofluorescencyjnych. Do przygotowania tkanek można zastosować dwie metody krioprezerwacji. Pierwsze podejście polega na szybkim krioprezerwacji poprzez bezpośrednie zanurzenie świeżych próbek tkanek w kąpieli izopentanowej wstępnie schładzonej ciekłym azotem, aby osiągnąć temperatury poniżej –20 °C, a następnie sekcjonowanie za pomocą mikrotomów kriostatu wyposażonych w komory cięcia z kontrolowaną temperaturą. Drugi protokół wykorzystuje krótki okres fiksacji paradehydu (PFA) lub formaliny, po którym następuje krioprotekcja poprzez stopniową infiltrację sacharozy przed zamrożeniem. Proces kriokonserwacji tworzy sztywną matrycę, która zachowuje integralność tkanek, jednocześnie zachowując rodzime konformacje białkowe niezbędne do rozpoznawania przeciwciał. Sekcjonowanie mrożone utrzymuje tkanki w stanie niemal naturalnym przy minimalnych modyfikacjach^{chemicznych 7}, co zmniejsza potrzebę stosowania surowych procedur pobierania antygenów i umożliwia zastosowanie szerszego zakresu przeciwciał pierwotnych, w tym tych niekompatybilnych z tkankami osadzonymi w parafinie z powodu maskowania epitopów lub denaturacji⁸.

Proces kriosekcji zazwyczaj wykorzystuje związek optymalnej temperatury cięcia (OCT), rozpuszczalne w wodzie medium osadzające się z alkoholu poliwinylowego i glikolu polietylenowego, które zapewnia wsparcie strukturalne podczas krojonowania, jednocześnie pozostając przezroczystym i kompatybilnym z systemami detekcji fluorescencji. Osadzenie OCT ułatwia generowanie cienkich, jednolitych przekrojów o grubości od 5 do 15 μm, w zależności od specyficznych wymagań analitycznych i cech tkanek⁹. Zachowanie natywnych konformacji białek w mrożonych przekrojach utrzymuje optymalne stosunki sygnału do szumu niezbędne do ilościowej analizy immunofluorescencji, jednocześnie zachowując nienaruszone epitopy umożliwiające wykorzystanie szerszego zakresu przeciwciał pierwotnych, w tym tych niekompatybilnych z tkankami osadzonymi w parafinie⁸.

Jednak sekcjonowanie tkanek mrożonych wiąże się z unikalnymi wyzwaniami technicznymi, szczególnie przy przetwarzaniu syntetycznych materiałów implantowych, które mają odrębne właściwości fizykochemiczne w porównaniu do rodzimych tkanek biologicznych. Różnica w rozszerzaniu cieplnym między syntetycznymi polimerami a biologicznymi interfejsami tkanek podczas zamarzania może prowadzić do lokalnych naprężeń mechanicznych, które naruszają integralność strukturalną i tworzą artefakty przekrojowe¹⁰. Ponadto sztywność wielu materiałów syntetycznych w porównaniu do zamrożonych tkanek biologicznych może powodować ugięcie ostrza podczas cięcia, co prowadzi do nierównej grubości przekroju oraz uszkodzenia zarówno próbki, jak i sprzętu do cięcia. Te ograniczenia techniczne wymagają specjalistycznych protokołów przetwarzania, które mogą uwzględnić unikalne wymagania próbek zawierających implanty, jednocześnie zachowując zalety mrożonego sekcjonowania dla zastosowań immunofluorescencyjnych.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowano protokół kriosekcjonacji łączący selektywną, utwardzalną UV-stabilizację żywicami z kontrolowanymi parametrami przecinkowania kriostatu, umożliwiając wysokorozdzielczą, wieloparametrową analizę immunofluorescencji konstrukcji tkanek implantowych.

Protocol

Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Mayo Clinic pod numerem zatwierdzenia A00003765-18-24. Wszystkie procedury z udziałem syntetycznych implantów biokompatybilnych przeprowadzono w warunkach sterylnych, zgodnie z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przetwarzanie próbek i krioprotekcja

UWAGA: Formalina należy obchodzić wyłącznie w chemicznym okapie i nosić odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE), ponieważ formalina zawiera formaldehyd, silny środek drażniący, uwrażliwiony i rakotwórczy.

1. Utrwalić biokompatybilne biokompatybilne próbki implantów tkankowych w 10% neutralnej buforowanej formalinie na noc w temperaturze 4°C, używając minimum 10 objętości utrwalacza względem objętości tkanki, aby zapewnić pełne zanurzenie i odpowiednią penetrację. Celem tego ograniczonego okresu utrwalenia jest osiągnięcie minimalnego usieciowania przy jednoczesnym zachowaniu morfologii tkanki. (Zobacz Tabelę Materiałów dla materiałów używanych w protokole.)
2. Przenieś próbki do roztworu sacharozy 15% przygotowanej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do inkubacji przez noc w temperaturze 4°C z delikatnym mieszaniem. Zapewnij pełną infiltrację sacharozy, co potwierdza zapadanie się tkanek.
3. Przenieś próbki do roztworu 30% sacharozy w PBS na drugą nocną inkubację w 4°C. Potwierdzić całkowitą równowagę poprzez opuszczenie tkanek na dno pojemnika, co wskazuje na odpowiednią infiltrację sacharozy i wyparcie wody.
4. Przygotuj proporcje objętościowe 1:1 z 30% roztworu sacharozy i związku OCT. Inkubuj próbki w tym medium przejściowym przez 2 godziny w temperaturze 4°C, następnie przenosi się do 100% OCT przez 1 godzinę, aby osiągnąć całkowitą równowagę, co wskazuje jednolicie nieprzezroczysty wygląd tkanki.
5. Próbki należy ostrożnie umieszczać w standardowych krioformach wypełnionych świeżym związkiem OCT, zapewniając optymalną orientację płaszczyzn sekcyjnych. Orientuj się tak, aby interfejs implant-tkanka był dostępny podczas kolejnych zabiegów. Eliminuj pęcherzyki powietrza za pomocą wcześniej schłodzonych kleszczy.
6. Umieść wypełnione krioformy natychmiast na platformie z suchym lodem, aby stworzyć gradient temperatury sprzyjający szybkiemu powstawaniu kryształów lodu od dołu ku górze. Monitoruj przez 10–15 minut aż do całkowitego zastygnięcia, co potwierdza charakterystyczny nieprzezroczysty biały wygląd zamrożonego związku OCT. Przenieś zamarznięte bloki do przechowywania przy temperaturze –80°C lub bezpośrednio do komory kriostatu w celu natychmiastowego cięcia.

2. Ustawienie kriostatu i początkowe sekcjonowanie

1. Utrzymywanie komory z kontrolowaną temperaturą kriostatu na –15°C Zweryfikowanie temperatury za pomocą zintegrowanego monitoringu cyfrowego i wyrównanie równowagi na noc przed wprowadzeniem próbki.
2. Zamontuj nowe jednorazowe ostrza. Ustaw kąt łopatki dla połączonego przekroju materiału syntetycznego i biologicznego zgodnie ze specyfikacją producenta.
3. Pożądana grubość przekroju (50–100 μm) jest programowana do kriostatu przez wybór ustawienia Grubość na panelu sterowania, regulację za pomocą klawiszy strzałek oraz potwierdzenie parametru naciśnięciem klawisza Set .
4. Przesuwaj się przez osadzony preparat, aby osiągnąć ustaloną głębokość odpowiadającą granicy implantu z tkanką. Monitoruj przesuwającą się powierzchnię przekroju, aby zidentyfikować optymalną płaszczyznę do aplikacji żywicy UV, charakteryzującą się subtelnymi zmianami nieprzezroczystości tkanek i początkową ekspozycją na obrzeża implantu, a głębokość jest potwierdzana, gdy te cechy pozostają widoczne na kolejnych przyciętych przekrojach.
   UWAGA: Natychmiast po osiągnięciu krytycznego interfejsu zatrzymać przekrojenie, aby zapobiec przesunięciu się poza docelowy obszar.

3. Aplikacja żywicy utwardzalnej UV

UWAGA: Obchodz się z żywicą utwardzającą się UV-w dobrze wentylowanym miejscu, nosząc odpowiednią ochronę osobistą, chroniąc oczy i skórę przed światłem utwardzającym LED. Żywice te zawierają drażniące, które mogą wywołać reakcje skórne i oczy, a ekspozycja na LED UV może prowadzić do urazów oczu wywołanych UV.

1. Wycinam parafilm nożyczkami do wymiarów 2–3 mm przekraczających obwód implantu. Ostrożnie oddziel od ochronnego papierowego podkładu sterylnymi kleszczemi.
2. Na odsłoniętą powierzchnię parafilmu nasyp 5–10 μL żywicy utwardzanej UV (rysunek 1A). Objętość żywicy jest optymalizowana poprzez wstępne testy, w których dozowywane są stopniowe objętości, a uzyskane rozprzestrzenianie jest wizualnie oceniane, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni próbki bez przepełnienia lub nadmiernego nagromadzenia żywicy zakłócającego przekrojenie.
3. Natychmiast wymień ochronną papierową podkładkę na parafilm z żywicą. Nałóż wałek poliuretanowy (2 cale) o stałym nacisku w nakładających się, równoległych przejściach, a następnie przejścia prostopadłe, aby uzyskać cienką, jednolitą warstwę żywicy (Rysunek 1B).
4. Ostrożnie usuń ochronną warstwę papieru, odsłaniając równomiernie rozłożoną warstwę żywicy. Umieść żywicę-parafilm bezpośrednio nad odsłoniętą powierzchnią implantu, zapewniając precyzyjne wyrównanie z interfejsem implant-tkanka (Rysunek 1C).
5. Nakład poliuretanowy wałek szwowy od środka implantu na zewnątrz, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza i zapewnić bliski kontakt żywicy z powierzchniami syntetycznymi i biologicznymi (Rysunek 1D).
6. Umieść źródło światła UV LED o długości fali 405 nm w odległości 2–3 cm bezpośrednio przy powierzchni implantu. Naświetlaj przez 90 sekund, aby zapewnić pełną polimeryzację, zweryfikowane przez dotykową ocenę twardości żywicy i właściwości nielepkich (Rysunek 1E). Przed fotopolimeryzacją UV załóż osłonę ochronną przed UV, aby osłonić operatora przed szkodliwym narażeniem UV podczas procesu utwardzania żywicy.

4. Odzyskiwanie przekroju i przygotowanie szkiełka

1. Usuń parafilm jednym ciągłym ruchem, aby zapobiec mechanicznemu zakłóceniu granicy żywicy z tkanką. Całkowita przyczepność żywicy potwierdza się poprzez inspekcję odsłoniętej powierzchni pod światłem kriostatu pod kątem jednolitego pokrycia żywicą, braku unoszenia się na krawędzi tkanki oraz braku widocznych pozostałości parafilmu.
2. Próbki przecinają do wcześniej ustalonej grubości 8 μm za pomocą skalibrowanego mechanizmu przesunięcia mikrotomu. Monitoruj każdą przekrojowość pod kątem spójnej grubości i braku artefaktów (ściskanie, rozdarcia, niepełne cięcie). Ustaw płytę antyprzechyłową optymalnie, aby zapobiec zgięciom (Rysunek 1F).
   UWAGA: Stosuje się hydrofilowe, dodatnio naładowane szkiełka samoprzylepne ze szkła, ponieważ zapewniają one lepsze zatrzymanie wymagających próbek, poprawiając przyczepność podczas przeszczepu i późniejszego przetwarzania. Etykieta wykonuje indywidualne slajdy przed przeniesieniem sekcji.
3. Umieść powierzchnię klejącą zamka, zapewniając początkowy kontakt na krawędzi przekroju, a następnie stopniowy kontakt na całej powierzchni. Upewnij się, że powierzchnia żywicy utwardzonej UV przylega do szkiełka, jednocześnie utrzymując powierzchnię tkanki uniesioną do góry dla immunofluorescencji (Rysunek 1G).
4. Delikatnie naciśnij zespół sekcji i suwaka, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza. Zweryfikować prawidłową orientację pod światłem kriostatu, potwierdzając nienaruszoną granicę implantu z tkanką.

5. Przechowywanie i konserwacja

1. Gotowe slajdy umieść w wcześniej oznaczonych pudełkach w temperaturze –20°C, jeśli aplikacje wymagają obróbki w ciągu 72 godzin.
2. Stosuj warunki – 80°C na okresy konserwacji przekraczające tydzień.

6. Protokół barwienia immunofluorescencyjnego

UWAGA: Obchodz się z pepsyną odpowiednim sprzętem ochronnym, ponieważ jest drażniącą skórę i układ oddechowy.

1. Wyciągnij szkiełka ze składu i przenieś do komór wilgotności na 15–20 minut w celu wyrównania temperatury pokojowej.
2. Wykonaj trzy kolejne 2-minutowe cykle prania PBS.
3. Pobieranie antygenów:
   1. Metoda pobierania epitopów indukowanych przez ciepło (HIER): Ustawia przesuwaki poziomo w pojemnikach bezpiecznych dla mikrofalówek z 1x roztworem do odzyskiwania celu. Mikrofala (moc 1000 watów) na dużą moc, przez 15 minut, po czym chłodzenie do temperatury pokojowej.
   2. Metoda pozyskiwania epitopów indukowanych proteolitycznie (PIER): Stosuj 100–150 μL gotowego do użycia roztworu pepsyny na sekcję. Przykryj tymczasowymi plastikowymi pokrywkami i inkubuj w temperaturze 37°C przez 10 minut w nawilżonej komorze.
4. Wykonaj trzy kolejne cykle prania PBS (po 2 minuty każdy).
5. Nałóż 1 ml roztworu blokującego zawierającego 0,1% saponiny i 2,5% normalnej surowicy koziej w PBS. Inkubuj 30 minut w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze.
6. Wykonaj trzy kolejne cykle prania PBS (po 2 minuty każdy).
7. Stosuj roztwory przeciwciał pierwotnych 100 μL w optymalnych stężeniach:
   1. Antykolagen IV dla królika poliklonalnego w rozcieńczeniu 1:100.
   2. Antylamininowy królik poliklonalny w rozcieńczeniu 1:500.
   3. Przeciwciało monoklonalne przeciwko królikom anty-F4/80 w rozcieńczeniu 1:500.
8. Przykryj tymczasowymi plastikowymi pokrywkami i inkubuj przez noc w 4°C w nawilżonych komorach.
9. Wykonaj trzy cykle prania PBS (po 2 minuty każdy).
10. Należy stosować przeciwciała wtórne w stężeniu 10 μg/mL.
    1. Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. IgG Alexa Fluor 488 przeciw kozom
11. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemnych warunkach.
12. Opcjonalne barwienie aglutyniną na kiełki pszenicy (WGA):
    1. Stosuj WGA-Alexa Fluor 647 w stężeniu 5 μg/mL w PBS z 2,5% normalnej surowicy koziej.
    2. Przykryj i wysiądź w temperaturze 37°C przez 30 minut. Wykonaj trzy kolejne 2-minutowe cykle prania PBS.
13. Nakładaj 80 μL twardego materiału montażowego z jądrowym barwikiem przeciwtwardym na sekcję.
14. Przykryj slip szybą, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.
15. Pozwól zjeżdżalniom utwardzać się poziomo w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w ciemności.
16. Przechowuj w temperaturze 4°C przez maksymalnie tydzień, aby uzyskać optymalną jakość obrazowania.

7. Mikroskopia fluorescencyjna i akwizycja obrazów

1. Wykonaj obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z zestawami filtrów producenta: wzbudzenie/emisja 360/460 nm, wzbudzenie/emisja 470/525 nm, wzbudzenie/emisja 545/605 nm, wzbudzenie/emisja 620/700 nm.
2. Obrazy są rejestrowane przez zaznaczenie każdego kanału fluorescencyjnego w menu filtrów oprogramowania mikroskopu. Przed optymalizacją ekspozycji przeprowadza się procedurę balansu czerni, wybierając opcję Adjust Black Balance , aby zapewnić dokładną korektę bazy dla każdego kanału. Parametry ekspozycji są następnie optymalizowane poprzez otwarcie okna Motion Capture , włączenie trybu Live oraz dostosowanie pokręteł Exposure i Light Intensity aż do uzyskania wysokiego stosunku sygnału do szumu bez nasycenia pikseli. Saturacja jest monitorowana za pomocą wyświetlacza Histogramu w oprogramowaniu oraz narzędzia Highlight Saturated Pixels . Każdy kanał jest regulowany niezależnie przed akwizycją obrazu.
3. Wykonaj automatyczne pozyskiwanie kafelków z 10% nakładem między sąsiednimi polami producenta. Utrzymuj automatyczną regulację ostrości przez cały proces akwizycji.

Results

Ocena jakości sekcji i optymalizacja
Po stabilizacji i pokroju żywicą UV na grubości 8 μm, należy zebrać przekroje na klejowe szkiełka i ocenić pod kątem kontroli jakości. Wysokiej jakości przekroje wykazują nienaruszoną morfologię bez znaczących pęknięć czy artefaktów pęknięć, z ciągłą architekturą tkanek i zachowanym interfejsem implant-tkanka (rysunek 2A). Przekroje wykazujące znaczne uszkodzenia strukturalne, w tym pęknięcia lub oddzielenie tkanek od powierzchni imp...

Discussion

Ta metoda stabilizacji żywicy utwardzalnej UV stanowi alternatywne podejście do kriosekcjonowania tkanek osadzonych w OCT zawierających materiały syntetyczne, które w innym przypadku są trudne do przetworzenia przy użyciu standardowych technik sekcji mrożonych. Chociaż dostępne są różne opcje klejów, takie jak naładowane szkiełka, taśmy do łączenia tkanek i inne elementy samoprzylepne, które pomagają zapobiegać odklejaniu się fragmentów tkanek lub delikatnych próbek podczas manipulacji, produkty te zapewniają przyczepnoś...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5W Gooseneck Ultrafioletowe światło 395– 405 nm do utwardzania żywicy	Amazon	UPC ‎ 603335835561
Przeciwciało - Anty-F4/80 (monoklonalne)	Abcam	ab300421	1:500
Przeciwciało – kolagen IV (poliklonalny)	Abcam	ab6586	1:100
Przeciwciało - Donkey Anti-Rabbit IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 ug/mL
Przeciwciało - IgG AlexaFluor 488 dla kóz przeciwkrólików	Invitrogen	A-11008	10 ug/mL
Przeciwciało - Laminina (poliklonalna)	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	Formlabs	FLBMCL01	Materiał biokompatybilny #1
BioMed Durable	Formlabs	FLBMDU01	Materiał biokompatybilny #2
Buforowana 10% formaliny	Kardynał Zdrowia	C4320-101
Filtr BZ-X Cy5	Keyence	OP-87766	Zestaw filtrów
Filtr BZ-X DAPI	Keyence	OP-87762	Zestaw filtrów
Filtr BZ-X GFP	Keyence	OP-87763	Zestaw filtrów
Filtr BZ-X TRITC	Keyence	OP-87764	Zestaw filtrów
Oprogramowanie analizatora BZ-X800	Keyence	BZ-X800	Zintegrowane oprogramowanie
Fisherbrand Premium Coverglass  50 x 24 mm	Fisher Scientific	12-544-14
Drukarka 3D Form4B	FormLabs	F4B-Printer
Zbiornik żywicy Form4	Formlabs	RT-F4-01
Serum koziego	Gibco	16210064
Kriostat HM525 NX	Epredia	956641EC
Domowy piekarnik mikrofalowy	Panasonic	NN-S766BA	Moc wyjściowa 1000 watów
Plastikowe pokrywy IHC-Tek 24 mm x 60 mm	IHC World	IW-2601	Tymczasowe pokrywanie
JDiction Niskolepkowa Żywica UV	Amazon	6974143904430	Wysoka autofluorescencja
Keyence BZ-X800	Keyence	BZ-X800
Zróbmy żywicę UV przezroczystą i twardą formę	Amazon	ALR00038	Wysoka autofluorescencja
Czyścimy żywicę UV o wysokiej lepkości typu	Amazon	ALR00048
Matsunami MAS Mikro Slide Szklane Slajdy	Dostawa dla nowicjuszy	SUMAS1190	Suwak samoprzylepny
Implant chirurgiczny Medpor	Stryker	8662	Materiał biokompatybilny #3
Mr. Resin UV Resin Crystal Clear	Amazon	B08FRF9QTB	Wysoka autofluorescencja
Mikrotomowa łopatka MX35 Ultra	Epredia	3053835
Film laboratoryjny Parafilm M	Parafilm	P7543-1EA
Pepsyna	Sigma	R2283-15ML
Fosforanowa buforowana sól fizjologiczna pH 7,4	Sigma	P3813
Plan Apo & lambda; 40X	Keyence	BZ-PA40	Soczewka obiektywowa
Plan Apo & lambda; 4X	Keyence	BZ-PA04	Soczewka obiektywowa
Poliuretanowy wałek do łączenia szwów	Amazon	682698799567
ProLong szklany uchwyt antyfade z bejcą NucBlue	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 Contrastain
Saponin	Millipore	558255-100GM
StainTray	Simport	M920-2
Sterylna powłoka silikonowa	Bentec	PR72034-51N
Roztwór do odzyskiwania celu, cytrynina pH6	Agilent	S236984-2
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583
Aglutynina kiełków pszenicy AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5 ug/mL