Test FRET na pojedyncząłce umożliwia ilościową analizę wyżarzania pośredniczonego przez Hfq pomiędzy bakteryjnymi sRNA a mRNA, umożliwiając pomiar kinetyki interakcji i stabilności. Reprezentatywne wyniki pokazują, jak długość nasion, motywy wiązania Hfq oraz rozmieszczenie motywów wpływają na powstawanie dupleksów RNA.
Artykuł badawczy
Wpływ długości nasion i motywów wiązania na wyżarzanie sRNA-mRNA podlegane Hfq analizowane za pomocą pojedyncząsteczkowego FRET
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Określenie reguł regulujących wyżarzanie małych bakteryjnych RNA (sRNA) a ich celami mRNA jest trudne, ponieważ te RNA są wysoce heterogeniczne pod względem sekwencji i struktury. Aby rozplątać wkład poszczególnych cech, systematycznie zmienialiśmy kluczowe determinanty, w tym siłę ziaren, motywy wiązające Hfq oraz odstępy między nimi. Wpływ tych cech na stabilność dupleksu sRNA-mRNA testowano za pomocą pojedyncząsteczkowego transferu energii rezonansu Förstera (smFRET), który umożliwia monitorowanie poszczególnych cząsteczek RNA w skali milisekundowej oraz umożliwia dostęp do dynamicznych zdarzeń często ukrytych w testach zespołowych.
Wykazujemy, że krótkie regiony nasienne (4-5 bp) tworzą niestabilne, krótkotrwałe kompleksy, podczas gdy dłuższe nasiona (8-10 bp) dają stabilne dupleksy. Rozszerzenie motywów wiążących Hfq lub wprowadzenie przekładu między miejscami wiązania na mRNA dodatkowo wydłużyło żywotność interakcji, podkreślając znaczenie siły i układu przestrzennego motywu w efektywności wyżarzania pośredniczonej przez Hfq. Ponadto to podejście zapewnia solidne i powtarzalne ramy do analizy dynamiki interakcji RNA-RNA z rozdzielczością pojedynczą cząsteczką oraz do badania mechanizmów chaperonów RNA.
Wprowadzenie
Ekspresja genów bakteryjnych jest szeroko regulowana na poziomie posttranskrypcyjnym przez małe RNA. Te krótkie (zazwyczaj 50-300 nt) RNA działają poprzez parowanie zasad z docelowymi mRNA1. W wielu przypadkach sRNA wyżarzają się z miejscami wiążącymi rybosomy, aby tłumić translację lub wywołać rozpad mRNA poprzez rekrutację RNaz 2,3. Chociaż te interakcje były szeroko badane za pomocą testów genetycznych i biochemicznych, większość dostępnych podejść sugeruje regulację pośrednio z efektów ustalonych na poziomy RNA lub produkcję białek, co utrudnia rozróżnienie leżącej u podstaw dynamiki wiązania.
Efektywna regulacja celów często wymaga chaperona RNA Hfq, małego białka podobnego do Sm w heksamerze 4,5. Hfq wydłuża okres półtrwania sRNA, chroniąc je przed nukleazami6 i promuje wyżarzanie z docelowymi mRNA 7,8. Hfq realizuje te funkcje poprzez trzy różne powierzchnie wiążące RNA, o różnych preferencjach: ściana dystalna rozpoznaje motywy AAN zwykle występujące w mRNA, ściana bliższa wiąże sekwencje bogate w U typowe dla terminatorów sRNA, a krawędź oddziałuje elektrostatycznie z kręgosłupami RNA9. Hfq jednak występuje w znacznie mniejszej ilości niż całkowita pula oddziałujących RNA10,11. Pomimo tego pozornego ograniczenia, nowo zsyntetyzowane sRNA szybko odnajdują swoje cele i wywołują regulację w ciągu kilku minut od transkrypcji12. Ten paradoks sugeruje, że interakcje RNA-Hfq są wysoce dynamiczne, a RNA nieustannie łączą się i dysocjują, zamiast pozostawać związane w stabilnych kompleksach13,14. Zrozumienie, jak takie przejściowe interakcje prowadzą do niezawodnej regulacji, wymaga eksperymentalnego dostępu do indywidualnych zdarzeń wiązań, a nie średnich populacji.
Interakcje między sRNA a mRNA są pośredniczone przez niedoskonale komplementarne sekwencje nasione, które muszą lokalizować swoje dopasowane miejsca w mRNA, często długim i silnie zstrukturyzowanym. Ponadto odległość między regionem nasiona sRNA a miejscem wiązania Hfq na mRNA może się znacznie różnić o15, co dodatkowo komplikuje proces wyżarzania. Hfq pomaga pokonać te wyzwania, elastycznie przekazując sRNA między potencjalnymi miejscami wiązania na celu, zwiększając tym samym prawdopodobieństwo napotkania właściwego regionu parowania16. Parowanie pośredniczone przez Hfq może również przemodelować lokalne struktury mRNA, tymczasowo rozwijając obszary sparowane zasadami i odsłaniając sekwencje, które inaczej były niedostępne. Takie przebudowy mogą jednak prowadzić do nieproduktywnych lub nieudanych zdarzeń wyżarzania. Te przejściowe interakcje mogą być czasem stabilizowane przez silne motywy wiązania Hfq znajdujące się w pobliżu miejsca parowania17. Pomimo tej elastyczności, nie wszystkie spotkania sRNA-mRNA prowadzą do stabilnej formacji dupleksów, a czynniki decydujące o efektywności wyżarzania pozostają słabo poznane. W szczególności pozostaje niejasne, w jaki sposób poszczególne determinanty sekwencji wpływają ilościowo na czas życia wiązania i złożoną stabilność.
Tutaj ustanowiliśmy minimalnie zrekonstytuowany system pojedynczej cząsteczki, który umożliwia stopniową manipulację determinantami sekwencji oraz bezpośrednie pomiary kinetyki wyżarzania za pomocą smFRET. W tym systemie zaprojektowaliśmy pary RNA z początkowo nieefektywnym wyżarzeniem i systematycznie zmieniliśmy kluczowe cechy, w tym wytrzymałość nasien, siłę motywu wiązającego Hfq oraz odstępy między tymi miejscami, aby rozłożyć na czynniki pierwsze, jak poszczególne parametry wpływają na stabilność dupleksu. Poprzez izolację określonych cech sekwencyjnych w kontrolowanym systemie in vitro , podejście to umożliwia mechanistyczną analizę reguł celowania w sRNA, które trudno rozplątać in vivo ze względu na złożoność sieci i pośrednie efekty regulacyjne.
Protokół
Protokół ten opisuje test FRET na pojedyncząłce do monitorowania wyżarzania sRNA-mRNA. Obejmuje procedury projektowania, syntezy RNA modelu, pasywacji i funkcjonalizacji szkiełek, obrazowania pojedynczych cząsteczek oraz analizy danych ilościowych.
Przygotowanie RNA
Projektuj sekwencje sRNA i mRNA in silico. Każde sRNA powinno zakończyć się terminatorem transkrypcyjnym i zawierać motyw wiążący Hfq bogaty w U oraz sekwencję nasienną uzupełniającą docelowe mRNA. Odpowiadające mu mRNA powinno zawierać powtórzenia AAN pełniące rolę motywu wiążącego Hfq oraz sekwencję uzupełniającą region nasiona sRNA. Sekwencje poza wiązaniem Hfq są losowe, unikając motywów AAN i traktów bogatych w U, aby zapobiec niezamierzonym interakcjom Hfq. Dodaj sekwencję komplementarną na 3' końcu mRNA, aby umożliwić unieruchomienie powierzchni podczas obrazowania. Przewiduj struktury wtórne RNA, z wyłączeniem sekwencji komplementarnej z linką, używając struktury RNA przez serwer WWW lub lokalnie18. Do analizy webowej przesłaj sekwencje FASTA na serwer RNAstructure (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) i wybierz Przewidywanie struktury wtórnej. Używaj domyślnych parametrów (temperatura 37 °C, brak ograniczeń składania). Po obliczeniach przeanalizuj schemat struktury oraz prawdopodobieństwo fałdowania. Regiony były klasyfikowane jako zakryte, jeśli nukleotydy w nasionie lub motywie wiążącym Hfq miały przewidywane prawdopodobieństwo parowania zasad >60%. Sekwencje przekraczające ten próg zostały przeprojektowane.
Przygotuj szablony DNA do transkrypcji in vitro poprzez rozszerzanie nakładających się oligonukleotydów za pomocą polimerazy DNA, zgodnie z protokołem producenta. Stężenie zapalnika wynosiło 3 μM każda. Program termocyklera był stosowany zgodnie z zaleceniami producenta, z wyjątkiem zmniejszenia liczby cykli wzmacniających do 8, co wystarczało do wydłużenia zapalników.
Przepisuj RNA w temperaturze 37 °C przez 3 godziny do nocy za pomocą polimerazy RNA T7 w buforze transkrypcyjnym 1× (80 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM spermydyny, 10 mM NaCl), uzupełnionej 1 mM NTP każda, 40 mM DTT i 30 mMMgCl2. Zatrzymaj reakcję, dodając EDTA do końcowego stężenia 30 mM. Do wytrącenia RNA należy dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc (pH 5,4), a następnie 2,5-3 objętości ≥99% etanolu. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę. Pellet RNA przez wirowanie w ≥20 000 × g przez 35 minut w temperaturze 4 °C. Usuń supernatant, przemyj granulek 70% etanolem i krótko susz na powietrzu. Rozpuść pellet RNA w 20 μL mocznika o pojemności 8 M i podgrzewać w temperaturze 90 °C przez 2 minuty. Oczyszcz RNA na żelach poliakrylamidowych o stężeniu 8% zawierających mocznik 8 M. Wyciąć interesujące pasma i eluować RNA przez noc w buforze elucyjnym (0,3 M octana sodu, pH 5,4, 1 mM EDTA). Odzyskaj RNA przez wytrącanie etanolem (zgodnie z instrukcjami dotyczącymi wytrącenia DNA) i rozpuszczaj granulek w wodzie wolnej od nukleazy.
Aby przygotować RNA do znakowania fluorescencyjnego, wykonaj transkrypcję in vitro zgodnie z opisaniem, uzupełniając reakcję 32 mM GMP, aby uzyskać transkrypcje zawierające monofosforan o średnicy 5'. Traktuj RNA karbodiamidem19 (EDC) i imidazolem, aby wprowadzić grupę aminową na końcu 5' (5'). Inkubuj sRNA w buforze węglanowo-wodorowęglanowym (pH 8,5) z esterem Alexa Fluor 555 lub Cy3 NHS, zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyść zmodyfikowane RNA za pomocą kolumn spinowych chromatografii, wytrącić się z etanolem i rozpuścić granulat w wodzie wolnej od nukleazy. Określ wydajność znakowania spektrofotometrycznie, mierząc absorpcję przy 260 nm oraz na maksymalnej absorpcji specyficznej dla barwnika za pomocą Nanodropa lub równoważnego spektrofotometru. Oblicz stężenia RNA i barwników za pomocą prawa Beer-Lamberta oraz odpowiednich współczynników wymierania dostarczonych przez producenta fluoroforu. Efektywność znakowania definiowana jest jako molowy stosunek barwnika do RNA i rutynowo zbliżała się do 100%. Oznaczone RNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
Uporządkuj oligonukleotydy DNA zawierające 3′-biotynową część oraz 5′-amino-C6 linker. Wytrącaj DNA za pomocą etanolu i octana sodu, jak opisano powyżej. Oznacz grupę aminową esterem NHS Cy5 w buforze węglanowo-wodorowęglanowym (pH 8,5) zgodnie z zaleceniami producenta. Określ stężenie znakowanego DNA spektrofotometrycznie, jak opisano powyżej. Oznakowane DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C.
Oczyszczanie Hfq
Hodować komórki Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB przenoszące plazmid ekspresji Hfq pET21b-EcHfq, w których gen E. coli hfq jest wyrażany z promotora indukującego IPTG. Hfq wyraża się bez tagu powinowactwa; natywne białko zawiera wystarczającą ilość powierzchniowo wystawionych reszt histydynowych, umożliwiając oczyszczenie za pomocą chromatografii powinowactwaNi 2+ . Komórki hodowlane w 1 L podłoża LB-Miller uzupełnionego ampicyliną o 100 μg/mL w temperaturze 37 °C do OD600 0,6. Indukuj ekspresję Hfq, dodając IPTG do końcowego stężenia 1 mM i inkubuj przez 4 godziny w 37 °C. Pobierz komórki przez wirowanie w 5 000 × g przez 10 minut, następnie ponownie zawiesij granulat w 50 mL buforu lizyzującego (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 250 mM MgCl2), 1 mM 2-merkaptoetanol, Uwaga: 2-merkaptoetanol jest toksyczny, obsłuż w okapie spalinowym). Analizuj komórki przez sonifikację na lodzie, przy użyciu pulsu na 50% cyklu pracy. Stosuj trzy impulsy po 40 sekund z 1-minutowymi przerwami chłodzenia na lodzie między impulsami. Wiruj lizat w 27 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Podgrzej supernatant w 85 °C przez 45 minut, a następnie ponownie w tych samych warunkach. Powstały supernatant należy poddać RNazie A (30 μg/mL) i DNazie I (5 U/mL) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając, a następnie przefiltruj przez filtr 0,45 μm. Aplikuj klarowany lizat do kolumny chromatografii powinowactwowej z wstępnym naładowaniem NiSO4. Przemyj kolumnę buforem (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 0,5 mM 2-merkaptoetanol). Eluć białko za pomocą tego samego buforu o liniowym stężeniu gradientu imidazolu od 10 mM do 1 M. Zgrupować frakcje zawierające Hfq i załadować je do kolumny chromatografii HiLoad 16/600 Superdex 200 z wykluczeniem wielkości, wyrównanej buforem HB (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NH4Cl, 1 mM EDTA, 10% glicerolu). Obsługuj kolumnę zgodnie z instrukcjami producenta. Reprezentatywna analiza SDS-PAGE oczyszczania Hfq przedstawiona jest na Rysunku Uzupełniającym 1. Skoncentruj oczyszczone białko, jeśli jest to konieczne, za pomocą filtrów odśrodkowych (3 kDa MWCO). Oczyszczone aliquoty Hfq można przechowywać w temperaturze -80 °C.
Eksperymenty z pojedyncząstą cząsteczką
Pasywacja przesuwań kwarcowych20
Przygotuj szkiełki kwarcowe z pięcioma równoległymi otworami (średnica 0,8 mm) wywierconymi przy każdej długiej krawędzi. Włóż szkiełka kwarcowe i pokrywki do słoika do barwienia Hellendahl (uchwyt na preparat) i sonikuj w acetonie przez 20 minut (uwaga: aceton jest łatwopalny i lotny; pracuj w okapie oparowym). Powtórz proces czyszczenia metanolem (uwaga: metanol jest toksyczny i łatwopalny; uchwyt w okapie oparowym). Dokładnie opłucz preparaty wodą i soniknij w 1 M KOH przez 1 godzinę (uwaga: KOH jest żrący, zakładaj rękawiczki i ochronę oczu). Płucz szkiełka wodą, a następnie sekwencyjnie sonikuj acetonem i metanolem przez 20 minut każda. Powtórz czyszczenie KOH z użyciem 5 M KOH przez 1 godzinę, po czym dokładnie płukaj wodą (Uwaga: Obchodz się z koncentrowanym KOH odpowiednim sprzętem ochronnym). Susz slajdy na powietrzu. Przygotuj czysty zestaw słoików do bejcowania Hellendahl i opłucz je heksanem (Uwaga: heksan jest wysoce łatwopalny; trzymaj się w okapie oparowym), a następnie pozwól wyschnąć na powietrzu. Włóż szkiełka do uchwytu i dwukrotnie przepłucz je heksanem. Dodaj 75 ml heksanu do uchwytu szkiełka i ostrożnie wstrzykni 50 μL dichlorodimetylosilanu (DMDCS) pod powierzchnię heksanu (UWAGA: unikaj narażania DMDCS na powietrze). Inkubuj zjeżdżalnie delikatnie kołysząc przez 1,5 godziny. Przepłucz i nasocuj preparaty w heksanie przez 1 minutę, a następnie powtórz ten krok trzy razy, aby usunąć pozostałości DMDC. Susz zamki na powietrzu i pakuj je próżniowo w rurkach o pojemności 50 mL (np. Falcon lub stożkowych). Przygotowane preparaty można przechowywać w temperaturze −20 °C do dalszego użytku.
Montaż i funkcjonalizacja kanałów przepływowych
Prosty kanał przepływowy można złożyć za pomocą szkiełka kwarcowego, szklanej pokrywki, taśmy dwustronnej, końcówek pipet oraz epoksydu. Przyklej cienkie paski taśmy dwustronnej między otwory na szkiełce kwarcowej i przyłóż pokrywkę na wierzch. Zabezpiecz dłuższe krawędzie żywicą epoksydową. Wytnij około 5 mm segmenty z końcówki pipety (zarówno wąską końcówkę, jak i szerszą kołnierz) i włóż jeden do otworu, który służy jako wylot, a drugi do równoległego otworu, tworząc zbiornik wlotowy. Zabezpiecz oba żywicami epoksydowymi. Zbiornik wlotowy powinien zatrzymywać ciecz bez wycieku przed wtryskiem. Aby pobierać roztwory przez kanał, podłącz rurkę ze strzykawki 1 mL do wylotu.
Kanały należy przecieńczyć kolejno następującymi odczynnikami, aby funkcjonalnie zdefiniować powierzchnię: biotinylowany BSA (0,2 mg/mL) przez 5 minut, Tween-20 (0,2%) przez 10 minut oraz NeutrAvidin (0,1 mg/mL) przez 1 minutę. Około 100 μL każdego roztworu wystarcza na kanał. Unikaj pobierania większej ilości cieczy niż jest obecna w zbiorniku wlotowym, ponieważ wprowadza to powietrze do kanału i generuje pęcherzyki. Pozostawiaj niewielką ilość roztworu w zbiorniku między etapami, aby zapobiec wysychaniu kanału. Dokładnie przepłucz buforem 1× TNK (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl) między każdym krokiem. To leczenie tworzy powierzchnię biotynowo-neutrawidynową do unieruchomienia RNA.
Przygotować dupleksy mRNA-tethera tuż przed unieruchomieniem, mieszając mRNA 40 nM z 20 nM biotinylowanym DNA znakowanym Cy5. Denaturuj mieszaninę w temperaturze 75 °C przez 5 minut w buforze 1× TNK (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl), następnie ponownie w 37 °C przez 15 minut i wyrównuj w 20 °C.
Rozcieńcz próbkę 50-krotnie w buforze obrazowym (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowego kwasu, 0,01% monododecylowego eteru oktaetyloglikolelu, 0,8% glukozy, 2 U/mL inhibitor RNazy) i wstrzyknij ją do kanału przepływowego, aby unieruchomić mRNA. Inkubuj przez 1 minutę, następnie myj buforem obrazującym uzupełnionym systemem usuwania tlenu (165 U/mL oksydazy glukozy i 2170 U/mL katalazy), aby zmniejszyć fotobielenie.
Przygotuj kompleksy sRNA-Hfq, mieszając składniki w proporcji 1:1 do końcowego stężenia 250 nM w buforze 1× TNK i inkubuj przez 5-15 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńcz kompleksy 50-krotnie w buforze obrazującym zawierającym system pobierania tlenu i wstrzykuj je do kanału przepływowego tuż przed obrazowaniem.
Akwizycja danych pojedynczych cząsteczek
Ustaw pryzmatyczny mikroskop całkowitej odbicia odbicia wewnętrznego (TIRF), włączając kamerę EMCCD i lasery. Zamontuj przygotowany szkiełko z złożonymi kanałami przepływowymi na stole mikroskopu i umieść pryzmat na górze. Użyj oprogramowania Single (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) do pozyskiwania danych. W oprogramowaniu określ poziom tła, wybierając AutoScale i kopiuj uzyskaną wartość do pola Tło. Ustaw szybkość akwizycji na 100 ms. Excite Alexa Fluor 555 lub Cy3 używa lasera 532 nm, a Cy5 lasera 633 nm. Zbieraj emisje z obu kanałów jednocześnie za pomocą obiektywu zanurzenia w wodzie o temperaturze 60×. Dla każdego filmu rozpocznij od dziesięciu klatek wzbudzenia o częstotliwości 633 nm, aby zlokalizować mRNA oznaczone Cy5 w polu widzenia. Kontynuuj nagrywanie przez 5 minut przy wzbudzeniu 532 nm. Zakończ akwizycję wzbudzeniem 1 s 633 nm, aby zweryfikować fotobielenie Cy5. To wygeneruje plik filmu .pma, który może być użyty do analizy.
Analiza danych pojedynczych cząsteczek
Analizuj surowe pliki .pma za pomocą niestandardowych skryptów IDL do mapowania kanałów dawca-akceptorów oraz wyodrębniania trajektorii intensywności fluorescencji. Po pierwsze, nagraj film kalibracyjny z użyciem wielokolorowych kulek fluorescencjowych wykrywalnych zarówno w kanałach dawcy, jak i akceptora po wzbudzeniu laserem 532 nm lub 633 nm. Użyj tego filmu kalibracyjnego, aby wygenerować plik mapowania, który wyrównuje kanały dawcy i akceptora. Zastosuj powstały plik mapowania do wszystkich nagrań eksperymentalnych, aby zidentyfikować odpowiadające im pary dawca-akceptor, wykryć plamy fluorescencyjne oraz wyeksportować ślady czasu intensywności do dalszej analizy FRET. Szczegółowe instrukcje krok po kroku są dołączone do skryptu (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab).
Śledzenia intensywności procesu w MATLAB-ie za pomocą skryptu s_tr_E.m. Uruchom skrypt i wejdź do katalogu zawierającego pliki .traces i .pks, następnie indeks pliku i rozdzielczość czasową. Wybierz okno ramki używane do identyfikacji punktów po wywołaniu polecenia. Następnie pismo pokazuje intensywności dawcy i akceptora dla pojedynczego miejsca. Przemieszczaj się po cząsteczkach za pomocą poleceń klawiatury (b, aby wrócić, g, by przejść do określonej cząsteczki). Zdefiniuj linię bazową dawcy i akceptora (k) oraz koryguj wycieki (l), klikając wykresy, gdy jest to potrzebne. Zapisuj zaakceptowane ślady pojedynczo jako .dat plikach zawierających czas, dawcę i intensywność akceptora, naciskając s. Wykorzystaj wyeksportowane pliki do dalszej analizy ilościowej.
Użyj programu peak-finder do analizy pojedynczych śladów smFRET i wyodrębnienia zdarzeń wiązania do kwantyfikacji, w tym analizy czasu pobytu i rozkładów stanów FRET. Uruchom program i otwórz folder zawierający wyeksportowane pliki śledzenia .dat za pomocą menu Plik. Ustaw wartości bazowe oraz wartości wycieku między dawcą a akceptorem ustalone wcześniej za pomocą skryptu MATLAB. Następnie ustaw progi intensywności, aby kierować automatycznym wykrywaniem szczytów tak, aby wszystkie wizualnie zweryfikowane zdarzenia wiązania znajdowały się powyżej wybranych wartości. Jeśli szum powoduje podzielenie pojedynczego zdarzenia na kilka szczytów, ręcznie je połącz za pomocą wbudowanej funkcji scalania. Kliknij Save peaks, aby wyeksportować wykryte zdarzenia jako .csv pliki zawierające czas rozpoczęcia, czas zakończenia oraz średnią efektywność FRET dla każdego zdarzenia. Pliki wyjściowe są zapisywane w katalogu peaks, natomiast wartości FRET rozwiązywane według ramek dla każdego zdarzenia są zapisywane do katalogu peak-fret. Efektywność FRET oblicza się przez podzielenie intensywności fluorescencji akceptora przez sumę intensywności dawcy i akceptora, przy użyciu wartości skorygowanych o tło i przecieki dawcy do kanału akceptora. Ręcznie sprawdź ślady pod kątem fotobielenia Cy5, co zidentyfikowano nagłym spadkiem efektywności FRET i wzrostem intensywności Cy3. Gdy dochodzi do fotowybielania, zakładaj, że wiązanie utrzymuje się tak długo, jak fluorescencja Cy3 pozostaje wykrywalna, i koryguj szczytowe czasy poprzez edycję odpowiednich plików .csv.
Importuj wartości efektywności FRET rozwiązywane według ramek z plików peak-fret do GraphPad Prism. Generuj histogramy FRET za pomocą funkcji rozkładu częstotliwości i dopasowuj rozkłady do modeli Gaussa, aby zidentyfikować dominującą populację FRET.
Określ czasy zatrzymania poszczególnych zdarzeń wiązania, odejmując skojarzenia od punktów czasu dysocjacji za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Oblicz ułamek zdarzeń przejściowych (<10 s) dla każdego powtórzenia eksperymentalnego. Analizy statystyczne przeprowadzono w GraphPad Prism. Porównania między dwoma schorzeniami oceniano za pomocą niesparowanych testów t, a porównania między trzema lub więcej schorzeniami analizowano za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya.
Wyniki
Długość nasiona wyznacza dynamiczny reżim parowania sRNA-mRNA
Opracowaliśmy minimalny test pojedynczą, aby sprawdzić, jak cechy sekwencyjne rządzą wyżarzeniem pośredniczonym przez Hfq. Modelowe RNA zostały zaprojektowane według wcześniej opisanych architektur par sRNA-mRNA zależnych od Hfq16,17 i miały motyw wiążący Hfq bogaty w adenozynę na mRNA oraz bogate w urydyny miejsce wiążące brzeg na sRNA (Rysunek 1A). SRNA zostało oznaczone Alexa Fluor 555 (dawcą) na końcu 5ʹ oraz wiązaniem mRNA-DNA z Cy5 (akceptor), co umożliwiło wykrywanie bliskości wywołanej parowaniem zasad za pomocą FRET.
Zmiana komplementarności nasion od 4, 5, 8 do 10 bp powodowała wyraźne zachowania dynamiczne. W przypadku 4-bp nasion interakcje były przeważnie przejściowe i wykazywały heterogeniczne efektywności FRET, co sugeruje niepełne parowanie zasad (Rysunek 1B-D). Dla porównania, nasiona 8 i 10 bp dawały stabilne duplexy, które często utrzymywały się przez okno obserwacyjne (Rysunek 1C). Oddziaływania te wywołały oczekiwany wysoki stan FRET (EFRET ≈ 0,79-0,80, rysunek 1D), zgodny z pełnym sparowaniem zasad między RNA. Nasiono 5 bp wywołało krótkotrwałe, ale dobrze określone zdarzenia wiązania (EFRET ≈ 0,66), zapewniając użyteczny zakres dynamiczny dla kolejnych modyfikacji sekwencji RNA (Rysunek 1B-D). Dlatego zastosowaliśmy komplementarność 5 bp dla wszystkich testów dalszych.
Silniejsze motywy wiążące Hfq zwiększają stabilność kompleksu sRNA-mRNA
Następnie zapytaliśmy, jak siła wiązania Hfq moduluje czas trwania wiązania przy stałej komplementarności 5 bp. Rozszerzenie motywu mRNA z AAN4 do AAN6 znacząco zwiększyło prawdopodobieństwo powstania stabilnych kompleksów (p < 0,001). Średnia długość życia wzrosła z 7,5 s do 18 s, a odsetek niestabilnych zdarzeń < 10 s spadł z 80 ± 2% do 68,3 ± 2,9% (Rysunek 2A-C).
Następnie przetestowaliśmy wpływ motywu wiązającego Hfq na sRNA. Skrócenie miejsca wiązania krawędzi z UUAUUUUUUU do CUUC (sRNA-SR, "krótki krawędź") powodowało wysoce niestabilne interakcje (średni czas życia 1,9 s z AAN4), a wzmocnienie motywu mRNA w tym kontekście miało jedynie umiarkowany efekt (średnia 3,0 s z AAN6, nieistotne, rysunek 2B,C). W ten sposób obaj partnerzy przyczyniają się do stabilności produkowanego złożonego organizmu, ale słabe kontakty sRNA-Hfq ograniczają zyski wynikające z silniejszego motywu mRNA.
Dystans między miejscami Hfq- a nasionami na mRNA sprzyja dłuższemu żywotowi kompleksów
Hfq może pozostać związany z obszarem AAN, wykorzystując jego powierzchnię brzegu do ułatwienia poszukiwania optymalnego miejsca parowania sRNA16. Ta właściwość sugerowała, że dodatkowe odstępy między dwoma obszarami wiążącymi mRNA mogą wpływać na stabilność interakcji.
Aby to przetestować, wprowadziliśmy 15-ntowy jednoniciowy spacer między miejscami wiążącymi Hfq i sRNA (N15). Ta modyfikacja znacząco wydłużyła czas trwania zdarzeń wyżarzania stabilnego z 7,5 s (AAN4) do 47 s (AAN4-N15) (p < 0,01) (rysunek 3A,B). Odsetek zdarzeń wiązania trwających krócej niż 10 sekund również spadł z 80 ± 2% do 44 ± 6% (Rysunek 3C). Dane te wskazują, że dodatkowa elastyczność między modułami wiązania może stabilizować węzły pośrednie i promować dłuższą żywotność duplexów.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Wszystkie dane wspierające wyniki tego badania, w tym trajektorie FRET pojedynczącej cząsteczki, przetworzone zbiory danych oraz skrypty analityczne, są publicznie dostępne w repozytorium danych Mendeley pod adresem: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
Rysunek 1: Wpływ komplementarności sRNA-mRNA na efektywność wiązania. (A) test smFRET dla wyżarzania sRNA-mRNA. Parowanie zasad między sRNA znakowanym przez Alexa Fluor 555 a unieruchomionym kompleksem mRNA-Cy5-DNA generuje sygnał o wysokim poziomie FRET. Modelowe mRNA zawierają miejsce wiążące Hfq (AAC)4 (niebieskie) oraz miejsce wiążące sRNA (S5, czerwone), następnie pięć nukleotydów oraz region hybrydy RNA-DNA. sRNA zawierają miejsce wiążące brzeg (pomarańczowe). Panele w (B-D) są grupowane według warunków eksperymentalnych (długość nasiona). (B) Reprezentatywne zdarzenie wiązania sRNA na pojedynczej cząsteczce mRNA. Pokazano ślady intensywności fluorescencji sRNA znakowanego przez Alexa Fluor 555 (dawca, zielone) oraz wiązania Cy5-DNA (akceptor, czerwony). Cy5 był bezpośrednio wzbudzony podczas pierwszej i ostatniej dziesięciu klatek nagrania. (C) Rastergramy przedstawiające 50 reprezentatywnych cząsteczek mRNA związanych przez sRNA-Hfq. Każdy poziomy pasek reprezentuje pojedynczą interakcję sRNA-mRNA. (D) Histogramy efektywności FRET dla interakcji między mRNA a sRNA zawierające 4 bp (N = 416 mRNA), 5 bp (N = 513 mRNA), 8 bp (N = 191 mRNA) lub 10 bp (N = 105 mRNA) komplementarnych regionów. Efektywność FRET obliczono na podstawie skorygowanych przez bazę i wyciek intensywności dawcy i akceptora dla poszczególnych zdarzeń wiązania w odstępach 0,1 s. Dopasowania Gaussa (niebieskie) wskazują dominującą populację FRET i nie były używane do obliczania E_FRET wartości. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 2: Wpływ długości motywu wiążącego Hfq na interakcje sRNA-mRNA. Region parowania zasad we wszystkich wariantach ma długość 5 bp. (A) Rastergramy pokazujące 50 reprezentatywnych mRNA związanych z kompleksami sRNA-Hfq. Każdy poziomy pasek reprezentuje pojedynczą interakcję. Powyższe diagramy rysunkowe ilustrują odpowiadające wzory RNA ze zmianami w liczbie powtórzeń (AAC) w mRNA oraz długości obszaru wiążącego brzeg w sRNA (SR = "krótki krawędź"). Kolorowanie jak na Rysunku 1A. (B) Wykresy rozproszone czasów wiązania sRNA-mRNA. Każda kropka reprezentuje jedno zdarzenie wiązania. Średnia długość życia (czerwona linia pozioma): 7,5 s dla mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNA), 18 s dla mRNA-AAN6 + sRNA (N = 142 mRNA), 1,9 s dla mRNA-AAN4 + sRNA-SR (N = 85 mRNA) oraz 3 s dla mRNA-AAN6 + sRNA-SR (N = 149 mRNA). (C) Wykres słupkowy pokazujący procent zdarzeń wiązań krótszych niż 10 s. Paski błędu oznaczają odchylenie standardowe od dwóch niezależnych zbiorów danych. Analiza statystyczna metodą jednokierunkowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya dla wielu porównań. p < 0,001, ****p < 0,0001; NS, nieistotny. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 3: Wpływ długości przestrzeni między miejscami wiążącymi Hfq i sRNA na interakcje sRNA-mRNA. Region parowania zasad we wszystkich wariantach ma długość 5 bp. (A) Rastergramy przedstawiające 50 reprezentatywnych mRNA związanych przez kompleks sRNA-Hfq. Każdy poziomy pasek reprezentuje pojedyncze zdarzenie wiążące. Powyższe diagramy rysunkowe ilustrują odpowiadający mu projekt RNA. N15 = 15 nt odstęp losowego ciągu. Kolorowanie jak na rysunku 1A. (B) Wykresy rozpraszane czasów wiązania sRNA-mRNA. Każda kropka reprezentuje jedno zdarzenie wiązania. Średnia długość życia (czerwona linia pozioma): 7,5 s dla mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNA) oraz 47 s dla mRNA-AAN4-N15 + sRNA (N = 289 mRNA). (C) Wykres słupkowy pokazujący procent zdarzeń wiążących krótszych niż 10 s. Paski błędu oznaczają odchylenie standardowe od dwóch niezależnych zbiorów danych. Analiza statystyczna za pomocą niesparowanego testu T. **p < 0,01. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek uzupełniający 1: Oczyszczanie E. coli Hfq. Analiza SDS-PAGE ekspresji i oczyszczania Hfq. (Góra) Próbki pobrane podczas oczyszczania na kolumnie z powinowactwemNi 2+ (HiTrap), w tym przed indukcją, po indukcji, pelletami, lizatem, ładunkiem, przepływem, frakcjami płukania oraz eluowanymi frakcjami pikowymi. (Na dole) SDS-PAGE ułamków pikowych po chromatografii wykluczającej rozmiar na kolumnie HiLoad 16/600 Superdex 200. Wskazuje się monomeryczne (~11 kDa) i heksameryczne (~66 kDa) formy Hfq. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Badanie to ustanawia minimalny test pojedynczą, który analizuje, jak konkretne cechy sekwencji RNA determinują skuteczność wyżarzania sRNA-mRNA za pośrednictwem Hfq. Zmieniając długość zasiona, siłę motywu wiązającego Hfq oraz odstępy między modułami wiązania, bezpośrednio zidentyfikowaliśmy, jak każdy parametr przyczynia się do stabilności dupleksów przy rozdzielczości pojedynczej cząsteczki. W przeciwieństwie do pomiarów zespołowych, które raportują efekty uśredniane według populacji, to podejście bezpośrednio rozwiązuje indywidualne zdarzenia wiązania i dysocjacji, umożliwiając pomiar heterogeniczności kinetycznej i interakcji przejściowych. Nasze wyniki pokazują, że nawet krótkie obszary nasion mogą się przejściowo łączyć, podczas gdy dłuższe nasiona dają stabilne dupleksy o wydłużonym okresie życia. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi danymi in vivo i zespołowymi, które pokazują, że naturalne obszary nasienne w bakteryjnych sRNA zazwyczaj obejmują 6-12 nukleotydów i rzadko tworzą w pełni komplementarne dupleksy 21,22,23.
Stwierdziliśmy również, że zarówno motywy mRNA, jak i sRNA wiążące Hfq silnie wpływają na stabilność dupleksu. Rozszerzenie motywu AAN na mRNA wydłużyło czas wiązania, jednocześnie skracając miejsce wiązania brzegu sRNA, co znacznie je destabilizowało. Wspiera to model kooperacyjny, w którym dystalna ściana Hfq kotwiczy motywy mRNA bogate w adenozyny, a obrzeża rekrutuje bogate w urydyny sRNA, aby promować efektywne wyrównanie regionów komplementarnych 9,17. W przeciwieństwie do testów genetycznych lub raportowych, które zazwyczaj wykrywają jedynie produktywne wyniki regulacyjne, ten system ilościowo oddziela stabilność wiązania od efektów dalszych, umożliwiając bezpośrednie porównanie, jak poszczególne cechy sekwencji modulują czas życia interakcji fizycznych. Silny motyw wiązania krawędzi jest szczególnie istotny, gdy konieczne są strukturalne przekształcenia do parowania sRNA-mRNA, ponieważ zwiększa retencję RNA na Hfq17. Uważa się również, że obrzeże sprzyja bocznemu skanowaniu mRNA przez kompleksy sRNA-Hfq16, co może być szczególnie istotne, gdy miejsca docelowe znajdują się oddalone od obszaru wiążącego Hfq. Nasze wyniki z 15-ntowym odstępem między miejscami wiązania potwierdzają ten pogląd, pokazując, że dodatkowa elastyczność między nasionem a motywem Hfq zwiększa stabilność parowania, prawdopodobnie poprzez zmniejszenie ograniczeń sterycznych podczas wymiany nici.
Poza systemami naturalnymi, wyniki te są istotne dla projektowania syntetycznych lub inżynieryjnych sRNA. Większość istniejących strategii projektowych koncentruje się na optymalizacji regionu nasionowego lub ogólnego rusztowania 23,24,25, ale nasze dane podkreślają dodatkowe czynniki, takie jak odstęp między motywem wiązającym Hfq a regionem docelowym. Ponieważ cechy sekwencji są wprowadzane w sposób kontrolowany i modułowy, test zapewnia systematyczne ramy eksperymentalne do testowania reguł projektowych. Ta zasada może kierować przyszłą budową sztucznych sRNA z lepszą efektywnością regulacyjną.
Chociaż podejście to umożliwia ilościową i powtarzalną analizę interakcji RNA-RNA, ma również swoje ograniczenia. Test bada w pełni komplementarne obszary, podczas gdy większość fizjologicznych interakcji sRNA-mRNA zawiera niedopasowania i wypukłości, które mogą wpływać na rozpoznawanie i regulację. Metoda mierzy czas życia wiązania sRNA-mRNA, ale nie uwzględnia bezpośrednio wyników regulacyjnych w dalszej fazie rozwoju, takich jak hamowanie translacji czy rozpad mRNA. Przyszłe adaptacje tego testu mogą uwzględniać niedopasowane regiony nasion, zróżnicowaną zawartość GC lub rybosomy i degradosomy, aby systematycznie zbadać, jak te czynniki kształtują kinetykę wiązania.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy prof. Sarah Woodson za ułatwienie dostępu do instrumentacji jednocząsteczkowej. Badanie to zostało sfinansowane przez Narodowe Centrum Nauki Polski (2022/46/E/NZ1/00462 do EMM) oraz grant na instalację EMBO (IG 5730-2024 dla EMM).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ Filtr m | Millipore | HABG04700 | |
| 5 mL Hi-Trap kolumna | Cytiva | GE17-0408-01 | |
| Aceton | Merck | 270725 | Klasa HPLC |
| Roztwór akrylamidu: bisakrylamidu | Merck | A2792-100ML | |
| ALEXA555 NHS ester sucynimidyl | Thermo Fischer | A20009 | |
| Filtry odśrodkowe Amicon Ultra (NMWL, 3 kDa) | Merck | UFC900308 | |
| Chlorek amonu | Merck | 1330-500G | |
| Ampycylina | Merck | A9518-5G | |
| ATP | Linegal Chemicals | K054.1 | |
| Beta-merkaptoetanol | Merck | M3148-500ML | |
| BIO-BSA | Merck | A8549-10MG | |
| Kolumny Bio-Spin z Bio-Gel P-30 | Bio Rad | 7326231 | Do oczyszczania oznakowanego RNA |
| Katalaza | Merck | C9322 | |
| CTP | Linegal Chemicals | K057.4 | |
| Ester HNS Cy3 | Cytiva | PA13105 | |
| Ester sucynimidylowy Cy5 NHS | Cytiva | PA15101 | |
| DDT | Thermo Fischer | R0861 | |
| Dichlorodimetylosilan | Merck | 440272 | |
| Oligomery DNA (tether) 5′-amino linker C6 | Termonaukowe | Nie ma | |
| Dnase I | Thermo Scientific | 18047019 | |
| EDC | Termonaukowe | PG82079 | |
| EDTA | Merck | ED2SS-1KG | |
| Kamera EMCCD | Andor | ||
| Etanol | Merck | 1085430250 | |
| Glukoza | Merck | D9434-1KG | |
| Oksydaza glukozy | Merck | G2133-50KU | |
| Glicerol | Merck | G5516-1L | |
| GMP | Merck | G8377 | |
| GTP | Linegal Chemicals | K056.4 | |
| HCl | Merck | 1.00318 | |
| Heksan | Thermo Fischer | 045652.M1 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 kolumna wykluczająca | Cytiva | GE28-9893-35 | |
| IPTG | Merck | 420322-1GM | |
| KCl | Merck | P9541-1KG | |
| KOH | Merck | 484016-1KG | |
| Chlorek magensu | Merck | M8266-1KG | |
| Metanol | Merck | 34885-M | Klasa HPLC |
| Neutrawidyna | Thermo Fischer | 31000 | |
| Siarczan niklu | Merck | 1067261000 | |
| Nikkol | Merck | P8925-1G | |
| Q5 Polimeraza | NEB | M0491S | Wykorzystywane do produkcji szablonu transkrypcji in vitro |
| RNaza A | Termonaukowe | EN0531 | |
| RNasin Plus | Promega | N2611 | |
| Octan sodu | Merck | S7545-100G | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S3014-1KG | |
| Spermidyna | Merck Life Science | S2626 | |
| Baza Tris | Thermo Scientific | 17926 | |
| Troloks | Merck | 238813-1G | |
| Mocznik | Merck | U1250-5KG | |
| UTP | Linegal Chemicals | K055.3 |
Bibliografia
- Alquethamy, S., Lalaouna, D., Tree, J. J. What makes a small RNA work. Nucleic Acids Res. 53 (12), 563(2025).
- Prévost, K., Desnoyers, G., Jacques, J. F., Lavoie, F., Massé, E. Small RNA-induced mRNA degradation achieved through both translation block and activated cleavage. Genes Dev. 25 (4), 385-394 (2011).
- Massé, E., Escorcia, F. E., Gottesman, S. Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev. 17 (19), 2374-2383 (2003).
- Panja, S., Woodson, S. A. Hexamer to monomer equilibrium of E. coli Hfq in solution and its impact on RNA annealing. J Mol Biol. 417 (5), 406-412 (2012).
- Sauter, C., Basquin, J., Suck, D. Sm-like proteins in eubacteria:the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31 (14), 4091-4098 (2003).
- Andrade, J. M., Pobre, V., Matos, A. M., Arraiano, C. M. The crucial role of PNPase in the degradation of small RNAs that are not associated with Hfq. RNA. 18 (4), 844-856 (2012).
- Panja, S., Schu, D. J., Woodson, S. A. Conserved arginines on the rim of Hfq catalyze base pair formation and exchange. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7536-7546 (2013).
- Soper, T. J., Woodson, S. A. The rpoS mRNA leader recruits Hfq to facilitate annealing with DsrA sRNA. RNA. 14 (9), 1907-1917 (2008).
- Updegrove, T. B., Zhang, A., Storz, G. Hfq:the flexible RNA matchmaker. Curr Opin Microbiol. 30, 133-138 (2016).
- Moon, K., Gottesman, S. Competition among Hfq-binding small RNAs in Escherichia coli. Mol Microbiol. 82 (6), 1545-1562 (2011).
- Hussein, R., Lim, H. N. Disruption of small RNA signaling caused by competition for Hfq. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (3), 1110-1115 (2011).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Mol Microbiol. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Wagner, E. G. H. Cycling of RNAs on Hfq. RNA Biol. 10 (4), 619-626 (2013).
- Roca, J., Santiago-Frangos, A., Woodson, S. A. Diversity of bacterial small RNAs drives competitive strategies for a mutual chaperone. Nat Commun. 13, 2449(2022).
- Tree, J. J., et al. Identification of bacteriophage-encoded anti-sRNAs in pathogenic Escherichia coli. Mol Cell. 55 (2), 199-213 (2014).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. RNA compaction and iterative scanning for small RNA targets by the Hfq chaperone. Nat Commun. 15, 2069(2024).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. Stepwise sRNA targeting of structured bacterial mRNAs leads to abortive annealing. Mol Cell. 81 (9), 1988-1999.e4 (2021).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nat Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nat Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Kawamoto, H., Koide, Y., Morita, T., Aiba, H. Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol Microbiol. 61 (4), 1013-1022 (2006).
- Bandyra, K. J., et al. The seed region of a small RNA drives the controlled destruction of the target mRNA by the endoribonuclease RNase E. Mol Cell. 47 (6), 943-953 (2012).
- Brück, M., et al. A library-based approach allows systematic and rapid evaluation of seed region length and reveals design rules for synthetic bacterial small RNAs. iScience. 27 (9), (2024).
- Han, K., Kim, K. S., Bak, G., Park, H., Lee, Y. Recognition and discrimination of target mRNAs by Sib RNAs, a cis-encoded sRNA family. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5851-5866 (2010).
- Sharma, V., Yamamura, A., Yokobayashi, Y. Engineering artificial small RNAs for conditional gene silencing in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 1 (1), 6-13 (2012).