Ten protokół opisuje metodę ustawiania assayu formacji mammosfer w celu badania inhibitora apoptozy 5 (Api5) wywołanej skurczliwości komórek macierzystych raka w nienowotworowych komórkach nabłonkowych piersi. Lizat zebrany z mammosfer pierwszej generacji jest analizowany pod kątem różnych markerów skurczliwości w celu oceny indukcji właściwości przypominających komórki macierzyste.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rak piersi pozostaje najczęstszym rakiem wśród kobiet na całym świecie, z najwyższymi standaryzowanymi wiekowo wskaźnikami zachorowań i umieralności. Mimo postępów w terapiach ukierunkowanych na raka piersi, 20% pacjentów wykazuje nawrót choroby, co można przypisać populacji komórek macierzystych raka odpornych na terapię (CSCs). Te komórki CSC mogą przetrwać konwencjonalne terapie, pozostając w stanie spoczynku lub przetrwały z powodu niekompletnej resekcji masy guza, co prowadzi do nawrotu w późniejszym etapie. Dlatego ostatnie badania skupiają się na identyfikacji, izolowaniu i ukierunkowywaniu tej odpornej populacji komórek. In vitro, test tworzenia mamokul serwuje jako mocny trójwymiarowy system hodowli w zawiesinie do wzbogacania i rozmnażania komórek przypominających macierzyste w populacjach nabłonkowych piersi. Przedstawiamy tu podejście wykorzystujące test mamokul do oceny fenotypu przypominającego komórki macierzyste raka, który jest umożliwiony w nienowotworzących nabłonkowych komórkach piersi przez nadmierną ekspresję inhibitora apoptozy 5 (Api5). Protokół obejmuje rozmnażanie mamokul przez kolejne przelewania w celu oceny wydajności tworzenia mamokul i zdolności do samoodnawania. Dodatkowo, lizaty białkowe pobrane z mamokul są badane pod kątem uznanych markerów macierzystości poprzez immunoblotting. Test ten umożliwia badanie nowych regulatorów, takich jak Api5, właściwości przypominających komórki macierzyste raka w populacjach nabłonkowych komórek piersi. Opisany podejście może być przystosowany do porównawczych badań interwencji molekularnych lub do przesiewowych badań środków terapeutycznych ukierunkowanych na CSC in vitro.
Wprowadzenie
Wzrost raka piersi opornego na chemioterapię doprowadził do zwiększenia nacisk na identyfikowanie i kierowanie się na przyczynę lekooporności i nawrotu terapii, populację komórek nowotworowych znaną jako komórki macierzyste raka. Komórki te charakteryzują się zdolnością do uniknięcia różnicowania i pozostania w stanie spoczynku, co umożliwia im opór na różne metody leczenia raka1,2. Kilka metod może być zastosowanych do identyfikacji komórek macierzystych raka piersi, w tym test tworzenia mammosfer3,4,5, sortowanie ko....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pokrycie płytek do hodowli tkankowych poli(2-hydroksyetylometakrylan), pHEMA
- Rozpuść 1,2 g pHEMA (masa cząsteczkowa ̴ 300 000) w 100 mL 95% etanolu, ciągle mieszając w temperaturze 65 °C, aby przygotować 1,2% roztwór pHEMA (patrz Tabela materiałów).
- Pokrój standardowe płytki do hodowli tkankowej pHEMA, nakładając 1 mL na każde pole płytki 6-polowej. Objętość roztworu pHEMA można dostosować w zależności od wielkości naczynia do hodowli tkankowej.
- Pozwól płytkom wyschnąć w piekarniku w temperaturze 40 °C w sterylnych warunkach.
- Wystaw płytki na działanie światła UV przez 15 min, a następnie p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ocenić wydajność tworzenia mammosfer w warunkach nieadherencyjnych, kontrolne i Api5-nadekspresujące komórki MCF10A w 3D były sadzone na platelkach pokrytych poliHEMA zgodnie z protokołem. Komórki z nadekspresją Api5 wykazywały 1,58-krotny wzrost średniej wydajności tworzenia mammosfer niż komórki kontrolne (Rysunek 1B,C). Ten wzrost pokazuje, że wyższa ekspresja Api5 zwiększa udział progenitorów przypominających komórki macierzyste, które przeżywają i proliferują w waru.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż kultury monowarstwowe uznanych linii komórek nowotworowych lub komórek pochodzenia guzowego dostarczają informacji na temat różnych szlaków molekularnych regulujących fenotypy nowotworowe, badania skupione na komórkach macierzystych raka nie mogą być prowadzone w dwuwymiarowych kulturach. Ponieważ uważa się, że komórki macierzyste raka są głównym czynnikiem przyczyniającym się do nawrotu po obecnych strategie terapii, konieczne jest ustanowienie solidnych testów do badania tych komórek1
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnego potencjalnego konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało wsparte przez granty od CSIR-ASPIRE (37WS(0078)/2023-24/EMR-II/ASPIRE) oraz SERB-POWER (SPG/2021/002661-G), a także częściowo przez fundusze rdzeniowe IISER, Pune. S.B. był finansowany dzięki stypendium UGC-SRF. Chcielibyśmy podziękować prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) za hojne udostępnienie komórek MCF10A oraz dr Abhijith K (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd) za jego cenne uwagi dotyczące rękopisu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C humidified incubator | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| Anti-Bmi1 Rabbit pAb | ABclonal | A13472 | 1:1000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature |
| Anti-Nanog Rabbit mAb | ABclonal | A22625 | 1:5000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Oct3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Sox2 Antibody (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Invitrogen | 12587010 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL stock in dH2O |
| DMEM/F12 | Thermo | 11330032 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL stock in dH2O |
| Ethanol absolute 99.9% | Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany | 58051 L05 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | SRL | 43272 | |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965126 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050122 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Qualigens | Q29145 | Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0) |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL stock in ethanol |
| ImageJ | Image processing software | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate | Merck | WBKLS0500 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid |
| Nikon Eclipse TS-100 microscope | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A cells | Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) | ||
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830-5G | |
| Plotting software | GraphPad Prism 10 | ||
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA) | Santacruz | sc-253284 | 1.2% pHEMA in 95% ethanol |
| Sodium chloride (NaCl) | SRL | 41721 | |
| Sodium deoxycholate | Amresco | 0613-100G | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | SRL | 54468 | |
| Sodium fluoride (NaF) | HiMedia | RM1081-500G | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris buffer | SRL | 71033 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML |
Bibliografia
- Li, X., et al. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).
- Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional th....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
