Ten protokół opisuje metodę ustawiania assayu formacji mammosfer w celu badania inhibitora apoptozy 5 (Api5) wywołanej skurczliwości komórek macierzystych raka w nienowotworowych komórkach nabłonkowych piersi. Lizat zebrany z mammosfer pierwszej generacji jest analizowany pod kątem różnych markerów skurczliwości w celu oceny indukcji właściwości przypominających komórki macierzyste.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rak piersi pozostaje najczęstszym rakiem wśród kobiet na całym świecie, z najwyższymi standaryzowanymi wiekowo wskaźnikami zachorowań i umieralności. Mimo postępów w terapiach ukierunkowanych na raka piersi, 20% pacjentów wykazuje nawrót choroby, co można przypisać populacji komórek macierzystych raka odpornych na terapię (CSCs). Te komórki CSC mogą przetrwać konwencjonalne terapie, pozostając w stanie spoczynku lub przetrwały z powodu niekompletnej resekcji masy guza, co prowadzi do nawrotu w późniejszym etapie. Dlatego ostatnie badania skupiają się na identyfikacji, izolowaniu i ukierunkowywaniu tej odpornej populacji komórek. In vitro, test tworzenia mamokul serwuje jako mocny trójwymiarowy system hodowli w zawiesinie do wzbogacania i rozmnażania komórek przypominających macierzyste w populacjach nabłonkowych piersi. Przedstawiamy tu podejście wykorzystujące test mamokul do oceny fenotypu przypominającego komórki macierzyste raka, który jest umożliwiony w nienowotworzących nabłonkowych komórkach piersi przez nadmierną ekspresję inhibitora apoptozy 5 (Api5). Protokół obejmuje rozmnażanie mamokul przez kolejne przelewania w celu oceny wydajności tworzenia mamokul i zdolności do samoodnawania. Dodatkowo, lizaty białkowe pobrane z mamokul są badane pod kątem uznanych markerów macierzystości poprzez immunoblotting. Test ten umożliwia badanie nowych regulatorów, takich jak Api5, właściwości przypominających komórki macierzyste raka w populacjach nabłonkowych komórek piersi. Opisany podejście może być przystosowany do porównawczych badań interwencji molekularnych lub do przesiewowych badań środków terapeutycznych ukierunkowanych na CSC in vitro.
Wprowadzenie
Wzrost raka piersi opornego na chemioterapię doprowadził do zwiększenia nacisk na identyfikowanie i kierowanie się na przyczynę lekooporności i nawrotu terapii, populację komórek nowotworowych znaną jako komórki macierzyste raka. Komórki te charakteryzują się zdolnością do uniknięcia różnicowania i pozostania w stanie spoczynku, co umożliwia im opór na różne metody leczenia raka1,2. Kilka metod może być zastosowanych do identyfikacji komórek macierzystych raka piersi, w tym test tworzenia mammosfer3,4,5, sortowanie komórek na podstawie markerów na powierzchni komórki6,7, izolację opartą na właściwościach wydzielania, testy tumorygeniczności in vivo7 oraz ocenę modulatorów jądrowych komórek macierzystych, takich jak Oct48, Nanog9, Sox210 i Bmi11. Zazwyczaj identyfikacja i izolowanie komórek macierzystych raka wymaga kombinacji jednej lub więcej z tych metod.
Inhibitor apoptozy 5 (Api5) to białko przeciw śmierci, które zostało znalezione w podwyższonym stężeniu w wielu rakach, w tym w raku piersi12,13,14, raku szyjki macicy15,16,17, przewlekłej białaczce limfocytów B18 oraz raku płuca o niewielkich komórkach19. Wysokie poziomy Api5 zostały związane z opornością na chemioterapię w raku szyjki macicy16 i potrójnie ujemnym raku piersi12. Istnieją coraz więcej dowodów na to, że oporność na leczenie i nawroty są często napędzane przez komórki macierzyste raka20,21. Interesujące badanie przeprowadzone przez Song i wsp.22 ujawniło, że nadmierna ekspresja Api5 w komórkach raka szyjki macicy prowadzi do podwyższonego poziomu Nanog, co przyczynia się do zwiększonej macierzystości raka. Poprzednie badania z naszego laboratorium wykazały, że nadmierna ekspresja Api5 prowadzi do transformacji nie-tumorogenicznych komórek nabłonkowych piersi hodowanych w 3D kulturach wspieranych przez Matrigel. Te przetransformowane komórki wykazują zakłóconą polaryzację, zwiększoną proliferację, wzrost niezależny od podłoża i częściowy przejściowy fenotyp epitelialno-mezenchymalny (EMT). Zmiany fenotypowe obserwowane po nadmiernej ekspresji Api5 w 3D kulturach były zachowane po rozdzieleniu sferoidów na kultury jednowarstwowe14. Biorąc pod uwagę, że Api5 jest podwyższone w chemiorezystentnych potrójnie ujemnych rakie piersi, spekulujemy, że Api5 może również regulować właściwości komórek macierzystych raka w komórkach nabłonkowych piersi.
W tym kontekście opisujemy test tworzenia mammosfer do identyfikacji komórek macierzystych raka z 3D dysocjowanych, nie-tumorogenicznych komórek nabłonkowych piersi przetransformowanych przez nadmierną ekspresję Api5, po czym wykonujemy przeciwciała do wykrywania markerów komórek macierzystych, aby potwierdzić tożsamość tych komórek. Test mammosfer polega na hodowlanom komórek nabłonkowych piersi w warunkach nie-adhezyjnych, nie-różnicujących, co umożliwia wzbogacenie komórek podobnych do macierzystych/przodków w trójwymiarowych strukturach zwanych mammosferami. Komórki nabłonkowe piersi, które nie posiadają właściwości podobnych do macierzystych, zwykle ulegają anoikisie; jednak komórki o charakterystycznych cechach macierzystych dają początek mammosferom4,5. Ta metoda została pierwotnie opracowana przez Dontu i wsp.3 i jest inspirowana testem neurosfer, który jest stosowany do badania i identyfikacji komórek macierzystych i przodków neuronów23. Opisany tutaj test mammosfer umożliwia ocenę aktywności komórek macierzystych i zdolności do samoodnawania w minimalnym pożywce uzupełnionej B27 bez witaminy A i rekombinantnym ludzkim czynnikiem wzrostu naskórka (EGF). Komórki 3D dysocjowane, nadmiernie ekspresujące Api5, są wysiewane rzadko na pokrytych płytkach poli(2-hydroksyetylometakrylan) (pHEMA). Umożliwia to komórkom wzrost w warunkach nie-adhezyjnych, tak że każda następna mammosfera jest pochodzenia klonalnego. Mammosferom pozwala się rosnąć do dnia siódmego, po czym oblicza się efektywność tworzenia mammosfer. Aby odróżnić prawdziwe komórki macierzyste od komórek nie-macierzystych, które tracą zdolność proliferacji z czasem, wykonuje się kolejne generacje tworzenia mammosfer. Seriowe przemieszczanie mammosfer polega na rozdzieleniu sferoidów zebranych z pierwszej generacji i ponownym przesiewaniu pojedynczych komórek w celu utworzenia mammosfer drugorzędowych (i kolejnych) generacji. Określa to, czy komórki mogą inicjować tworzenie sfery wielokrotnie i jest mierzone jako zdolność do samoodnawania komórek
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pokrycie płytek do hodowli tkankowych poli(2-hydroksyetylometakrylan), pHEMA
- Rozpuść 1,2 g pHEMA (masa cząsteczkowa ̴ 300 000) w 100 mL 95% etanolu, ciągle mieszając w temperaturze 65 °C, aby przygotować 1,2% roztwór pHEMA (patrz Tabela materiałów).
- Pokrój standardowe płytki do hodowli tkankowej pHEMA, nakładając 1 mL na każde pole płytki 6-polowej. Objętość roztworu pHEMA można dostosować w zależności od wielkości naczynia do hodowli tkankowej.
- Pozwól płytkom wyschnąć w piekarniku w temperaturze 40 °C w sterylnych warunkach.
- Wystaw płytki na działanie światła UV przez 15 min, a następnie przeprowadź trzy płukania buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS), zanim zastosujesz je do ustawienia testu formowania mammosfer.
2. Wysiew mammosfer pierwszego pokolenia
- Hoduj 3D dysocjowane komórki MCF10A (Kontrola i przewlekła ekspresja Api5), uzyskane poprzez dysocjację 3D kultur dnia 16 w środowisku hodowli14.
UWAGA: Skład środowiska hodowli: DMEM z wysoką zawartością glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony o 5% surowicy końskiej, 10 µg/mL insuliny, 0,5 µg/mL hydrokortyzonu, 20 ng/mL rekombinantnego ludzkiego czynnika wzrostu naskórka (EGF), 100 ng/mL toksyny cholery i 200 jednostek/mL penicyliny z streptomycyną (patrz Tabela materiałów). - Wysuń zużyte środowisko, przepłucz komórki 1 mL DPBS, a następnie dodaj 500 µL 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 przez 12-15 min, aż wszystkie komórki zostaną trypsynizacji.
- Po oderwaniu wszystkich komórek dodaj 2 mL środowiska resuspendującego, aby zneutralizować aktywność trypsyny, a następnie przekręć zawiesinę komórek z prędkością 112 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Skład środowiska resuspendującego: DMEM z wysoką zawartością glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony o 20% surowicy końskiej i 200 jednostek/mL penicyliny z streptomycyną. - Wysuń nadstan i resuspenduj pellet komórek w 1 mL środowiska mammosfer. Przepuść zawiesinę komórek przez igłę 25 G, aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę.
UWAGA: Skład środowiska mammosfer: DMEM/F12 uzupełnione o 20 ng/mL czynnika wzrostu naskórka (EGF), 1 × suplement B27 bez witaminy A i 200 jednostek/mL penicyliny z streptomycyną (patrz Tabela materiałów). - Za pomocą licznika Heinca zlicz liczbę komórek i oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do wysiewu 0,2 × 104 komórek na pole.
UWAGA: Utrzymuj niską gęstość wysiewu, aby dokładnie określić wydajność formowania mammosfer, minimalizując w ten sposób wpływ agregacji komórek. Podczas pobierania lizatów białkowych do immunoblottingu gęstość komórek można zwiększyć nawet do 2,5 × 105 komórek na pole. - Rozcieńcz wymaganą objętość zawiesiny komórek w 2 mL środowiska mammosfer i zasiej w każde pole płytki 6-polowej. Zasiej komórki potrójnie dla każdego warunku.
- Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 przez 7 dni.
- Po siedmiu dniach w hodowli ręcznie zlicz liczbę mammosfer o średnicy większej niż 50 µm w każdym polu za pomocą mikroskopu wyposażonego w kratkę lub za pomocą siatki kwadrantowej pod mikroskopem świetlnym.
- Zdjąć mammosfery za pomocą aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 20x.
- Oblicz wydajność formowania mammosfer (MFE) za pomocą następującego wzoru5
3. Wysiew mammosfer drugiego pokolenia
- Zbierz mammosfery utworzone w pierwszym pokoleniu w 15 mL probówce i wyśrodkuj w temperaturze pokojowej z prędkością 300 × g przez 10 min.
- Wysuń nadstan, pozostawiając pellet mammosfer.
- Przepłucz pellet DPBS.
- Dodaj 200 µL 0,05% trypsyny-EDTA do pelletu mammosfer i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 przez 2-3 min. Przepuść mammosfery w roztworze trypsyny przez igłę 25 G trzykrotnie, aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę.
- Dodaj 0,5 mL
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ocenić wydajność tworzenia mammosfer w warunkach nieadherencyjnych, kontrolne i Api5-nadekspresujące komórki MCF10A w 3D były sadzone na platelkach pokrytych poliHEMA zgodnie z protokołem. Komórki z nadekspresją Api5 wykazywały 1,58-krotny wzrost średniej wydajności tworzenia mammosfer niż komórki kontrolne (Rysunek 1B,C). Ten wzrost pokazuje, że wyższa ekspresja Api5 zwiększa udział progenitorów przypominających komórki macierzyste, które przeżywają i proliferują w waru...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż kultury monowarstwowe uznanych linii komórek nowotworowych lub komórek pochodzenia guzowego dostarczają informacji na temat różnych szlaków molekularnych regulujących fenotypy nowotworowe, badania skupione na komórkach macierzystych raka nie mogą być prowadzone w dwuwymiarowych kulturach. Ponieważ uważa się, że komórki macierzyste raka są głównym czynnikiem przyczyniającym się do nawrotu po obecnych strategie terapii, konieczne jest ustanowienie solidnych testów do badania tych komórek1
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnego potencjalnego konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało wsparte przez granty od CSIR-ASPIRE (37WS(0078)/2023-24/EMR-II/ASPIRE) oraz SERB-POWER (SPG/2021/002661-G), a także częściowo przez fundusze rdzeniowe IISER, Pune. S.B. był finansowany dzięki stypendium UGC-SRF. Chcielibyśmy podziękować prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) za hojne udostępnienie komórek MCF10A oraz dr Abhijith K (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd) za jego cenne uwagi dotyczące rękopisu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C humidified incubator | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| Anti-Bmi1 Rabbit pAb | ABclonal | A13472 | 1:1000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature |
| Anti-Nanog Rabbit mAb | ABclonal | A22625 | 1:5000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Oct3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Sox2 Antibody (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Invitrogen | 12587010 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL stock in dH2O |
| DMEM/F12 | Thermo | 11330032 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL stock in dH2O |
| Ethanol absolute 99.9% | Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany | 58051 L05 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | SRL | 43272 | |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965126 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050122 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Qualigens | Q29145 | Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0) |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL stock in ethanol |
| ImageJ | Image processing software | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate | Merck | WBKLS0500 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid |
| Nikon Eclipse TS-100 microscope | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A cells | Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) | ||
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830-5G | |
| Plotting software | GraphPad Prism 10 | ||
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA) | Santacruz | sc-253284 | 1.2% pHEMA in 95% ethanol |
| Sodium chloride (NaCl) | SRL | 41721 | |
| Sodium deoxycholate | Amresco | 0613-100G | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | SRL | 54468 | |
| Sodium fluoride (NaF) | HiMedia | RM1081-500G | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris buffer | SRL | 71033 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML |
Bibliografia
- Li, X., et al. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).
- Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Kim, R. J., Nam, J. S. OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer. Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).
- Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis. Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Paranjape, A. N., et al. Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog. BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).
- Bousquet, G., et al. High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target. Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).
- Basset, C., et al. Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome. Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).
- Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis. BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).
- Cho, H., et al. Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer. BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).
- Jang, H. S., et al. API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells. Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).
- Song, K. H., et al. Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression. BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).
- Krejci, P., et al. The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia. J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).
- Koci, L., et al. Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo. Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).
- Phi, L. T. H., et al. Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment. Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).
- Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).
- Song, K. H., et al. API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis. Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Eyre, R., et al. Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
