Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Intranosowe podawanie polyplexów mRNA za pomocą aerozoli Rayleigh Breakup: metoda in vitro do osadzania nosa i testów funkcjonalnych

744 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70000

⸱

20 stycznia 2026

 ,  , 
1GKT School of Medical Education, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 2Genetics, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia rozbicie Rayleigha jako łagodny proces aerozolizowania niewirusowych wektorów mRNA. Regionalna depozycja dla aerozolowanych wektorów mRNA jest oceniana za pomocą modelu Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI). Ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w ludzkich komórkach płuc reprezentuje utrzymanie funkcji fizykochemicznych i biologicznych wektorów mRNA po aerozoli.

Streszczenie

Podawanie terapii mRNA donośnie to obiecująca strategia szczepień i leczenia chorób układu oddechowego, oferująca bezpośrednią aktywację immunologiczną w miejscu wejścia patogenu. Jednak konwencjonalne metody aerozoalizacji (np. ultradźwiękowe lub nebulizatory wysokociśnieniowe) uszkadzają niewirusowe wektory mRNA pod wpływem nadmiernych sił ścinania, powodując utratę integralności strukturalnej i aktywności biologicznej mRNA. Do delikatnego aerozolizowania wektorów mRNA polietyleiminy (PEI) użyto atomizera Rayleigha do rozszczepienia nosa w jednolite krople. MRNA kodujące Green Fluorescent Protein (GFP) zostało sformułowane w kationowych polipleksach i scharakteryzowane przed i po aerozolizacji. Proces rozbicia Rayleigha tworzy ciągły mikrostrumień kropelek z minimalnym ścinaniem, zachowując tym samym właściwości fizykochemiczne nanocząstek. Zaobserwowano stały rozmiar cząstek, niski indeks polidyspersji oraz stabilny potencjał zeta przed i po aerozolizacji, co potwierdza, że właściwości fizykochemiczne polyplexów mRNA zostały dobrze zachowane dzięki rozbiciu Rayleigha w celu aerozolizacji. Korzystając z modelu Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) dróg oddechowych, dostarczono aerozole PEI-mRNA. Aerozoalne mRNA były głównie zdeponowane w regionach turbinowych. W przekrojach nosowogardła lub równoważnych płucach stwierdzono pomijalne ułamki. Ponadto polipleksy mRNA po aerozolou zostały pomyślnie dostarczone do komórek nabłonka płuc A549 i wywołały wykrywalną ekspresję GFP. Protokół ten demonstruje nieniszczącą metodę dostarczania mRNA wewnątrznosową z wykorzystaniem aerozolizacji rozbicia Rayleigha. Skutecznie utrzymuje właściwości fizykochemiczne i funkcje biologiczne niewirusowych wektorów mRNA, atomizując fazę wodną na krople odpowiednich rozmiarów do ukierunkowanej depozycji nosowej. Protokół ten ujawnia nowatorskie podejście do skutecznego aerozolizowania mRNA oraz oceny ich regionalnego osadzania się w jamie nosowej.

Wprowadzenie

Podanie szczepionek do błony śluzowej nosa (portalu wejścia do wielu patogenów układu oddechowego) może wywołać silną lokalną odporność i zablokować infekcje u źródła. Sukces szczepionek przeciw grypie wewnątrznosowej oraz niedawna akceptacja donośnych szczepionek przeciw COVID-19 podkreślają skuteczność drogi nosowej w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej zarówno błony śluzowej, jak i ogólnoustrojowej1. Dlatego podawanie mRNA donośnie wzbudza duże zainteresowanie jako strategia zapobiegania infekcjom dróg oddechowych. Dużym wyzwaniem technicznym jest jednak przekształcenie delikatnych mRNA poliplexów w aerozol inhalowalny bez naruszenia ich stabilności.

Aerozolizacja rozbicia Rayleigh oferuje łagodną alternatywę, działając na innej zasadzie fizycznej. W urządzeniu rozbijającym Rayleigh sprężony strumień cieczy jest przepychany przez mikroskalowy otwór, tworząc ciągły mikro-strumień strumienia. Strumień naturalnie rozpada się na krople o równomiernej wielkości z powodu niestabilności Plateau-Rayleigh2. Napięcie powierzchniowe powoduje, że kolumna cieczy rozpada się na charakterystycznej długości fali około dwukrotnie większej niż średnica dyszy. W przeciwieństwie do nebulizacji ultradźwiękowej, proces ten praktycznie nie wprowadza turbulentnego ścinania; Krople powstają naturalnie z powodu samoniestabilności dysza, a nie zewnętrznych sił rozbijających się. W rezultacie formuły nanocząsteczek doświadczają minimalnego stresu. Wykazano, że zastosowanie rozkładu Rayleigha może aerozolizować mRNA nanocząsteczek lipidowych (LNP) bez istotnej zmiany ich rozmiaru, ładunku powierzchniowego czy efektywności enkapsulacji przed rozpyleniem 3,4,5. W tej metodzie PEI-mRNA pozostaje nienaruszone i funkcjonalne po aerozolizacji, w przeciwieństwie do pogorszenia widocznego przy ostrzejszych technikach nebulizacji.

Kolejną zaletą rozbicia Rayleigh jest kontrola nad rozmiarem kropelki. Generowane krople są stosunkowo duże (rzędu 20-30 μm). Ten rozmiar kropli jest idealny do dostarczania nosa: cząstki o średnicy aerodynamicznej >10 μm mają tendencję do osadzania się w nosie i górnych drogach oddechowych, zamiast dryfować do płuc3. Wytwarzając krople głównie powyżej tego progu, atomizer Rayleigha naturalnie kieruje się do osadzania się w jamie nosowej. Celowanie jest dodatkowo ulepszane dzięki zastosowaniu modelu Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) do optymalizacji technik podawania. AINI to drukowana w 3D replika nosowych dróg oddechowych, która dokładnie przewiduje wzorce natrysku in vivo 6. Korzystając z tego modelu, stwierdzono, że rozpylanie pod kątem 45° w głąb nozdrza znacznie zwiększa osadzanie się w małżowinach7. Aspekt administracji znacząco wpływa na wzorzec depozycji7. Osadzanie się w miejscach niedocelowych, takich jak nosogardło czy płuca, jest niepożądane, ponieważ może powodować podrażnienie gardła, nieprzyjemny smak lub skutki uboczne układowe8. W tym protokole powtórzono te warunki (kąt rozpylania 45° i kontrolowany przepływ powietrza wdechowego), aby zmaksymalizować osadzanie się aerozoli mRNA3 przez małżowiny. Wcześniejsze dane pokazują, że ponad połowa dostarczonej masy mRNA może być skoncentrowana w okolicy małżowin w optymalnych warunkach, podczas gdy <10% dociera do nosowogardła lub dalejniż 3. Takie ukierunkowane podawanie ma poprawić skuteczność szczepionki poprzez koncentrację dawki w miejscach indukcyjnych odporności (które są dobrze unaczynione i bogate w komórki odpornościowe) oraz jednoczesne minimalizowanie osadzania poza celem, które mogłoby prowadzić do odpadów lub skutków niepożądanych.

W tym artykule metodycznym szczegółowo opisano eksperymentalną procedurę aerozolizacji mRNA poprzez rozpad Rayleigha, oceniając regionalne depozycji w modelu AINI oraz oceniając aktywność biologiczną zdeponowanego mRNA in vitro. Do wizualizacji wyników transfekcji w komórkach ludzkich używa się mRNA raportującego kodującego GFP. HEK293T komórki są wybierane do testowania funkcjonalności kompleksów aerozolicznych. Aby zwiększyć komórkowy wchłam aerosolizowanego mRNA in vitro, mRNA jest rozgałęziane z PEI, tworząc polipleksy PEI-mRNA przed ich dodaniem do komórek. PEI to kationowy środek transfekcyjny polimerowy, który może poprawić efektywność dostarczania mRNA, a stosunek molowy N:P (azot:fosforan) wynoszący 24:1 został tutaj wykorzystany na podstawie wcześniejszych optymalizacji dostarczania genów. PEI jest stosowane wyłącznie do etapu walidacji hodowli komórkowej w tym badaniu i nie jest częścią dostarczania aerozoli do faktycznego nosa (in vivo polega się wyłącznie na LNP-mRNA, ale w hodowli komórkowej pomaga to maksymalizować ekspresję genów do wykrycia).

Protokół ten podkreśla nowe podejście do podawania mRNA w środku nosowym, które rozwiązuje kwestię stabilności aerozolizującej mRNA. Rozpad Rayleigha został niedawno zastosowany do dostarczania kwasów nukleinowych w kilku badaniach 3,4,5,9, a niniejsza praca dostarcza szczegółowego przewodnika metodologicznego do zastosowania tej techniki. Stosując tę krok po kroku procedurę, naukowcy mogą odtworzyć delikatną aerozolizację nanonośników mRNA oraz ocenić ich właściwości depozycji i transfekcji. Poniższa sekcja Protokołu jest podzielona na sekwencyjne części: (1) formułowanie PEI-mRNA; (2) Charakterystyka nanocząstek (rozmiar i potencjał zeta) przed i po aerozolizacji; (3) Działanie atomizera Rayleigha i procedura nanoszenia nosa AINI. Kluczowe kwestie sukcesu, takie jak utrzymanie warunków wolnych od RNaz oraz prawidłowe ustawienie urządzeń. Wyniki i dyskusja zawierają reprezentatywne wyniki, zalety metody w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami, potencjalne zastosowania (np. szczepionki nosowe przeciwko grypie lub COVID-19 10,11,12), a także ograniczenia i wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów. Ta kompleksowa metodologia ma na celu umożliwienie powtarzalnych eksperymentów z dostarczaniem mRNA do nosa oraz przyspieszenie rozwoju szczepionek śluzowych RNA bez igieł.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Hodowla HEK293T i linie komórkowe A549 w pełnym medium składającym się z Zmodyfikowanego Medium Orła (DMEM) Dulbecco, uzupełnionego 10% surowicy bydła płodu (FBS) oraz 2% penicylin-streptomycyny przed transfekcją PEI-mRNA. Obie linie komórkowe przechodzą mniej więcej co 48 godzin po osiągnięciu połączenia komórek. Komórki nasienne mają gęstość 40 000 komórek na cm² i hodują przez ~48 godzin. Usuń podłoże i przemyj komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) tuż przed transfekcją, aby usunąć surowicę i ustandaryzować warunki transfekcji. Przed użyciem zautoklawuj wszystkie kolby do hodowli komórkowych, płytki 24-dołkowe, PBS, pipety i końcówki pipetek.

1. Formułowanie PEI-mRNA

  1. Tworzenie kompleksów PEI-mRNA (transfekcja in vitro )
    UWAGA: Ten krok jest wymagany tylko wtedy, gdy PEI jest stosowane do zwiększenia transfekcji w hodowli komórkowej.
    1. Oblicz wymaganą ilość PEI dla pożądanego stosunku molowego N:P.
      UWAGA: Stosuje się N:P = 24 (czyli 24 mole dodatnio naładowanych amin na mol ujemnie naładowanych fosforanów na mRNA); a ilość mRNA 10 μg wymagałaby ~31 μg PEI do utworzenia mRNA PEI przy tym stosunku N/P.
    2. Przygotuj rozcieńczony roztwór PEI (np. 1 mg/mL w wodzie) i poddaj go w autoklawie.
    3. Rozcieńcz mRNA do odpowiedniego stężenia (np. 0,2 μg/μL).
    4. Dodaj roztwór PEI do roztworu mRNA, delikatnie mieszając (nie wiruj).
      UWAGA: Mieszanka może być w małej tubie; Delikatnie pipetuj w górę i w dół lub pstryknij rurką do mieszania.
    5. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez ~20 minut, aby umożliwić elektrostatyczne wiązanie PEI z mRNA.
      UWAGA: Jeśli nie używa się PEI, nagie mRNA może być bezpośrednio aerozolizowane. Dodatkowy PEI znacznie poprawił ekspresję genów w komórkach A549, ale jest opcjonalny i może nie być stosowany do faktycznego dostarczania in vivo ze względu na toksyczność.

2. Charakteryzacja nanocząstek (rozmiar i potencjał zeta)

UWAGA: Ustaw parametry pomiaru w oprogramowaniu i zapisz jako metodę przed użyciem analizatora do pomiaru rozmiaru lub potencjału zeta. Do uruchomienia instrumentu wymagana jest konfiguracja metody , a parametry są zależne od środowiska pomiarowego, użytej kuwety oraz właściwości próbki.

  1. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) przed aerozoryzacją
    1. Za pomocą analizatora wielkości cząstek załaduj rozcieńczoną próbkę tej formuły do jednorazowej kuwety wielkości (np. 500 μL przy 0,2 μg/μL).
    2. Włącz analizator i otwórz oprogramowanie13 na podłączonym komputerze.
    3. Kliknij przycisk Mierz u góry okna.
    4. Kliknij na niebieską ikonę pliku u góry okna, aby wybrać metodę wstępnego rozmiaru.
    5. Zmień nazwę protokołu, aby pasowała do nazwy próbki.
    6. Naciśnij przycisk pokrywy analizatora, aby otworzyć komorę.
    7. Włóż kuwetę do komory.
    8. Kliknij zielony przycisk Run u góry okna oprogramowania. Poczekaj, aż pomiar zakończysię 13.
    9. Kliknij przycisk Analizuj u góry okna oprogramowania, a następnie kliknij przycisk Rozmiar na stronie wyników13.
    10. Uzyskaj średnią średnicę hydrodynamiczną (średnią Z) oraz wskaźnik polidyspersji (PDI) z tabeli statystycznej.
    11. Naciśnij przycisk pokrywy analizatora, aby otworzyć komorę, zdjąć kuwetę i zamknąć pokrywkę.
    12. Pozbądź się kuwety i przepłucz ją wodą wolną od RNAazy oraz 70% etanolem v/v, aby zdezynfekować i ułatwić suszenie między pomiarami Size.
      UWAGA: W przypadku atomizera Rayleigh upewnij się, że w dyszie nie pozostają żadne osady soli ani resztki, ponieważ mogą one wpłynąć na działanie natrysku.
  2. Potencjał zeta przed aerozolizacją
    1. Użyj tego samego instrumentu (lub analizatora potencjału Zeta), załaduj rozcieńczoną próbkę formuły do złożonej komórki kapilarnej (np. 700 μL przy 0,2 μg/μL).
    2. Włącz analizator i otwórz oprogramowanie13 na podłączonym komputerze.
    3. Kliknij przycisk Mierz u góry okna.
    4. Kliknij na niebieską ikonę pliku u góry okna, aby wybrać gotową metodę zeta.
    5. Zmień nazwę protokołu, aby pasowała do nazwy próbki.
    6. Naciśnij przycisk pokrywy analizatora, aby otworzyć komorę.
    7. Włóż kuwetę do komory.
    8. Kliknij zielony przycisk Run u góry okna oprogramowania. Poczekaj, aż maszyna będzie działała13.
    9. Kliknij przycisk Analizuj u góry okna oprogramowania, a następnie kliknij przycisk Zeta na stroniewyników 13.
    10. Uzyskaj potencjał zeta (ładunek powierzchniowy), patrząc na Tabelę Statystyk.
    11. Naciśnij przycisk pokrywy analizatora, aby otworzyć komorę, wyjąć próbkę i zamknąć pokrywkę.
    12. Przepłucz kuwetę i atomizer wodą wolną od RNAazy oraz 70% etanolem v/v, aby dezzynfekować i ułatwić suszenie między pomiarami potencjału Zeta.
      UWAGA: W przypadku atomizera Rayleigh upewnij się, że w dyszie nie pozostają żadne osady soli ani resztki, ponieważ mogą one wpłynąć na działanie natrysku.

3. Aerozol rozbicia Rayleigha i osadzanie się w nosie

  1. Zestaw atomizera i AINI
    1. Złóż urządzenie Rayleigh Breakup Nasal Atomizer oraz model Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI).
      UWAGA: Model AINI składa się z anatomicznie reprezentatywnych pustych przekrojów odpowiadających różnym obszarom jamy nosowej człowieka (np. przedsionek nozdrza, okolica małżow, obszar węchowy, nosowogardło).
    2. Upewnij się, że wszystkie komponenty AINI są czyste i suche przed użyciem (osady mogą wpłynąć na wyniki osadzania). Czyść przez mycie wodą dejonizowaną9 , a następnie etanolem lub rozpuszczalnikiem organicznym.
    3. Podłącz AINI do Next Generation Impactor (NGI), który jest podłączony do pompy próżniowej na wylocie, aby zasysać powietrze przez kanały nosowe.
    4. Ustaw przepływ na 7,5 L/min – przepływ oznaczający powolny, głęboki wdech nosowy u dorosłego6. Użyj kalibrowanego przepływomierza (lub rotametru) podłączonego do portu indukcyjnego NGI. Reguluj pompę, aż przepływomierz pokaże 7,5 L/min.
      UWAGA: Użyj przepływomierza, aby zmierzyć przepływ powietrza przy wymaganym przepływie do testów.
    5. Utrzymuj ten przepływ powietrza przez cały czas natrysku. Użyj Parafilm, aby prawidłowo uszczelnić urządzenie do AINI.
  2. Ustawienie atomizera
    1. Włóż dyszę atomizera rozbijającego Rayleigha do wejścia nozdrza AINI (część przedsionka) pod kątem 45°.
    2. Zabezpiecz atomizer tak, aby nie przesuwał się podczas pracy (wszystkie połączenia, sekcje modelowe, rurki do pompy) są szczelne.
  3. Ładowanie próbki
    1. Delikatnie wymieszaj przygotowaną zawieszinę PEI-mRNA, aby zapewnić jednorodność (unikając powstawania bąbelków).
    2. Pobierz próbkę do zbiornika atomizera.
      UWAGA: W zależności od konstrukcji urządzenia, może to wymagać napełnienia końcówki strzykawki lub pipety, która jest mocowana do atomizera.
    3. Załaduj próbkę do urządzenia.
      UWAGA: Na przykład usuń centralną koreczkę lub komorę w atomizatorze, podaj próbkę pipetą, a następnie bezpiecznie złoż urządzenie. Upewnij się, że nie ma przecieków i że urządzenie jest odpowiednio zagruntowane, jeśli jest to konieczne.
  4. Generowanie aerozolu
    1. Włącz przepływ powietrza (7,5 L/min przez AINI) pompy przed lub jednocześnie z rozpoczęciem natrysku, zgodnie z instrukcjami urządzenia.
    2. Aktywuj atomizer Rayleigh do rozbijania, aby rozpocząć aerozolizację.
      UWAGA: W przypadku ręcznego atomizera napędzanego strzykawką, stopniowo naciskaj tłok strzykawki, aby przepchnąć płyn przez otwór. Jeśli to możliwe, spryskaj całą objętość próbki jednym ciągłym ruchem. Tłok powinien być płynnie wciskany, aby uzyskać stabilne ciśnienie robocze, ponieważ formuła jest aerozolizowana dopiero po podwyższeniu ciśnienia i wystawieniu na szybkości ścinania ściany wewnątrz mikrootworu14. Szybkie ruchy tłoka zmieniają ciśnienie, a tym samym zarówno szybkość ścinania, jak i czas ekspozycji na ścinanie14.
    3. Upewnij się, że przepływ utrzymuje się na poziomie 7,5 L/min przez cały czas. Krople aerozoli powinny przemieszczać się przez model przejścia nosowego i być osadzane w różnych regionach zgodnie z ich rozmiarami aerodynamicznymi.
    4. Natychmiast wyłącz pompę powietrza, aby zapobiec dalszemu zasysaniu lub nierównomiernemu wysychaniu już osadzonych kropelek.
  5. Kolekcja próbek z AINI
    1. Ostrożnie rozłóż model AINI na jego indywidualne segmenty anatomiczne, aby zebrać zdeponowane nanocząstki z każdego regionu.
      UWAGA: Przed rozłożeniem zanotuj lub zaznacz orientację, aby śledzić przekroje.
    2. Zbieraj osady z sześciu przedziałów: (i) urządzenia atomizera, (ii) sekcji przedsionka nosowej, (iii) sekcji małżowinowej, (iv) obszaru węchowego, (v) sekcji nosogardłowej oraz (vi) dowolnego wychwytu poniżej (np. etapów dołączonego NGI lub końcowego filtra reprezentującego frakcję penetrującą płuca)
    3. Dla każdej komory użyj zmierzonej objętości pożywki komórkowej, aby wypłukać zdeponowany materiał.
      UWAGA: Na przykład, aby zebrać osad małżowinowy, odłącz sekcję małżowiny i dokładnie przepłucz jej wewnętrzne powierzchnie 5 mL Zmodyfikowanego Medium Orła (DMEM) firmy Dulbecco, używając jednorazowej pipety. Delikatnie umyj wszystkie powierzchnie, a następnie wlej płukanie do oznaczonej rurki do wirówki o pojemności 15 mL (użyj lejka ułatwiającego transfer). Podczas płukania segment był trzymany poziomo lub lekko przechylony, aby zapewnić pełny kontakt z powierzchnią wewnętrzną i zapobiec wycieczce płynu. Powtórz podobnie dla przedsionka, węchu, nosowogardła i innych sekcji, używając 5 ml świeżego DMEM dla każdej i zbierając je do osobnych, oznakowanych probówek.
    4. Odzyskaj wszelkie pozostałości próbki z urządzenia atomizera.
      UWAGA: W przypadku strzykawki spłukaj strzykawkę i dyszę do probówki.
    5. Pobieranie cieczy ze stopni NGI (kaskadowego impaktora), jeśli AINI było podłączone do NGI, aby zatrzymać drobne cząstki (np. płukając stopnie DMEM).
    6. Zatkaj tubkę zebraną cieczą.
      UWAGA: Unikaj utraty kropelek na powierzchniach stołu lub przez parowanie.
  6. Obsługa po zbiorze
    1. Bezpośrednio po pobraniu próbki PEI-mRNA były osobno umieszczane na komórkach w celu transfekcji.
      UWAGA: Próbki PEI-mRNA można zostawić w lodówce na ~1-2 godziny (maksymalnie 6 godzin) przed użyciem do transfekcji. Z każdej pobranej próbki PEI-mRNA pobierana jest określona objętość (maksymalnie 1 mL) do charakteryzacji wektorów po aerozoli (tj. pomiarów DLS i zeta).
  7. Czyszczenie aparatu
    1. Po każdym uruchomieniu dokładnie czyść atomizer i model AINI, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu w kolejnych eksperymentach.
    2. Przepłucz wszystkie sekcje AINI oraz części atomizera wodą dejonizowaną, aby usunąć medium i nanocząsteczki, a następnie 70% etanolem, aby zdezynfekować i ułatwić suszenie.
      UWAGA: Jeśli urządzenie lub model ma małe otwory, przepłucz je strzykawką.
    3. Przed ponownym złożeniem wysusz wszystkie części na powietrze (lub umieść w suszarce na niskim temperaturze). W przypadku atomizera Rayleigh upewnij się, że w dyszi nie pozostaną żadne osady soli ani resztki, ponieważ mogą one wpływać na wydajność natrysku.

4. Obrazowanie komórkowe

UWAGA: Po transfekcji usuń ośrodek transfekcyjny i zamień go na świeże, kompletne medium, aby zakończyć ekspozycję. Hodowanie komórek przez 48 godzin, aby umożliwić ekspresję reportera i odzyskanie komórek. Przy ~80% konfluencji utrwalaj komórki 4% formaldehydem przez 8 minut, następnie barw jądra 4',6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI; 300 nM) przez 5 minut, a następnie dwukrotne mycie PBS przed obrazowaniem.

  1. Obrazowanie fluorescencyjne
    1. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego z zestawami filtrów do DAPI i GFP.
    2. Zacznij od kanału niebieskiego (długość fali wzbudzenia = 385 nm, długość fali emisyjnej = 477,5 nm), aby zwizualizować jądra barwione DAPI.
    3. Przełącz na kanał Green (długość fali wzbudzenia = 488 nm, długość fali emisji = 525 nm), aby zwizualizować ogniwa GFP-dodatnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako manuskrypt skoncentrowany na metodach, szczegółowe wyniki nie są głównym celem; Jednak przedstawione są reprezentatywne wyniki, aby zilustrować oczekiwane wyniki każdej części protokołu. Poniżej przedstawione rysunki pokazują przykładowe dane (np. wykresy lub obrazy) potwierdzające trafność metody, ale nie uwzględniono nowych analiz ilościowych poza demonstracją.

Wielkość kropel i wzór osadzania:
Atomizer rozbijający Rayleigha zachował właściwości fizykochemiczne pol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole, przed aerozolizacją formuły, mRNA jest rozgałęziane z PEI, aby zwiększyć wchłam komórkowy. Służy ona jako zastępstwo dla dostarczania LNP-mRNA podczas walidacji in vitro 10,15. PEI-mRNA zachowuje większość funkcji formuł LNP, w tym ważne cechy biologiczne i funkcjonalne10. Dodatnio naładowane grupy aminowe w PEI wiążą się ujemnie naładowanym mRNA poprzez interakcje elektrostatyczne, tworząc zespoły nanoskalowe mni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy wyrazili wsparcie finansowe z King's Undergraduate Research Fellowship (KURF) oraz Student Opportunity Fund przyznanego przez King's College London.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurki wirówkowe 50 mLSigma-Aldrich Company LimitedCLS430829-500EA
50 & ndash; 1000 i mu; Końcówki pipety LSigma-Aldrich Company LimitedZ740031-1000EA
Linia komórkowa A549Kolekcja Amerykańskiej Kultury TypowejATCC CRM-CCL-185
Miernik przepływu powietrzaNie maNie maMożna używać uniwersalnego miernika przepływu powietrza.
Model idealizowanego wlotu nosowego (AINI) z AlbertyTSI Incorporated (za pośrednictwem Copley Scientific, Wielka Brytania)0001-01-8540
Taśma wskaźnikowa autoklawuSigma-Aldrich Company LimitedZ744090
DAPISigma-Aldrich Company LimitedD1306
DMEM (Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco)Gibco, Thermo Fisher Scientific11966025
Alkohol etylowy, czystySigma-Aldrich Company Limited32221-MZakupiony przez Merck
Serum bydła płodu (FBS)Gibco, Thermo Fisher ScientificA5256701
FormaldehydSigma-Aldrich Company LimitedF8775
HEK293T Linia komórkowaKolekcja Amerykańskiej Kultury TypowejATCC CRL-3216
Szafka na bezpieczeństwo biologiczne Heraeus HERAsafe HS 12HeraeuszNie ma
Następna generacja ImpactoraMSP's, oddział TSI0170-01-1000Produkt ten jest również wymieniony w katalogu Copley, numer części 5201.
Monochromatyczny aparat mikroskopowy Nikon DS-Qi2NikonNie ma
Wielonaczynia poddawane hodowli komórkowej NuncThermo Fisher Scientific142475
Kolby objęte hodowlą komórek Nunc EasYFlaskThermo Fisher Scientific156340
ParafilmSigma-Aldrich Company LimitedP7793-1EA
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco, Thermo Fisher Scientific15140148
Tabletki soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014
Chlorek polietyliminySigma-Aldrich Company Limited764965-1GZakupione przez SLS
Rayleigh Jet Atomizer NosowyResyca BV EnschedeMiękki adapter do sprayu do nosa
Woda wolna od RNAeThermo Fisher ScientificJ60610. EQC
Rozmiary CuvetteMalvern PanalyticalZEN0040
Komórka kapilarna fałdowanaMalvern PanalyticalDTS1070
Zetasizer ProMalvern PanalyticalZetasizer Pro
Oprogramowanie Zetasizer Ultra-Pro ZS XplorerMalvern PanalyticalNie ma

Bibliografia

  1. Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
  2. Van Hoeve, W., et al. Breakup of diminutive Rayleigh jets. Phys Fluids. 22 (12), (2010).
  3. Li, H. Y., et al. Targeted nasal delivery of LNP-mRNAs aerosolised by Rayleigh breakup technology. Int J Pharm. 672, 125335(2025).
  4. He, P., et al. Rayleigh-based soft mist inhalers preserve mRNA-LNP integrity for pulmonary delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 115, 107651(2026).
  5. Biesel, A., et al. Soft mist inhaler nebulization by Rayleigh-breakup largely preserves functional integrity of liposomal mRNA in respirable aerosols. Eur J Pharm Sci. 214, 107300(2025).
  6. Chen, J. Z., Finlay, W. H., Martin, A. In vitro regional deposition of nasal sprays in an idealized nasal inlet: comparison with in vivo gamma scintigraphy. Pharm Res. 39 (11), 3021-3028 (2022).
  7. Chen, J. Z., Kiaee, M., Martin, A. R., Finlay, W. H. In vitro assessment of an idealized nose for nasal spray testing: comparison with regional deposition in realistic nasal replicas. Int J Pharm. 582, 119341(2020).
  8. Hopke, P. K., Wang, Z. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. , Springer. US, Boston, MA. (2012).
  9. Wang, H., et al. Evaluation of Rayleigh jet atomizer for intranasal delivery of lipid nanoparticle-siRNA formulations: stability, deposition, and device performance. Int J Pharm. 683, 126084(2025).
  10. Moreno Herrero, J., et al. Compact polyethylenimine-complexed mRNA vaccines. Nat Nanotechnol. 20 (9), 1323-1331 (2025).
  11. Geall, A. J., et al. Non-viral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14604-14609 (2012).
  12. Xi, J., Lei, L. R., Zouzas, W., Si, X. A. Nasally inhaled therapeutics and vaccination for COVID-19: developments and challenges. MedComm. 2 (4), 569-586 (2021).
  13. Zetasizer Advance Series User Guide. , MAN0592-15-EN edn, Malvern Panalytical. (2023).
  14. Method of aerosolizing nanoparticle formulations. China patent. , CN116723892A (2023).
  15. Casper, J., et al. Polyethylenimine (PEI) in gene therapy: current status and clinical applications. J Control Release. 362, 667-691 (2023).
  16. Jin, Y., et al. A novel experimental approach to measure nebulized droplet deposition pattern and deposition fraction in an idealized mouth-to-throat model. Phys Fluids. 35 (8), (2023).
  17. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  18. Liu, J., et al. Turbinate-homing IgA-secreting cells originate in the nasal lymphoid tissues. Nature. 632 (8025), 637-646 (2024).
  19. Debus, H., Baumhof, P., Probst, J., Kissel, T. Delivery of messenger RNA using poly(ethylene imine)-poly(ethylene glycol)-copolymer blends for polyplex formation: biophysical characterization and in vitro transfection properties. J Control Release. 148 (3), 334-343 (2010).
  20. Brandtzaeg, P. Potential of nasopharynx-associated lymphoid tissue for vaccine responses in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 183 (12), 1595-1604 (2011).
  21. Foley, R. A., et al. Lipid nanoparticles for the delivery of CRISPR/Cas9 machinery to enable site-specific integration of CFTR and mutation-agnostic disease rescue. bioRxiv. , (2025).
  22. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  23. D'Angelo, I., et al. Hybrid lipid/polymer nanoparticles for pulmonary delivery of siRNA: development and fate upon in vitro deposition on the human epithelial airway barrier. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 31 (3), 170-181 (2018).
  24. Movia, D., Bazou, D., Volkov, Y., Prina-Mello, A. Multilayered cultures of NSCLC cells grown at the air-liquid interface allow the efficacy testing of inhaled anti-cancer drugs. Sci Rep. 8 (1), 12920(2018).
  25. Waltl, E., Eckl-Dorna, J., Selb, R., Valenta, R., Niederberger, V. Characterisation and culture of primary human nasal epithelial cells and the influence of interferon-gamma. Clin Transl Allergy. 4 (2), P21(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Donosowe dostarczanie mRNAmRNA z polietyleniminąkomórki A549model Alberta Nasal Inletekspresja GFPniewirusowe wektory mRNAtransfekcja mRNA w formie aerozolu
Intranosowe podawanie polyplexów mRNA za pomocą aerozoli Rayleigh Breakup: metoda in vitro do osadzania nosa i testów funkcjonalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.