Trójwymiarowa wizualizacja naczyń limfatycznych w ludzkiej skórze i ich zmian strukturalnych podczas obrzęku limfatycznego

Podsumowanie

W tym przypadku trójwymiarowa wizualizacja struktury naczyń limfatycznych w ludzkiej skórze została wykonana za pomocą mikroskopii konfokalnej lub arkuszowej po zastosowaniu trzech odrębnych technik oczyszczania tkanek. Połączenia tych metod z barwieniem immunohistochemicznym dostarczają wglądu w zmiany funkcjonalne naczyń limfatycznych podczas postępu obrzęku limfatycznego.

Streszczenie

Naczynia limfatyczne skóry, składające się z naczyń włosowatych i naczyniów zbiorczych, odgrywają kluczową rolę w usuwaniu odpadów i odpowiedziach immunologicznych, a także są niezbędne do utrzymania homeostazy tkanek. Jednak ludzka skóra, z trzema warstwami – naskórkiem, skórzą i tłuszczem podskórnym – zawiera gęstą macierz zewnątrzkomórkową bogatą w kolagen, więc wizualizacja sieci limfatycznych w trzech wymiarach jest trudna. Aby rozwiązać to ograniczenie, artykuł wprowadza trzy odrębne metody, z których każda jest dostosowana do konkretnych cząsteczek i celów eksperymentalnych, dla trójwymiarowej wizualizacji ludzkiej skóry limfatycznej za pomocą odczynników oczyszczających tkanki w połączeniu z mikroskopią konfokalną lub świetlną. Poprzez ukierunkowanie na cząsteczki złączy adherens w komórkach śródbłonka limfatycznego za pomocą immunohistochemii, oceniono zmiany strukturalne o wyraźnych implikacjach funkcjonalnych, szczególnie charakterystyczne przemodelowanie złączeń naczyń włosowatych przypominające guzik na zamek włoski, w tkankach skóry pochodzących od pacjentów z wtórnym obrzękiem limfatycznym. Ta trójwymiarowa technika wizualizacji ujawnia struktury naczyniowe, których nie można dostrzec za pomocą konwencjonalnej analizy przekroju tkanki histologicznej, co poszerza wiedzę o strukturze i funkcji naczyń limfatycznych.

Wprowadzenie

Rośnie zainteresowanie funkcją naczyń limfatycznych od czasu uznania ich roli w utrzymaniu homeostazy skóry, wykraczającej poza dobrze udokumentowane zaangażowanie w przerzuty nowotworowe ^1,2. Naczynia limfatyczne są strukturalnie podzielone na naczynia włosowate i naczynia zbiorcze, z których każdy posiada odrębne cechy. Naczynia włosowate limfatyczne składają się z jednowarstwowej struktury utworzonej przez komórki śródbłonka limfatycznego i służą jako początkowe miejsca zbierania płynu śródmiąższowego, produktów przemianownych oraz komórek odpornościowych. Natomiast naczynia limfatyczne zbierające mają strukturę dwuwarstwową z komórkami mięśni gładkich otaczających warstwę śródbłonka limfatycznego, co umożliwia aktywny transport płynu limfatycznego zbieranego przez sieć kapilarną w kierunku centralnego krążenia³. Modele mysie zostały wykorzystane do wyjaśnienia cech strukturalnych, szczególnie naczyń limfatycznych oskrzeli i wykazały, jak stany zapalne wywołują przebudowę strukturalną⁴. Wcześniejsze badania wykazały, że zapalenie wywołane promieniowaniem ultrafioletowym powoduje nieprawidłowe rozszerzanie naczyń limfatycznych, co osłabia ich funkcję gromadzenia płynów. Zidentyfikowano mechanizmy molekularne leżące u podstaw tej dysfunkcji, wykazując konkretnie, że zwiększona ekspresja VEGF-A w połączeniu ze zmniejszoną ekspresją VEGF-C napędza te zmiany strukturalne ^5,6,7.

Chociaż techniki wizualizacji trójwymiarowej znacząco przyczyniły się do rozwoju wiedzy o sieci limfatycznej w modelach mysich ^8,9, porównywalna analiza strukturalna naczyń limfatycznych człowieka pozostaje wyzwaniem. Ta luka analityczna wynika z trudności w pracy z ludzkimi tkankami, w tym ograniczonej dostępności próbek oraz technicznych problemów związanych z uzyskaniem kompleksowego obrazowania trójwymiarowego. W szczególności skóra, charakteryzująca się trzywarstwową strukturą obejmującą naskórek, skórę i tkankę podskórną, pełniącą rolę bariery wobec środowiska zewnętrznego, stanowi większe wyzwania niż inne narządy miękkie. Ponadto ludzka skóra stanowi szczególne wyzwania analityczne w porównaniu do modeli myszy, w tym większą grubość tkanek, co utrudnia głębokie przenikanie obrazowania. Ponadto obfite składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, szczególnie kolagen, wraz z ich modyfikacjami strukturalnymi powiązanymi z wiekiem, tworzą bariery optyczne, które zmniejszają skuteczność nowych technik oczyszczania tkanek, które zrewolucjonizowały obrazowanie limfatyczne u myszy¹⁰.

Różne środki oczyszczające tkanki były wcześniej testowane w celu wizualizacji naczyń włosowatych skóry u ludzi, co wykazało ich kompatybilność z tkankami¹¹. Po tych badaniach odczynniki oczyszczające tkanki zostały z powodzeniem wykorzystane do wizualizacji naczyń limfatycznych ludzkiej skóry w trzech wymiarach¹². Skupiając się na połączeniach przylegających komórek śródbłonka limfatycznego, zidentyfikowano zmiany strukturalne w naczyniach limfatycznych związane z postępem obrzęku limfatycznego¹³. Celem tego artykułu jest szczegółowe opisanie procedur trójwymiarowej wizualizacji naczyń limfatycznych skóry ludzkiej skóry za pomocą kombinacji trzech technik oczyszczania skóry, a także mikroskopii konfokalnej i mikroskopii świetlnej oraz barwienia immunohistochemicznego dostosowanego do konkretnych celów badawczych. W tym badaniu, choć koncentrujemy się wyłącznie na świeżych tkankach skóry ludzkiej, które zostały utrwalone w dniu wycięcia i nie przeszły cykli zamarzania i rozmrażania, techniki te dostarczają wglądu nie tylko w zmiany strukturalne naczyń limfatycznych podczas chorób i starzenia, ale także na związane z nimi zmiany funkcjonalne.

Protokół

Próbki skóry osób pozyskano ze Szpitala Uniwersyteckiego w Chiba (Chiba, Japonia). Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową Szpitala Uniwersyteckiego w Chiba oraz Shiseido Global Innovation Center, a wszyscy badani wyrazili pisemną świadomą zgodę. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wstępne przetwarzanie próbek skóry ludzkiej

1. Usuwanie tkanki podskórnej z usuniętych próbek po pobraniu.
   UWAGA: Przerwa między wycięciem a przejęciem skóry wynosiła około h. Podczas transportu tkanka była zanurzana w DMEM i przechowywana na okładach lodowych.
2. Ułóż próbki z naskórkiem do dołu na płytę gorącą o temperaturze 60 °C przez 45 sekund, aby oddzielić naskórek i skórę skórną.
3. Natychmiast zanurz okazy w lodowatym PBS.
4. Oddziel naskórek od skóry za pomocą pęsety.
5. Utrwal części skóry w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4°C przez 16 godzin, a następnie przed użyciem umyj PBS.
   UWAGA: Po utrwaleniu próbki przechowywano w PBS w temperaturze 4 °C, a etapy immunobarwienia rozpoczęto w ciągu kilku miesięcy.
   UWAGA: Roztwór PFA jest toksyczny. Całe przygotowanie i obsługa muszą odbywać się w okapie wyparowym, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.

2. Immunodbarwienie pełne w połączeniu z odczynnikami oczyszczającymi

1. Technika iDISCO
   1. Przycinaj okazy do około 5 mm × 5 mm × 5 mm.
   2. Przenieś próbki do 5% Triton X-100 i 2,5% Tween 20 w PBS na orbitalnym wstrząsie ustawionym na 50 obr./min przy 24 °C przez 16 godzin w celu permeabilizacji.
   3. Przemyj próbki PBS w temperaturze 24 °C przez 1 godzinę, powtarzając proces trzy razy.
   4. Zanurz próbki w świeżo przygotowanym buforze blokującym A (1% BSA, 0,1% Tween 20, 0,03% azyku sodu w PBS) na orbitalnym shakerze ustawionym na 50 rpm w temperaturze 24 °C przez 72 godziny.
   5. Inkubuj próbki z pierwotnym przeciwciałem przeciwko podoplaninie (1:100) w buforze blokującym A na orbitalnym shakerze ustawionym na 50 obr./min przy 37 °C przez 72 godziny.
   6. Przemyj próbki buforem A (0,1% Tween-20 w PBS) w temperaturze 24 °C przez 1 godzinę, powtarzając proces trzy razy. Następnie utrzymywać próbki w buforze płukającym A na orbitalnym potrząsaczu ustawionym na 50 obr./min przy 4 °C przez 72 godziny.
   7. Inkubuj próbki z wtórnym przeciwciałem przeciwko myszemu IgG sprzężonym z Alexa Fluor 647 (1:1000) w buforze blokującym A na orbitalnym wstrząsie ustawionym na 50 obr./min przy 37 °C przez 72 godziny.
   8. Powtórz krok 1.6.
   9. Inkubuj okazy z 50% MeOH w temperaturze 24 °C przez 3 godziny.
   10. Inkubuj okazy z 70% MeOH w temperaturze 24 °C przez 3 godziny.
   11. Inkubuj okazy w 100% MeOH w temperaturze 24 °C przez 16 godzin.
   12. Inkubuj próbki dichlorometanem w temperaturze 24 °C przez 15 minut, powtarzając proces dwukrotnie.
   13. Preparaty należy usunąć z eterem dibenzyloowym w temperaturze 24 °C przez 16 godzin.
       UWAGA: Jeśli tkanka nie stała się przezroczysta w tym momencie, dalsze oczekiwanie nie przyniesie istotnej poprawy.
   14. Wykonaj zdjęcia okazów mikroskopem świetlnym.
       UWAGA: Używaj arkusza świetlnego z celem EC Plan-Neofluar 5×/0.16; ustawij oświetlenie (wzbudzanie) na 63 nm i detekcję na 648 nm; uzyskaj stos Z o kroku 5,8 μm.
       UWAGA: Metanol, dichlorometan i eter dibenzylowy są niebezpieczne. Całe przygotowanie i obsługa muszą odbywać się w okapie wyparowym, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.
2. Odczynnik Rapiclear 1.52
   1. Przycinaj okazy do około 5 mm × 5 mm × 2 mm.
   2. Przenieś próbki do 2% Triton-X 100 w PBS na orbitalnym wstrząsie ustawionym na 50 rpm przy 24 °C przez 16 godzin w celu permeabilizacji.
   3. Zanurz próbki w świeżo przygotowanym buforze blokującym B (5% surowicy osła i 1% Triton-X 100 w PBS) na orbitalnym shakerze ustawionym na 50 rpm przy 4 °C przez 16 godzin.
   4. Inkubuj próbki z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko podoplaninie i VE-kadherynie (oba w 1:100) w buforze blokującym B na wstrząsie orbitalnym ustawionym na 50 obr./min przy 4 °C przez 72 godziny.
   5. Przemyj próbki buforem B (3% NaCl i 0,2% Triton-X 100 w PBS) w temperaturze 24 °C przez 1 godzinę, powtarzając proces trzy razy. Następnie utrzymywać próbki w buforze B na orbitalnym shakerze ustawionym na 50 obr./min przy 4 °C przez 16 godzin.
   6. Przemyj okazy PBS w temperaturze 24 °C przez 1 godzinę.
   7. Inkubuj próbki z wtórnymi przeciwciałami przeciwko myszemu IgG i króliczemu IgG, sprzężonym odpowiednio z Alexa Fluor 647 i 568 (oba w rozdzielczości 1:1000), w blokującym buforze B na orbitalnym shakerze ustawionym na 50 obr./min przy 4 °C przez 16 godzin.
   8. Powtórz kroki 1.5. oraz 1.6.
   9. Próbki przeczyść co najmniej 5-krotnie większą objętością próbki niż Rapiclear 1.52 w temperaturze 24 °C przez 16 godzin.
      UWAGA: Usunięcie obwodowych obszarów tkanki zaobserwowano w mniej niż 1 godzinę.
   10. Osadzić wyczyszczone próbki w komorze żelu polidimetylosiloksanu umieszczonej na pokrywie z nowym odczynnikiem Rapiclear 1.52.
   11. Zrób zdjęcia okazów mikroskopem konfokalnym.
       UWAGA: Użyj mikroskopu konfokalnego z obiektywem Plan-Apochromat 10×/0,45 M27; ustawić wzbudzenie na 633 nm i 561 nm oraz zakres detekcji 641-754 nm i 566-628 nm, z detektorem GaAsP; uzyskaj stos Z o kroku 3,15 μm.
3. Technika CUBIC
   1. Przycinaj okazy do rozmiarów około 5 mm × 5 mm × 3 mm.
   2. Zanurz próbki w 50% CUBIC-L w temperaturze 24 °C przez 24 godziny jako wstępne przygotowanie do delipidacji.
   3. Przenieś próbki do 100% CUBIC-L na orbitalnym shakerze ustawionym na 50 obr./min przy 37 °C przez 7 dni w celu delipidacji.
   4. Myj próbki PBS w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
   5. Zanurz próbki w świeżo przygotowanym buforze blokującym A na orbitalnym shakerze ustawionym na 50 rpm przy 24 °C przez 72 godziny.
   6. Inkubuj próbki z pierwotnym przeciwciałem przeciwko VE-kadherynie, podoplaninie i CD31 (odpowiednio 1:100, 1:100 i 1:200) w blokującym buforze A na orbitalnym wstrząsie ustawionym na 50 obr./min przy 37 °C przez 72 godziny.
   7. Przemyj próbki buforem A w temperaturze 24 °C przez 1 godzinę. Powtórz proces trzy razy, a następnie utrzymuj próbki w buforze płukającym A na orbitalnym wstrząsie ustawionym na 50 obr./min przy 4 °C przez 72 godziny.
   8. Inkubuj próbki z wtórnymi przeciwciałami przeciwko myszym IgG, króliczym IgG i owczym IgG, sprzężonym odpowiednio z Alexa Fluor 647, 568 i 488 (wszystkie w 1:1000), w blokującym buforze A na orbitalnym shakerze ustawionym na 50 obr./min przy 37 °C przez 72 godziny.
   9. Powtórz krok 3.7.
   10. Preparaty przedczyście przecież 50% CUBIC-R+(M) w temperaturze 24 °C przez 16 godzin.
   11. Preparaty należy wyczyścić 100% CUBIC-R+(M) w temperaturze 24 °C przez 16 godzin.
       UWAGA: Jeśli tkanka nie stała się przezroczysta w tym momencie, dalsze oczekiwanie nie przyniesie istotnej poprawy.
   12. Zrób zdjęcia okazów mikroskopem konfokalnym.
       UWAGA: Użyj mikroskopu konfokalnego z obiektywem Plan-Apochromat 20×/0.8 M27; ustaw wzbudzenie na 633 nm, 561 nm i 488 nm oraz zakres detekcji 641-754 nm, 566-628 nm i 479-550 nm, za pomocą detektora GaAsP; uzyskaj stos Z o kroku 0,78 μm.

Wyniki

Różnica w przepuszczalności światła przez oczyszczoną tkankę ludzkiej skóry z naskórkiem i bez niego
Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne fotografie próbek ludzkiej skóry z naskórkiem i bez niego, po permeabilizacji i oczyszczeniu odczynnikiem Rapiclear 1.52. Usuwanie naskórka zwiększa przezroczystość tkanek poprzez eliminację melaniny, silnego pochłaniacza światła, co potwierdza lepsza widoczność czarnej linii pod próbkami.

Trójwym...

Dyskusja

Trójwymiarowa wizualizacja sieci limfatycznych w tkankach biologicznych jest niezwykle istotna dla zrozumienia ich cech strukturalnych i funkcji fizjologicznych, a także zmian patologicznych. Protokół ten przedstawia trzy odrębne metody oczyszczania tkanek zoptymalizowane pod kątem ludzkiej skóry, z których każda jest dostosowana do konkretnych celów obserwacyjnych.

Usunięcie naskórka uważane jest za kluczowy krok w eliminacji melaniny, która zmniejsza przezroczystość tkanek i zakłóca ocenę hi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało przeciw CD31	R& D Systems	AF806	rozcieńczenie w 1:200
Przeciwciało przeciwpodoplaninowe	Dako	M3619	rozcieńczenie w 1:100
Przeciwciało przeciwciało przeciw VE-kadherynie	Technologia sygnalizacji komórkowej	#2500	rozcieńczenie w 1:100
CUBIC-L	Przemysł Chemiczny Tokio	T3740
SZEŚCIENNY-R+(M)	Przemysł Chemiczny Tokio	T3741
DMEM, niska glukoza, pirokrowian	Thermo Fisher SCIENTIFIC	11885084
Przeciwciało wtórne o silnej adsorbacji krzyżowej przeciwciała przeciw mysłom IgG (H+L) osioł, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-31571	rozcieńczenie przy 1:1000
Przeciwciało przeciwwtórne przeciwciało przeciw IgG (H+L) przeciwciału przeciw królikom osiołkiemu przeciwciału przeciw królikom, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A10042	rozcieńczenie przy 1:1000
Przeciwciało przeciwwtórne przeciw Adsorbacji IgG (H+L) przeciwciała przeciw owcom przeciwowczego, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-11015	rozcieńczenie przy 1:1000
Rapiclear 1.52	Laboratorium Sunjin	RC152001
Mikroskop ZEISS Lightsheet Z.1	Carl Zeiss
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy ZEISS LSM 880	Carl Zeiss