Przepływ pracy dla obrazowania na żywo i analizy ilościowej bezśrodkowych sieci mikrotubul w komórkach jajowych Drosophila

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół, który łączy obrazowanie na żywo z automatycznymi narzędziami analitycznymi w celu analizy dynamiki mikrotubul w komórce jajowej Drosophila. Ten przepływ pracy umożliwia wydajne i powtarzalne pomiary zachowania mikrotubul, w tym wzrost, orientację, prędkość i organizację przestrzenną, i może być dostosowany do innych typów komórek po optymalizacji.

Abstract

Szkielet mikrotubul (MT) jest niezbędny dla wielu funkcji komórkowych, w tym kształtu komórki, polarności, migracji i podziału. Podczas gdy centrosomy pełnią funkcję głównego centrum organizującego mikrotubule (MTOC) w dzielących się komórkach zwierząt, wiele zróżnicowanych komórek, w tym komórki jajowe Drosophila , opiera się na bezcentrosomowych szlakach do organizowania sieci MT. W przeciwieństwie do rozległej wiedzy o organizacji MT w komórkach dzielących się, niewiele wiadomo o tym, jak sieci MT organizują się bez centrosomów. Komórki jajowe Drosophila stanowią potężny model do badania organizowania i dynamiki MT bez centrosomów. Jednak ich gęsta sieć MT stanowi wyzwanie dla konwencjonalnego obrazowania. Obrazowanie na żywo umożliwia wizualizację wzrostu i orientacji MT w czasie rzeczywistym, jednak standaryzowane metody analizy są nadal ograniczone. Przedstawiamy tutaj protokół oparty na obrazowaniu na żywo do analizy dynamiki wzrostu MT w komórkach jajowych Drosophila z wykorzystaniem końcowej Białka Wiążącego 1 (EB1)-Zielonej Fluorescencyjnej Białka (GFP), białka śledzącego końce plusowe, które oznacza miejsca aktywnej polimeryzacji MT. Mikroskopia konfokalna Airyscan o wysokiej rozdzielczości umożliwia wykrywanie komet EB1, podczas gdy niestandardowe makra Fiji i skrypty Python zapewniają strumieniowaną, powtarzalną ilościową analizę gęstości komet, prędkości, długości i orientacji. Walidacji tej metody dokonaliśmy porównując komórki jajowe kontrolne z tymi, które były poddane chłodniczej depolimeryzacji MT, a także mutantów Patronin (CAMSAP u ludzi), zachowanego stabilizatora końców minusowych MT i składnika rdzeniowego niecentrosomowych centrów organizujących mikrotubule (ncMTOC), jako dodatniego kontrolnego potwierdzenia upośledzonej dynamiki MT. Nasze analizy ujawniły regionowo specyficzną dynamikę MT, w tym przednią koncentrację komet EB1 i charakterystyczne uprzednie nastawienia orientacji, potwierdziły też wrażliwość przepływu pracy na wykrywanie subtelnych zakłóceń w wzroście MT. To podejście zapewnia niezawodną, przyjazną dla użytkownika ramę do badania zachowania MT w komórkach jajowych. Krok po kroku protokół umożliwia badanie regulatorów MT w tym kontekście i może być przystosowany do innych zróżnicowanych typów komórek, takich jak neurony i komórki nabłonkowe, przy odpowiedniej optymalizacji. Bardziej ogólnie, wspiera on badania mechanizmu i przesiewowe badania genetyczne dotyczące tego, jak różnorodne architektury MT leżą u podstaw specjalizowanych funkcji komórkowych.

Introduction

Szkielet mikrotubul (MT) jest niezbędnym składnikiem komórki eukariotów, odgrywając kluczową rolę w ustanawianiu i utrzymywaniu kształtu, polaryzacji i podziału komórki. Dynamiczne zachowanie polimerów MT, charakteryzujące się wzrostem i kurczeniem, jest niezbędne dla wielu procesów opartych na MT^1,2. Zgromadzenie różnych układów MT opiera się na połączonej akcji centrów organizujących mikrotubule (MTOC), z których mikrotubuły są jądrowane, oraz aktywności różnorodnych białek regulacyjnych MT, które kontrolują stabilność, orientację i dynamikę MT^1,2,3. Najlepiej zbadanym MTOC jest centrosoma, która generuje radialne układy MT, które są ważne dla regulacji kształtu i polaryzacja komórki w interfazie i dla montażu wrzeciona podziałowego w mitozie^4,5. Jednak po wyjściu z mitozy lub różnicowania, jak w neuronach i komórkach nabłonkowych, aktywność MTOC centrosomalnych jest często osłabiona, aw skrajnych przypadkach, takich jak w komórkach jajowych, może zostać wyeliminowana^6,7. Często jest to związane z przebudową szkieletu MT komórkowego specyficzną dla typu komórki, z przypisaniem funkcji MTOC do innych miejsc komórkowych^2,3,8, zwykle nazywanych nie-centrosomalnymi MTOC (ncMTOC). Podczas gdy osiągnięto znaczny postęp w wyjaśnianiu organizacji MT w komórkach podziałowych, w porównaniu niewiele wiadomo o tym, jak MT są jądrowane, stabilizowane i ułożone przestrzennie w komórkach zwierzęcych wychodzących z mitozy lub ulegających różnicowaniu². Należy zauważyć, że w żywych organizmach większość komórek nie dzieli się; wyszły z cyklu komórkowego i / lub zróżnicowały. Dlatego kluczowe jest zrozumienie, jak szkieleton MT jest organizowany i regulowany w tych kontekstach. Ta wiedza jest niezbędna do poznania, jak różne architektury MT są ustalane w celu wsparcia wyspecjalizowanych funkcji komórkowych.

Komórka jajowa Drosophila melanogaster zapewnia potężny system do badania organizacji i funkcji MT bez centrum. W środkowym etapie ooogenezy aktywność centrosomy jest osłabiona⁹, a MT są generowane z ncMTOC zlokalizowane w przednio-bocznej korze komórki jajowej (Rysunek 1B). Ta sieć MT jest niezbędna dla lokalizacji macierzystych mRNA, białek i organelli, które z kolei są kluczowe dla ustanowienia przyszłych osi zarodka i rozwoju^10,11. Poprzednie prace wykazały, że ncMTOC komórki jajowej składają się z białka MT minus-end Patronin, które tworzy kompleks z białkiem spectraplakin Shot, zakotwiczonym w kortykalnym cytoszkielecie aktynowym. Zaproponowano, że MT rosną z krótkich fragmentów MT wygenerowanych przez enzymy przecinające, takie jak Katanin, które mogą działać jako nasiona dla dalszej polimeryzacji MT¹². Podobne mechanizmy zostały zaproponowane w innych zróżnicowanych komórkach, takich jak neurony¹³, gdzie aktywność centrosomalna jest zmniejszona. Jednak mechanizmy, dzięki którym przecinające generuje złożone sieci MT, takie jak w komórce jajowej, pozostają słabo poznane. Jest nadal niejasne, czy MT w tych kontekstach są formowane głównie poprzez przegrupowanie oparte na przecinaniu czy też kombinację przecinania i de novo nukleacji MT. Złożoność sieci MT komórki jajowej sprawia, że jest to idealny system do badania, jak MT są generowane i zorganizowane poza dobrze znanym kontekstem centrosomalnym. Należy zauważyć, że stanowi to również wyzwanie dla obrazowania i analizy: gęsta sieć MT wewnątrz komórki jajowej sprawia, że trudno jest rozdzielić pojedyncze MT za pomocą konwencjonalnego barwienia immunologicznego lub statycznych metod obrazowania^2,14.

Ożywione obrazowanie znacznie poprawiło zdolność do badania sieci MT, ponieważ umożliwia wizualizację zdarzeń polimeryzacji MT w czasie rzeczywistym, oferując kluczowe wglądy w dynamikę i orientację wzrostu MT. Poprzednie badania z powodzeniem analizowały dynamikę wzrostu MT w komórkach jajowych przy użyciu żywego obrazowania markerów plus-end^14,15,16. Jednak w wielu przypadkach procedury analizy obrazów używane do ilościowej oceny dynamiki MT są opisywane tylko krótko, opierają się na niestandardowych lub laboratorium-specyficznych implementacjach lub nie są udostępniane publicznie, ograniczając w ten sposób możliwość powtórzenia i szersze przyjęcie. Nasza metoda opiera się na tych wcześniejszych podejściach, zapewniając w pełni udokumentowaną, dostępną publicznie i przyjazną dla użytkownika analizę potoku, która umożliwia standaryzowane ilościowe określenie parametrów wzrostu MT w całych zestawach danych i warunkach eksperymentalnych. W tym protokole dynamika MT jest przedstawiana na środkowym etapie ooogenezy, gdy cytoszkielet MT jest zorganizowany przez bez-centrosomalne sieci MT. Rosnące MT są wizualizowane za pomocą EB1-GFP, białka śledzenia

Protocol

1. Genetyka much

UWAGA: Aby wizualizować MT w komórce jajowej, w tym protokole stosuje się dostępny publicznie transgen (Tabela Materiałów), który ekspresuje białko śledzące końce plus MT EB1 oznaczone zieloną fluorescencyjną białkiem (GFP)¹⁹. EB1-GFP specyficznie wiąże się z rosnącymi końcami plus MT, pojawiając się jako fluorescencyjne "komety" poruszające się wzdłuż kierunku polimeryzacji^17,18. Umożliwia to wizualizację i ilościową ocenę dynamiki wzrostu MT, w tym orientacji wzrostu, prędkości i rozkładu przestrzennego w komórce jajowej^14,20.

1. Utrzymuj wszystkie szczepy muszek na standardowym podłożu kukurydzianym w temperaturze 25 °C, stosując standardowe techniki hodowania Drosophila.
2. Skrzyżuj 8–12 dziewiczych samic muszek noszących transgen UAS-RNAi ukierunkowany na ekspresję białka interesującego z 5 samcami o genotypie matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
   UWAGA: Aby uprościć krzyżówki genetyczne, wygeneruj hodowlę muszek poprzez skrzyżowanie linii V32-Gal4 (wstawka na drugim chromosomie) z linią EB1-GFP (wstawka na trzecim chromosomie). Ponieważ EB1-GFP jest pod kontrolą promotora UASp, sterownnik V32-Gal4 indukuje ekspresję EB1-GFP, jak również dowolnego transgenu UAS-RNAi wprowadzonego w kolejnych krzyżówkach, jeśli jest to pożądane.
3. Po wykluciu się potomstwa F1 (potomstwo), wybierz 10–15 samic o pożądanym genotypie (młodszy niż tydzień).
4. Przenieś samice, wraz z 2–3 samcami, do świeżego pojemnika zawierającego niewielką ilość pasty drożdżowej na powierzchni pokarmu. Pasta drożdżowa stymuluje ooogenezę i wspomaga postęp rozwoju komory jajowej. Obecność samców zapewnia kopulację, co również sprzyja dojrzewaniu komórek jajowych i składaniu jaj. Utrzymuj muszki w temperaturze 25 °C przez 2 dni.
   UWAGA: Aby zbadać rolę określonych genów w dynamice MT, wyciszenie białka można osiągnąć za pomocą systemu UAS/GAL4²¹, z publicznie dostępnym sterownikiem matczynym matα4-Gal4-VP16 (znanym również jako V32-Gal4; Tabela Materiałów), który inicjuje ekspresję Gal4 w komórkach zarodkowych od stanów 3–4 ooogenezy. Jak opisano powyżej, ten sterownnik indukuje ekspresję EB1-GFP, jak również konstrukcji UAS-RNAi, umożliwiając wyczerpanie białek interesujących tylko po przejściu stapania. Ta strategia omija potencjalne wczesne funkcje docelowych białek podczas początkowych podziałów mitotycznych i specyfikacji komórki jajowej. Przeprowadzając takie eksperymenty, muszki powinny być przygotowane zgodnie z opisem wcześniej.

2. Sekcja jajników

1. Znieczulić samice F1 za pomocą CO₂ na standardowej poduszce dla much i wybrać jedną samicę do sekcji.
2. Przenieś wybraną samicę bezpośrednio do 35 mm szklano-dennej miski (o grubości szkła 0,13–0,15 mm) i umieść kroplę oleju do obrazowania na wierzchu muchy.
3. Umieść muchę brzuchem w górę (skrzydła w dół). Używając jednej pary kleszczy, delikatnie przytrzymaj dolny tors za pomocą drugiej pary kleszczy, a za pomocą trzeciej pary kleszczy, zaciśnij odrobinę skóry brzusznej z tylnego końca brzucha.
4. Delikatnie wyciągnij trakt rozrodczy, ostrożnie wyciągając go przez otwór.
5. Izolują jajniki, a następnie pojedyncze jajniki, delikatnie przesuwając je przez olej za pomocą kleszczy. Podczas manipulacji jajnikami zawsze trzymaj je za starsze komory jajowe (etapy 13–14), aby uniknąć uszkodzenia bardziej delikatnych środkowych etapów (etapy 6–9), które są interesujące dla obrazowania (Rysunek 1A,B).
6. Chwyć przednią końcówkę jajnika, gdzie znajduje się stapanie i komory jajowe wczesnego etapu (Rysunek 1A,B). Nałożyć powolną, stałą siłę, aby oddzielić pojedyncze jajniki. Podczas wyciągania pojawią się komory jajowe na różnych etapach rozwoju. Ten proces można powtórzyć wielokrotnie na jednym jajniku, aby odizolować dodatkowe jajniki²² (zobacz wideo jako demonstrację).
   UWAGA: Dla komórek jajowych poddanych zimnemu traktowaniu w celu depolimeryzacji MT, sekcje wykonywano zgodnie z opisem wcześniej, ale z użyciem bufora BRB-80 zamiast oleju do obrazowania. Przecięte jajniki następnie przeniesiono do mikroprobówek zawierających BRB-80 i inkubowano na lodzie przez 15 min²³. Po inkubacji jajniki przeniesiono do szklano-dennej miski z obrazowaniem oleju, a protokół wznowiono od kroku 3.1.

3. Obraz

Results

To protokoll zostało pomyślnie wykorzystane do analizy dynamiki wzrostu i polarności MT w komórkach jajowych Drosophila melanogaster na średnich etapach ooogenezy, za pomocą EB1-GFP, białka śledzącego końce plusowe, które oznajmia miejsca aktywnej polimeryzacji MT^17,18. Kiedy są przedstawione za pomocą mikroskopii laserowo-skaningowej konfokalnej, EB1-GFP pojawia się jako jasne, punktowe „komety”, które poruszają się w kierunku wzrostu MT^17,18 (Rysunek 3A; Dodatkowy Wideo 1). Śledzenie i ilościowa ocena tych komet pozwala na precyzyjną ocenę nukleacji, elongacji i organizacji MT wewnątrz komórki jajowej. Używając tego protokołu przepływu pracy, dynamika MT została oceniona w komórkach jajowych kontrolnych i w komórkach jajowych poddanych eksperymentalnemu zaburzeniu sieci MT. Szczególnie, zachowanie komety EB1 zostało porównane w trzech warunkach: nieleczone komórki jajowe kontrolne, nieleczone komórki jajowe poddane zimnemu leczeniu i nieleczone komórki jajowe heterozygotycznego mutanta patronin poddane zimnemu leczeniu^12,26. Leczenie zimnem indukuje depolimeryzację MT, co pozwala na ocenę ponownego wzrostu MT podczas regeneracji. Heterozygotyczne komórki jajowe mutanta patronin (+/ patr⁰⁵²⁵²) zostały włączone jako dodatnia kontrola dla upośledzonej dynamiki MT. Patronin jest zachowanym stabilizatorem końców minusowych MT²⁷, a podstawowym składnikiem ncMTOC w komórkach jajowych¹² i innych tkankach². Poprzednie badania wykazały, że mutanty patronin poddane depolimeryzacji MT wykazują znaczne zmniejszenie liczby komet EB1 po ponownym wzroście¹². Dlatego włączenie heterozygotycznych mutantów patronin pozwoliło na walidację metody na tle znanego defektu ponownego wzrostu MT. Komórki jajowe stadium 7-8 zostały przedstawione, gdy centrosomy są osłabione, a MT generowane są przez ścieżki acentrosomalne.

Zgodnie z poprzednimi obserwacjami, najwyższa gęstość komet EB1 została wykryta w przednim regionie komórki jajowej, ze stopniowym zmniejszeniem w kierunku tylnym^14,15 (Rysunek 5B; Tabela 1; Dodatkowe Tabele 1 i 2). Aby odróżnić pomiędzy rzeczywistymi procesami polimeryzacji MT i stacjonarnymi lub poza-płaszczyznowymi sygnałami, ten protokół odróżnia pomiędzy całkowitą liczbą wykrytych ognisk EB1-GFP i podzbiorem ognisk, które są mobilne. Nieruchoma frakcja prawdopodobnie reprezentuje stacjonarne komety lub komety poruszające się głównie w płaszczyźnie osiowej (Rysunek 5A,B). Analizy długości ścieżek MT i prędkości wzrostu zostały przeprowadzone wyłącznie na mobilnych kometach EB1-GFP, aby uniknąć uwzględnienia stacjonarnych sygnałów lub ruchów osiowych, które mogłyby zakłócić oszacowanie długości ścieżki i prędkości. Całkowita liczba ognisk EB1-GFP i ruchoma frakcja są przedstawione na oddzielnych wykresach, aby umożliwić bezpośrednie porównanie między ogólnym wykryciem a dynamicznym zachowaniem (Rysunek 5A,B). W kontrolnych komórkach jajowych, protokół mierzył 0,189 ± 0,02 SEM komet EB1 mobilnych/µm² (18,9 komet EB1/100 µm²) w przednim regionie, następnie 0,064 ± 0,02 SEM i 0,043 ± 0,01 SEM komet EB1 mobilnych/µm² w środkowym i tylnym regionach, odpowiednio (6,4 i 4,3 komet EB1/100 µm²) (Rysunek 5B; Tabela 1; Dodatkowe Tabele 1 i 2). Poprzednie badanie²⁸ mierzące komety EB1 na tym samym etapie rozwoju wykryło 48,54 komet EB1/100µm², co jest wyższe niż wartości wykryte tutaj dla mobilnych komet EB1-GFP. Jednak wartości zmierzone są spójne, biorąc pod uwagę całkowitą liczbę wykrytych komet EB1-GFP (Rysunek 5A; Tabela 1; Dodatkowe Tabele 1 i 2). Sekcja Materiały i Metody tego badania nie określa, ile z-stacków zostało użytych do obrazowania komórek jajowych. Dlatego możliwe jest, że w analizie włączono więcej niż jeden z-stack, co mogłoby przyczynić się do wyższej liczby wykrytych komet EB1-GFP. Innym czynnikiem, który może wpłynąć na podaną wartość, jest region komórki jajowej wybrany do ilościowego określenia komet. Jeśli obszary zainteresowania zostały wybrane bliżej najprzedniej bieguna, gdzie gęstość komet EB1 jest najwyższa, mogłoby to zwiększyć średnią gęstość komet w porównaniu z pomiarami przedstawionymi tutaj. Niemniej jednak, uzyskane tutaj wyniki są w tej samej rzędności i konsekwentnie odzwierciedlają zmniejszenie gęstości kom

Discussion

Badanje w vivo dynamiki MT w jajnikach prezentuje unikalne wyzwania, ponieważ wymagają one wysokiej jakości zestawów danych i ilościowych analiz, aby wyciągnąć sensowne informacje. Podczas gdy poprzednie badania opisywały podejścia do badań w vivo^14,15,16, kroki analizy obrazu są często wysoce spersonalizowane, a protokoły nie dostarczają wystarczającej ilości szczegółów dla reprodukowalności. W konsekwencji, naukowcy bez rozległej wiedzy dotyczącej obrazowania czy komputerowych umiejętności mogą napotykać na przeszkody w reprodukowaniu tych analiz. Aby zmierzyć się z tymi wyzwaniami, opracowano uproszczony przepływ pracy, łączący wysokorozdzielcze obrazowanie Airyscan w vivo z przyjaznymi dla użytkownika, zautomatyzowanymi makrami i skryptami. Ten potok umożliwia wydajne wykrywanie i śledzenie komet EB1, a następnie ilościową analizę orientacji, prędkości i organizacji przestrzennej MT. Minimalizując interwencję manualną i zapewniając jasne, krokowe instrukcje, potok promuje dostępność i reprodukowalność analizy dynamiki MT w jajnikach.

Rozebranie jajnika i przygotowanie próbki to krytyczne pierwsze kroki. Jajo musi być starannie rozdzielane, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych, a czas obrażania powinien być ograniczony do 90 minut, aby zachować żywotność²⁰. Selekcja etapu jest ważna: po środkowej fazie oogenezy jajo zwiększa się w rozmiarze i gromadzi żółtko w cytoplazmie, co utrudnia wizualizacje sygnału EB1 powyżej 9. etapu. Dlatego też obrażanie powyżej 9. etapu nie jest zalecane²⁰. Również, dla reprodukowalnych ilościowych wyników, jeśli to możliwe, jaja o porównywalnej wielkości są preferowane, gdyż to zapewnia, że określone obszary zainteresowania odpowiadają równoważnym pozycjom przednio-tylnym wśród próbek.

Kontrola temperatury jest istotna dla reprodukowalności. Linie lotników powinny być utrzymywane w standardowych warunkach hodowli (25 °C), aby wspierać normalny rozwój i konsystencję ekspresji EB1-GFP, szczególnie przy użyciu systemu GAL4/UAS, który jest wrażliwy na wahania temperatury. Stabilność temperatury podczas obrażania jest równie ważna, gdyż zmiany mogą wpływać na dynamikę MT. Chociaż komora kontrolująca temperaturę nie jest wymagana, unikanie wahań temperatury podczas nabywania danych jest zalecane.

Dla nabywania obrazu, wybrana została konfokalna technika obrażania z detektorem matrycowym ze względu na jej wysoką wrażliwość i poprawioną SNR, minimalizując potrzebę denoizyfikacji po nabywaniu danych. Wysokonumeryczne obiektywy (tak wysokie, jak to możliwe) w połączeniu z odpowiednim dopasowaniem indeksu załamania światła powinny być używane, aby zmaksymalizować rozdzielczość boczną i osiową, co jest kluczowe dla rozdzielania indywidualnych komet w gęstych sieciach. Równie ważne jest staranne wybranie płaszczyzny obrażania wzdłuż osi z. Obrażanie zbyt głęboko prowadzi do utraty fluorescencji z powodu rozproszenia światła, podczas gdy ograniczenia nabywania do powierzchni kory nie pozwalają na uchwycenie pełnej dynamiki komet EB1. Najbardziej pouczające dane są uzyskiwane na średniej pozycji z. Jajo, w którym jądro znajduje się na wybranej płaszczyźnie, powinno być unikanie, ponieważ komora jądrowa przemieszcza dużą część cytoplazmy i nie posiada ścieżek EB1, co zmniejsza liczbę wykrywalnych komet.

Mimo że optymalizowane dla konfokalnej techniki obrażania z detektorem matrycowym, ten potok analizy jest niezależny od sprzętu i kompatybilny z innymi modalnościami, takimi jak mikroskopia konfokalna z dyskiem wirującym. Jednak użytkownicy powinni mieć świadomość, że systemy z niższymi wartościami NA lub SNR mogą wymagać korekt parametrów preprocesowania makr (np. tolerancja na szum/sigma DoG) i mogą prowadzić do zmniejszenia gęstości wykrywanych komet w porównaniu z wartościami przedstawionymi w tym badaniu. Mimo to, podczas gdy wartości absolutne mogą się różnić pomiędzy systemami, relatywne trendy obserwowane pomiędzy warunkami eksperymentalnymi i ROI spodziewają się pozostać odporne.

Mając na uwadze dużą strukturę 3D jaja, obrazowanie 2D uchwytuje tylko optyczną sekcję sieci MT. W konsekwencji, komety poruszające się stromo wzdłuż osi z mogą opuścić płaszczyznę fokusu, co może prowadzić do niedoszacowania czasu trwania ścieżek i prędkości bezwzględnej (ponieważ mierzy się tylko komponent xy wektora prędkości). Jednakże, wysokoszybkowe obrażanie 3D objętościowe całego jaja wymagałoby mniejszych pól widzenia (FOV), krótszych czasów ekspozycji i szybszych czasów reakcji detektora, co zmniejsza SNR i rozdziela czas nabywania danych na wiele poziomów z, co kompromisuje rozdzielczość czasową wymaganą do śledzenia szybkich komet EB1. Aby złagodzić komety, które się nie poruszają, i artefakty poza fokusem, zastosowano filtry konwolucyjne i minimalnej trwałości ścieżki (wykluczając ścieżki mniejsze niż 3 klatki), aby usunąć przejściowe punkty przecinające pła

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
EB1::GFP	Od Dr. Antoine Guichet, CNRS, Institut Jacques Monod, Francja		Genotyp: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Glass-bottom Petri dishes	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα4-Gal4-VP16	Bloomington Drosophila Stock Center	7062	Genotyp: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Oil 10S, VOLTALEF	VWR Chemicals	24627.188
Patronin mutant	Bloomington Drosophila Stock Center	16647	Genotyp: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
Zeiss LSM 980 with Airyscan 2	Zeiss