Workflow do obrazowania na żywo i analizy ilościowej sieci mikrotubul acentrosomalnych w jajkach Drosophila

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół łączący obrazowanie na żywo z automatycznymi narzędziami analitycznymi do analizy dynamiki mikrotubul w oocze Drosophila . Ten workflow umożliwia efektywne i powtarzalne pomiary zachowania mikrotubul, w tym wzrostu, orientacji, szybkości i organizacji przestrzennej, i może być dostosowany do innych typów komórek po optymalizacji.

Abstract

Cytoszkielet mikrotubuli (MT) jest niezbędny do wielu funkcji komórkowych, w tym kształtu komórek, polaryzacji, migracji i podziału. Podczas gdy centrosomy pełnią rolę głównego centrum organizującego MT (MTOC) w dzielących się komórkach zwierzęcych, wiele komórek różnicowych, w tym oocytów Drosophila , polega na szlakach acentrosomalnych do tworzenia sieci MT. W przeciwieństwie do rozległej wiedzy o organizacji MT w komórkach proliferujących się, niewiele wiadomo o tym, jak sieci MT składają się bez centrosomów. Oocyty Drosophila stanowią potężny model do badania organizacji i dynamiki acentrosomalnego MT. Jednak ich gęsta sieć MT stanowi wyzwanie dla konwencjonalnego obrazowania. Obrazowanie na żywo umożliwia wizualizację wzrostu i orientacji MT w czasie rzeczywistym, jednak standaryzowane metody analizy pozostają ograniczone. Przedstawiamy protokół oparty na obrazowaniu na żywo, analizujący dynamikę wzrostu MT w oocytach Drosophila , wykorzystując End-Binding Protein 1 (EB1)-Green Fluorescent Protein (GFP), białko śledzące plus end, które oznacza miejsca aktywnej polimeryzacji MT. Wysokorozdzielcza mikroskopia konfokalna Airyscan umożliwia wykrywanie komet EB1, podczas gdy niestandardowe makra Fiji i skrypty Pythona zapewniają uprostronioną, powtarzalną ilościową ilościową liczbę gęstości, prędkości, długości i orientacji komet. Zweryfikowaliśmy tę metodę, porównując kontrolne oocyty z tymi poddanymi depolimeryzacji MT wywołanej przez zimno, a także mutantów Patronin (CAMSAP u ludzi), konserwowanego stabilizatora MT minus-end oraz kluczowego składnika niecentrosomalnych centrów organizujących mikrotubule (ncMTOC), jako dodatniej kontroli zaburzonej dynamiki MT. Nasze analizy ujawniły specyficzną dla regionu dynamikę MT, w tym przednie wzbogacenie komet EB1 oraz charakterystyczne błędy orientacji, a także potwierdziły wrażliwość przepływu na wykrywanie subtelnych zaburzeń wzrostu MT. To podejście zapewnia niezawodne, przyjazne dla użytkownika ramy do badania zachowań MT w oocytach. Protokół krok po kroku umożliwia badanie regulatorów MT w tym kontekście i może być dostosowany do innych zróżnicowanych typów komórek, takich jak neurony i komórki nabłonkowe, przy odpowiedniej optymalizacji. Szerzej rzecz biorąc, wspiera badania mechanistyczne i badania genetyczne badające, jak różnorodne architektury MT leżą u podstaw wyspecjalizowanych funkcji komórkowych.

Introduction

Cytoszkielet mikrotubuli (MT) jest niezbędnym elementem komórki eukariotycznej, odgrywając istotną rolę w kształtowaniu i utrzymywaniu kształtu, polaryzacji oraz podziału komórki. Dynamiczne zachowanie polimerów MT, charakteryzujące się wzrostem i kurczeniem się, jest kluczowe dla wielu procesów opartych na MT ^1,2. Montaż różnych matryc MT opiera się na łącznym działaniu centrów organizujących mikrotubule (MTOC), z których są jądrowane MT, oraz aktywności różnych białek regulacyjnych MT, które kontrolują stabilność, orientację i dynamikę MT ^1,2,3. Najlepiej zbadanym MTOC jest centrosom, który generuje radialne układy MT istotne dla regulacji kształtu i polaryzacji komórek w fazie interfazowej oraz dla montażu wrzeciona mitotycznego w mitozie ^4,5. Jednak po wyjściu lub różnicowaniu mitotycznym, podobnie jak w neuronach i komórkach nabłonkowych, aktywność MTOC w centrosomie jest często osłabiona, a w skrajnych przypadkach, takich jak w oocytach, można ją wyeliminować ^6,7. Często wiąże się to z remodelacją cytoszkieletu MT specyficzną dla typu komórki, z przypisaniem funkcji MTOC innym miejscom komórkowym ^2,3,8, zwykle określanym jako niecentrosomalne MTOC (ncMTOC). Chociaż poczyniono znaczne postępy w wyjaśnianiu organizacji MT w komórkach mitotycznych, stosunkowo niewiele wiadomo o tym, jak MT są jądrowane, stabilizowane i przestrzennie uporządkowane w komórkach zwierzęcych wychodzących z mitozy lub przechodzących różnicowanie². Co istotne, u organizmów żywych większość komórek nie dzieli się; opuściły cykl komórkowy i/lub się różnicowały. Dlatego kluczowe jest zrozumienie, jak cytoszkielet MT jest składany i regulowany w tych kontekstach. Ta wiedza jest niezbędna do odkrycia, jak różne architektury MT są tworzone, aby wspierać wyspecjalizowane funkcje komórkowe.

Oocyt Drosophila melanogaster zapewnia potężny system do badania organizacji i funkcji acentrosomalnego MT. W średnich stadiach oogenezy aktywność centrosomu jest osłabiona⁹, a MT powstają z ncMTOC zlokalizowanych w korze przed-bocznej oocytu (Rysunek 1B). Ta sieć MT jest niezbędna do lokalizacji mRNA, białek i organelli matki, które z kolei są kluczowe dla ustanowienia osi i rozwoju przyszłych zarodków^10,11. Wcześniejsze badania wykazały, że ncMTOC w oocze składają się z MT minus-end białka Patronin, które tworzy kompleks z białkiem spektraplakiny Shot, zakotwiczonym w cytoszkieletze aktyny korowej. Zaproponowano, aby MT rosły z krótkich fragmentów MT powstałych przez enzymy odcinających, takich jak katanin, które mogą działać jako nasiona do dalszej polimeryzacji MT¹². Podobne mechanizmy zaproponowano także w innych komórkach zróżnicowanych, takich jak neurony¹³, gdzie aktywność centrosomalna jest zmniejszona. Jednak mechanizmy, dzięki którym przerywanie generuje złożone sieci MT, takie jak w oocytu, pozostają słabo poznane. Wciąż nie jest jasne, czy MT w tych kontekstach powstają głównie w wyniku przerażenia opartego na przerywaniu, czy też w wyniku połączenia zerwania i nukleacji de novo MT. Złożoność sieci MT oocytów czyni ją idealnym systemem do badania sposobu generowania i organizacji MT poza dobrze znanym kontekstem centrosomalnym. Co istotne, stanowi to również wyzwanie dla obrazowania i analizy: gęsta sieć MT w ojaju utrudnia rozdzielenie pojedynczych MT przy użyciu konwencjonalnego immunobarwienia lub statycznych metod obrazowania ^2,14.

Obrazowanie na żywo znacznie poprawiło możliwość badania sieci MT, ponieważ pozwala na wizualizację zdarzeń polimeryzacji MT w czasie rzeczywistym, oferując kluczowe informacje o dynamice i orientacji wzrostu MT. Wcześniejsze badania skutecznie analizowały dynamikę wzrostu MT w oocytach za pomocą obrazowania na żywo markerów plus-end 14,15,16. Jednak w wielu przypadkach procedury analizy obrazów używane do ilościowego określania dynamiki MT są opisywane tylko pobieżnie, opierają się na niestandardowych lub laboratoryjnych implementacjach albo nie są publicznie udostępniane, co ogranicza powtarzalność i szersze wdrożenie. Nasza metoda opiera się na tych wcześniejszych podejściach, oferując w pełni udokumentowany, otwarcie dostępny i przyjazny dla użytkownika pipeline analityczny, który umożliwia ustandaryzowaną ilościową ilościową liczbę parametrów wzrostu MT w zbiorach danych i warunkach eksperymentalnych. W tym protokole dynamika MT jest obrazowana w połowie oogenezy, gdy cytoszkielet MT jest organizowany przez acentrosomalne sieci MT. Rosnące MT są wizualizowane za pomocą EB1-GFP, białka śledzącego MT plus end^17,18, a następnie pobierane za pomocą laserowej mikroskopii konfokalnej z detektorem matrycowym w trybie wysokiej prędkości. Nowość naszego podejścia tkwi w analizie obrazów: w pełni udokumentowanym, przyjaznym dla użytkownika pipeline'owi krok po kroku, który wymaga wybierania tylko obszarów zainteresowania. Przetwarzanie i ilościfikację obrazów ułatwiają niestandardowe makra Fiji oraz skrypty Pythona, co umożliwia efektywne, powtarzalne wykrywanie komet EB1 oraz wyodrębnianie parametrów, takich jak orientacja wzrostu, prędkość i organizacja przestrzenna. Te ramy stanowią standaryzowane i dostępne narzędzie do porównywania dynamiki MT w różnych warunkach eksperymentalnych.

W tym manuskrypcie stosujemy tę metodę do porównania wzrostu MT w kontrolnych oocytach oraz w oocytach depolimeryzowanych przez zimno. Służy to zarówno do weryfikacji protokołu, jak i wspierania przyszłych badań mających na celu rozłożenie roli białek kandydatów w regulacji MT.

Protocol

1. Genetyka much

UWAGA: Aby zobrazować MT w oocytzie, protokół ten wykorzystuje publicznie dostępny transgen (Tabela materiałów), który wyraża MT plus end śledzące białko EB1, oznaczone tagiem GFP (Green Fluorescent Protein)¹⁹. EB1-GFP wiąże się konkretnie z rosnącymi MT i końcówkami, które pojawiają się jako fluorescencyjne "komety" poruszające się w kierunku polimeryzacji^17,18. Pozwala to na wizualizację i ilościowość dynamiki wzrostu MT, w tym orientacji wzrostu, prędkości i rozkładu przestrzennego w ooccie^14,20.

1. Wszystkie szczepy much utrzymuj na standardowym podłożu z mąki kukurydzianej i agaru w temperaturze 25 °C, stosując standardowe techniki hodowli Drosophila .
2. Krzyżuj 8–12 dziewiczych samic noszących transgen UAS-RNAi ukierunkowany na ekspresję interesującego białka z 5 samcami genotypu matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
   UWAGA: Aby uprościć krzyżowanie genetyczne, wygeneruj zapas muchy przez skrzyżowanie linii V32-Gal4 (wstawka na drugim chromosomie) z linią EB1-GFP (wstawienie na trzecim chromosomie). Ponieważ EB1-GFP jest kontrolowany przez promotor UASP, sterownik V32-Gal4 indukuje ekspresję EB1-GFP, a także dowolnego transgenu UAS-RNAi wprowadzonego w kolejnych krzyżowaniach, jeśli jest to pożądane.
3. Po wykluciu się potomstwa F1 wybierz 10–15 samic pożądanego genotypu (mniej niż tydzień mające lata).
4. Przenieś samice, wraz z 2–3 samcami, do świeżej fiolki zawierającej niewielką ilość pasty drożdżowej na powierzchni pokarmu. Pasta drożdżowa stymuluje oogenezę i wspiera rozwój komory jajowej. Obecność samców zapewnia kopulację, co również sprzyja dojrzewaniu oocytów i składaniu jaj. Utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C przez 2 dni.
   UWAGA: Aby zbadać rolę konkretnych genów w dynamice MT, knockdown białek można osiągnąć za pomocą systemu UAS/GAL4²¹, z publicznie dostępnym czynnikiem matα4-Gal4-VP16 (znanym również jako V32-Gal4; Tabela materiałów), która inicjuje ekspresję Gal4 w linii germinalnej od stanów 3–4 oogenezy. Jak opisano powyżej, ten czynnik indukuje ekspresję EB1-GFP oraz struktur UAS-RNAi, umożliwiając wyczerpanie interesujących białek dopiero po etapie germarium. Ta strategia omija potencjalne wczesne funkcje docelowych białek podczas początkowych podziałów mitotycznych i specyfikacji oocytów. Podczas przeprowadzania takich eksperymentów muchy powinny być przygotowane zgodnie z opisaniem wcześniej.

2. Rozwarstwienie jajnika

1. Znieczulaj samice F1 za pomocą CO₂ na standardowej poduszce muchowej i wybierz jedną samkę do sekcji.
2. Przenieś wybraną samicę bezpośrednio na talerz o szklanym dnie o średnicy 35 mm (o grubości szkła 0,13–0,15 mm) i umieść kroplę oleju obrazującego na wierzchu muchy.
3. Ustaw muchę skierowaną brzuszną stroną do góry (skrzydła skierowane w dół). Używając jednej pary pęsety, delikatnie chwyć dolną część tułowia pęsetą, a drugą pęsetą uszczypnij kawałek skórki brzusznej z tylnego końca odwłoka.
4. Delikatnie wyciągnij drogi rozrodcze, wyciągając je przez otwór.
5. Odizoluj jajniki, a następnie poszczególne jajniki, delikatnie przesuwając je przez olej za pomocą pęsety. Podczas manipulacji jajnikami zawsze trzymaj je przy starszych komorach jajowych (stadia 13–14), aby uniknąć uszkodzenia bardziej delikatnych stadiów środkowych (stadia 6–9), które są interesujące do obrazowania (Rysunek 1A,B).
6. Chwyć przedni czubek jajnika, gdzie znajdują się germarium i komory jajowe we wczesnym stadium (Rysunek 1A,B). Stosuj powolne, stałe napięcie, aby oddzielić poszczególne jajki. Podczas wyciągania wyłaniają się komory jajowe na różnych etapach rozwoju. Proces ten można powtarzać wielokrotnie na jajnik, aby wyizolować dodatkowe ovariole²² (zobacz wideo dla demonstracji).
   UWAGA: W przypadku oocytów poddanych zimnej obróbce w celu depolimeryzacji MT przeprowadzono sekcje zgodnie z opisaną wcześniej, ale z użyciem buforu BRB-80 zamiast oleju obrazowego. Rozcięte jajniki były następnie przenoszone do mikrorurek zawierających BRB-80 i inkubowane na lodzie przez 15 minut^{i 23} minuty. Po inkubacji jajniki były przenoszone do misy z szklanym dnem z olejem obrazującym, a protokół wznowiono od kroku 3.1.

3. Obrazowanie na żywo

1. Umieść szklaną antenę na stole mikroskopu za pomocą odpowiedniego uchwytu na szkiełko.
2. Wybierz komory jajowe stadium 7 lub 8 do obrazowania.
   UWAGA: Komory jajowe na tych etapach można zidentyfikować na podstawie wielkości oocytu i pozycji jądrowej. Oocyt jest wyraźnie większy niż pojedyncze komórki pielęgniarskie i zajmuje około jednej trzeciej (stadium 7) do połowy (stadium 8) komory jajowej. Jądro oocytu znajduje się w przedniej korze oocytu, obok komórek pielęgniarskich²⁴.
3. Unikaj obrazowania komór jajowych, które wykazują nieciągłość w zewnętrznej warstwie mieszków mieszkowych lub inne oznaki uszkodzenia, które mogą wskazywać na mechaniczne zakłócenia spowodowane kleszczemi. Dla optymalnej jakości obrazu należy użyć szybkiego systemu obrazowania konfokalnego o wysokim stosunku sygnału do szumu (SNR) i obiektywie 63x (1,40 NA, zanurzenie olejowe). Upewnij się, że przestrzegasz kryteriów próbkowania według Nyquist-Shannon.
4. Dostosuj ostrość i określ odpowiednią ekspozycję, ponieważ może się ona różnić w zależności od użytej konstrukcji EB1 (np. różnych promotorów lub znaczników fluorescencjowych) oraz systemu mikroskopu. Sygnał powinien być wystarczająco jasny, aby śledzić dynamikę komety, ale nie nasycony ani zasłonięty przez fluorescencję tła.
5. Ustaw laser 488 nm tak, aby wzbudził fluorofor GFP (10% mocy lasera; wzmocnienie detektora = 750 V). Wybierz odpowiedni zestaw filtrów o promieniowaniu 500–550 nm lub równoważny dla fluoroforu GFP.
6. Pobierz filmy time-lapse o długości co najmniej 4 minuty, z interwałem klatki 500 ms (2 klatki/s), aby uzyskać wystarczające dane do śledzenia poszczególnych końców MT plus. (Wideo uzupełniające 1 ilustruje reprezentatywne pozyskanie czasopoklatkowe odpowiednie do późniejszej analizy śledzenia maszynowego).
7. Przetwarzaj uzyskane obrazy za pomocą przetwarzania detektora matrycowego w oprogramowaniu do akwizycji mikroskopu z domyślną siłą filtra przetwarzającego.
   UWAGA: Po zanurzeniu w olejku obrazującym rozcięte jajniki pozostają żywotne do 90 minut. W tym okresie komory jajowe można obrazować bez istotnych oznak degeneracji. Po tym okresie należy rozciąć nową samicę i przygotować świeże komory jajowe do obrazowania²⁰.

4. Przetwarzanie obrazu

Wykonaj następujący workflow, aby wygenerować wykresy i statystyki do ilościowego określenia różnych parametrów związanych z dynamiką MT. Każdy krok wykonuj automatycznie za pomocą makra/skryptu lub ręcznie, stosując się do protokołu (Rysunek 2). Wszystkie makra Fiji, skrypty śledzące oraz kod analityczny Pythona używane w tym workflow są udostępnione jako Dodatkowe Pliki Kodowania 1–7.

1. Wstępne przetwarzanie obrazu – KROK 1
   Następne kroki to przygotowanie surowych obrazów time-lapse poprzez korektę fotoblajchowania i redukcję szumów tła, zapewniając stabilność sygnału do śledzenia. Po pierwsze, widoczność EB1 jest zwiększana dzięki filtrowi Różnicy Gaussów (DoG), który działa jako filtr przestrzenny z przepustowością. Poprzez odjęcie mocno rozmytego obrazu od lekko rozmytego, proces ten tłumi niskoczęstotliwościowe cytoplazmatyczne zamglenie i szum pikseli o wysokiej częstotliwości, jednocześnie izolując sygnał komet EB1 ograniczony dyfrakcją. Po drugie, stosuje się filtr gradientu czasowego, aby wzmocnić szczególnie rosnące końcówki MT. Stos obrazów jest przecięty, aby odwzorować wymiar czasowy na przestrzenną oś Y. Następnie stosuje się jednowymiarową konwolucję z jądrem [-1 0 1], aby obliczyć pochodną czasową dla każdego piksela, podkreślając krawędź natarcia poruszających się komet, gdzie intensywność rośnie najszybciej. Następnie stos jest ponownie przecinany do pierwotnych wymiarów, scalany w obraz kompozytowy i eksportowany do analizy.
   UWAGA: Ten krok można wykonać w trybie wsadowym dla wszystkich plików w folderze, przeciągając plik makra File1.Step1_MTs_macro.ijm (Supplementary Coding File 1) do Fiji i uruchamiając makra.
   1. Konieczna instalacja wtyczki (jednorazowa konfiguracja)
      1. Launch Fiji. Przejdź do Plugins > Install w pasku menu.
      2. W przeglądarce plików wybierz plik File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (Supplementary Coding File 7) dołączony do tego protokołu.
      3. Gdy pojawi się pytanie o zapisanie wtyczki, upewnij się, że docelowym folderem jest domyślny folder plugins w katalogu instalacyjnym Fiji i kliknij Zapisz.
      4. Zrestartuj Fiji , aby zakończyć instalację.
         UWAGA: Ta skompilowana wersja wtyczki jest identyczna z wbudowaną wersją Fiji, ale eliminuje wymóg instalacji osobnego Java Development Kit (JDK), usprawniając proces konfiguracji.
   2. Korekcja wybielacza i usuwanie szumów:
      1. Otwórz Fiji, a następnie otwórz każdy plik za pomocą wtyczki importera Bio-Formats
      2. Kompensuj spadek fluorescencji w czasie, uruchamiając wtyczkę Bleach Correction, używając korekty Simple-Ratio (tło = 0).
      3. Uruchom Kalman Stack Filter Compiled (acquisition_noise = 0,1; polaryzacja = 0,7), aby tłumić losowy szum fotonów, jednocześnie zachowując prawdziwą dynamikę sygnału w czasie
      4. Jeśli chcesz, przytnij powstały wymiar czasu obrazu, aby skrócić czas przetwarzania.
         UWAGA: Te kroki generują obraz z zaciemnianiem, który później pojawia się jako kanał 1 na końcu kroku 1 (4.1.5) (Rysunek 3A). Zaleca się wyłączenie pierwszych 5 do 10 klatek (punktów czasowych), ponieważ okno toczące filtra Kalmana filtruje te początkowe klatki tylko częściowo.
   3. Różnica w ulepszaniu cech Gaussów (DoG):
      1. Zduplikuj obraz z wersji 4.1.2.4 dwa razy (kliknij prawym przyciskiem myszy i kliknij Duplicate).
      2. Zastosuj wtyczkę Gaussian Blur do jednej kopii przy użyciu niskiego sigma (σ = 1).
      3. Zastosuj wtyczkę Gaussian Blur do drugiej kopii, używając wysokiego sigma (σ = 8).
      4. Otwórz wtyczkę Image Calculator i odejmij obraz o wysokim sigma od obrazu o niskim sigma (= Niski – Wysocy), aby wyodrębnić drobne szczegóły.
      5. Usuń tło, używając matematyki Fidżi > odejmuj i wybierz wartość (próg wartości G = 100), aby zachować tylko prawdziwy sygnał, jeśli jest to konieczne.
         UWAGA: Te kroki generują obraz różnicy Gaussa, który później pojawia się jako kanał 2 na końcu kroku 1 (4.1.5) (Rysunek 3B).
   4. Wzmocnienie sygnału EB1-GFP:
      1. Wybierz obraz z wersji 4.1.2.4 i użyj wtyczki Reslice z ustawieniami: góra, Brak interpolacji.
      2. Użyj wtyczki Convolve 2D z jądrem [–1 0 1], aby ulepszyć wskazówki do MT.
      3. Użyj ponownie wtyczki Reslice z tymi samymi ustawieniami, aby przywrócić oryginalne wymiary obrazu.
      4. UWAGA: Te kroki wygenerują obraz z wzmocnionym sygnałem EB1-GFP. Ten obraz pojawi się później jako kanał 3 na końcu kroku 1 (4.1.5) (Rysunek 3C).
      5. Łączenie kanałów i eksport obrazu:
         1. Połącz obraz MT EB1-GFP (4.1.2.4) z obrazem Difference of Gaussians (4.1.3.5) oraz obrazem wzmocnienia sygnału EB1-GFP (4.1.4.3) za pomocą wtyczki Merge Channels. Upewnij się, że obraz przeznaczony do dalszej analizy zostanie umieszczony na Kanale 3 podczas procesu fuzji.
         2. Zapisz powstały plik jako plik .tif, używając formatu nazewnictwa: "filename"_processed.tif. Upewnij się, że obraz używany do analizy końcowej kończy się _processed.tif
2. Regiony zainteresowania (ROI) - KROK 2
   W tym etapie zostaną zdefiniowane trzy ROI wzdłuż osi przedzodzadnej oocytu: przedni (ROI1), środkowy (ROI2) i tylny (ROI3). Wykonaj tę segmentację przestrzenną, aby umożliwić analizę dynamiki MT w różnych obszarach oocytu.
   UWAGA: Ten krok 2 można uruchomić dla każdej "nazwy pliku"_processed.tif przeciągając plik makra File_2_Step2_MTs_macro.ijm (Supplementary Coding File 2) do Fiji i naciskając Run. Makro poprosi użytkownika o ręczne narysowanie prostokąta w oocie. Obszar najbliższy początku wielokąta (pierwsze kliknięcie) odpowiada pierwszemu zwrotowi z inwestycji. Wybrany region prostokątny zostanie automatycznie podzielony na równe prostokątne ROI. Jeśli nie zostaną zapisane zwroty z inwestycji, kolejne kroki będą wykonywane w pełnym obrazie.
   1. Definiowanie zwrotów z inwestycji:
      1. Otwórz docelowy plik za pomocą Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer.
      2. Użyj narzędzia Polygon, aby narysować obszar zainteresowania obejmujący wybrany obszar.
      3. Dodaj wybrany region do menedżera ROI (naciśnij klawisz T).
      4. Powtórz krok 4.2.1, aby sprawdzić, ile potrzebnych zwrotów z inwestycji.
   2. Obszar pomiaru i eksportu:
      1. Wybierz pierwszy zwrot z inwestycji
      2. Uruchom Analizę → Mierzenie i zapisz wartość Obszar jako plik o nazwie: "nazwa pliku"_processed_RoiArea.csv
         UWAGA: Nazwa pliku musi odpowiadać oryginalnej nazwie obrazu i kończyć się na: _processed_RoiArea.csv
      3. Użyj menedżera ROI, aby zapisać ROI. Użyj tej samej nazwy pliku co . Rozszerzenie ROI dla jednego ROI lub .zip rozszerzenie dla wielu ROI.
3. Wykryj i śledź komety EB1-GFP – KROK 3
   Użyj wtyczki TrackMate²⁵ , aby wykrywać komety EB1-GFP i śledzić ich ruch w czasie.
   UWAGA: STEP 3 można zastosować do każdej "nazwy pliku"_processed.tif przeciągając plik makro File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (Supplementary Coding File 3) do Fiji i naciskając RUN. Następnie wybierz folder do przetworzenia. ROI będą automatycznie ładowane, a analiza zostanie przeprowadzona dla każdego pliku, generując odpowiadające im wyjścia spotów i ścieżek. Przed przetwarzaniem wsadowym zaleca się analizę 2–3 reprezentatywnych obrazów, aby wizualnie zweryfikować, czy domyślne ustawienia detektora i śledzenia są odpowiednie dla rozmiaru i dynamiki komet. Jeśli ustawienia są odpowiednie, użytkownik może dostosować odpowiednie parametry, aby dokładnie śledzić wskazówki EB1, minimalizując tym samym liczbę fałszywych negatywów i fałszywych pozytywów.
   1. Otwórz docelowy plik za pomocą Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer
   2. Otwórz wtyczkę TrackMate. Wybierz TAK, jeśli poproszono o zamianę T i Z.
   3. Wybierz Detektor logów. Ustaw średnicę cząstki na 0,5 μm (dostosuj w razie potrzeby)
   4. Ustaw próg jakości na 30 (dostosuj w razie potrzeby). Aktywuj zarówno lokalizację subpikselową, jak i Pre-process za pomocą filtra mediany.
   5. Usuń wszelkie dodatkowe filtry punktowe. Wybierz metodę śledzenia Kalmana
   6. Ustaw promień przeszukiwania na 0,5, promień przeszukiwania 0,7, a maksymalną przerwę w klatkach na 2 (dostosuj w razie potrzeby – promień początkowego przeszukiwania zasiewa tracker, promień przeszukiwania decyduje, jak daleko miejsce może się przesunąć między klatkami, a maksymalna przerwa pozwala na krótkie zniknięcia trajektorii).
   7. Pomiń filtrowanie utworów, które się pojawi. Po ukończeniu ścieżki przejdź do Spots → Export do CSV i nazwij plik "filename"_ROI01_spots.csv
   8. UWAGA: Nazwa plików powinna odzwierciedlać liczbę analizowanych ROI. Jeśli używa się wielu zwrotów z inwestycji, zapisz każdy plik wyjściowy z odpowiednim identyfikatorem, takim jak _ROI01, _ROI02 itp.
4. Wizualizacja danych i analiza ilościowa – KROK 4
   Użyj skryptów Pythona do przetwarzania danych śledzenia i obliczania kluczowych parametrów, w tym liczby komety, prędkości, czasu życia, spójności kątowej oraz orientacji. Skrypty te generują tabele podsumowujące (pliki CSV), wykresy oraz analizę statystyczną, wspierającą ilościową analizę dynamiki MT (Rysunek 4).
   1. Konfiguracja środowiska programowego:
      1. Zainstaluj dystrybucję Python (3.12). Upewnij się, że zainstalowano następujące zewnętrzne biblioteki Pythona (za pomocą pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodels notebook): Pandas i NumPy (do obsługi struktur danych i obliczeń numerycznych), SciPy i Statsmodels (konkretnie scipy.stats, do statystyki kołowej i testowania hipotez), Matplotlib i Seaborn (do generowania wykresów róż i statystycznych wykresów słupkowych), IPython (do narzędzi wyświetlania w notatniku), Jupyter Notebook (do korzystania z notesu).
      2. Umieść niestandardowe moduły analityczne (File_5_MTModule1.py i File_6_MTModule2.py – Supplementary Coding Files 5 i 6) w katalogu głównym obok notatnika analitycznego (File 4_Step4_MTs_results.ipynb – Supplementary Coding File 4).
      3. Otwórz notes Jupyter, uruchamiając polecenie "jupyter notebook" w terminalu Python i ładuj notes File 4_Step4_MTs_results.ipynb – Supplementary Coding File 4.
   2. Dane wejściowe i definicja parametrów:
      1. Wypełnij bazę danych, aby odwzorować biologiczne repliki na ich eksperymentalne metadane.
      2. Podaj następujące dla każdego eksperymentu: Nazwa bazy: unikalny ciąg identyfikatorów znaleziony w nazwach plików, Warunek: Grupa eksperymentalna (np. "Kontrola", "Traktowany"), Kąt korekcji: Kąt potrzebny do wyrównania ROI z osią biologiczną (np. Przedni = 0°).
      3. Dostosuj parametry: eksportuj format obrazu i dpi, kolory wykresu oraz domyślny rozmiar kosza do obliczeń kątowych
      4. Ustaw parametry filtrowania danych, aby wykluczyć krótkie ścieżki: Minimalna długość ścieżki: ścieżki krótsze niż ten czas są odrzucane
   3. Wykonanie potoku analitycznego:
      1. Odczytaj i wykonaj wszystkie komórki kodu, aby przetworzyć surowe dane śledzenia. Skrypt iteruje przez listę bazy danych, wykonując następujące kroki proceduralne:
         1. Zidentyfikuj wszystkie pliki CSV specyficzne dla ROI powiązane z każdą nazwą bazy.
         2. Filtruje się ślady oparte na minimalnej długości (zachowuje się tylko trajektorie utrzymujące się dłużej niż 3 klatki), oblicza prędkości natychmiastowe, oblicza całkowite przemieszczenie i stosuje korekcję kąta odniesienia do wszystkich trajektorii.
         3. Normalizuj liczbę kometów według obszaru ROI (ładowanego z metadanych), aby obliczyć gęstość komet.
      2. Agreguj przetworzone dane do zbioru danych głównych (df_all) i obliczaj ogólne statystyki podsumowujące (średnia prędkość, czas trwania trasy i długość wektora spójności kątowej) dla każdego ROI.
      3. Wykonaj funkcję make_combined_rose_panel, aby wygenerować zgrupowane wykresy róż. Tworzy to porównanie kątowych rozkładów kątowych obok siebie dla wszystkich ROI w ramach każdego warunku eksperymentalnego. Wykonaj create_comprehensive_analysis_plots_enhanced, aby tworzyć wykresy słupkowe dla metryk skalarnych.
      4. Wykonaj funkcję run_angle_analysis_pipeline, aby przeprowadzić analizę orientacji specyficznej:
         1. Klasyfikuj tory do stref orientacyjnych za pomocą dwóch strategii: Cardinal Binning (4 biny o szerokości 90°: północ/przód, wschód/prawo, południe/tył, zachód/lewo) oraz przednie/tylne binowanie (2 biny o 180° przednim vs. tylnym).
         2. Oblicz procent torów poruszających się w każdej zdefiniowanej orientacji na oocyt.
   4. Analiza statystyczna i generowanie wyników:
      1. Iteruj przez zdefiniowane metryki skalarne: średnia liczba komety na klatkę na obszar, średnia długość toru komety oraz średnia prędkość komety. Dla każdej metryki wykonuje się:
         1. Wykonaj testy Kruskala-Wallisa lub Mann-Whitney U dla niezależnych porównań między warunkami eksperymentalnymi.
         2. Wykonaj testy Friedmana lub Wilcoxona , aby ocenić spójność w poszczególnych ROI.
         3. Wykonaj testy Friedmana i Wilcoxona z zakresu znaków (metodą Pratta), aby ocenić preferencje orientacyjne (np. Północ kontra Południe) w ramach każdego ROI.
         4. Eksportuj następujące wyniki do katalogu wyników : Podsumowania CSV (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), raporty statystyczne (np. średnia kometa velocity_mwu.csv) oraz wykresy (pliki PNG o wysokiej rozdzielczości).
            UWAGA: Krok 4 można wykonać tylko w Pythonie. Otwórz File_4_Step4_MTs_results.ipynb i odczytaj oraz wykonaj wszystkie komórki. Każda komórka zawiera instrukcje wykonania oraz oczekiwany wynik.

5. Analiza statystyczna:

UWAGA: Ze względu na rozkład danych tropienia niegaussowski, do wszystkich porównań zastosowano nieparametryczne testy statystyczne.

1. Oceń niezależne różnice między warunkami eksperymentalnymi (np. kontrolne vs. leczone) za pomocą testu Mann-Whitney U (dla dwóch grup) lub testu Kruskal-Wallis, a następnie porównań Mann-Whitney po raz drugi (dla >2 grupy)).
2. Oceń preferencje orientacyjne w ramach tego samego ROI za pomocą testu Friedmana (różnica globalna), a następnie testu Wilcoxona z rangą znakową (parowo).
3. Rozwiązuj remisy zerowe za pomocą metody Pratta.
4. Raportuj porównania parowe jako nieskorygowane wartości p, aby zachować moc statystyczną. Użyj dostępnych skryptów, aby raportować zarówno surowe, jak i skorygowane wartości p, z istotnością ustawioną na 0,05. Wszystkie statystyki podsumowujące należy raportować jako średnią ± błędem standardowym średniej (SEM), chyba że zaznaczono inaczej.

Results

Protokół ten został pomyślnie wykorzystany do analizy dynamiki wzrostu MT i polaryzacji w oocytach Drosophila melanogaster w środkowych etapach oogenezy, wykorzystując EB1-GFP, białko śledzące plus end, które oznacza miejsca aktywnej polimeryzacji MT^17,18. Podczas obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej skanującego laserowego, EB1-GFP wygląda jako jasne, przerywane "komety", które poruszają się w orientacji wzrostu MT^17,18 (Rysunek 3A; Wideo uzupełniające 1). Śledzenie i ilościowe określenie tych komet pozwala precyzyjnie ocenić jądrowanie, wydłużenie i organizację MT wewnątrz oocytu. Korzystając z tego protokołu workflow, oceniano dynamikę MT w kontrolnych oocytach oraz w oocytach poddanych eksperymentalnym zaburzeniom sieci MT. Konkretnie, zachowanie komet EB1 porównano w trzech warunkach: nieleczone kontrolne oocyty, kontrolne oocyty poddane zimnu oraz zimno obtraktowane heterozygotyczne oocyty mutacjip-atroniny ^12,26. Zimno powoduje depolimeryzację MT, co pozwala ocenić odrastanie MT podczas rekonwalescencji. Heterozygotyczne oocyty z mutacjąp-atroniny (+/patr⁰⁵²⁵²) zostały uwzględnione jako dodatnia kontrola dla zaburzonej dynamiki MT. Patronin jest konserwowanym stabilizatorem MT minus end²⁷ oraz podstawowym składnikiem ncMTOC w oocytach¹² i innych tkankach². Wcześniejsze badania wykazały, że mutanty patroniny poddane depolimeryzacji MT wykazują istotny spadek liczby komety EB1 po ponownym odroście¹². Dzięki temu uwzględnienie heterozygotycznych mutantów patroniny umożliwiło weryfikację metody na podstawie znanego tła wadliwego MT-regrowth. Oocyty stadium 7-8 były obrazowane, gdy centrosomy są osłabione i MT generowane przez szlaki acentrosomalne.

Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, najwyższa gęstość komet EB1 wykryta była w przedniej części oocytu, z stopniowym spadkiem w kierunku^{tylnej części 14,15} (Rysunek 5B; Tabela 1; Tabele uzupełniające 1 i 2). Aby rozróżnić prawdziwe zdarzenia polimeryzacji MT od sygnałów stacjonarnych lub poza płaszczyzną, protokół ten rozróżnia łączną liczbę wykrytych ognisk EB1-GFP od podzbioru ognisk ruchomych. Ułamek nieruchomy prawdopodobnie oznacza komety stacjonarne lub poruszające się głównie po płaszczyźnie osiowej (Rysunek 5A,B). Analizy długości toru MT i prędkości wzrostu przeprowadzono wyłącznie na mobilnych kometach EB1-GFP, aby uniknąć włączenia sygnałów stacjonarnych lub ruchów osiowych, które mogłyby zakłócić szacowanie długości i prędkości toru. Całkowite ogniska EB1-GFP oraz frakcja ruchoma są przedstawione na osobnych wykresach, aby umożliwić bezpośrednie porównanie ogólnej detekcji i zachowania dynamicznego (Rysunek 5A,B). W kontrolnych oocytach protokół zmierzył 0,189 ± 0,02 ruchowych komet SEM EB1/μm² (18,9 komet EB1/100 μm²) w okolicy przedniej, następnie 0,064 ± 0,02 SEM oraz 0,043 ± 0,01 ruchowych komet EB1/μm² odpowiednio w środkowej i tylnej części (6,4 i 4,3 komety EB1/100 μm²) (Rysunek 5B; Tabela 1; Tabele uzupełniające 1 i 2). Poprzednie badanie²⁸ mierzące komety EB1 na tym samym etapie rozwoju wykryło 48,54 komety EB1/100μm², co jest wyższą liczbą niż wartości wykryte tutaj dla ruchomych komet EB1-GFP. Jednak zmierzone wartości są spójne, biorąc pod uwagę łączną liczbę wykrytych komet EB1-GFP (Rysunek 5A; Tabela 1; Tabele uzupełniające 1 i 2). Sekcja Materiały i metody tego badania nie precyzuje, ile stosów z użyto do obrazowania oocytów. Możliwe więc, że w analizie uwzględniono więcej niż jeden stos z-stack, co mogło przyczynić się do większej liczby wykrytych komet EB1-GFP. Kolejnym czynnikiem, który może wpływać na zgłaszane wartości, jest obszar oocytu wybranego do ilościowania komety. Gdyby obszary zainteresowania wybrano bliżej najbardziej przedniego bieguna, gdzie gęstość EB1 jest najwyższa, mogłoby to zwiększyć średnią gęstość komety w porównaniu z przedstawionymi tutaj pomiarami. Niemniej jednak uzyskane tutaj wyniki są tego samego rzędu wielkości i konsekwentnie odzwierciedlają spadek gęstości komet EB1 w kierunku tylnego obszaru niż wcześniej zgłaszano^14,15.

Po odnowieniu MT wywołanym zimnem, oocyty kontrolne wykazały liczbę komet EB1 porównywalną z nieleczonymi kontrolami, co wskazuje na silną regenerację MT. W przeciwieństwie do wcześniejszych raportów¹², mutanci patronina wykazali istotny spadek liczby ruchomych komet EB1 w przednim regionie (ROI1) w porównaniu z obiema kontrolami (Rysunek 5B; Tabela 1; Tabele uzupełniające 1 i 2). Chociaż liczba kometów w regionach środkowych i tylnych (ROI 2 i 3) również spadała, różnice te nie były statystycznie istotne (rysunek 5B). Zaobserwowane tutaj zmniejszenie było mniej wyraźne niż w testach opartych na nokodazolie¹². Prawdopodobnie odzwierciedla to stosowanie heterozygotycznych mutantów patronin , u których zmutowany jest tylko jeden allel. Ponadto protokół depolimeryzacji indukowanej zimnem może nie depolimeryzować wszystkich MT, a 5–15-minutowy odstęp między usunięciem z lodu a obrazowaniem prawdopodobnie pozwala na pewną nukleację i ponowne odrastanie MT przed pozyskaniem danych. Natomiast testy na bazie nocodazolu wykonuje się natychmiast po inaktywacji kolcemidu za pomocą mikroskopowego lasera^{UV 12}. Niemniej jednak wyniki te pokazują, że ten protokół może wykrywać biologicznie istotne, specyficzne dla regionu zmiany w organizacji MT. Są one również zgodne z wzbogacaniem ncMTOC oraz Patroninu, kluczowego składnika ncMTOC, w przedniej części oocytu. Słabszy spadek liczby kometów w regionach środkowych i tylnych może również odzwierciedlać rozwojowe wykluczenie ncMTOC i Patroniny z kory tylnej na tych etapach¹².

Analiza długości śladu EB1 w kontrolnych oocytach wykazała dłuższe ślady komety w przedniej części oocytu (0,613 μm ± 0,04 SEM) oraz krótsze komety w regionach środkowych i tylnych (0,463 μm ± 0,04 SEM i 0,488 μm ± 0,05 SEM, odpowiednio) (Rysunek 5C; Tabela 1; Tabele uzupełniające 1 i 2). To odkrycie jest zgodne z wcześniejszymi danymi, które pokazują, że MT utrzymuje się krócej na biegunie tylnym niż na biegunie przednim, co sugeruje, że MT na biegunie tylnym są krótsze¹⁴. W oocytach heterozygotycznych patronin mutowanych na zimno, długość komety EB1 była istotnie skrócona w porównaniu z kontrolnymi poddawanymi zimnem w przednich i tylnych obszarach. Podobny, niestatystycznie istotny trend zaobserwowano w regionie środkowym (Rysunek 5C; Tabela 1; Tabele uzupełniające 1 i 2), sugerujące częściowe obniżenie stabilności MT. Łącznie te wyniki potwierdzają znaną rolę Patroniny jako stabilizatora MT na minus-end i są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami w komórkach hodowanych przez Drosophila, gdzie utrata Patroniny skutkuje krótszymi wrzecionami MT^12,27. Wyniki te podkreślają również wrażliwość tego protokołu na wykrywanie subtelnych, lecz biologicznie istotnych zaburzeń w dynamice MT.

Podczas pomiaru prędkości komety EB1 w kontrolnych oocytach analiza wykazała średnie prędkości 0,208 ± 0,01 μm/s, 0,207 ± 0,01 μm/s oraz 0,202 ± 0,01 μm/s odpowiednio w przednim, środkowym i tylnym regionie (Rysunek 5D; Tabela 1; Tabele uzupełniające 1 i 2), co jest zgodne z wcześniejszymi pracami^14,15. Oocyty kontrolne wykazały niewielkie zmniejszenie prędkości wzrostu MT od przedniej do tylnej części ciała. Może to odzwierciedlać wzbogacenie ncMTOC, a także potencjalnie innych niezidentyfikowanych białek związanych z mikrotubulami (MAP), w obszarach przednich i bocznych, które ułatwiają wzrost i wydłużenie MT, przyczyniając się tym samym do obserwowanego spadku tylnego obszaru. W oocytach poddanych zimnu mutanci heterozygoci patronina wykazywali nieistotny statystycznie trend nieznacznego spadku prędkości wzrostu MT w porównaniu z grupami kontrolnymi, choć różnica ta nie osiągnęła istotności statystycznej (Rysunek 5D; Tabela 1; Tabele uzupełniające 1 i 2). To odkrycie jest zgodne z wcześniejszymi obserwacjami u neuronalnych komórek macierzystych Drosophila wyrażających mutantów patroniny²⁹.

Lokalizacja ncMTOC w przednim i bocznym obszarze oocytu, wraz z ich wykluczeniem z tylnego obszaru, sprawia, że większość MT jest hodowana z końcówkami dolnymi zakotwiczonymi w korze przednio-bocznej. W rezultacie w ooocu ustanawiany jest gradient przed-tylny MT, z umiarkowanym błędem orientacji: 60% MT rośnie w kierunku tylnej, a 40% w kierunku^{przedniej 14}. Nasz protokół skutecznie wykrył to błędne działanie w kontrolnych oocytach we wszystkich obszarach oocytu (Rysunek 5E). Ukierunkowanie MT było bardziej widoczne w tylnej części ciała, jak wcześniej zgłaszano:¹⁴. Warto zauważyć, że to tylne wzbogacenie błędu orientacji zostało utracone po leczeniu zimnem u oocytów kontrolnych i heterozygotycznych mutantów patronin (rysunek 5E,F). W kontrolnych oocytach poddanych zimno, orientacja MT przesunęła się w kierunku wzrostu skierowanego do przodu we wszystkich regionach. To przesunięcie pojawiło się jako trend w przedniej i środkowej części i stało się statystycznie istotne w tylnej części (rysunek 5F). Jednym z możliwych wyjaśnień tej utraty skrętu w stronę tylnej strony jest fakt, że w warunkach zimnego procesu nowo polimeryzowane MT mogą potrzebować czasu, aby związać się z MAP, takimi jak białka motoryczne, które sprzyjają stabilizacji i/lub sieciowaniu MT. Opóźniona rekrutacja tych czynników może utrudniać wzmacnianie MT zorientowanych na tył. Podsumowując, protokół ten pozwala na czułą, ilościową analizę wzrostu, długości, prędkości i orientacji MT wewnątrz oocytów. Niezawodnie wykrywa specyficzne dla regionu, biologicznie istotne zmiany w dynamice MT, zgodnie z wcześniejszymi badaniami, i wykazuje wrażliwość na rozróżnianie subtelnych różnic w zachowaniu MT, co ilustrują obserwacje u heterozygotycznych mutantówp-atroniny.

Rysunek 1: Oogeneza Drosophila melanogaster (A) Przegląd oogenezy jajnika Drosophila . Każdy jajnik zawiera 12–16 jajników, które pełnią funkcję linii produkcyjnej komórek jajowych. Oogeneza rozpoczyna się w germarium, gdzie 2–3 komórki macierzyste linii zarodkowej dzielą się asymetrycznie, tworząc komórkę macierzystą i komórkę potomną, które zaczynają się różnicować. Komórki te przechodzą 4 podziały mitotyczne, tworząc torbiel 16-komórkową połączoną kanałami pierścieniowymi. Z tych komórek jedna staje się oocytem, a pozostałe pełnią funkcję komórek pielęgniarskich, wspierając wzrost i rozwój oocytów do stadium 14 na tylnym końcu. (B) Schemat komory jajecznej Drosophila w stadium 9. MT powstają z ncMTOC zlokalizowanych w korze przedniowo-bocznej, które są wykluczone z tylnej strony oocytu¹². Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Diagram przepływu protokołu. Przegląd głównych etapów od sekcji jajnika i obrazowania na żywo po śledzenie komety i analizę ilościową. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy generowane przez przetwarzanie oocytów stadium 7–8. (A-E) Reprezentatywne obrazy ilustrujące workflow przetwarzania obrazów w kroku 1 zastosowane do oocytów stadia 7–8 z kontrolnych, kontrolnych oocytów objętych zimnem i heterozygotycznym patroninem⁰⁵²⁵² . Kanały są reprezentatywnym obrazem z maksymalnej projekcji 2 klatek z filmu poklatkowego o długości 150 klatek uzyskanym z prędkością 0,5 s na klatkę. (A) Kanał 1, który odpowiada generowaniu obrazu zaniszczonego z odpowiadającego mu obrazowanego oocytu. (B) Kanał 2, który odpowiada generowaniu różnicy obrazu Gaussa. (C) Kanał 3, który odpowiada generowaniu obrazu, w którym sygnał komet EB1-GFP został wzmocniony, aby pokazać ich końcówki. (D) Połączenie kanałów 2 i 3, co pomaga wizualizować powstałe komety na podstawie przetwarzania kanału 2. (E) trajektorie komety EB1-GFP generowane z czasopoklatkowego C w FIJI za pomocą wtyczki Temporal Color code do ilustrowania dynamiki MT. Kod kolorów wskazuje czasową projekcję dla 20 klatek (0,50 s między klatkami). Pasek skali = 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zrzut ekranu sekcji w zeszycie STEP 4 Jupyter. Notatnik jest zbudowany z komórek Markdown, które dostarczają samowyjaśniających instrukcji, a następnie komórek kodu generujących wyniki i logi w czasie rzeczywistym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Analiza dynamiki komety EB1-GFP w oocytach kontrolnych i zimno obtraktowanych stadium 7-8. Dane reprezentują średnią ± SEM na ROI (ROI1–ROI3) dla oocytów kontrolnych, kontrolnych poddanych zimnemu i patroninowi⁰⁵²⁵² . Pomiary komet EB1-GFP uzyskano na podstawie obrazów poklatkowych opracowanych na FIJI; o ile nie wskazano inaczej, przeprowadzano analizy na obrazach przetwarzanych w Kanale 3. Całkowita liczba kometów EB1-GFP została przeanalizowana na podstawie obrazów z Kanału 2 (obraz DoG). Istotność statystyczną oceniano za pomocą testu Kruskal–Wallis, po którym następowały porównania Mann–Whitney post-hoc, lub testu Friedmana, a następnie testów Wilcoxona na podstawie par dopasowanych, w zależności od tego (np . < 0,05; s. < 0,001; p < 0,0001). (A) Wykres punktowy rozrzutowy pokazujący średnią liczbę łącznych liczb kometów EB1-GFP. (B) Wykres punktowy rozrzutowy pokazujący średnią liczbę ruchomych komet EB1-GFP. (C) Wykres punktowy rozrzutowy pokazujący średnią długość toru komet EB1-GFP. (D) Wykres kropkowy rozrzutowy pokazujący średnią prędkość komety EB1-GFP. (E) Wykresy Rose pokazujące orientację ścieżek EB1-GFP w oocytach kontrolnych (n = 14), kontrolnych (n = 12) oraz patronin⁰⁵²⁵² chłodzonych (n = 11). Średni procent każdego toru na oocyt, skierowany w kierunku przedniego (A) lub tylnego (P), jest wskazany dla każdego stanu i zwrotu z inwestycji. (F) Wykres słupkowy pokazujący średni procent kątów toru EB1-GFP skierowanych w kierunku przedniej i tylnej strony oocytu. Procenty obliczono na oocyt, które odzwierciedlają względny rozkład orientacji komety w obrębie każdego ROI. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Metryka	ROI	Kontrola (n=14)	Kontrola poddana zimnej poddrobie (n=12)	Patronin05252 Impregnowany na zimno (n=11)
Całkowita liczba komet EB1-GFP (#/μm2)	ROI 1 (przedni)	0.667 ± 0.18	0.691 ± 0.20	0.570 ± 0.17
	ROI 2 (środek)	0.394 ± 0.11	0.532 ± 0.15	0.400 ± 0.12
	ROI 3 (tylny)	0.353 ± 0.09	0.561 ± 0.16	0.378 ± 0.11
Ruchoma liczba komet EB1-GFP (#/μm2)	ROI 1 (przedni)	0.189 ± 0.02	0.175 ± 0.03	0.099 ± 0.03
	ROI 2 (środek)	0.064 ± 0.02	0.091 ± 0.02	0.056 ± 0.02
	ROI 3 (tylny)	0.043 ± 0.01	0.104 ± 0.03	0.047 ± 0.02
Długość toru EB1-GFP Comet (μm)	ROI 1 (przedni)	0.613 ± 0.04	0.621 ± 0.03	0.478 ± 0.07
	ROI 2 (środek)	0.463 ± 0.04	0.535 ± 0.03	0.410 ± 0.05
	ROI 3 (tylny)	0.488± 0.05	0.543 ± 0.04	0.393 ± 0.05
Prędkość komet EB1-GFP (μm/s)	ROI 1 (przedni)	0.208 ± 0.01	0.198 ± 0.01	0.188 ± 0.01
	ROI 2 (środek)	0.207 ± 0.01	0.199 ± 0.01	0.186 ± 0.01
	ROI 3 (tylny)	0.202 ± 0.01	0.194 ± 0.01	0.177 ± 0.01

Tabela 1. Podsumowanie pomiarów komety EB1-GFP w obszarach przednich i tylnych w analizowanych oocytach. Pomiary uzyskano z kontrolnych, kontrolnych oocytów objętych zimnem i heterozygotycznymi patroninami⁰⁵²⁵² . Obszary zainteresowania zdefiniowano jako ROI1 (przedni), ROI2 (środkowy) oraz ROI3 (tylny).

Tabela uzupełniająca 1. Analiza statystyczna pomiarów komety EB1-GFP pomiędzy warunkami eksperymentalnymi. Wartości p wskazują różnice między kontrolnymi, kontrolnymi oocytami objętymi zimnym zabiegiem a heterozygotycznymi patroninem⁰⁵²⁵² obtraktowanymi na zimno dla każdego ROI (ROI1-ROI3). Globalne porównania między trzema warunkami przeprowadzono za pomocą testu Kruskal–Wallis, a następnie porównania Mann–Whitney po raz dwójny. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik

Tabela uzupełniająca 2. Statystyczne porównanie pomiarów komety EB1-GFP pomiędzy ROI w ramach każdego warunku eksperymentalnego. Wartości p wskazują na różnice między ROI1 (przedni), ROI2 (środkowy) i ROI3 (tylny) w kontrolnych, kontrolnych oocytach objętych zimnem i heterozygotycznym patroninem⁰⁵²⁵² . Ogólne różnice między ROI w obrębie każdego z tych schorzeń oceniono za pomocą testu Friedmana. Następnie przeprowadzono porównania parowe między ROI za pomocą testów Wilcoxona z dopasowanymi parami o rangach znakowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Wideo uzupełniające 1. Obrazowanie poklatkowe białka EB1-GFP śledzącego plus end w oocu stadium kontrolnym 7–8, wykazujące reprezentatywne nabycie odpowiednie do dalszej analizy śledzenia MT (powiązane z rysunkiem 3). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Dodatkowy plik kodowania 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. Makro Fiji/ImageJ do wstępnego przetwarzania obrazów. Automatyzuje korektę fotobielenia, filtrowanie Kalmana oraz odejmowanie tła za pomocą filtra różnicy Gaussa (DoG). Stosuje także ulepszenie gradientu czasowego (relicing i konwolucja 1D), aby wyostrzyć krawędzie natarcia końcówek MT dla lepszej wierności śledzenia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Dodatkowy plik kodowania 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. Makro Fiji/ImageJ dla półautomatycznego definicji regionu zainteresowania (ROI). Użytkownik wymaga zdefiniowania granicy oocytu i automatycznie segmentuje wybór na strefy równie odległe (w naszym przykładzie 3 strefy: przednia, centralna i tylna), aby umożliwić regionalną stratyfikację analizy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Dodatkowy plik kodowania 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Skrypt Pythona (wykonywany w Fiji/ImageJ), który automatycznie śledzi komety EB1 za pomocą Trackmate. Przetwarza partie wstępnie przetworzonych obrazów, wykrywa komety przy użyciu określonych parametrów jakości, łączy je w trajektorie i eksportuje surowe dane współrzędnych jako pliki CSV. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Plik kodowania uzupełniający 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. Notatnik Jupytera, który służy jako główny interfejs do analizy ilościowej. Ładuje surowe dane śledzenia, wykonuje pipeline analityczne i generuje wszystkie końcowe wyniki, w tym wykresy róż, tabele podsumowujące statystyczne oraz wykresy porównawcze dotyczące gęstości, prędkości i czasu życia komet. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Dodatkowy plik kodowania 5: File_5_MTModule1.py. Niestandardowy moduł Pythona zawierający podstawowe funkcje użytkowe używane do ekstrakcji danych i podstawowych obliczeń geometrycznych. Zawiera funkcje do wyszukiwania plików ROI, obliczania prędkości natychmiastowych oraz obliczania podstawowych przemieszczeń kątowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Dodatkowy plik kodowania 6: File_6_MTModule2.py. Niestandardowy moduł Pythona zawierający zaawansowane funkcje analizy i wizualizacji. Zawiera algorytmy do analizy orientacji (Cardinal vs. Axial binning), solidnych testów statystycznych (Friedman/Wilcoxon z metodą Pratta) oraz generowania wykresów polarnych (różowych) o jakości publikacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Dodatkowy plik kodowania 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. Do kroków redukcji szumów w makro wstępnego przetwarzania wymagana jest skompilowana wtyczka Java Kalman Filter dla Fiji/ImageJ. Ta samodzielna wersja eliminuje potrzebę osobnego Java Development Kit (JDK), upraszczając konfigurację oprogramowania użytkownika. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Discussion

Obrazowanie na żywo dynamiki MT w oocytach stanowi unikalne wyzwania, ponieważ do wydobycia istotnych informacji potrzebne są wysokiej jakości zbiory danych oraz analizy ilościowe. Chociaż wcześniejsze badania raportowały podejścia obrazowania na żywo^{14, 15, 16}, kroki analizy obrazu są często bardzo dostosowane, a protokoły nie dostarczają wystarczającej szczegółowości do powtarzalności. W konsekwencji badacze bez rozległej wiedzy w zakresie obrazowania lub obliczeń mogą napotkać przeszkody w odtwarzaniu tych analiz. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano uprościony workflow, łączący wysokiej rozdzielczości obrazowanie na żywo Airyscan z przyjaznymi, zautomatyzowanymi makrami i skryptami. Ten pipeline umożliwia efektywne wykrywanie i śledzenie komet EB1, a następnie przeprowadzana jest ilościowa analiza orientacji, prędkości i organizacji przestrzennej MT. Minimalizując ręczną interwencję i dostarczając jasne, krok po kroku instrukcje, workflow sprzyja dostępności i powtarzalności analizy dynamiki MT w oocytach.

Sekcja jajnika i przygotowanie próbki to kluczowe pierwsze kroki. Oocyty muszą być dokładnie rozcięte, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych, a czas trwania obrazowania powinien być ograniczony do 90 minut, aby utrzymać żywotność²⁰. Selekcja etapu jest ważna: po śródstadium oogenezy oocyt zwiększa rozmiar i gromadzi żółtko w cytoplazmie, co utrudnia wizualizację sygnału EB1 powyżej etapu 9. Dlatego obrazowanie powyżej etapu 9 nie jest zalecane²⁰. Ponadto, dla powtarzalnych ilości, jeśli to możliwe, preferowane są oocyty o porównywalnej wielkości, ponieważ zapewnia to, że zdefiniowane obszary zainteresowania odpowiadają równoważnym pozycjom przednim–tylnym na różnych próbkach.

Kontrola temperatury jest niezbędna dla powtarzalności. Muchy powinny być utrzymywane w standardowych warunkach hodowli (25 °C), aby wspierać normalny rozwój i stałą ekspresję EB1-GFP, szczególnie przy użyciu systemu GAL4/UAS, który jest wrażliwy na wahania temperatury. Stabilność temperaturowa podczas obrazowania jest równie ważna, ponieważ zmiany mogą wpływać na dynamikę MT. Chociaż komora z kontrolą temperatury nie jest wymagana, zaleca się unikanie wahań temperatury podczas akwizycji.

Do akwizycji obrazów wybrano obrazowanie konfokalne detektorem matrycowego ze względu na wysoką czułość i lepszy poziom SNR, co zminimalizowało potrzebę usuwania dźwięków po akwizycji. Obiektywy o wysokiej aperturze numerycznej (tak wysoko, jak to możliwe) w połączeniu z odpowiednim dopasowaniem współczynników załamania powinny być stosowane w celu maksymalizacji rozdzielczości bocznej i osiowej, co jest kluczowe dla rozdzielania pojedynczych komet w gęstych sieciach. Ponadto kryteria próbkowania^{Nyquista-Shannona 30} powinny być przestrzegane w XYZ i czasie, aby uniknąć utraty dokładności w śledzeniu komety. Równie istotny jest staranny dobór płaszczyzny obrazowania wzdłuż osi z. Zbyt głębokie obrazowanie prowadzi do utraty fluorescencji spowodowanej rozpraszaniem światła, podczas gdy ograniczenie pozyskiwania do powierzchni kory nie rejestruje pełnej dynamiki komet EB1. Najbardziej informacyjne dane pozyskane są na pozycji pośredniej z-pozycji. Należy unikać oocytów, w których jądro znajduje się w wybranej płaszczyźnie, ponieważ przedział jądrowy wypiera dużą część cytoplazmy i nie posiada śladów EB1, co zmniejsza liczbę wykrywalnych komet.

Chociaż zoptymalizowany do obrazowania konfokalnego opartego na detektorze macierzy, ten proces analizy jest niezależny od sprzętu i kompatybilny z innymi metodami, takimi jak konfokalna mikroskopia obrotowa z dyskiem. Jednak użytkownicy powinni być świadomi, że systemy o niższym NA lub SNR mogą wymagać korekt parametrów wstępnego przetwarzania makra (np. tolerancja na szum/sigmy DoG) i mogą skutkować niższą gęstością wykrywania komety w porównaniu z wartościami przedstawionymi w badaniu. Niemniej jednak, choć wartości bezwzględne mogą się różnić między systemami, trendy względne obserwowane między warunkami eksperymentalnymi a ROI mają pozostać solidne.

Biorąc pod uwagę dużą trójwymiarową strukturę oocytu, obrazowanie 2D rejestruje tylko optyczny fragment sieci MT. W konsekwencji komety poruszające się stromo wzdłuż osi z mogą opuścić płaszczyznę ogniskową, co może prowadzić do niedoszacowania długości trwania toru i prędkości bezwzględnej (ponieważ mierzony jest tylko składowy xy wektora prędkości). Jednak szybkie obrazowanie objętościowe 3D całego oocytu wymagałoby mniejszych pól widzenia (FOV), krótszych czasów ekspozycji i szybszej reakcji detektora, co zmniejsza SNR i rozkłada czas akwizycji na wiele z-slice, co ogranicza rozdzielczość czasową potrzebną do śledzenia szybkich komet EB1. Aby ograniczyć nieruchome komety i nieostre artefakty, zastosowano filtry splotowe i minimalnego czasu trwania ścieżki (z wyłączeniem śladów < 3 klatki), aby usunąć przejściowe plamy przechodzące przez płaszczyznę ogniskową. Ponadto, ponieważ to ograniczenie geometryczne stosuje się równomiernie we wszystkich warunkach eksperymentalnych, obserwowane względne różnice w gęstości, prędkości i orientacji komety pozostają wyraźne. Chociaż nowe techniki, takie jak mikroskopia pola świetlnego, idealnie uchwyciłyby pełną strukturę 3D jednocześnie, nie są jeszcze szeroko dostępne. Niemniej jednak wartości zmierzone dla wszystkich parametrów dynamiki MT są zgodne z wcześniejszymi raportami, co wskazuje, że ten protokół nadaje się do badania dynamiki MT w różnych konfiguracjach eksperymentalnych.

Przed użyciem makr w tym protokole zaleca się ręczne przetworzenie pierwszych kilku obrazów, aby upewnić się, że parametry oprogramowania są poprawnie zoptymalizowane. Czynniki takie jak rozdzielczość obrazu, powiększenie, stosunek sygnału do szumu, liczba klatek na sekundę oraz to, czy dane są jednopłaszczyznowe czy stosowe z, mogą wpływać na dokładność śledzenia. Iteracyjnie dostosowywanie parametrów podczas wizualnej inspekcji powstałych ścieżek, aby zminimalizować liczbę fałszywych alarmów i fałszywych negatywów. Po optymalizacji należy stosować parametry konsekwentnie we wszystkich zbiorach danych, aby zapewnić powtarzalność.

Na koniec należy zauważyć pewne ograniczenia dotyczące interpretacji biologicznej. EB1-GFP selektywnie oznacza rosnące MT plus końcówki, dlatego raportuje miejsca aktywnej polimeryzacji MT, a nie całą populację MT. Stabilne, niepolimeryzujące MT obecne podczas okresu obrazowania nie są wykrywane tą metodą. Chociaż to ograniczenie jest mniej restrykcyjne w oocytach w środkowej oogenezie, gdzie większość MT jest wysoce dynamiczna, należy je uwzględnić przy stosowaniu protokołu do innych typów komórek o znaczącej stabilnej populacji MT, takich jak neurony³¹.

Podsumowując, ten workflow umożliwia wysokorozdzielczą, ilościową analizę dynamiki MT w oocytach Drosophila . Integrując zoptymalizowaną dyssekcię, konfokalne obrazowanie na żywo detektorami matrycowych oraz zautomatyzowane narzędzia analityczne, zapewnia rygorystyczną, a jednocześnie dostępną metodę badania regulatorów MT w kontekście acentrosomalnym. Chociaż głównie walidowane w oocytach, zasady tego podejścia są adaptowalne po optymalizacji do innych typów komórek, w tym komórek niedzielących się, takich jak neurony i nabłonki, oferując skalowalną platformę do badań genetycznych i mechanistycznych badań organizacji MT.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kleszcze Dumont #5	Narzędzia Nauki Ścisłej	11252-20
EB1::GFP	Od dr Antoine'a Guicheta, CNRS, Instytut Jacques Monod, Francja		Genotyp: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Szkła Petriego z dnem szklanym	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα 4-Gal4-VP16	Centrum Hodowla Drosophila w Bloomington	7062	Genotyp: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Oil 10S, VOLTALEF	VWR Chemicals	24627.188
Patronin mutant	Centrum Hodowla Drosophila w Bloomington	16647	Genotyp: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
W1118	Centrum Hodowla Drosophila w Bloomington	3605
Zeiss LSM 980 z Airyscan 2	Zeiss