Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający ustanowienie powtarzalnych modeli zwierzęcych uszkodzeń skóry wywołanych promieniowaniem z wykorzystaniem strontu-90 (90Sr) β-promieniowania. Protokół ten umożliwia badanie efektów dawki i reakcji zapalnych w powierzchownych uszkodzeniach promieniowania, stanowiąc podstawę dla przyszłych badań mechanistycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie i zastosowanie modeli zwierzęcych uszkodzeń skóry wywołanych promieniowaniem opartych na promieniach strontu-90 β
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Uszkodzenie skóry wywołane promieniowaniem to poważne powikłanie często spotykane w sytuacjach awaryjnych wypadków jądrowych lub zawodach związanych z promieniowaniem, wymagające opracowania ustandaryzowanych, skoncentrowanych na specyficzności modeli urazów do badań mechanistycznych. Konwencjonalne promieniowanie rentgenowskie gamma lub wysokoenergetyczne, o silnej zdolności penetracyjnej, powoduje uszkodzenia skóry, ale nieuchronnie wywołuje złożone reakcje tkanek głębokich, utrudniając badania nad powierzchownymi efektami skóry. Biorąc pod uwagę ryzyko wyraźnego uszkodzenia tkanek powierzchniowych spowodowanych promieniowaniem β w scenariuszach takich jak opad jądrowy, opracowaliśmy oparty na β-promieniowym modelu zwierzęcego na podstawie źródeł strontu-90 (90Sr) uszkodzeń skóry wywołanych promieniowaniem, aby sprostać temu wyzwaniu. Model ten wykorzystuje właściwości fizyczne promieni β, które deponują energię głównie w tkankach powierzchniowych, umożliwiając precyzyjną symulację lokalnych efektów biologicznych spowodowanych kontaktem materiału promieniowania ze skórą, jednocześnie unikając potencjalnych systemowych reakcji wywołanych promieniowaniem głębokim przenikaniem. Niniejsze badanie systematycznie opisuje cały proces pracy, w tym parametryzację źródeł promieniowania 90Sr, protokoły napromieniowania zwierząt oraz metody pobierania i oceny preparatów patologicznych. Model ten stanowi wiarygodne narzędzie zwierzęce do wyjaśniania mechanizmów patofizjologicznych urazów skóry wywołanych promieniowaniem oraz stymulowania rozwoju badań mechanistycznych lub strategii terapeutycznych.
Wprowadzenie
Promieniowanie jonizujące jest szeroko stosowane w wielu dziedzinach, w tym w energetyce, medycynie, przemyśle i rolnictwie. Choć przynosi znaczące korzyści, stanowi także bezpośrednie i potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzi, szczególnie dla pracowników zawodowych i pacjentów onkologicznych 1,2. Ponieważ skóra jest największym organem ciała i stanowi jego zewnętrzną powłokę, nieuchronnie staje się głównym celem po ekspozycji na promieniowanie jonizujące. Zbudowana z naskórka, skóry i tkanki podskórnej, pełni niezbędne funkcje fizjologiczne. Jednak mechanizmy leżące u podstaw urazów skóry wywołanych promieniowaniem oraz skuteczne strategie ich zapobiegania i leczenia pozostają niewystarczająco wyjaśnione. Dlatego istnieje krytyczna potrzeba standaryzowanego i powtarzalnego modelu eksperymentalnego, który konkretnie celuje w uszkodzenia skóry wywołane promieniowaniem w warstwie powierzchniowej i nadaje się do badań mechanistycznych i interwencyjnych. W związku z tym, aby rozwijać badania w tej dziedzinie, z powodzeniem opracowaliśmy nowy model zwierzęcy uszkodzeń skóry spowodowanych promieniowaniem.
W konwencjonalnych badaniach promieniowanie wysokoenergetyczne, takie jak promieniowanie rentgenowskie czy γ, jest powszechnie stosowane do indukowania modeli urazów skóry 3,4. Tego typu promieniowanie posiada wysoką zdolność penetracji, co pozwala im łatwo oddziaływać na tkanki podskórne i głębsze oraz narządy. W konsekwencji, choć powodują uszkodzenia skóry, wywołują one także rozległe reakcje w głębszych tkankach, co ogranicza specyficzność modelu do badań skoncentrowanych na skórze i znacząco komplikuje interpretację wyników5. Brak specyficzności tkankowej stanowi poważne ograniczenie, gdy głównym celem badań jest badanie urazów promieniowania ograniczanych przez skórę, a nie ogólnoustrojowych efektów promieniowania.
W przeciwieństwie do tego opracowaliśmy bardziej specyficzny i dopracowany model urazu skóry, wykorzystujący cechy β-promieniowania strontu-90 (90Sr), czyli niską energię i ograniczoną penetrację tkanek. Badania wykazały, że uszkodzenia spowodowane przez promienie β są głównie ograniczone do warstw naskórnych i skórnych skóry6, co skutecznie minimalizuje zakłócenia spowodowane odpowiedzią tkanek głębokich. W porównaniu z modelami promieniowania o wysokiej penetracji, takie podejście pozwala na precyzyjną lokalizację urazu, zmniejszenie zaangażowania narządów trzewnych oraz lepszą interpretowalność specyficznych dla skóry zmian patologicznych i zapalnych. Ponadto wykorzystanie promieni β do stworzenia modelu radiodermatitis jest również uzasadnione przez krytyczne rozważania potencjalnych zagrożeń w rzeczywistości. Wnioski z katastrofy jądrowej w Czarnobylu pokazują, że wysokie dawki zewnętrzne ekspozycji na cząstki β mogą prowadzić do poważnych oparzeń β, a nawet śmiertelnych obrażeń7. Ponadto istnieją potencjalne długoterminowe zagrożenia zdrowotne związane z promieniowaniem β pochodzące z zanieczyszczeń promieniowania 8,9.
Aby zbadać te mechanizmy, kluczowe jest również wybranie odpowiedniego zwierzęcia do poddawania β-promieniowemu napromieniowaniu. Chociaż miniświnki zostały z powodzeniem wykorzystane do opracowania modeli urazów skóry wywołanych promieniami β10,11, ich ogólne zastosowanie w badaniach jest bardziej ograniczone niż u myszy. Ponadto kluczową cechą skóry myszy jest wysoka gęstość mieszków włosowych, co czyni ją odpowiednim modelem do badania wpływu promieniowania na kończyny skóry w badaniach urazów skóry spowodowanych promieniowaniem. Dlatego użycie modelu myszy ma istotne zalety. Ponadto modele myszy oferują praktyczne zalety, takie jak niższe koszty, wyższa przepustowość, manipulacja genetyczna oraz szersza kompatybilność z analizami molekularnymi i immunologicznymi, co czyni je szczególnie odpowiednimi do badań mechanistycznych i przesiewowych interwencji.
Cytokiny zapalne to biologicznie aktywne małe cząsteczki lub białka wydzielane zarówno przez komórki układu odpornościowego, jak i nieodporne, szeroko klasyfikowane jako prozapalne lub przeciwzapalne. W uszkodzeniach skóry wywołanych promieniowaniem jonizującym te cytokiny są kluczowymi czynnikami. W rzeczywistości takie uszkodzenia są zasadniczo niekontrolowaną chorobą zapalną, głównie wywołaną siecią cytokin i chemokin12. IL-6 jest kluczowym mediatorem prozapalnym i jednym z kluczowych cytokin zaangażowanych w ostre reakcje zapalne na promieniowanie i infekcje 13,14,15. Najnowsze badania wykazały, że promieniowanie aktywuje szlak sygnalizacyjny IL-6/STAT3 oraz starzenie komórkowe, co sprzyja infiltracji komórek odpornościowych i przyczynia się do powstawania zapalenia skóry spowodowanego promieniowaniem, zapalenia skóry oraz wypadania włosów16. Co ciekawe, wykazuje także działanie radioprotekcyjne w określonych kontekstach17,18. Dla porównania, IL-10 jest ważnym regulatorem przeciwzapalnym. Jej funkcje obejmują ograniczanie nadmiernych reakcji zapalnych, wzmacnianie odporności wrodzonej, wspieranie mechanizmów naprawy tkanek oraz utrzymanie homeostazy tkanek podczas infekcji i stanu zapalnego19,20. IL-10 często działa razem z IL-6, wykazując korzystne efekty w wspieraniu gojenia ran skórnych, zmniejszaniu powstawania blizn oraz łagodzeniu niektórych schorzeń dermatologicznych 21,22,23. Chociaż istniejące badania wykazały, że IL-6 i IL-10 reagują na promieniowanie i promieniowanie ultrafioletowe, odpowiednio16, 24, 25, ich reakcje na promieniowanie β pozostają niejasne.
Podsumowując, celem tego badania jest ustanowienie stabilnego i powtarzalnego modelu myszy dotyczącego uszkodzeń skóry wywołanych promieniowaniem wywołanym promieniowaniem 90Sr β-radiacyjnego. Model ten jest szczególnie odpowiedni w badaniach dotyczących urazów skórnych promieniowania, scenariuszy ekspozycji na promieniowanie β, regulacji stanu zapalnego, uszkodzenia kończyn skóry oraz długoterminowej remodelacji tkanek. Nie jest jednak przeznaczona do replikowania radioterapii głębokiej tkanki ani guzów litych, która zazwyczaj wymaga silnie przenikającego promieniowania, takiego jak promieniowanie rentgenowskie czy γ. Przedstawiamy procedury tworzenia modelu oraz systematycznego weryfikowania jego wykonalności poprzez wielopoziomowe oceny, w tym wynik urazów promieniowania, badanie histologiczne oraz ekspresję molekularną kluczowych cytokin (IL-6 i IL-10). Dynamiczna analiza tych parametrów pomoże wyjaśnić regulacyjne role IL-6 i IL-10 w procesie urazów, zapewniając tym samym solidne podstawy eksperymentalne i teoretyczne odniesienie do opracowywania strategii ukierunkowanej interwencji w przyszłości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Zachodniochińskiej Szkoły Podstawowych Nauk Medycznych i Medycyny Sądowej (Chengdu, Chiny).
1. Przygotowanie zwierząt
- Osiedla i grupowanie zwierząt
- Przydziel dwanaście samic o klasie SPF C57BL/6J (zakres wagowy: 18–25 g, wiek: 3 miesiące) do czterech standardowych wentylowanych klatek i losowo podziel je na cztery grupy (n=3) do narażenia na różne dawki zewnętrznego napromieniowania (grupa kontrolna nienapromieniowana oraz 3 eksperymentalne grupy napromieniowania).
- Utrzymuj wszystkie zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności z doraźnym dostępem do standardowego jedzenia dla gryzoni i wody.
- Użyj ponumerowanych etykiet usznych, aby jednoznacznie zidentyfikować każdą mysz i rozróżnić grupy eksperymentalne.
- Pozwól zwierzętom eksperymentalnym zaaklimatyzować się do nowego środowiska przez 3 dni przed kolejnymi procedurami.
- Umieść jednego szczura Sprague Dawley (SD) (wiek: 2 miesiące; waga: około 160 g) w identycznych warunkach.
- Znieczulenie
- Znieczulony myszy poprzez podanie wewnątrzotrzewnkowego roztworu 1,25% tribrometanolu. Aby zapewnić bezpieczną anestezję, oblicz objętość zastrzyku na podstawie masy ciała, podając 15–20 mL/kg masy ciała, zgodnie z ustalonymi standardami odniesienia.
- Przygotowanie miejsca napromieniowania
- Po znieczuleniu usuń sierść z miejsca napromieniowania grzbietowego za pomocą maszynek do strzyżenia.
- Używając czerwonego markera i przygotowanego sztywnego szablonu o średnicy około 3 cm, zaznacz okrągły obszar napromieniowania na ogolonej skórze grzbietowej.
UWAGA: Kremy depilacyjne nie są stosowane, ponieważ mogą powodować podrażnienia skóry i potencjalnie zmieniać architekturę histologiczną, co zakłóca wyniki eksperymentalne.
2. Obliczanie dawki dla napromieniowania
UWAGA: 90Sr emituje wysokoenergetyczne promienie β podczas swojego rozpadu do 90Y (rysunek 1A). β-promienie mają słabą penetrację, zwykle dotykając tylko naskórka. Precyzyjne określenie czasu napromieniowania myszy wymaga obliczenia szybkości wchłonianej dawki (D, cGy/s).
- Oblicz stałą rozpadu (λ) z fizycznego okresu półtrwania (T1/2) według wzoru:
T1/2 ≈ 0,693/λ
Biorąc pod uwagę, że okres półtrwania 90Sr wynosi około 28,6 lat, λ ≈ 0,02423 roku-1. - Oblicz liczbę radionuklidów (N) według następującego wzoru:
A = λ N
Gdzie:
O: Radioaktywność (mCi)
N: Liczba radionuklidów po czasie t (lata)
Przy początkowej radioaktywności A0 = 30 mCi (1 Ci = 3,7x1010 Bq) i λ ≈ 0,02423,
N0 = A0/λ = 1238,13454
Następnie zastosuj ogólne prawo zaniku promieniowania, tzn. liczba radionuklidów zmniejsza się wykładniczo w czasie:
dN/dt = -λ N
Całkowanie daje:
N = N0 е-λt
Gdzie:
N0: Początkowa liczba radionuklidów przy t = 0
N: Liczba radionuklidów pozostałych po czasie t - Na koniec oblicz szybkość absorpcji dawki, D, w cGy/s, używając następującego wzoru:
Wzór konwersji dla wchłoniętej dawki aplikatora 90 Sr-90Y:
D = [(A×1770/S) ×(E90Y/E32P) ×Fm] /3600 = (A/S) ×0,6347
Gdzie
D: Szybkość wchłoniętej dawki (cGy/s)
O: Millicurie (mCi)
S: Powierzchnia (cm2)
1770: Stała jonizacji dla 32P
E90Y: Średnia energia = 0,93 MeV
E32P: Średnia energia = 0,693 MeV
Fm: współczynnik konwersji ekspozycji do dawki (0,962)
3600: Współczynnik konwersji z godziny na sekundę
UWAGA: Obliczenia 90parametrów Sr są podsumowane w Tabeli 1. Przykładowe obliczenie przedstawiono poniżej:
3 marca 2023:
Zewnętrzna średnica aplikatora = 3 cm, średnica wewnętrzna = 2,47 cm, promień = 1,235 cm, radioaktywność A = 30 mCi
S = π ×1,2352
D=(A/S) ×0,6347 ≈ 3,9738 cGy/s
3 listopada 2023 roku (t = 0,583 lat później):
N(t) = N0 е-λt = 1238,13454×e-0,02423×0,583 ≈ 1220,7675
A(t) = λN(t) = 0,02423×1220,7675 ≈ 29,579 mCi
D = (A/S) ×0,6347 ≈ 3,918 cGy/s
Po t = 2,25 roku:
N = N0 õ-λt ≈ 1238.13454×e-0.02423×2.25 ≈ 1172.4391
A = λN ≈ 0,02423×1172,4391 ≈ 28,408 mCi
D = (A/S) ×0,6347 ≈ 3,7629 cGy/s - Oblicz czas napromieniowania każdej grupy dawki na podstawie uzyskanych danych (patrz Tabela 2).
3. Napromieniowanie
UWAGA: Chociaż promienie β emitowane przez 90Sr mają ograniczoną penetrację i zazwyczaj dotykają jedynie warstwę naskórka (Rysunek 1D), nadal stanowią potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzi. Upewnij się, że wszystkie procedury dotyczące źródeł 90Sr są przestrzegane przez odpowiednie środki ochronne, aby zminimalizować narażenie operatorów i środowiska na promieniowanie. Operatorzy muszą ukończyć specjalistyczne szkolenie z obsługi źródeł promieniowania. Procedury dotyczące obsługi i wykorzystania źródeł promieniowania ściśle przestrzegały międzynarodowych standardów określonych w Rekomendacjach Międzynarodowej Komisji ds. Ochrony Radiologicznej z 2007 roku (ICRP Publication 103).
- Przygotowanie przed użyciem: Złóż wniosek o wykorzystanie źródła 90Sr. Po zatwierdzeniu przez kierownika pobierz klucz laboratoryjny oraz kod rozbrajający system alarmowy.
- Przygotuj wszystkie niezbędne materiały, w tym myszy z ogolonymi i oznaczonymi obszarami grzbietowymi, strzykawki o pojemności 1 mL, roztwór tribrometanolu, folię spożywczą, timery, taśmę oraz pianki.
- Wstępne przygotowanie myszy
- Znieczulanie myszy poprzez podtrzymnowkowe podanie roztworu tribrometanolu (patrz krok 1.2).
- Po pełnym uspokojeniu umieść grzbiet myszy na sztywnej desce, przykryj jej grzbietową powierzchnię folią spożywczą i zabezpiecz taśmą.
- Procedura napromieniowania
- Wchodzisz do pomieszczenia ze źródłem promieniowania, rozbrajasz system alarmowy, zakładam ochronny sprzęt (ochronny kombinezon, czapkę, gogle i osobisty dozymetr), a następnie wyciągnij źródło 90Sr z ołowianej osłony.
- Przymocuj metalowy pręt do górnego pokrętła źródła, aby podnieść i przesunąć aplikator.
- Aby zasymulować uraz skóry wywołany promieniowaniem β istotny w wyniku wypadków jądrowych lub narażenia zawodowego, umieść powierzchnię emitującą (Rysunek 1B) aplikatora 90Sr nad zaznaczoną ogoloną grzbietową częścią znieczulonej myszy (Rysunek 1C). Rozpocznij timer natychmiast po założeniu. Dokładnie po upływie ustalonego czasu trwania należy wycofać aplikator i tymczasowo przechować go w oryginalnym pojemniku.
UWAGA: Nigdy nie zwracaj się do dołu aplikatora w stronę personelu. - Po użyciu zwróć źródło 90Sr do ołowianej osadnicy.
UWAGA: W grupie 10 Gy×5 napromieniuj raz dziennie przez 5 kolejnych dni, aby uzyskać łączną dawkę 50 Gy.
- Kroki po napromieniowaniu
- Wypełnij rejestr inspekcji źródeł promieniowania oraz dziennik zużycia źródeł promieniowania, ponownie aktywuj system alarmowy, zamknij drzwi, oddaj klucz i zgłoś status źródła.
- Zbieranie wszystkich odpadów radioaktywnych powstałych podczas procedury i utylizacja zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
4. Wyniki urazów radiacyjnych
- Oceń postęp uszkodzenia skóry u myszy, badając miejsce napromieniowania co 2–3 dni w początkowej fazie. Po zaobserwowaniu nieprawidłowego wyglądu skóry zwiększ częstotliwość oceny do codziennej. Gdy postęp zmian się ustabilizuje, przywróć odstęp ocen do co 2–3 dni.
UWAGA: Przez cały proces grupa kontrolna nienapromieniowana przeszła identyczne procedury co grupy napromieniowane, w tym późniejsze ocenianie i pobieranie tkanek. Punkty czasowe pobierania próbek dla grup kontrolnych są planowane tak, aby pokrywały się z fazą progresji uszkodzeń skóry w grupach napromieniowanych. - Okresowo fotografuj napromieniowane obszary skóry i oceniaj stan zapalenia skóry wywołanego promieniowaniem na grzbiecie myszy.
- Oceniaj reakcje skórne w obrębie napromieniowanego pola za pomocą zweryfikowanej skali (patrz Tabela 3).
UWAGA: Podczas oceny obrażeń trzech badaczy niech samodzielnie przeprowadzi oceny w oślepie, bez znajomości dawki napromieniowania. Ocena opiera się na dominujących cechach rany zgodnie z ustalonymi kryteriami. Przypisz ostateczny wynik na podstawie konsensusu, mając na uwadze, że niektóre rany mogą nie idealnie odpowiadać każdemu opisowi w systemie punktacji, ale nadal odzwierciedlać istotną patologię.
5. Pobieranie próbek i barwienie
- Pobieranie tkanki skóry: W dniach 13, 19, 27 i 32 po napromieniowaniu pobierać seryjne biopsje skóry pełnej grubości od myszy w każdej grupie leczenia, w obrębie wcześniej oznaczonego okrągłego pola napromieniowania.
- Znieczulony myszy poprzez podanie roztworu trybrometanolu (15–20 mL/kg) wewnątrzotrzewnejowego, zgodnie z krokiem 1.2.
- Dezynfekuj obszar operacyjny alkoholem w 75%. Następnie użyj sterylnych cienkich kleszczy, aby ustabilizować docelową skórę.
- Wyciąć pełną grubość skóry o wielkości około 0,5 cm² pionowo, używając nożyczek chirurgicznych wzdłuż strefy przejściowej między uszkodzonymi tkankami, zapewniając uwzględnienie centralnego obszaru uszkodzonego. Trzymaj nożyczki prostopadle do powierzchni skóry i przedłuż cięcie aż do warstwy powięzi podskórnej.
- Natychmiast umieść pobraną tkankę w 4% paraformaldehydu do utrwalenia.
- Delikatnie naciskaj ranę na krwawienie. Dla każdej sesji pobierania próbek stosuj strategię, przesuwając się z jednego z czterech kierunków w kierunku centrum pola napromieniowania.
- Barwienie histologiczne i immunofluorescencyjne
UWAGA: Barwienie H&E oraz immunofluorescencja zostały wykonane przy wsparciu komercyjnego dostawcy usług (Servicebio Biotechnology, Wuhan, Chiny) zgodnie z ich standardowymi zoptymalizowanymi protokołami.- Wykonaj barwienie hematoksyliny i eozyny (H&E) na próbkach skóry pobranych we wszystkich czterech punktach czasowych (dni 13, 19, 27 i 32 po napromieniowaniu).
- Najpierw osadz ustalone próbki tkanki w parafinie i stwórz przekroje tkanki.
- Wykonaj odwoskowanie i nawodnienie, zanurzając sekcje kolejno w Przyjaznym Środowisku Przezroczystym Płynie I (20 min), Przyjaznym Środowisku Przezroczystym Płynie II (20 min), bezwodnej etanolu I (5 min), bezwodnemu etanolu II (5 min) oraz 75% etanolu (5 min), a następnie przepłukaj wodą z kranu.
- Traktuj wszystkie fragmenty roztworem HD do stałego barwienia wstępnego przez 1 minutę. Następnie barw roztworem hematoksyliny przez 3–5 minut, a następnie płucz wodą z kranu.
- Następnie zanurz fragmenty w roztworze różnicowania hematoksyliny i ponownie przepłucz wodą z kranu. Następnie poddaj je roztworowi do niebieszczenia hematoksyliny, a następnie ponownie spłukaj.
- Następnie umieść kawałki w 95% etanolu na 1 minutę i pokryj barwnikami eozynowymi przez 15 sekund.
- Następnie odwodnij te fragmenty za pomocą serii etanolu absolutnego (trzy zmiany, po 2 minuty), zwykłego butanolu (dwie zmiany, po 2 minuty) i ksylenu (dwie zmiany, po 2 minuty), a na końcu zapieczętuj je neutralną gumą.
- Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne, aby zobrazować cytokiny zapalne IL-6 i IL-10.
UWAGA: Na podstawie ogólnego przebiegu urazu pobrano wybrane tkanki w dniu 13, gdy zaczęły pojawiać się widoczne zmiany, oraz w dniu 27, gdy postęp urazu się stabilizuje i wykazuje oznaki powrotu do zdrowia, poddać barwienie immunofluorescencyjnemu w celu wizualizacji cytokin zapalnych IL-6 i IL-10.- Odparowuję i nawodnij fragmenty za pomocą ksylenu (trzy zmiany, każda 10 minut) oraz sortowanego etanolu (trzy zmiany czystego etanolu, po 5 minut każda), a następnie płucz je w wodzie destylowanej.
- Do pobrania antygenów podgrzej szkiełka w roztworze naprawy antygenu kwasu cytrynowego o stężeniu 1× (pH 6,0) w temperaturze 70°C przez 20 minut. Pozwól szkiełkom naturalnie ostygnąć, a następnie przemyj je w PBS (pH 7,4) na shakerze dekoloryzującym (trzy mycia, po 5 minut każdy).
- Następnie nałóż 3% BSA, aby zablokować niespecyficzne wiązanie w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Przygotuj i zastosuj mieszany roztwór przeciwciał pierwotnych zawierający anty-IL-6 (1:3000) i anty-IL-10 (1:2000), a następnie wykubuj przekroje w temperaturze 4°C przez noc w nawilżonej komorze.
- Następnego dnia myj preparaty w PBS (trzy razy, po 5 minut każdy) i inkubuj z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi w temperaturze pokojowej przez 50 minut w ciemności.
- Po umyciu w PBS (trzy razy, po 5 minut każdy), pokoloruj jądra DAPI przez 10 minut w ciemności. Następnie ponownie myj w PBS (trzy razy, po 5 minut każdy), traktuj przez 5 minut chłodzeniem autofluorescencyjnym i płucz pod bieżącą wodą przez 10 minut.
- Na koniec zamontuj pokrywy za pomocą medium antyfade.
- Wykonaj barwienie hematoksyliny i eozyny (H&E) na próbkach skóry pobranych we wszystkich czterech punktach czasowych (dni 13, 19, 27 i 32 po napromieniowaniu).
- Analiza ilościowa
- Użyj oprogramowania Image J, aby ilościowo określić grubość naskórka z przekrojów barwionych H&E.
- Skalę obrazu na Obrazie J skalibruj, przesuwając pasek skali narzędziem do prostej i ustawiając znaną długość w Analizuj > Ustaw Skalę.
- Następnie przejdź do Analizy > narzędzi > menedżera ROI , aby wybrać interesujące obszary i dodać je do Menedżera ROI.
- Na koniec kliknij Mierz w Menedżerze ROI , aby uzyskać rzeczywiste długości.
- Użyj oprogramowania Image J do pomiaru średniej intensywności immunofluorescencji IL-6 i IL-10.
- Importuj obraz i podziel kanały za pomocą Image > Color > Split Channels. Następnie wybierz kanał odpowiadający docelowej fluorescencji (np. czerwony dla IL-6, zielony dla IL-10).
- Zastosuj automatyczne progowanie w sekcji Obraz > Dostosuj > Automatyczny Próg > Spróbuj Wszystko. W oknie Threshold wybierz optymalny algorytm i ręcznie dostosuj suwak do rzeczywistej fluorescencji.
- Ustaw pomiary w sekcji Analizuj > Ustaw pomiary , sprawdzając wartość średniej szarości i włączając limit do progu.
- Na koniec wykonaj Analizę > Pomiar , aby uzyskać dane o intensywności.
- Użyj oprogramowania Image J, aby ilościowo określić grubość naskórka z przekrojów barwionych H&E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki badania fizykalnego
Myszy były narażone na promieniowanie β ze źródła 90Sr w trzech różnych schematach dawowania: 0 Gy, 25 Gy, 10 Gy×5 frakcji i 50 Gy. Równolegle przeprowadzano oceny na miejscu, aby udokumentować postęp uszkodzenia skóry, aż do ustabilizowania się progresji. Wyniki eksperymentalne wykazały, że 90Sr β-radiacyjnych urazów indukowanych promieniowaniem we wszystkich grupach, a stopień uszkodzeń zależał od dawki napromieniowania. Niezależnie od dawki czy frakc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przy tworzeniu zwierzęcego modelu uszkodzeń skóry spowodowanych promieniowaniem wykorzystaliśmy długotrwały radionuklid 90Sr jako źródło promieniowania β. Precyzyjne obliczenia szybkości dawki promieniowania i czasu napromieniowania stanowiły kluczowy krok w pomyślnym rozwoju tego modelu. Udokumentowano kliniczne zastosowanie 90Sr w terapii nowotworowej, a jego wiarygodność uzyskała częściową walidację27,28. Podczas gdy inne radionuklidy β-p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają znanych konkurujących ze sobą interesów finansowych ani relacji osobistych, które mogłyby wpłynąć na prace opisane w tym artykule.
Podziękowania
Prace te są wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U25A20151, 82473574 i 82203973), Kluczowy Projekt Innowacji z prowincji Xizang (XZ202501ZY0131) oraz Fundację Transformacji Laboratorium Tianfu Jincheng (2025ZH006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Anty-IL-6 Rabbit pAb | Servicebio | GB11117 | Barwienie immunofluorescencyjne |
| Anty-IL-10 Rabbit pAb | Servicebio | GB11108 | Barwienie immunofluorescencyjne |
| Roztwór naprawy antygenu kwasu cytrynowego (PH6.0) | Servicebio | G1202 | Barwienie immunofluorescencyjne |
| Suszarka | DIAPATH | Donatello | H& E i immunofluorescencja Bejcowanie |
| Cyfrowy Kamera | Kanon | EOS 70D | Dokumentuj postęp urazów skóry podczas eksperymentu |
| Jednorazowa sterylizowana strzykawka | Profesjonalny producent jednorazowych sterylnych urządzeń medycznych. | GB20163140107 | Do iniekcji do otrzewnewki |
| Jednorazowa rękawica lateksowa | Medicom | 1186 | Ochrona |
| Przyjazny środowisku bezbarwny płyn do odpylania | Servicebio | G1128-1L | H& E i immunofluorescencja Bejcowanie |
| Zamrznięty peron | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | H& E Bejcowanie |
| Hematoksylina-eozyna (H& E) HD zestaw do stałego barwienia | Servicebio | G1076 | H& E Bejcowanie |
| Obraz J | Instytuty Narodowe | Przetwarzanie obrazu | Umożliwienie precyzyjnej ilościowej ilościowej analizy danych barwienia histologicznego |
| Ołowiany fartuch | Shandong Oureixin Radiation Protection Engineering Co., Ltd. | Nie ma | Ochrona personelu przed promieniowaniem |
| Liquid Blocker PAP Pen | Servicebio | G6100 | Barwienie immunofluorescencyjne |
| Film medyczny | 3M | 10163337409520 | Zapobieganie skażeniu źródła promieniowania przez powierzchnie biologiczne |
| Guma neutralna | SCRC | 10004160 | H& E Bejcowanie |
| Nuklearne promieniowanie Detektor | FNIRSI | 100128262296 | Monitorowanie poziomów promieniowania w czasie rzeczywistym wokół operatora, aby zapewnić bezpieczeństwo personelu |
| Utrwalacz paraformaldehydu (4%) | Biosharp | BL539A | Napraw próbek tkanki skóry |
| Patologiczny splicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | H& E i immunofluorescencja Bejcowanie |
| Maszyna do osadzania parafiny | Elektronika Junjie w Wuhan | JB-P5 | H& E i immunofluorescencja Bejcowanie |
| Stront-90 | Spółka akcyjna Instytutu Radium Instytutu Khlopin (Radium Institute JSC, Rosja) | Nie ma | Udostępnij β-promienie |
| Tribrometanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co.,Ltd | M2910 | Znieczulaj myszy |
| Suszarka do kąpieli wodnej i zjeżdżalni | SPRZĘT INSTRUMENTALNY ZHEJIANG JINHUA KEDI | KD-P | H& E i immunofluorescencja Bejcowanie |
Bibliografia
- Talapko, J., et al. Health effects of ionizing radiation on the human body. Medicina (Kaunas). 60 (4), 653(2024).
- Wucherer, M., Loose, R. occupational exposure to radiation. Radiologe. 45 (3), 291-302 (2005).
- Du, Y., et al. Heavy ion and x-ray irradiation alter the cytoskeleton and cytomechanics of cortical neurons. Neural Regen Res. 9 (11), 1129-1137 (2014).
- Jameus, A., Kennedy, A. E., Thome, C. Hematological changes following low dose radiation therapy and comparison to current standard of care cancer treatments. Dose Response. 19 (4), 15593258211056196(2021).
- Chen, X., et al. Autophagy gene atg7 regulates the development of radiation-induced skin injury and fibrosis of skin. Skin Res Technol. 29 (6), e13337(2023).
- Hopewell, J. W., Sieber, V. K., Heryet, J. C., Wells, J., Charles, M. W. Dose- and source-size-related changes in the late response of pig skin to irradiation with single doses of β-radiation from sources of differing energy. Radiat Res. 133 (3), 303-311 (1993).
- Samoylov, A. S., Bushmanov, A. Y., Galstyan, I. A. Medical management: Major lessons learned from the Chernobyl accident (the review). J Radiol Prot. 41 (3), (2021).
- Junk, A. K., et al. long-term radiation damage to the skin and eye after combined beta- and gamma- radiation exposure during the reactor accident in chernobyl. Klin Monbl Augenheilkd. 215 (6), 355-360 (1999).
- Kim, G., Choi, S. D., Lim, J. M., Kim, H. Strontium-90 levels in seawater southeast of jeju island during 2021-2023. Mar Pollut Bull. 193, 115258(2023).
- Kim, J. S., et al. β-irradiation (166ho patch)-induced skin injury in mini-pigs: Effects on NF-κB and COX-2 expression in the skin. J Vet Sci. 16 (1), 1-9 (2015).
- Burnett, L. R., et al. Biomolecular analysis of beta dose-dependent cutaneous radiation injury in a porcine model. Radiat Res. 192 (2), 145-158 (2019).
- Ryan, J. L. Ionizing radiation: The good, the bad, and the ugly. J Invest Dermatol. 132 (3 Pt 2), 985-993 (2012).
- Müller, K., Meineke, V. Radiation-induced alterations in cytokine production by skin cells. Exp Hematol. 35 (4 Suppl 1), 96-104 (2007).
- Nishimura, N., Tohyama, C., Satoh, M., Nishimura, H., Reeve, V. E. Defective immune response and severe skin damage following uvb irradiation in interleukin-6-deficient mice. Immunology. 97 (1), 77-83 (1999).
- Tanaka, T., Narazaki, M., Kishimoto, T. Il-6 in inflammation, immunity, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (10), a016295(2014).
- Paldor, M., et al. Single-cell transcriptomics reveals a senescence-associated il-6/ccr6 axis driving radiodermatitis. EMBO Mol Med. 14 (8), e15653(2022).
- Huang, E. Y., Peng, C. T., Wang, C. C. Effects of radiation response modifiers given after lethal whole-abdominal irradiation. Int J Radiat Biol. 94 (3), 289-294 (2018).
- Kumari, N., Dwarakanath, B. S., Das, A., Bhatt, A. N. Role of interleukin-6 in cancer progression and therapeutic resistance. Tumour Biol. 37 (9), 11553-11572 (2016).
- Ouyang, W., O'garra, A. Il-10 family cytokines il-10 and il-22: From basic science to clinical translation. Immunity. 50 (4), 871-891 (2019).
- Saraiva, M., Vieira, P., O'garra, A. Biology and therapeutic potential of interleukin-10. J Exp Med. 217 (1), e20190418(2020).
- Singampalli, K. L., et al. The role of an il-10/hyaluronan axis in dermal wound healing. Front Cell Dev Biol. 8, 636(2020).
- Short, W. D., et al. Interleukin-10 producing t lymphocytes attenuate dermal scarring. Ann Surg. 274 (4), 627-636 (2021).
- Weiss, E., et al. The role of interleukin 10 in the pathogenesis and potential treatment of skin diseases. J Am Acad Dermatol. 50 (5), 657-675 (2004).
- Kang, K., Hammerberg, C., Meunier, L., Cooper, K. D. Cd11b+ macrophages that infiltrate human epidermis after in vivo ultraviolet exposure potently produce il-10 and represent the major secretory source of epidermal il-10 protein. J Immunol. 153 (11), 5256-5264 (1994).
- Piskin, G., Bos, J. D., Teunissen, M. B. Neutrophils infiltrating ultraviolet b-irradiated normal human skin display high il-10 expression. Arch Dermatol Res. 296 (7), 339-342 (2005).
- Kinoshita, K., et al. Cell and tissue damage after skin exposure to ionizing radiation: Short- and long-term effects after a single and fractional doses. Cells Tissues Organs. 200 (3-4), 240-252 (2014).
- Niu, B., Zheng, C., Hu, F. Strontium 90 combined with surgery for a patient with giant subungual glomus tumor. Asian J Surg. 46 (10), 4549-4551 (2023).
- Russak, O. M., Verganti, S., Berlato, D. Strontium 90 plesiotherapy for the treatment of eyelid squamous cell carcinoma in eight cats. J Feline Med Surg. 24 (6), 524-529 (2022).
- Garcia, H., Shubik, P. Epilation and hair greying in hamsters following one single application of beta rays. J Invest Dermatol. 57 (2), 94-99 (1971).
- Ungvari, A., et al. Irradiation-induced hair graying in mice: An experimental model to evaluate the effectiveness of interventions targeting oxidative stress, DNA damage prevention, and cellular senescence. Geroscience. 46 (3), 3105-3122 (2024).
- Yang, X., Ren, H., Guo, X., Hu, C., Fu, J. Radiation-induced skin injury: Pathogenesis, treatment, and management. Aging (Albany NY). 12 (22), 23379-23393 (2020).
- Xiao, Y., et al. Ionizing radiation induces cutaneous lipid remolding and skin adipocytes confer protection against radiation-induced skin injury. J Dermatol Sci. 97 (2), 152-160 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
