Artykuł metodologiczny

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

DOI:

10.3791/69986

⸱

27 lutego 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University, 2Admissions Counselor, Case Western Reserve University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tych protokołów jest ocena organizacji i funkcji bariery plisowanych złączy przegrodowych (pSJ) w tkankach nabłonkowych embrionów Drosophila pochodzących od ektodermalnych. pSJ tworzy barierę zakrywającą na błonie bocznej tkanek ektodermalnych, w tym naskórka, gruczoły ślinowe, tchawicę i jelita tylnego, która jest funkcjonalnie podobna do ciasnego połączenia w tkankach kręgowców. U Drosophila zidentyfikowano 30 białek niezbędnych do tworzenia pSJ. Białka pSJ rdzenia są początkowo zlokalizowane wzdłuż błony bocznej, ale do 16. stadium embriogenezy stają się silnie wzbogacone w bocznej części wierzchołkowej złącza, tuż u podstawy do połączenia adherensa. Pod koniec 15. stadium embriogenezy tkanki te posiadają w pełni funkcjonalne złącze occlumencyjne. Niniejszy artykuł opisze protokoły immunobarwienia i przepuszczalności barwników, które mogą być wykorzystywane do badania organizacji i funkcji pSJ w zarodkach kontrolnych i mutantów. Skuteczne zastosowanie tych protokołów może posłużyć do wykazania funkcji zakrywającej pSJ oraz do sprawdzenia, czy nieznany gen koduje kluczowy komponent złącza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczową funkcją tkanek nabłonkowych jest dzielenie poszczególnych obszarów w organizmie. Tworzenie tych odrębnych środowisk jest niezbędne dla funkcjonowania narządów oraz ochrony organizmu przed zagrożeniami zewnętrznymi. Połączenie zatykające utworzone między komórkami nabłonka odpowiada za tworzenie i utrzymanie tych środowisk, zapobiegając przepływowi substancji parakomórkowych między stroną wierzchołkową a podstawną nabłonka 1,2. U organizmów kręgowców połączenie zakrywające nazywa się złączeniem ciasnym, natomiast u bezkręgowców, takich jak Drosophila melanogaster 1,3, określa się jako połączenie przegrody (SJ). U stawonogów wyróżnia się dwa typy SJ według rozkładu tkanek i ultrastruktury4. Złącza przegrody fałdowane (pSJ) występują w tkankach pochodzących z ektodermy, takich jak naskórek, gruczoły ślinowe, tchawica i jelita tylne. Charakteryzują się one ultrastrukturalnie przez drabinowaty układ materiału gęstego elektronów w przestrzeni zewnątrzkomórkowej między komórkami, który leży tuż u podstawy złącza adherensa 3,5. Natomiast gładkie połączenia przegrody (sSJ) występują w tkankach pochodzących od endodermy, takich jak kanałki jelita środkowego i Malpighiego, i nie wykazują przegrod gęstych elektronów między komórkami6.

Badania genetyczne u Drosophili zidentyfikowały 30 białek niezbędnych do budowy i funkcji pSJ oraz dodatkowe białka znajdujące się w połączeniu, które nie wydają się pełnić funkcji w ich ustanowieniu lub utrzymaniu (omówiono w7). Na podstawie tych analiz naukowcy podzielili białka SJ na trzy klasy. Białka SJ rdzenia znajdują się w połączeniu i są niezbędne do jego ustanowienia i utrzymania. Siedemnaście białek zostało zidentyfikowanych jako białka rdzeniowe pSJ, w tym Coracle (Cora), Neurexin IV, Macroglobulin complement-related (Mcr), Kune-kune oraz ATPaza alfa 8,9,10,11,12. Zidentyfikowano dziewięć białek pomocniczych pSJ niezbędnych do ustanowienia i/lub utrzymania złącza, ale niekoniecznie znajdują się w samym złączeniu. Ta klasa obejmuje białka takie jak Rab5, Rab11 oraz Coiled13,14. Na koniec, białka pSJ lokalizują się w pSJ, ale są niepotrzebne do ustanowienia i utrzymania połączenia pSJ. Przykładami czterech członków tej grupy są Discs Large oraz FasciclinIII 15,16.

Ustanowienie funkcjonalnie nienaruszonego pSJ to proces wieloetapowy, który rozpoczyna się w połowie embriogenezy, gdy wszystkie podstawowe białka pSJ są w pełni ekspresyjne. Niektóre podstawowe geny pSJ są wyrażane matczynie, ale wszystkie wykazują silną ekspresję zygotyczną do stadium12-17. W stadium 12 białka rdzenia pSJ lokalizują się wzdłuż całej długości błony bocznej. W etapach 13-16 białka pSJ rdzenia są endocytowane, a następnie recyklingowane z powrotem do błony bocznej w regionie pSJ. Proces ten wymaga białek pomocniczych pSJ, w tym Rab5 i Rab1111. Do stadium 16 białka rdzenia pSJ są ściśle zlokalizowane w obszarze pSJ wzdłuż błony bocznej. Zgodnie z tymi obserwacjami, pełna funkcja zakrywania połączenia występuje pod koniec 15. stadium embriogenezy12. Najlepiej to zilustrować za pomocą testu przepuszczalności barwników. Przed utworzeniem połączenia przez przestrzeń parakomórkową między komórkami może przejść kulka dekstranu o masie 10 kDa, oznaczona markerem fluorescencyjnym, takim jak rodamina. Jeśli znakowany dekstran zostanie wstrzyknięty do hemocela, szybko gromadzi się w lumenie nabłonka jajowodowodowego, takiego jak tchawica, gruczoł ślinowy i jelito tylne. Po fizjologicznie napiętym na końcu etapu 15, wstrzyknięty dekstran jest ograniczony do strony podstawy nabłonka i nie może gromadzić się w lumenie (domenie wierzchołkowej) tych narządów.

Białka rdzeniowe pSJ mają cechę charakterystyczną, że każde podstawowe białko pSJ wymaga obecności wszystkich pozostałych białek rdzeniowych pSJ do prawidłowej lokalizacji podkomórkowej18,19. Ta współzależność w tworzeniu pSJ jest cechą definiującą podstawowe białka pSJ i stanowi podstawę protokołów przedstawionych w tym artykule. Mutacje w genach rdzeniowych lub pomocniczych pSJ prowadzą do śmiertelności embrionalnej i charakteryzują się błędną lokalizacją innych białek rdzeniowych pSJ wzdłuż błony bocznej w stadium 16 zarodków, zamiast być ściśle zlokalizowanym w ich normalnym obszarze bocznym wierzchołkowym. Natomiast mutacje w genach pSJ nie prowadzą do błędnej lokalizacji podstawowych białek pSJ15. Funkcjonalne zakłócenia pSJ w mutacjach rdzeniowych i dodatkowych genów pSJ ujawniają się poprzez nagromadzenie oznakowanego 10 kDa dekstranu w lumenie tchawicy, gruczołach ślinowych lub jelita tylnym w zarodkach mutantów stadium 16 lub 17. Wreszcie, cechą wyróżniającą białko pSJ rdzenia i pomocniczego jest ich lokalizacja podkomórkowa. Białka pSJ rdzeniowe są ściśle związane z pSJ po utworzeniu, podczas gdy białka pomocnicze pSJ są kluczowe dla składania złącza, ale niekoniecznie znajdują się w samym złączu. Najlepsze przykłady białek pomocniczych pSJ to Rab5 i Rab11. Oba są białkami cytoplazmatycznymi, które pomagają transportować ładunek z błony plazmatycznej do wczesnych i recyklingowych endosomów, a następnie z powrotem do błony plazmatycznej14. Aby rozróżnić, czy nowe potencjalne białko pSJ jest składnikiem rdzeniowym czy białkiem pomocniczym, zazwyczaj pomocne jest stworzenie konkretnego przeciwciała lub ekspresja fluorescencyjnie oznaczonego białka rekombinowanego, aby określić, gdzie te białka lokalizują się w różnych punktach procesu dojrzewania pSJ.

Celem tych protokołów jest jednoznaczne odróżnienie potencjalnych białek rdzeniowych i pomocniczych pSJ od białek rezydentów pSJ. Kilka badań ujawniło dodatkowe, niezakrywające role białek pSJ podczas rozwoju, w tym rolę w morfogenezie i polaryzacji apikalno-bazalnej 17,20,21,22. Wraz ze wzrostem zainteresowania biologią pSJ i identyfikacją większej liczby potencjalnych białek pSJ, proste, łatwe do interpretacji protokoły przedstawione tutaj pomogą badaczom prawidłowo scharakteryzować organizację pSJ i funkcje okcludujące tych białek. W literaturze opisano wiele dodatkowych eksperymentalnych metod charakteryzacji białek pSJ, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz transmisyjną mikroskopię elektronową 6,23. Chociaż te metody są często bardzo przydatne, przedstawiony tutaj test immunobarwienia umożliwia szybką wizualizację lokalizacji białka pSJ bez kosztownych i czasochłonnych metod ultrastrukturalnych, podczas gdy test przepuszczalności barwnika oferuje funkcjonalny odczyt integralności pSJ, którego nie można uzyskać wyłącznie obrazowaniem. Dodatkowo te testy można wykonywać przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak wysokiej jakości mikroskop fluorescencyjny oraz prymitywny zestaw mikroiniekcji. Należy zauważyć, że te testy są zoptymalizowane do analizy zarodków Drosophila stadium 16 i nie są odpowiednie do oceny organizacji ani funkcji sSJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Etapowanie zarodków

  1. Krzyżuj zdrowe samce i samice odpowiednich genotypów (patrz Tabela materiałów dla przykładów) i umieszczaj je w klatkach na zbieranie embrionów z świeżymi talerzami soku jabłkowego posmarowanymi pastą drożdżową. Pozwól muchom przyzwyczaić się do klatek na zebranie jaj przez dzień lub dwa, zanim zaczniesz pobierać zarodki.
  2. Zbieraj zarodki na talerze soku jabłkowego i pozwól im rozwijać się do stadium 16 (~13 h po złożeniu jaj (AEL) do 16 h AEL w 25 °C). Pozwól dorosłym osobnikom składać zapłodnione jaja przez 1-2 godziny na talerze z sokiem jabłkowym, wyjmij płytkę z klatki do zbierania jaj, a następnie dojrzewaj do temperatury 13-16 AEL przy 25 °C. Alternatywnie, pobieraj zarodki przez noc w temperaturze 25 °C, a następnie wybieraj zarodki stadium 16 przed fiksacją lub podczas obrazowania po fiksacji i immunobarwieniu.
    UWAGA: Etap embrionalny można ocenić na podstawie morfologii jelit, którą najłatwiej zobrazować poprzez autofluorescencję w widmie UV (czyli kanale DAPI). W zarodkach stadium 16 jelita wyglądają jako trzy równoległe, długie owalne owale prostopadłe do długiej osi ciała (Rysunek 1H).

2. Utrwalanie i barwienie immunologiczne zarodków

  1. Złóż kosz do zbierania zarodków z nylonową siatką (siatka 120 mm). Przykryj otwór i gwinty koszyka nylonową siatką, a następnie przykręć nakrętkę.
  2. Delikatnie usuń zarodki z talerza soku jabłkowego pędzlem i roztworem do mycia zarodków. Wlej mieszankę zarodków do koszyka na zbieranie zarodków i przepłucz je wodą destylowaną.
    UWAGA: Należy uważać, aby woda płynęła wzdłuż wnętrza koszyka do zbierania zarodków i unikać rozpryskiwania zarodków na bokach koszyka, co może prowadzić do ich utraty z powodu zwierzania.
  3. Dechorionuj zarodki, zanurzając koszyk zbiorczy i zarodki w tacce zawierającej 50% komercyjnego wybielacza (końcowe stężenie 3,75% podchlorynu sodu). Mieszaj zarodki w wybielaczu i trzymaj je zanurzone przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij koszyk z wybielacza i przepłucz zarodki wodą destylowaną, ponownie kierując przepływ wody w dół wnętrza koszyka.
  4. Przygotuj fiolkę utrwalającą, dodając równe ilości świeżego roztworu paraformaldehydu 4% i heptanu do fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 mL. Roztwór paraformaldehydu przygotuj, rozpuszczając odpowiednią ilość paradehydu w gorącej (~90 °C) soli fosforanowej (PBS) w chemicznym okapie oparowym. Aby przyspieszyć proces rozpuszczania, dodaj 10 μL wodorotlenku sodu 14 N (na 10 mL PBS) do stężenia, aż formaldehyd wejdzie w roztwór, a następnie dodaj 10 μL kwasu solnego 14 N, aby przywrócić pH do neutralnego.
    UWAGA: Zawsze nosz fartuch laboratoryjny, gogle i rękawiczki podczas kontaktu z paraformaldehydem i heptanem, używaj wyłącznie pod kapturem oparów chemicznych. Paraformaldehyd jest rakotwórczy i żrący, natomiast heptan jest wysoce łatwopalny oraz drażniący skórę i oczy.
  5. Rozłóż koszyk do zbierania zarodków i zanurz nylonową siatkę z odchorionowanymi zarodkami w heptanie. Zarodki odłączają się od nylonu i osiadają na granicy między heptanem (górną warstwą) a fiksacją (dolną warstwą). Utrwal zarodki, potrząsając fiolką stabilizacyjną na platformowym shakerze z prędkością 240 obrotów na minutę (RPM) przez 20 minut.
  6. Usuń środek z fiolki utrwalającej pipetą Pasteura w okapie chemicznym. Usuń środek do zatwierdzonego pojemnika na niebezpieczne chemikalia. Dodaj równą ilość metanolu, zamknij komorę utrwalającą i energicznie potrząsaj komorą przez 5-10 sekund. Utrwalone zarodki oderwą się od otoczki vitelline i opadają na dno metanolu (niższą warstwę). Otoczki vitelline oraz wszelkie zarodki, które nie udało się oderwać od otoczki vitelline, pozostaną na granicy i zostaną usunięte w kroku 2.7.
    UWAGA: Zawsze nosz fartuch laboratoryjny, gogle i rękawiczki podczas kontaktu z metanolem, ponieważ jest toksyczny i łatwopalny.
  7. Usuń heptan pipetą Pasteur i wyrzuć go do zatwierdzonego pojemnika na niebezpieczne chemikalia. Następnie usuń większość metanolu, zostawiając zarodki w małej kałuży metanolu, a metanol wyrzuć do niebezpiecznych odpadów chemicznych. Dodaj 5 ml metanolu, mieszaj zarodki i pozwól im się osadzić. Usuń większość metanolu ponownie i powtórz ten proces jeszcze dwa razy.
  8. Przenieś zarodki w metanolu do szklanej probówki do hodowli o pojemności 0,8 mL. Usuń metanol i dodaj 750 mL roztworu blokowego (PBS plus 1% zwykłej surowicy osła i 0,1% Triton X-100). Przemyj zarodki 3 razy w PBS, a następnie inkubuj je w roztworze blokowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na platformie kołysajnej.
  9. Przepłucz zarodki jeszcze raz w PBS, a następnie dodaj przeciwciała blokowe plus pierwotne. Używaj przeciwciał przeciwko rdzeniowemu białkowi pSJ (np. Coracle) oraz białkowi łączącemu adherens (np. E. kadherynie). Inkubuj zarodki w pierwotnym przeciwciału przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na platformie bujającej.
  10. Usuń blokadę z przeciwciałami pierwotnymi i spłukaj zarodki trzy razy w PBS. Dodaj Block i myj zarodki przez 30 minut w temperaturze pokojowej na platformie bujanej.
  11. Przepłucz zarodki jeszcze raz w PBS, następnie dodaj roztwór blokujący i fluorescencyjne przeciwciała wtórne specyficzne dla pierwotnych przeciwciał użytych w kroku 2.9. Inkubuj zarodki w temperaturze pokojowej przez 3-4 godziny lub przez noc w 4 °C.
  12. Usuń blokadę z przeciwciałami wtórnymi i spłukaj zarodki trzy razy w PBS. Dodaj Block i myj zarodki przez 30 minut w temperaturze pokojowej na platformie bujanej.
  13. Przepłucz zarodki jeszcze raz w PBS, a następnie przenieś je na szkiełko mikroskopowe za pomocą pipety Pasteura. Usuń nadmiar PBS za pomocą małych pasków papieru Whatman, uważając, by nie dotykać zarodków. Okryj zarodki podłożem mocującym (dostępnym komercyjnie lub wykonanym z 90% glicerolu, 10% 1 M Tris, pH 8,0, z 0,5% galinianem n-propylu jako środkiem przeciwzanikającym). Przykryj odpowiednio wymiarowym szkłem okładkowym o rozmiarze 1,5 i zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci.

3. Obrazowanie i analiza danych zarodków immunobarwionych

  1. Dla najlepszych rezultatów obrazuj zarodki mikroskopem konfokalnym za pomocą obiektywu do zanurzenia oleju 40x. Użyj zarodków kontrolnych, aby ustawić intensywność lasera i wzmocnienie na konfokalnym, aby uzyskać silny sygnał fluorescencjonalny bez nadmiernego nasycenia pikseli. Identyfikacja zarodków z wyboru stadium 16 (czyli tych, które nie wykazują GFP kodowanego przez balanser do identyfikacji mutantów) za pomocą morfologii śródjelita. Skoncentruj się na gruczole ślinowym lub jelicie tylnym, ponieważ te narządy są spolaryzowane i mają długie błony boczne, idealne do rozróżniania złącza adheren, pSJ oraz pozostałej powierzchni bocznej. Obraz w pozycji z, która będzie zawierać największą możliwą średnicę lumenu gruczołu ślinowego lub jelita tylnego, aby obserwować całą błonę boczną komórki nabłonkowej.
    UWAGA: Przykład pokazany na Rysunku 1C został wykonany na mikroskopie konfokalnym z soczewką HC PL APO 40x/1.3 CS2 o intensywności lasera 1,59 i wzmocnieniu 3,3 dla lasera 561 nm oraz intensywności lasera 2,0 i wzmocnieniu 21,7 dla lasera 638 nm (patrz Tabela materiałów).
  2. Wyobraź sobie spolaryzowaną tkankę w co najmniej 20 zarodkach kontrolnych i mutantów w stadium 16. Rejestruj tylko dane z embrionów, w których marker połączenia adherens jest ściśle zlokalizowany w bocznej części wierzchołkowej błony, aby zapewnić odpowiedni ustalenie i zabarwienie zarodka. Następnie zapisz rozkład markera pSJ wzdłuż błony bocznej. W zarodkach typu dzikiego w stadium 16 należy szukać silnego wzbogacenia białek pSJ wzdłuż ~10-15% błony bocznej, tuż u podstawy do połączenia adherensa.
    UWAGA: Błędna lokalizacja nawet 10-20% białka pSJ wzdłuż błony bocznej jest diagnostyczna dla wady organizacji pSJ. Defekty organizacji pSJ są silnie penetrujące we wszystkich rdzeniowych i dodatkowych mutowanych zarodkach pSJ, więc można się spodziewać, że 75-100% mutowanych zarodków będzie miało wyraźnie nieprawidłowo zlokalizowane białko pSJ.

4. Przygotowanie do wtrysku barwnika

  1. Przygotuj świeży roztwór barwnika, rozpuszczając dextran oznakowany rodaminą 10 kDa do 1 mg/mL w 0,5 M fosforanu sodu, pH 7,5 oraz 5 mM chlorku potasu.
  2. Wciągnij rurkę kapilarną (1,0 mm średnicy średnicy x 0,5 mm średnicy z włóknem) do szklanej igły za pomocą wyciągacza igieł.
    UWAGA: Ciągacze igieł są specyficzne, a ustawienia idealnych igieł często różnią się z dnia na dzień. Dobre igły mają stopniowe zwężanie się do ostrego czubka i powinny znajdować się pomiędzy kształtami pokazanymi na Rysunku 2A. Igła po lewej stronie jest dłuższa i może się wyginać podczas wpychania do zarodka. Można to skorygować, ponownie łamiąc igłę dalej od punktu. Igła po prawej stronie jest dobra, ale przy początkowym złamaniu będzie miała większy otwor i może wcisnąć zbyt dużo płynu do zarodka. Jeśli tak się stanie, zmień igłę na nową z cieńszą końcówką. Najlepiej jest wyciągać kilka drutów jednocześnie, gdy warunki na drutze tworzą odpowiedni kształt. Nadmiar igieł można przechowywać w zamkniętym pojemniku z kawałkiem pianki lub taśmy, aby zabezpieczyć igły samodzielnie.
  3. Załaduj igłę do uchwytu na igły na mikromanipulatorze. Umieść mikromanipulator obok odwróconego mikroskopu (rysunek 2F). Ustaw igłę jak najbliżej równoległości do szkiełka mikroskopu i opuść ją tak, aby znajdowała się w tej samej płaszczyźnie Z co bok szkiełka.
  4. Złam końcówkę igły, uderzając w bok szkiełka mikroskopowego. Podnieś igłę powyżej poziomu suwaka i wyjmij ją do załadunku.
  5. Napełnij rurkę kapilarną barwnikiem, używając najmniejszej dostępnej końcówki pipety (końcówka P2 lub P10) lub kapilarnie, umieszczając tylną część igły w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL razem z barwnikiem.
  6. Ponownie załaduj wypełnioną igłę do uchwytu na igły i sprawdź przepływ dekstranu, wstrzykując trochę do kropli oleju halowęglowego na powierzchni szkiełka mikroskopowego.
    UWAGA: Dobrze uszkodzona igła nie przecieka bez zwiększenia nacisku, a prędkość przepływu można regulować w zależności od tego, ile nacisku jest wywierane na tłok strzykawki.

5. Montaż zarodków i wstrzyknięcie barwnika

  1. Wybierz zarodki ze stadium 16 lub 17 (kontrolne i mutantne), używając morfologii śródjelita jako markera stadijowego.
  2. Stwórz wciętą linię na talerzu soku jabłkowego, używając pokrywki o grubości 22 x 22 #2. Ułóż około 25 zarodków w etapach na talerzu soku jabłkowego, tak że ich tylne końce stykają się z linią, a brzuszna powierzchnia skierowana do góry.
  3. Przyklej kawałek taśmy dwustronnej na pokrywkę #2 o wymiarach 22 x 22. Dotknij taśmą linii zarodka i lekko pocieraj pokrywkę, aby przenieść zarodki z płytki na dwustronną taśmę na pokrywce (Rysunek 2B).
  4. Przymocuj slip do szkiełka mikroskopowego, dodając kroplę oleju halowęglowego do preparatu i używając działania kapilarnego, aby stworzyć wiązanie. Ustaw pokrywkę bliżej boku zlewki, przeciwnej do każdej matowej części. Osusz zarodki przez 3-5 minut w pojemniku z suszeniem lub w powietrzu na stole laboratoryjnym przez 10-15 minut (rysunek 2C-E). Całkowicie pokryj zarodki olejem Halocarbon.
    UWAGA: Zarodki będą nieco mniej napięte po wysuszeniu, ale nie będą mocno wiotkie. Zarodki pokazane na Rysunku 2E pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut w pomieszczeniu o wilgotności względnej 42% i temperaturze 21,2 °C.
  5. Zamontuj szkiełko z embrionami na odwróconym mikroskopie tak, że zarodki są skierowane do góry (od obiektywu). Ustaw mikromanipulator tak, aby igła była skierowana w stronę tylnego końca zarodków pod kątem jak najbliższym równoległości do zarodków (rysunek 2G). Dostosuj oś z mikromanipulatora tak, aby czubek igły był wyrównany do środka zarodka (wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej).
  6. Wstrzyknij zarodki, szybko wprowadzając stopień do igły, tak aby końcówka igły weszła do hemocoela zarodka. Wstrzyknij niewielką ilość barwnika (~0,2-0,5 nL) za pomocą strzykawki o pojemności 10, 25 lub 50 mL. Szybko wyjmij igłę, przenieś etap do następnego zarodka i powtórz cały proces. Wstrzyknij jak najwięcej zarodków w ciągu 10 minut.
    UWAGA: Ważne jest, aby igła była wprowadzona około 25% głębokości w zarodek, aby barwnik nie był bezpośrednio wstrzyknięty do przestrzeni okołodzielnej łączącej się z lumenem przedniego i tylnego jelita. Wstrzyknięty barwnik powinien wyglądać tak, jakby "napompowywał" zarodek, czyniąc go bardziej napiętym. Nadmierne wstrzykiwanie spowoduje wypuszczenie bąbelka barwnika i hemolimfy w miejscu wkłucia i należy tego unikać.
  7. Dodaj dodatkowy olej z halowęglowodorem i przykryj zarodki pokrywką #2 o wymiarach 22 x 22. Dodatkowy olej halowęglowodorowy tworzy bardziej jednolitą warstwę między dwoma pokrywkami, zapobiegając zgniataniu zarodków.

6. Obrazowanie i analiza danych

  1. Wykonaj obrazowanie na mikroskopie fluorescencyjnym złożonym lub konfokalnym (10x lub 20x obiektywów powietrznych wystarczy, aby uzyskać jednoznaczne wyniki). Na konfokalnym obrazowaniu stosu z przez około jedną czwartą głębokości (wzdłuż grzbietowo-brzusznej osi) zarodka ujawni, czy oznakowany dekstran wszedł do światła tchawicy i jelita tylnego (konieczne jest głębsze przekroje lub przeorientowanie zarodków z powierzchnią brzuszną na górze, aby zobaczyć gruczoły ślinowe).
    UWAGA: Przykłady pokazane na Rysunku 3 zostały wykonane na mikroskopie konfokalnym z suchą soczewką HC PL APO 10x/0.4 CS2 o intensywności lasera 2,0 i wzmocnieniu 13,6 dla lasera 561 nm. Uzyskano 24 wycinki z o kroku z 2,4 nm (patrz Tabela materiałów).
  2. Pozostawić zainiekcjonowany zarodek dojrzewać przez 10 minut, a następnie zbadaj światło tchawicy, gruczołu ślinowego lub jelita zadnego pod kątem nagromadzenia oznakowanego dekstranu. Zapisz genotyp i stadium każdego zarodka oraz czy w jakimkolwiek narządzie rurkowym gromadzi się oznakowany dektran. Zwróć uwagę na zarodki, w których przestrzeń periwitelinna jest również mocno zabarwiona barwnikiem, ponieważ mogą one reprezentować zarodki przypadkowo wstrzyknięte do tej przestrzeni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione protokoły służą do badania organizacji i funkcji pSJ w tkankach ektodermalnych w zarodkach Drosophila w stadium 16. Protokoły te mają zastosowanie wyłącznie do pSJ i nie mogą być używane do przesłuchań sSJ. Mutacja w genie, która powoduje nieumiejscowienie innych białek pSJ w regionie pSJ w zarodkach stadium 16 oraz utworzenie złącza zakrywającego na etapie 16, występuje albo w genie rdzeniowym pSJ, albo w genie pomocniczym pSJ. Główna różnica między nimi polega na tym, czy zakodowane białko jest podkomórko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół identyfikacji białek rdzeniowych i pomocniczych pSJ za pomocą dwóch stosunkowo prostych testów, które można wykonać w skromnie wyposażonych laboratoriach z możliwością mikroskopii fluorescencyjnej. Pierwszy test bada molekularną organizację pSJ w dojrzałych spolaryzowanych nabłonkach za pomocą obrazowania konfokalnego embrionów niezmiennych mutantów. Drugi test sprawdza integralność funkcji oklumentycznej pSJ poprzez wstrzyknięcie barwnikowych cząsteczek 10 kDa dextran do żywych zarodków stad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Bloomington Drosophila Stock Center za młyki użyte w tym badaniu. Dziękujemy Bankowi Hybrystoma Developmental Studies za wykorzystanie przeciwciał w badaniu. Dziękujemy również Wydziałowi Biologii na Case Western Reserve University za wykorzystanie ich stereomikroskopu fluorescencyjnego Leica MZ10F do genotypowania i etapowania zarodków do sekcji oraz odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego DMi8 do eksperymentów z iniekcją barwnikową. Dziękujemy Helen Salz, profesor genetyki i genomu na CWRU School of Medicine, za dostarczenie mikromanipulatora oraz za wyciągnięcie kilku igieł użytych w eksperymencie z zastrzykiem barwnika przedstawionym w tym badaniu. Projekt ten został wsparty grantem od National Science Foundation (IOS 2111069) dla REW.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilarna rurka na igły (Boro 1 x 0,5/włókno)FHC30-30-1
Mikroskop konfokalnyLeicaStellaris 5 
Szkło pokrywowe 22 x 22 grubości 2 do wtryskówFisher Scientific12-540-B
Szkło okładkowe 22 x 30, grubość 1,5 do obrazowaniaCorning2980-233
Rurka hodowla do immunobarwienia (6 x 50 mm)  Fisher Scientific14-958-A
Klatka zbiorcza zarodkówGenesee Scientific59-100
Stereomikroskop fluorescencyjnyLeicaMZ10 F
Olej halowęglowodowy (700)Genesee Scientific59-131
HeptanFisher ScientificH350-4
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyLeicaDMi8
Koszyki siatkowe do dechorionacji zarodkówGenesee Scientific46-101
MetanolFisher ScientificA412-4
MikromanipulatorNarishigeMN151
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-544-2
Ciągarka igiełInstrumenty Davida KopfaModel 720
Normalne osiołko serumJackson ImmunoReseaerch017-000-121
Siatka nylonowa (120 um)Genesee Scientific57-102
Obiektyw HC PL FLUOTR 10X/0,32 PH 1Leica11506537
Obiektyw HC PL APO 10x/0.40 CS2Leica15506407
Obiektyw HC PL APO 40x/1.30 CS2Leica15506358
Tablice Petriego 60 x 15 mmCorning351007
Kołysak platformowyGlobe ScientificGTR-FS
Przeciwciało pierwotne (Coracle)DSHBC566.9
Przeciwciało pierwotne (Coracle)DSHBC615.16
Przeciwciało pierwotne (E cadherin)DSHBDCAD2
Przeciwciało pierwotne (Mcr)Laboratorium Ward, CWRUŚwinka morska poliklonalna
Rodamina oznaczona jako 10 kDa dektranuSondy molekularneD1824
Przeciwciało wtórne (przeciw śwince osłowej Cy3)Jackson ImmunoReseaerch706-165-148
Przeciwciało wtórne (przeciwmysie osiołki Cy2)Jackson ImmunoReseaerch715-225-151
Przeciwciało wtórne (przeciwszczurze osły Cy5)Jackson ImmunoReseaerch712-175-150
Shaker na blat stołowyNew Brunswick ScientificWstrząsająca platforma C2
Tegosept (metyl4-hydroksybenzoan)TCIH0216
Triton X-100Fisher ScientificBP151500
Fiolki do utrwalania (20 ml fiolki płynnej scyntylacji WHEATON)Fisher Scientific03-341-73C
Whatman 3MM  Papier chromatograficznyFisher Scientific05-716-6H
Muchowe kolbypełny genotypliczba zapasówŹródło
cor4w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO52232BDSC
W1118w[1118]5905BDSC
RozwiązaniePrzepis
10x PBSWymieszaj 90 g NaCl, 20 g Na2HPO4 oraz 8,3 g NaH2PO4.H2O i dH20 na 1L. Sterylizuj filtr. Rozcieńcz do 1X dH2O na etapach płukania immunobarwienia.
Roztwór 10% Triton X-100Wymieszaj 1 ml Triton X-100 z 9 ml dH2O na platformowym kołysze do rozpuszczenia. Przechowuj w temperaturze pokojowej.
50% wybielaczaWymieszaj 10 ml komercyjnego wybielacza (7,5% podchlorynu sodu) z 10 ml wody przed dechorionowaniem zarodków.
Talerze soku jabłkowegoUgotuj 15 g agaru Drosophila w 725 ml dH2O. Dodaj 25 g cukru i 250 ml soku jabłkowego i mieszaj, aż się zmiksuje. Pozwól roztworowi ostygnąć do 55°C, następnie dodaj 1,3 g tegoseptu i delikatnie wymieszaj. Wlej do talerzy Petriego 60 x 15 i pozwól ostygnąć. Przechowywać w 4C.
Rozwiązanie blokująceWymieszaj 9,8 ml 1X PBS z 100 ul 10% Triton X-100 i 100 ul Normal Donkey Serum w 15-stożkowej tubce.
Roztwór płukania zarodkówPrzygotuj 10X roztwór do płukania zarodków, mieszając 70 g NaCl i 2 ml Triton X-100 do 1L dH2O. Rozcieńcz do 1X z dH2O, żeby roztwór działał.
FixPodgrzej 10 ml 1X PBS w mikrofalówce. Dodaj 0,4 g  paradehydu i pipeta do mieszania. Dodaj 10 ul 14N NaOH, aby przyspieszyć rozpuszczanie. Umieść na 90°C bloku grzewczym, aż się rozpuści. Gdy nie pozostanie stały paraformaldehyd, dodaj 10 ul 14N HCL, aby dostosować pH do neutralnego. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawiczki i okulary podczas stosowania paraformaldehydu.
Nośniki montażoweWymieszaj 9 ml glicerolu i 1 ml 1M Tris o pH zasadowym 8,0. Dodaj 0,05 g n-propyl-galianu,  Wymieszaj i podgrzej, żeby się rozpuścić. Zawieram 0,5 ml do probówek Eppendorfa.
Roztwór dekstranu rodaminyPrzygotuj świeży roztwór barwnika, rozpuszczając Dextran oznakowany Rhodaminą 10 kDa do 1 mg/ml w 0,5M fosforanu sodu, pH 7,5 oraz 5 mM chlorku potasu.
Pasta drożdżowaWymieszaj 50 g drożdży komercyjnych (Red Star) z szczyptą sacharozy i wystarczającą ilością wody, aby uzyskać gęstą pastę. Przechowywać w 4C.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
  2. Lord, B. A., DiBona, D. R. Role of the septate junction in the regulation of paracellular transepithelial flow. J. Cell Biol. 71 (3), 967-972 (1976).
  3. Noirot-Timothée, C., Smith, D. S., Cayer, M. L., Noirot, C. Septate junctions in insects: comparison between intercellular and intramembranous structures. Tissue Cell. 10 (1), 125-136 (1978).
  4. Rouka, E., et al. The Drosophila septate junction beyond barrier function: review of the literature, prediction of human orthologs of SJ-related proteins and identification of protein domain families. Acta Physiol. 231 (1), e13527(2021).
  5. Poodry, C., Schneiderman, H. The ultrastructure of the developing leg of Drosophila melanogaster. Roux Arch. Dev. Biol. 166, 1-44 (1970).
  6. Tepass, U., Hartenstein, V. The development of cellular junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161 (2), 563-596 (1994).
  7. Rice, C., De, O., Alhadyian, H., Hall, S., Ward, R. E. Expanding the junction: new insights into non-occluding roles for septate junction proteins during development. J. Dev. Biol. 9 (1), 11(2021).
  8. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  9. Fehon, R. G., Dawson, I. A., Artavanis-Tsakonas, S. A Drosophila homologue of membrane-skeleton protein 4.1 is associated with septate junctions and is encoded by the coracle gene. Development. 120 (3), 545-557 (1994).
  10. Hall, S., et al. Macroglobulin complement-related (Mcr) encodes a protein required for septate junction organization and paracellular barrier function in Drosophila. Development. 141, 889-898 (2014).
  11. Nelson, K. S., Furuse, M., Beitel, G. J. The Drosophila claudin Kune-kune is required for septate junction organization and tracheal tube size control. Genetics. 185 (3), 831-839 (2010).
  12. Paul, S. M., Ternet, M., Salvaterra, P. M., Beitel, G. J. The Na⁺/K⁺-ATPase is required for septate junction function and epithelial tube-size control in the Drosophila tracheal system. Development. 130 (20), 4963-4974 (2003).
  13. Nilton, A., et al. coiled and crimpled are three Ly6-like proteins required for proper localization of septate junction components. Development. 137 (14), 2427-2437 (2010).
  14. Tiklova, K., Senti, K. A., Wang, S., Gräslund, A., Samakovlis, C. Epithelial septate junction assembly relies on melanotransferrin iron binding and endocytosis in Drosophila. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1071-1077 (2010).
  15. Bilder, D., Schober, M., Perrimon, N. Integrated activity of PDZ protein complexes regulates epithelial polarity. Nat. Cell Biol. 5 (1), 53-58 (2003).
  16. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66 (3), 451-464 (1991).
  17. Hall, S., Ward, R. E. Septate junction proteins play essential roles in morphogenesis throughout embryonic development in Drosophila. G3 (Bethesda). 6 (8), 2375-2384 (2016).
  18. Genova, J. L., Fehon, R. G. Neuroglian, Gliotactin, and the Na⁺/K⁺-ATPase are essential for septate junction function in Drosophila. J. Cell Biol. 161 (5), 979-989 (2003).
  19. Ward, R. E., Lamb, R. S., Fehon, R. G. A conserved functional domain of Drosophila coracle is required for localization at the septate junction and has membrane-organizing activity. J. Cell Biol. 140 (6), 1463-1473 (1998).
  20. De, O., et al. Septate junction proteins are required for cell shape changes, actomyosin reorganization and cell adhesion during dorsal closure in Drosophila. Front. Cell Dev. Biol. 10, 947444(2022).
  21. Laprise, P., et al. The FERM protein Yurt is a negative regulatory component of the Crumbs complex that controls epithelial polarity and apical membrane size. Dev. Cell. 11 (3), 363-374 (2006).
  22. Laprise, P., et al. Neurexin IV and the Na⁺/K⁺-ATPase form a novel group of epithelial polarity proteins. Nature. 459 (7250), 1141-1145 (2009).
  23. Oshima, K., Fehon, R. G. Analysis of protein dynamics within the septate junction reveals a highly stable core protein complex that does not include the basolateral polarity protein Discs large. J. Cell Sci. 124 (Pt 16), 2861-2871 (2011).
  24. Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  25. Lamb, R. S., Ward, R. E., Schweizer, L., Fehon, R. G. Drosophila coracle, a member of the protein 4.1 superfamily, has essential structural functions in septate junctions and developmental roles in epithelial cells. Mol. Biol. Cell. 9 (12), 3505-3519 (1998).
  26. Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for blood-brain barrier integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233(2019).
  27. Laprise, P., et al. Epithelial polarity proteins regulate Drosophila tracheal tube size in parallel to the luminal matrix pathway. Curr. Biol. 20 (1), 55-61 (2010).
  28. Batz, T., Förster, D., Luschnig, S. The transmembrane protein macroglobulin complement-related is essential for septate junction formation and epithelial barrier function in Drosophila. Development. 141 (4), 899-908 (2014).
  29. Behr, M., Riedel, D., Schuh, R. The claudin-like Megatrachea is essential in septate junctions for epithelial barrier function in Drosophila. Dev. Cell. 5 (4), 611-620 (2003).
  30. Wu, V. M., et al. Sinuous is a Drosophila claudin required for septate junction organization and epithelial tube size control. J. Cell Biol. 164 (2), 313-323 (2004).
  31. Wu, V. M., et al. Drosophila Varicose, a member of a new subgroup of basolateral MAGUKs, is required for septate junctions and tracheal morphogenesis. Development. 134 (5), 999-1009 (2007).
  32. Jaspers, M. H., et al. The claudin Megatrachea protein complex. J. Biol. Chem. 287 (44), 36756-36765 (2012).
  33. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  34. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic Drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pliskowane po czenia septalnezarodki Drosophilaprotok immunobarwieniafunkcja bariery nab onkowejkluczowe bia ka SJb ona bocznatkanki ektodermalnepo czenie szczelnepo czenie adherens

Powiązane artykuły