Artykuł metodologiczny

Wizualizacja w czasie rzeczywistym wpływu ośrodków odżywczych na rozwój biofilmu Pseudomonas aeruginosa z wykorzystaniem systemu mikrofluidycznego

DOI:

10.3791/69997

⸱

15 maja 2026

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ocenia wpływ bogatego (TSB) i minimalnego (FAB) składu mediów odżywczych na rozwój biofilmu Pseudomonas aeruginosa PAO1 i PA14 w środowisku przepływu stacjonarnego w mikrokanale.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogenna bakteria Pseudomonas aeruginosa jest główną przyczyną licznych infekcji nosokomialnych, a jej rosnąca oporność przeciwdrobnoustrojowa sprawia, że stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Niniejszy artykuł przedstawia kompleksowy protokół szczegółowo opisujący zastosowanie systemu mikrofluidycznego do wizualizacji i ilościowej identyfikacji rozwoju biofilmu w czasie rzeczywistym w dwóch kluczowych szczepach P. aeruginosa : PAO1 i PA14. Metoda wykorzystuje optycznie przezroczyste, wielokanałowe płytki mikrokanałowe do poddawania hodowli bakteryjnych ciągłemu, stałemu przepływowi ośrodków, w tym tryptycznego bulionu sojowego (TSB) lub zmodyfikowanego minimalnie wyciszonego bulionu beztlenowego (FAB) o różnym stężeniu węgla, co naśladuje warunki występujące w środowiskach klinicznych. W ciągu 24 godzin zautomatyzowane obrazowanie w czasie rzeczywistym rejestruje wzrost i dojrzewanie biofilmów w postaci pokrycia powierzchni, grubości i chropowatości powierzchni biofilmu w wysoce powtarzalny sposób. Celem eksperymentalnym jest wykorzystanie wyników do wykazania, że tworzenie biofilmu dla obu szczepów jest istotnie wpływane przez zmiany składu medium odżywczego. Celem tego wizualizowanego protokołu jest stworzenie metody umożliwiającej badaczom dynamikę biofilmu w warunkach stałego przepływu laminarnego, a zdobyte wnioski mogą być wykorzystane do opracowania alternatywnych, nieantybakteryjnych strategii eradykacji wczesnych etapów biofilmów P. aeruginosa w warunkach noskocomialnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tej metody jest obserwacja wpływu dwóch różnych mediów hodowlanych, tj. tryptycznego bulionu sojowego (TSB) oraz zmodyfikowanego minimalnie wyciszonego bulionu beztlenowego (FAB), na wzrost biofilmu dwóch szczepów Pseudomonas aeruginosa, mianowicie PAO1 i PA14. Chociaż P. aeruginosa PAO1 i PA14 są powszechnymi szczepami referencyjnymi laboratoryjnie, szczep PA14 infekuje większą część gospodarzy od roślin po bezkręgowce1. Bulion odżywczy TSB to uniwersalne medium hodowlane z 2,5 g/l glukozy jako źródła węgla i zdolne do hodowli szerokiego spektrum bakterii dzięki składowi kazeiny i peptonów sojowym dla organicznego azotu i naturalnego zaopatrzenia w cukier, a także chlorku sodu do utrzymania równowagi osmotycznej. Minimalne podłoże FAB, w przeciwieństwie do tego, jest formułowane przy minimalnych stężeniach (50-krotne redukcje) pojedynczego źródła węgla, w stężeniach 0,05 g/L, aby zbadać wymagania wzrostu bakterii beztlenowych. Zarówno odkształcenia PAO1, jak i PA14 były narażone na jednokierunkowy, laminarny przepływ, co skutkowało niskim naprężeniem ścinającym ściany o wartości 0,01 Pa. Ta wartość naprężenia ścinającego często występuje w miejscach skolonizowanych przez P. aeruginosa, w tym w oskrzelach pacjentów z mukowiscydozą oraz w przewodzie pokarmowym. Wzrost biofilmu mierzono w ciągu 24 godzin poprzez ocenę w czasie rzeczywistym pokrycia powierzchni, grubości oraz średniej arytmetycznej chropowatości powierzchni.

Biofilmy P. aeruginosa odpowiadają za znaczący odsetek zakażeń nosokomyalnych i są główną przyczyną zgonów u osób z mukowiscydozą 3,4,5. Poprzednie badania wpływu poziomu źródeł węgla na rozwój biofilmu bakteryjnego pomijały kluczową rolę przepływu hydrodynamicznego podczas powstawania biofilmu, stosowały wartości naprężeń ścinających niereprezentatywne dla miejsc zakażenia P. aeruginosa lub przeprowadzały jedynie analizę biofilmu kinetyczną i morfologiczną po eksperymencie 6,7. Ograniczenia te są rozwiązane tą metodą poprzez wykorzystanie obrazowania w czasie rzeczywistym rozwoju biofilmu, w warunkach przepływu stacjonarnego w kanale mikrofluidycznym, który wiernie odzwierciedla środowiska fizjologiczne występujące u pacjentów z mukowiscydozą.

Ta metoda oferuje znaczące zalety w porównaniu z alternatywnymi metodami stosowanymi do badania rozwoju biofilmu. Zastosowanie obrazowania w czasie rzeczywistym podczas 24-godzinnego okresu wzrostu biofilmu zapewnia, że rozwijający się biofilm nie jest zakłócony, ponieważ nie są potrzebne żadne suszenie ani zmiany chemiczne, co pozwala uniknąć zmian w jego składzie i daje bardziej reprezentatywne wyniki niż metody wymagające manipulacji próbką8. Dodatkowo, stosując stałe warunki przepływu hydrodynamicznego i zmieniając stężenia źródeł węgla w dużej skali, procedura ta dokładniej odwzorowuje środowiska fizjologiczne występujące w miejscach zakażeń nosokomialnych P. aeruginosa. Czyni ją to bardziej reprezentatywną metodą w porównaniu z metodami wykorzystującymi testy statyczne, takimi jak mikropłytki miareczkowe z 96 dołkami czy kupony, które nie oddają krytycznego wpływu przepływu płynów na rozwój biofilmu 9,10,11.

Zastosowane urządzenie mikrofluidyczne zostało wybrane specjalnie, ponieważ jego wymiary są zbliżone do części płuca, takich jak oskrzele i oskrzela12. Ponadto zakażenia P. aeruginosa są poważnym problemem dla pacjentów z ciężkimi poparzeniami, gdzie poziomy glukozy mogą znacząco wahać się od normalnego zakresu13,14.

Chociaż protokół ten wykorzystuje konkretnie dwa szczepy P. aeruginosa, metoda ta jest również stosowana w badaniach nad wczesnym stadium rozwoju innych bakterii wywołujących infekcje lub kolonizujących obszary w podobnych warunkach. Dodatkowo, inne składy ośrodków odżywczych oraz warunki przepływu (np. przepływy pulsacyjne i oscylujące lub wyższe wartości ścinania ścian) również mogły być badane tą samą metodologią.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Czyszczenie szkła

  1. Zanurz dwie szklane butelki o pojemności 200 mL przeznaczone do produkcji medium i agaru oraz trzy butelki szklane o pojemności 1 L w kąpieli z kwasem solnym 10% (HCl) na około 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Kwas solny jest żrący. Całą obsługę kwasu wykonuj w okapie chemicznym, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny (fartuch laboratoryjny, rękawiczki i ochronę oczu).
  2. Następnie wyjmij szkło z kąpieli HCl i przepłukaj dwukrotnie wodą z kranu oraz raz wodą destylowaną (dH2O).

2. Tryptyczne przygotowanie do wywaru sojowego

  1. Przygotuj roztwór TSB, zważ 6 g/200 mL proszku TSB na czystej łodzi ważącej i precyzyjnej wagi.
    UWAGA: Skład użytego proszku TSB jest następujący: dekstroza (2,5 g∙L-1), fosforan potasowy (2,5 g∙L-1), trawienie kazeiny do trzustki (17 g∙L-1), trawienie papaiczowe mąki sojowej (3,0 g∙L-1) oraz chlorek sodu (5,0 g∙L-1).
  2. Zmierz 200 ml dH2O za pomocą cylindra pomiarowego i wlej do jednej z wcześniej wyczyszczonych szklanych butelek.
  3. Dodaj 6 g TSB do czystej szklanej butelki zawierającej 200 mLdH2O, szczelnie zamknij butelkę i wymieszaj przez około 2 minuty, aby rozpuścić proszek, tworząc medium roztworowe TSB.
  4. Roztwór TSB w autoklawie przez 15–20 minut w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 1,5 atm, aby roztwór sterylizować.
    UWAGA: (Punkt Pauzy) Roztwór TSB można przechowywać w temperaturze pokojowej (około 20 °C) między użyciami i stosować w przyszłych eksperymentach.

3. Skrupulatne beztlenowe przygotowanie supstratu do bulionu

  1. Przygotuj roztwór metali śladowych FAB.
    1. Używaj oddzielnych, czystych łodzi ważących i łopatki oraz precyzyjnej wagi przy masach od 0,5 do 210 g, a wagi analitycznej przy masach między 0,001–0,5 g. Zmierz następujące składniki i ich ilości: CaSO4,2H 2O(200 mg∙L-1), FeSO4,7H 2O (200 mg∙L-1), MnSO4. H2O (20 mg∙L-1), CuSO 4,5H2O (20 mg∙L-1), ZnSO4,7H 2O (20 mg∙L-1), CoSO4,7H 2O (10 mg∙L-1), NaMoO4. H2O (10 mg∙L-1) oraz H3BO3 (5 mg∙L-1)7,9.
    2. Każdy składnik włóż do butelki o pojemności 1 L oczyszczonego szkła zawierającej 1 L dH20i dokładnie wymieszaj z dH20.
    3. Dodaj po 1 ml tej mieszanki do każdej z dwóch pozostałych butelek po 1 L sterylizowanego szkła z 1 L dH2O i dokładnie wymieszaj.
  2. Przygotuj 20 mM FAB z dodatkiem cytrynianu sodu do nocnych hodowli
    1. Zmierz następujące składniki i ich ilości za pomocą oddzielnych, czystych wag i szpatułki, precyzyjnej wagi przy ważeniu mas między 0,5-200 g oraz wagi analitycznej przy ważeniu mas między 0,001-0,5 g,: cytrynian sodu (20 mM), (NH4)2SO4 (2 g∙L-1), Na2HPO 4,2H2O (6 g∙L-1), KH2PO4 (3 g∙L-1), NaCl (3 g∙L-1), MgCl2 (93 mg∙L-1) oraz CaCl2 (11 mg∙L-1)7,9.
    2. Wszystkie składniki włóż do jednej z pozostałych 1 L sterylnych butelek szklanych zawierających 1 L dH2O z 1 ml roztworu metali śladowych.
    3. Wymieszaj dokładnie.
  3. Przygotuj 0,3 mM glukozy FAB do wzrostu biofilmu.
    1. Zastąpić 20 mM cytrynianu sodu 0,3 mM glukozy. Używaj tych samych składników i mas wymienionych w kroku 3.2.1.
    2. Do pozostałej wyczyszczonej butelki szklanej o pojemności 1 L dodaj 0,3 mM składniki glukozy FAB do 1 mL dH2Oz 1 mL roztworu metali śladowych i dobrze wymieszaj.
  4. Autoklawuj przez 15-20 minut w temperaturze pary 121 °C i ciśnieniu 1,5 atm, aby sterylizować medium.
    UWAGA: (PUNKT PAUZY) Roztwór medium fab może być przechowywany w temperaturze pokojowej (około 20 °C) między użyciami i wykorzystywany w przyszłych eksperymentach.

4. Przygotowanie agaru TSB

  1. Odmierz 8 g/200 mL agaru TS przy użyciu precyzyjnej wagi i umytych wag oraz szpatuły.
  2. Odmierz 1 g/200 mL agaru o jakości bakteriologicznej na osobnej łodzi ważącej i używając tej samej precyzyjnej wagi.
  3. Za pomocą cylindra pomiarowego zmierz 200 mL dH2Oi wlej je do ostatniej, wcześniej wyczyszczonej szklanej butelki.
  4. Wlej oba składniki agaru do 200 mLdH2Oi dobrze wymieszaj.
  5. Autoklawuj przez 15–20 minut w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 1,5 atm, aby sterylizować podłoże.
    UWAGA: (PUNKT PAUZY) Agar TSB można przechowywać w temperaturze pokojowej (około 20 °C) między użyciami i wymaga ponownego podgrzania przed użyciem w przyszłych eksperymentach.

5. Hodowla na szalce Petriego Pseudomonas Aeruginosa

  1. Rozpuszczaj agar w mikrofalówce przez około 5 minut lub aż roztwór stanie się płynny.
  2. Otwórz i zdezynfekuj powierzchnię szafki bezpieczeństwa klasy II roztworem etanolu 70%, gotową do użycia. Wykonaj wszystkie poniższe kroki w tej sekcji w tej szafie bezpieczeństwa klasy II.
  3. Odmierz 25 ml roztworu agaru do fiolki o pojemności 50 mL i wlej do szalki Petriego o średnicy 90 mm, a następnie poczekaj, aż agar się zastygnie.
  4. Pobierz mrożone buliony P. aeruginosa PAO1 i PA14 z zamrażarki o temperaturze -80 °C. Umieść buliony w inkubatorze w temperaturze 37 °C na około 5 minut lub do całkowitego rozmrozenia zawartości.
  5. Zanurz pętlę szczepionkową w jednym z rozmrożonych zapasów P. aeruginosa i rozprowadz próbkę po agarze.
  6. Powtórz krok 5.5 dla drugiego szczepu P. aeruginosa , tworząc dwie oddzielne kultury na szalce Petriego P. aeruginosa , jedną z szczepem PAO1, a drugą z szczepem PA14.
  7. Każdą miskę Petriego oznacz szczepem P. aeruginosa , datą odrodzenia i inicjałami, a następnie umieść w inkubatorze na 16–18 godzin w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: (PUNKT PAUZY) P. aeruginosa PAO1 i PA14 szalki Petriego można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres przechowywania do 4 tygodni i stosować do przyszłych eksperymentów.

6. Stocki glicerolu Pseudomonas aeruginosa PAO1 i PA14

  1. Otwórz i zdezynfekuj szafkę bezpieczeństwa klasy II do użytku, wybierz osiem fiolek po 50 mL, aby pomieścić nocne hodowle.
  2. Używając wcześniej przygotowanych podłoży FAB TSB i cytrynianu sodu (sekcja 3), wlej 5 ml medium TSB do czterech z ośmiu fiolek oraz medium o minimalnej ilości cytrynianu sodu FAB do pozostałych czterech.
  3. Korzystając z wcześniej inkubowanych szalek Petriego i pętli inokulacyjnej, dotknij pięciu oddzielnych kolonii w szalce P . aeruginosa PAO1 Petriego i przenieś do jednej z fiolek TSB. Powtórz to dla podłoża FAB z cytrynianem sodu oraz dla szczepu Petriego P. aeruginosa PA14.
  4. Zanurz czystą pętlę szczepień bezpośrednio w pozostałe cztery fiolki z TSB i cytrynianem sodu FAB, tworząc grupy kontrolne.
  5. Wszystkie osiem fiolek inkubuj w inkubatorze potrząsającym przez 16–18 godzin przy 200 obr./min i 37 °C i wyraźnie etykietuj.
  6. Pobierz fiolki hodowlane, upewnij się, że osoby zaszczepione P. aeruginosa są mętne, a te używane jako środki zwalczania pozostają czyste.
  7. Wirówka cztery fiolki zaszczepione P. aeruginosa w dawce 4000 × g przez 5 minut w temperaturze 20 °C, aby oddzielić P. aeruginosa od podłoża hodowlanego. Upewnij się, że wirówka jest zrównoważona.
  8. Po wirowaniu odłóż 1 ml roztworu zawierającego 15% glicerol i ponownie zawiesij pellet P. aeruginosa i ponownie zawiesij pellet P. aeruginosa w 15% glicerolu, z 150 μL glicerolu i 850 μL świeżego podłoża TSB lub cytrynianu sodu.
  9. Przełóż ponownie zawiesowane hodowle do fiolek o pojemności 1 mL i umieść w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    UWAGA: (PUNKT PAUZY) Zapasy glicerolu można przechowywać w temperaturze -80 °C do długoterminowego przechowywania i wykorzystać do przyszłych eksperymentów.

7. Pomiar gęstości optycznej nocnych hodowli

  1. Powtórz kroki 6.1–6.5, tylko dla dwóch fiolek średniej ilości TSB, z jedną jako kontrolą, a drugą z szczepem PAO1 P. aeruginosa .
  2. Pipeta 1 mL podłoża TSB do fiolki spektrofotometru o pojemności 1 mL, wewnątrz szafki bezpieczeństwa klasy II, a następnie przelej 0,9 mL pożywki TSB do drugiej fiolki, uzupełniając o 0,1 mL nocnej hodowli.
  3. Ustaw spektrofotometr na długość fali światła 600 nm i, używając fiolki spektrofotometru TSB o pojemności 1 mL do kalibracji urządzenia, zmierz gęstość optyczną fiolki zawiesiny15 o pojemności 0,1 mL.
    1. Jeśli mierzona absorbancja nie wynosi 0,1, ponownie oblicz potrzebną objętość zawieszenia.
      UWAGA: Objętość zawiesiny potrzebna do uzyskania odczytu absorpcji 0,1 (V1) można obliczyć na podstawie początkowego odczytu absorbancji zawiesiny w fiolce 0,1 mL, C1, pożądanej absorpcji, do której regulowane jest zawieszenie, C2, oraz objętości skoncentrowanej zawiesziny nocnej, V2:
      C1V1 = C2V2
      W powyższym przykładzie, jeśli C1 = 3,59, C2 = 0,1 oraz V2 = 10 mL, objętość nocnego zawieszenia wymagana będzie wynosić 0,279 mL w roztworze 10 mL.
  4. Odmierz 10 mL pożywki TSB do fiolki 50 mL i usuń taką samą objętość jak objętość zawiesiny potrzebnej do stworzenia zawieszenia o temperaturze 10 mL 0,1 OD 600 nm. Używając nocnej hodowli, dodaj obliczoną objętość zawieszenia i wir na około 5 sekund, aby wymieszać.
  5. Przelej 1 mL z 10 mL regulowanej zawiesziny do fiolki spektrofotometru i ponownie zmierz absorpcję, aby upewnić się, że wynosi 0,1.
  6. Powtórz powyższe 7,1–7,5 dla PA14 i podłoża TSB oraz dla szczepów P. aeruginosa i podłoża FAB z cytrynianem sodu.

8. Liczba komórek żywotnych

  1. PrzelejdH2Odo kwadratowej szalki Petriego w szafce bezpieczeństwa klasy II i użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 180 μL do kolumn 2–9 przezroczystej 96-dołkowej płytypolistyrenowej 16.
  2. Przenieść zawieszenie 0,1 OD 600 o pojemności 10 mL do osobnej kwadratowej szalki Petriego i za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 200 μL zawieszenia do kolumny 1 z płyty polistyrenowej z 96 dołkami.
  3. Przelej ponad 20 μL zawieszenia za pomocą pipety wielokanałowej z kolumny 1 płyty polistyrenowej z 96 dołków do kanału 2, następnie przelej 20 μL rozcieńczonej zawiesziny z kanału 2 do kanału 3, powtarzając do kanału dziewięć, tworząc rozcieńczenia zawieszenia od 10-1 do 10-8.
  4. Przelej 50 mL agaru TS (sekcja 4 i krok 5.1) w szafce bezpieczeństwa klasy II za pomocą fiolki do kwadratowej miseczki Petriego i zostawij do momentu, gdy agar stanie się mętny.
  5. Przelej 10 μL z każdej z dołków wzdłuż kolumn 2–9 na szalkę Petriego agaru TS w formacji kolumnowej, używając pipety wielokanałowej, aby kolumny nie stykały się ze sobą.
  6. Inkubuj agar TS przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, po oczekiwaniu aż przeniesione rozcieńczenia się ustabilizują.
  7. Oblicz jednostki tworzące kolonie (CFU) na mililitr (mL), ustalając, czy szalka Petriego jest przeliczalna (od 30 do 300 kolonii).
  8. Określ współczynnik rozcieńczenia używanego zawieszenia 10 mL; w tym przypadku zawieszenie rozcieńczono do 1/10 (0,1 OD 600).
  9. Oblicz indywidualne współczynniki rozcieńczenia każdej kolumny pokrytej powłoką. Jest to ilość rozcieńczonego zawieszenia dodanego do każdej kolumny podzielona przez całkowitą objętość kolumny po dodaniu zawieszenia. W przypadku kolumny 2 płyty 96-dołowej (kolumna 1 szalki Petriego), 20 μL/200 μL = 1/10.
  10. Oblicz całkowity szeregowy współczynnik rozcieńczenia, mnożąc poszczególne czynniki rozcieńczenia każdej z kolumn.
    UWAGA: W tym przypadku, ponieważ 20 μL zostało przeniesione z każdej kolumny do następnej, co dało całkowitą objętość każdej kolumny studni 200 μL, każde rozcieńczenie szeregowe wynosiło 1/10. Całkowite rozcieńczenie serii wynosi 1 × 10-8.
  11. Określ współczynnik rozcieńczenia powłoki, gdy rozcieńczenie jest przenoszone z płyty 96-dołkowej do szalki Petriego. Aby określić CFU/mL, podziel objętość każdej pokrytej kolumny (10 μL) przez 1 mL. W tym przypadku: figure-protocol-1.
  12. Określ końcowy współczynnik rozcieńczenia, mnożąc pierwotny współczynnik rozcieńczenia zawieszenia (0,1) przez całkowity współczynnik szeregowego rozcieńczania (1 × 10-8) oraz współczynnik rozcieńczania powłoki (figure-protocol-2).
  13. Oblicz CFU∙mL-1 w oryginalnej próbce, pomnożyj CFU na płycie przez odwrotność końcowego współczynnika rozcieńczania.
    UWAGA: W tym przypadku, jeśli policzyć 200 CFU, oznaczałoby to wykonanie 200 × 1/1 × 10-8, co skutkowałoby wynikiem CFU/mL 2 × 1010 CFU∙mL-17.

9. Konfiguracja systemu mikrofluidycznego i praca eksperymentalna

  1. Inokuluj 5 mL bulionu z podłożem hodowlanym każdym szczepem P. aeruginosa , aby utworzyć nocną hodowlę i inkubuj przez 16–18 godzin w temperaturze 37 °C.
  2. Skonfiguruj system mikrofluidyczny i powiązane oprogramowanie do pracy.
    1. Aktywuj komponenty systemu mikrofluidycznego w następującej kolejności: zasilacz, sterownik systemu mikrofluidycznego, kamera CMOS, podgrzewacze obudowy, mikroskop, komputer oraz monitory powiązane.
    2. Aktywuj oprogramowanie mikrofluidyczne i inicjuj interfejs modułu sterującego, wprowadzając 48-dołkowy kod kreskowy 0–2 Pa powiązany z płytą wielokanałową po wywołaniu sygnału, znajdujący się po boku płyty wielokanałowej.
  3. Ustaw procedurę wielokanałowej odsłony płytkowej studni P. aeruginosa .
    1. Dostosuj gęstość optyczną nocnej hodowli do 0,1 OD600.
    2. Przelej 50 μL zawieszenia 0,1 OD 600 do otworu wylotowego każdego z sześciu kanałów równolegle wewnątrz szafki bezpieczeństwa klasy II.
      UWAGA: Sześć kanałów działało równolegle, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo identyfikacji anomalii wyniku.
    3. Wymień pokrywę płyty wielokanałowej z 48 dołkami i przenieś ją do ruchomego stopnia znajdującego się wewnątrz inkubatora systemowego i zabezpiecz ją.
  4. Ustaw procedurę wielokanałowej inokulacji kanałów płytowych P. Aeruginosa .
    1. Zasiać kanały mikrofluidyczne za pomocą modułu sterowania systemu mikrofluidycznego, wybierając: Kolumny Manual > 1–4 > Płyn: TSB przy 37 °C > Maksymalny ścinanie (Pa): 0,1 (1 dyne∙cm-2 = 0,1 Pa) i wybierz odwiert wylotowy z diagramu płyt wielokanałowych 48 otworów 0–2 Pa.
    2. Wybierz przycisk przerwania, aby zatrzymać przepływ po 2–4 sekundach i pozostawić płytę na 30 minut, aby upewnić się, że komórki przyczepią się do podłoża kanałowego przed rozpoczęciem ciągłego przepływu.
      UWAGA: 30-minutowy czas trwania pozwala siłe grawitacyjnej pomóc przylegać planktonicznej bakterii P. aeruginosa do dolnej ściany kanału. Ten czas będzie się różnił w zależności od bakterii i rodzaju nośnika.
    3. Usuń wielokanałową płytkę ze stopnia przenośnego inkubatora i przelej 1 mL świeżego TSB do studni wlotowej każdego z sześciu kanałów w szafie bezpieczeństwa klasy II.
    4. Przenieś płytę wielokanałową do ruchomego stopnia wewnątrz inkubatora i zabezpiecz ją na miejscu.
  5. Ustaw AutoRun.
    1. Upewnij się, że przepływ używany przez całe 24-godzinne eksperymenty jest istotny dla miejsc występowania P. aeruginosa w naturze, nawigując na ręczne > naprężenia ścinające: 0,01 Pa, oraz zapisz wyświetlaną objętość przepływu (μL⋅h-1). Upewnij się, że ta wartość dla płytki mikrokanałowej z 48 dołkami wynosi 8,2 μL⋅h-1.
    2. Przelicz przepływ objętościowy na m3∙s-1, oblicz przekrój poprzeczny koryta (m2) i określ prędkość przepływu przy hydrodynamicznym naprężeniu ścinającym 0,01 Pa.
      UWAGA: Używając i przestawiając równanie przepływu objętościowego płynu, można obliczyć prędkość przepływu płynu przez kanał:
      figure-protocol-3
      Gdzie U to prędkość płynu (m∙s-1), a A to przekrój mikrokanałowy (m2) kanałów w wielokanałowej płycie.
    3. Oblicz liczbę Reynoldsa przepływu, używając gęstości ρ i lepkości dynamicznej μ, ośrodka TSB, i upewnij się, że biofilmy P. aeruginosa znajdują się w zakresie przepływu cieczy. Dla hydrodynamicznego naprężenia ścinającego 0,01 Pa, należy upewnić się, że liczba Reynolda wynosi 0,0117 i 0,0165 odpowiednio dla ośrodków TSB i FAB. Jeśli wykracza poza ten zakres, sprawdź, czy warunki płynów są ustawione na TSB.
      figure-protocol-4
      Gdzie Dh to średnica hydrauliczna użytego mikrokanału, uzyskana za pomocą:
      figure-protocol-5
      Gdzie w i h oznaczają szerokość (m) i wysokość (m) użytego mikrokanału.
    4. Oblicz długość wywoływania płynu, aby upewnić się, że przepływ płynu w obszarze akwizycji obrazu jest w pełni rozwinięty.
      UWAGA: Długość wywoływania płynu laminarnego przez kanał można obliczyć za pomocą liczby Reynoldsa, Re, oraz średnicy hydraulicznej kanałów, Dh:
      Ldev = 0,06ReDh
    5. Ustaw autorun: Edytuj AutoRun > Konfiguracja protokołu > czas trwania: 24 godziny, z powtórzeniem 1 i naprężeniem ścinającym 0,01 Pa. Zapisz protokół.
    6. Utwórz nową sekwencję w zakładce Sequence Setup , stosując nowo utworzony protokół jednym powtórzeniem do kanałów 1–6 i wybierz płyn: TSB przy 37 °C. Zapisz tę sekwencję.
  6. Ustaw akwizycję obrazu za pomocą okna Wielowymiarowego Akwizycji .
    1. Wybierz Wielowymiarowe Akwizycje za pomocą oprogramowania systemowego, a następnie przycisk na żywo (w lewym dolnym rogu okna Akwizycji Wielowymiarowej ). Przejdź przez etap mikroskopu, aby zobaczyć kanały 1–6 za pomocą przycisku podglądu na żywo i powiększeń kamery od 5× do 40× na ekranie dotykowym mikroskopu, pokazując jeden kanał w polu widzenia kamery naraz.
    2. Przygotuj aparat do akwizycji obrazu: Wielowymiarowe akwizycje > Zapis: wybierz katalog, do którego zdjęcia zostaną zapisane > Timelapse: Czas trwania: 24 godziny, tyle samo co przepływ hydrodynamiczny > Interwał czasu: Czas między każdym pobranym obrazem, ustaw 10 minut.
    3. Wprowadź ustawienia aparatu, wybierając długość fali > oświetlenie: jasne pole 50% aparat 50%: czarno-biały > automatyczne naświetlanie: każde akwizcje > uzyskanie: każdy punkt > automatyczne ustawianie ostrości: nigdy.
    4. Określ pozycje kamery do uchwycenia obrazów biofilmowych, ustawiając powiększenie na 20×, tworząc pole widzenia o wymiarach 665,6 μm × 665,6 μm, a następnie przesuwaj się do środka obszaru obserwacji kanału, gdzie numer kanału zostanie wygrawerowany w centrum.
    5. Dodaj pozycję sceny, aby była uchwycona przez kamerę, przejdź do Stage – oznacz pozycję i wybierz przycisk dodawania, aby dodać ją do katalogu.
      1. Powtórz to dla punktów upstream 0,9984 mm oraz punktów downstream 3,0016 mm od wlotu obszaru widzenia kanału, gdzie pozycja reprezentuje środkowy punkt pola widzenia kamery.
        UWAGA: Te pozycje obrazowania zostały wybrane tak, aby przedstawić wzrost biofilmu wzdłuż obszaru widzenia, jednocześnie zapewniając pełny rozwój przepływu wewnątrz. Skutkuje to uzyskaniem trzech obrazów dla każdego mikrokanału, w tym przypadku 18 zdjęć wykonywanych co 10 minut.
  7. Przeprowadz eksperyment
    1. W oknie modułu sterowania systemu wybierz AutoRun > Run Setup > Sequence: wybierz utworzoną sekwencję 0.01 Pa, a następnie wybierz start.
    2. Zaraz potem przejdź do okna Wielowymiarowego Pozyskiwania > Nabrzeże. Rozpoczyna się wtedy pozyskiwanie 18 obrazów co 10 minut z 24-godzinnego procesu eksperymentalnego, a po zakończeniu eksperymentu powstaje 2610 obrazów.
      UWAGA: Powyższa sekcja została odtworzona na kolejnych sześciu mikrokanałach o długości około 48 godzin po początkowym eksperymencie w identycznych warunkach.

10. Nagromadzenie stosu Z

  1. Na końcu każdego eksperymentu wybierz trzy kanały i uzyskaj stosy z trzech sekcji wzdłuż nich przy powiększeniu 40×, otwierając Multi Dimensional Acquisition > Main: odznacz wszystkie opcje oprócz 'Serii Z'.
  2. Po wybraniu sekcji na kanale w trybie Wielowymiarowego Akwizycji przejdź do serii Z i zmień > Ustawienia interaktywne: Przyrost: 0,5 i odznacz oba pola.
  3. Użyj pokrętła do ustawiania ostrości mikroskopu i obróć je tylko do momentu, gdy biofilm stanie się nieostry, a następnie wpisz z-dystans, wybierając Ustaw na prąd. Powtórz tę procedurę, ale obracając pokrętło ustawiania ostrości w przeciwnym kierunku i wybierając Ustaw dół na prąd. Daje to mikroskopowi zasięg do uchwycenia stosu z.
  4. Wybierz folder w oknie Zapisu , aby zapisać z-stack i wybierz Zdobywanie w prawym dolnym rogu okna, aby rozpocząć zdobywanie.

11. Analiza obrazów i danych po eksperymencie

  1. Uzyskaj dane o procentowym pokryciu powierzchni biofilmu.
    1. Załaduj pobrane obrazy do oprogramowania systemowego, wybierając: Narzędzia analityczne > Przegląd danych wielowymiarowych > Wybierz plik bazowy > Wybierz katalog: przejdź do i wybierz folder z zapisanymi obrazami > View > Długość fali 1, a w centralnej kwadratowej sekcji poziomo wyświetlającej liczbę pobranych obrazów kliknij prawym przyciskiem myszy na małe, szare pole u góry, Lewy róg.
    2. Załaduj obrazy każdej sekcji kanału, pojedynczo, wybierz pozycję sceny: wybierz pozycję do wyświetlenia > Załaduj obraz(y). Zapisz serię zdjęć jako plik TIFF.
    3. Zmień obraz progowo, wybierając Threshold Image > Auto Threshold for Dark Objects podkreślając biofilm, a następnie obejmij obraz za pomocą narzędzia Rectangular Region .
      UWAGA: Suwak po lewej stronie obrazu progowego można przesuwać w górę i w dół, aby zmienić intensywność progową i lepiej rozróżnić biofilm od tła. Jeśli obraz zawiera cienie, ogranicz fragment bez nich, ponieważ cienie mogły być domyślnie podświetlone, zmieniając wartości pomiarowe.
    4. Uzyskaj dane o procentowym pokryciu powierzchni biofilmu na obrazie przez 24-godzinny eksperyment, wybierając w oknie oprogramowania systemowego MM Standard > Measure > Region Measurements , aby wygenerować tabelę danych o zaświetlonym biofilmie w obrębie prostokątnej ramki, w tym Threshold Area %. Wybierz Otwórz dziennik , aby otworzyć i zapisać plik logu, oraz F9: Dane logu, aby wprowadzić dane do pliku logu.
    5. Otwórz arkusz kalkulacyjny i, korzystając z 24-godzinnych danych biofilmowych dla każdego przekroju kanału, stwórz wykres pokazujący procentowy zasięg powierzchni biofilmu przez 24 godziny.
  2. Uzyskaj grubość biofilmu i średnią chropowatość powierzchni arytmetycznej.
    1. Zapisywałem stos z-na Fiji (ImageJ), przeciągając zapisany plik do paska sterowania Fiji i konwertując na 8-bitowy obraz: Image > Type > 8-bitowy.
    2. Zwiększ kontrast między biofilmem a powierzchnią kanału, aby wyeliminować niepożądane zakłócenia: > obraz > jasność/kontrast.
    3. Zdefiniuj próg obrazu, ustawiając wartość piksela biofilmu na 255 (biały) i tła 0 (): obraz > dostosuj > progu.
    4. Ustaw skalę obrazu, Analizuj > Ustaw skalę > odległości w pikselach: 2048 > Znana odległość: 332,8 > Proporcje obrazu pikseli: 1,0 > Jednostka długości: μm.
      UWAGA: Znana odległość wynosi 332,8 μm, ponieważ używana kamera Hamamatsu ma pole widzenia 2048 × 2048 pikseli, przy czym każdy piksel ma rozmiar 6,5 μm, a zdjęcia wykonywano przy 40 × powiększeniu.
    5. Przeanalizuj stos Z, używając niestandardowego makro18 (Plik Uzupełniający 1), który oblicza i sumuje powierzchnię biofilmu na każdym fragmentze stosu Z oraz wykorzystuje wartości skali wejściowej do obliczenia grubości serii, umożliwiając znalezienie objętości. Alternatywnie, można znaleźć grubość biofilmu, dzieląc obliczoną objętość przez powierzchnię.
    6. Uzyskaj średnie wartości arytmetycznej chropowatości powierzchni biofilmu z każdej serii z, pobierając wtyczkę ImageJ (nie Fiji) SurfCharJ i zapisując ją w folderze plugins .
    7. Prześlij stos z do ImageJ, przeciągając zapisany stos na pasek sterowania i konwertując go na obraz 32-bitowy: Typ > obrazu: 32-bitowy.
    8. Stwórz wykres powierzchniowy, pokazujący zmienność szarości na powierzchni stosu: Analizuj > Profil wykresu > Więcej: Wykres wysokiej rozdzielczości. Przekonwertuj wykres wysokiej rozdzielczości na 32-bitowy.
    9. Uzyskaj arytmetyczną średnią wartość chropowatości powierzchni, inicjując wtyczkę SurfCharJ: Plugins > SurfCharJ > Obliczenie chropowatości: Średnia długość próbkowania (): 10.
      UWAGA: Wtyczka SurfCharJ wykorzystuje różne wartości szarości wzdłuż powierzchni stosu z do obliczenia średniej chropowatości powierzchni arytmetycznej. Zostanie wygenerowana tabela zawierająca parametry chropowatości powierzchni, jedynym parametrem interesującym jest średnia arytmetyczna – chropowatość powierzchni, Ra. Wartości tabelowe będą musiały zostać przeliczone na mikrometry z pikseli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta sekcja przedstawia reprezentatywne wyniki przy stosowaniu powyższej procedury protokołu. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z co najmniej trzema niezależnymi biologicznymi replikacjami, z których każdy składa się z sześciu równoległych kanałów, a dane prezentowano jako średnią ± odchylenia standardowe. Paski błędu we wszystkich wykresach reprezentują odchylenie standardowe, zgodnie z definicją w legendach rysunków.

Wzrost odkształceń PAO1 i PA14 w temperaturze 37 °C, w ośrodku T...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka kluczowych kroków, które łącznie tworzą ten protokół, umożliwia bardziej kompleksową i dokładną analizę powstawania biofilmu niż alternatywne, bardziej tradycyjne metody. Kluczowym elementem jest zastosowanie płytki mikrokanałowej z 48 dołkami, z mikrokanałami o wymiarach 350 μm × 70 μm × 4 mm (W × H × L). Te wymiary specyficznie odwzorowują warunki przepływu i mikrośrodowiska występujące w szpitalach, takie jak cewniki moczowe czy oskrzele płucne pacjentów z mukowiscydozą 12,21,2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Szkole Mechaniki, Inżynierii Lotniczej i Lądowej (MAC) na Uniwersytecie w Sheffield za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(NH4)2SO4Acros Organics7783-20-2Dla zmodyfikowanego medium FAB
Płytka mikrokanałowa 48-dołkowa 0-2 Pa – szklana pokrywaMikrosystemy komórkowe910-0047-5PackMikrokanały do przepływu mediów i wzrostu biofilmu
z obrazowaniem w czasie rzeczywistym
-80 &°; Zamrażarka CThermo Fisher Scientific1.16057E+15Do przechowywania bulionów glicerolu do dalszego użycia
Agar, stopień bakteriologicznyAcros Organics443570010Dla płyt agarowych – hodowla bakterii
Analityczna równowagaVWRVWRI611-2297Do pomiaru składników użytych mediów
AutoklawPriorklaw4304Sterylizacja szkła
BioFlux 1000HTI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- mikrosystemy/urządzenie/bioflux-1000ht-
system ścinania/ 		Do eksperymentów przepływu mikrokanałowego i wzrostu biofilmu
Moduł sterujący BioFluxI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
mikrosystemy/urządzenie/bioflux-1000ht- system ścinania-przepływ/ 		Ustawianie i monitorowanie przepływu ośrodka oraz wzrostu biofilmu w mikrokanałach
Oprogramowanie BioFlux MontageI& L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		Ustawianie i monitorowanie przepływu ośrodka oraz wzrostu biofilmu w mikrokanałach
CaCl2Fisher Scientific10043-52-4Dla zmodyfikowanego medium FAB
CaSO4.2H2OChemCruzA1719Dla 1 L minimalnego roztworu metalicznego
Przezroczysta płytka polistyrenowa z 96 dołkamiCorning, CostarCLS7007Dla liczenia żywotnych komórek
CoSO4.7H2OSigma-Aldrich10026-24-1Dla 1 L minimalnego roztworu metalicznego
CuSO4.5H2OHoneywell209198-100GDla 1 L minimalnego roztworu metalicznego
Lampy Eppendorf 3810XEppendorf30125150Jeśli chodzi o zapasy glicerolu P. aeruginosa
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005EDla 1 L minimalnego roztworu metalicznego
Fidżi (ImageJ)Narodowe Instytuty Zdrowiahttps://imagej.net/software/fiji/downloa
DS		Przetwarzanie obrazu stosem Z
GlukozaSigma-Aldrich50-99-7Dla substrumu glukozowo-modyfikowanego FAB
GlicerolSigma-Aldrich56-81-5Jeśli chodzi o zapasy glicerolu P. aeruginosa
H3BO3Fisher Scientific10043-35-3Dla 1 L minimalnego roztworu metalicznego
Hamamatsu Orca-Flash 4.0 Model C11440-
42U		HamamatsuC11440-42UDla przepływu mikrokanałów i wzrostu biofilmu eksperyment obrazowania w czasie rzeczywistym
KH2PO4BioReagenty Fishera7778-77-04Dla zmodyfikowanego medium FAB
Spirytus metylowanySigma-Aldrich2857Do czyszczenia szafki mikrobiologicznej przed i po
użycie
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100GDla zmodyfikowanego medium FAB
Gabinet mikrobiologiczny klasy IIThermo Fisher Scientific42111226Aby wykonać procedury bez zanieczyszczenia bakteriami, bulionem lub agarem< >
Mini InkubatorLabnet InternationalSN03171014Aby rozmrozić PAO1 i PA14 po -80 stopniach; Zamrażarka C i do początkowego wzrostu bakteryjnej płytki agarowej przez 24 godziny
MnSO4. H2OSigma-Aldrich10034-96-5Dla 1 L minimalnego roztworu metalicznego
Na2HPO4.2H2OSigma-Aldrich10102-40-6Dla zmodyfikowanego medium FAB
NaClSigma-AldrichS5886-500GDla zmodyfikowanego medium FAB
NaMoO4. H2OSigma-Aldrich10102-40-6Dla 1 L minimalnego roztworu metalicznego
Precyzyjna równowagaVWRVWRI611-2299Do pomiaru składników użytych mediów
Chłodzenie w wirówceHeraeusz40289841Oddzielenie kultury P. aeruginosa od
supernatantu dla zapasów glicerolu
Półmikro CuvettesLaboratoria AlphaX72053Do pomiarów gęstości optycznej
Inkubator TrzęsącegoINFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator - shakery/multitron-standardDla kultur nocnych
Cytrynian soduSigma-Aldrich71498-250GDla modyfikowanego podłoża FAB z cytrynianem sodu
Pętle szczepienia plastiku sterylnegoMicrospec15782105Dla P. aeruginosa PAO1 i PA14 szczepienie do płytek agarowych i rurek falcon
Tryptyczny agar sojowy, warzywaMillipore14432-500G-FDla płyt agarowych – hodowla bakterii
Tryptyczny bulion sojowySigma-AldrichT8907Suszone podłoże hodowlane - 6 g/200 mL
Dystrybutor wody typu 1Thermo Fisher ScientificSN42103311Dla wody z podłożami
ZnSO4.7H2OFisher Scientific7446-20-0Dla 1 L minimalnego roztworu metalicznego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grace, A., Sahu, R., Owen, D. R., Dennis, V. A. Pseudomonas aeruginosa reference strains PAO1 and PA14: A genomic, phenotypic, and therapeutic review. Front Microbiol. 13, 1023523(2022).
  2. T8907 Tryptic Soy Broth. , Sigma-Aldrich. Available from: https://www.merckmillipore.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/275/615/t8907dat.pdf (2018).
  3. Donlan, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis. 7 (2), 277-281 (2001).
  4. Pseudomonas Aeruginosa - Biofilm Formation, Infections and Treatments. , IntechOpen. (2021).
  5. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A Review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  6. She, P., et al. Effects of exogenous glucose on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and antibiotic resistance. MicrobiologyOpen. 8 (12), e933(2019).
  7. Klausen, M., et al. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants. Mol Microbiol. 48 (6), 1511-1524 (2003).
  8. Preda, V. G., Săndulescu, O. Communication is the key: biofilms, quorum sensing, formation and prevention. Discoveries (Craiova). 7 (3), e100(2019).
  9. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  10. Seneviratne, C. J., Yip, J. W. Y., Chang, J. W. W., Zhang, C. F., Samaranayake, L. P. Effect of culture media and nutrients on biofilm growth kinetics of laboratory and clinical strains of Enterococcus faecalis. Arch Oral Biol. 58 (10), 1327-1334 (2013).
  11. Rajewska, M., Maciąg, T., Narajczyk, M., Jafra, S. Carbon source and substrate surface affect biofilm formation by the plant-associated bacterium Pseudomonas donghuensis P482. Int J Mol Sci. 25 (15), 8351(2024).
  12. Goswami, S., Dey, C. COVID-19 and SARS-CoV-2: The Science and Clinical Application of Conventional and Complementary Treatments. , CRC Press. Boca Raton. (2022).
  13. Jeschke, M. G. Clinical review: Glucose control in severely burned patients - current best practice. Crit Care. 17 (4), 232(2013).
  14. Badoiu, S. C., et al. Glucose metabolism in burns—What happens. Int J Mol Sci. 22 (10), 5159(2021).
  15. Wacogne, B., et al. Concentration vs. optical density of ESKAPEE bacteria: A method to determine the optimum measurement wavelength. Sensors. 24 (24), 8160(2024).
  16. Meyer, C. T., et al. A high-throughput and low-waste viability assay for microbes. Nat Microbiol. 8 (12), 2304-2314 (2023).
  17. Allen, T. Serial Dilution Problem Help. , The University of Vermont. Available from: https://www.uvm.edu/~btessman/calc/serhelp.html (2012).
  18. Blog Post: Loading and Measurement of Volumes in 3D Confocal Image Stacks with ImageJ. , VISIKOL. Available from: https://visikol.com/blog/2018/11/29/blog-post-loading-and-measurement-of-volumes-in-3d-confocal-image-stacks-with-imagej/ (2024).
  19. Kasetty, S., Katharios-Lanwermeyer, S., O'Toole, G. A., Nadell, C. D. Differential surface competition and biofilm invasion strategies of Pseudomonas aeruginosa PA14 and PAO1. J Bacteriol. 203 (22), e0026521(2021).
  20. Shen, Y. Role of biofilm roughness and hydrodynamic conditions in Legionella pneumophila adhesion to and detachment from simulated drinking water biofilms. Environ Sci Technol. 49 (7), 4274-4282 (2015).
  21. Sankari, A., Sharma, S. Cystic Fibrosis. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  22. Cameron, K., Jarvis, K. Urinary Catheterisation for Adults Clinical Guideline. , Available from: https://www.rightdecisions.scot.nhs.uk/media/2210/urinary-catheterisation-adultsfinal.pdf (2022).
  23. IV access improvement project guidelines: choosing catheter sizes. , Children's Hospital of Philadelphia. Available from: https://www.chop.edu/clinical-pathway/iv-access-improvement-project-guidelines-choosing-catheter-sizes (2017).
  24. Casadevall, A., Fang, F. C. Reproducible science. Infect Immun. 78 (12), 4972-4975 (2010).
  25. Sutlief, A. L., et al. Live cell analysis of shear stress on Pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system. J Vis Exp. (143), e58926(2019).
  26. Shear Flow BioFlux Plates. , Cell Microsystems. Available from: https://cellmicrosystems.com/wp-content/uploads/2024/09/BioFlux-Brochure_v6-Single-page.pdf (2024).
  27. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Med Princ Pract. 28, 28-35 (2019).
  28. Jahid, I. K., Lee, N. -Y., Kim, A., Ha, S. -D. Influence of glucose concentrations on biofilm formation, motility, exoprotease production, and quorum sensing in Aeromonas hydrophila. J Food Prot. 76 (2), 239-247 (2013).
  29. De Plano, L. M., Caratozzolo, M., Conoci, S., Guglielmino, S. P. P., Franco, D. Impact of nutrient starvation on biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa: An analysis of growth, adhesion, and spatial distribution. Antibiotics. 13 (10), 987(2024).
  30. Tan, X., et al. Alkaline phosphatase LapA regulates quorum sensing-mediated virulence and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 under phosphate depletion stress. Microbiol Spectr. 11 (6), e0206023(2023).
  31. Quan, K., et al. Water in bacterial biofilms: pores and channels, storage and transport functions. Crit Rev Microbiol. 48 (3), 283-302 (2022).
  32. Green, A. S. Modelling of peak-flow wall shear stress in major airways of the lung. J Biomech. 37 (5), 661-667 (2004).
  33. Lee, K., Han, J. Analysis of the urine flow characteristics inside catheters for intermittent catheter selection. Sci Rep. 14, 13273(2024).
  34. Wang, C., et al. Carbon starvation induces the expression of PprB-regulated genes in Pseudomonas aeruginosa. Appl Environ Microbiol. 85 (22), e01705-e01719 (2019).
  35. Sarinas, P. S. A., et al. Inspiratory flow rate and dynamic lung function in cystic fibrosis and chronic obstructive lung diseases. Chest. 114 (4), 988-992 (1998).
  36. Franca, M. J., Valero, D., Liu, X. Turbulence and Rivers. Treatise on Geomorphology. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  37. Shroder, J. F. Treatise on Geomorphology. , Elsevier Science & Technology. San Diego. (2022).
  38. Narciso, D. A. C., Pereira, A., Dias, N. O., Melo, L. F., Martins, F. G. Characterization of biofilm structure and properties via processing of 2D optical coherence tomography images in BISCAP. Bioinformatics. 38 (6), 1708-1715 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Laminar FlowBiofilm QuantificationSurface Area CoverageAntimicrobial ResistanceNosocomial Infections
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły