Ocena mutacji DNA receptora czynnika wzrostu naskórka w krążących rzadkich komórkach za pomocą systemu izolację komórek i kroplowej PCR cyfrowej

Summary

Przedstawiamy protokół ilustrujący izolację rzadkich komórek rakowych z przygotowanej próbki zawierającej pełną krew i wzbogaconą w komórki raka płuca. Protokół wykorzystuje półautomatyczną platformę do izolacji komórek bez znaków. Wzbogacone komórki są następnie analizowane pod kątem mutacji receptora czynnika wzrostu naskórka za pomocą kroplowej cyfrowej PCR.

Abstract

Mutacje występujące w genie czynnika wzrostu naskórka (EGFR) są kluczowe dla określenia najskuteczniejszych terapii dla pacjentów z rakiem płuc. Rutynowe testowanie na mutacje EGFR może mieć postać biopsji guza lub analizy ctDNA z osocza pacjentów z rakiem płuc. Chociaż testowanie próbek krwi pacjentów z rakiem płuc jest rutynowo wykonywane, aby uzyskać informacje o obecności lub nawrocie raka płuc, poprzez wykrywanie ctDNA lub CTC, zazwyczaj nie obejmuje późniejszej analizy molekularnej schwytanych komórek. Wykrywanie pojedynczych mutacji w genie EGFR obecnych w rzadkich krążących komórkach nowotworowych (CTC) może dać dodatkowe informacje na temat potencjalnej skuteczności terapii ukierunkowanej i, co więcej, rokowania pacjenta, szczególnie w przypadku niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Niestety, rzadkość takich krążących komórek nowotworowych i brak uproszczonych procedur do badania ich informacje genomowych stanowią znaczące wyzwanie wykrywcze.

Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie realistycznego potencjału wychwytywania CTC z pełnej krwi i oceny ich zawartości molekularnej za pomocą ddPCR. Do wychwytywania krążących komórek nowotworowych zastosowano półautomatyczną platformę izolację komórek opartą na wielkości, które następnie odzyskiwano do dalszej analizy molekularnej. Aby określić obecność określonych mutacji EGFR w genomowym DNA schwytanych komórek, wykonano ddPCR przy użyciu testów na EGFR pT790M i EGFR pL858R.

Dwie oddzielne linie komórek raka płuca (A549 i H1975) były aktywnie wzbogacane z pełnej krwi, a dokładne ilości mutacji występujące w liniach komórek H1975 były wykonywane za pomocą ddPCR.

Introduction

Dzięki ciągłym badaniom translacyjnym nad wartością biopsji płynowych, a ostatnio także publikacjom szczególnie ilustrującym kliniczną wartość monitorowania ctDNA w wyborze terapii¹, biopsje płynowe osiągają dojrzałość. Biopsje płynowe zapewniają alternatywną, mniej inwazyjną metodę monitorowania i prognozowania raka w porównaniu z konwencjonalnymi metodami biopsji tkankowych. Intensywne badania skupiły się na fragmentowanym DNA znajdującym się we krwi (wolny od komórek DNA, cfDNA), a zwłaszcza podzespole pochodzącym z guza, znanym jako krążący DNA nowotworowy (ctDNA). ctDNA było intensywnie badane przez ostatnie dwie dekady i wykazano, że zawiera specyficzne dla guza mutacje genów, np. SNVs i warianty strukturalne, a także markery metylacji i charakterystyczny wzór fragmentów w porównaniu z nie-nowotworowym cfDNA. Te specyficzne cechy ctDNA są obecnie wykorzystywane do monitorowania statusu molekularnego pacjentów z rakiem na poziomie wczesnego wykrycia, reakcji na terapię, choroby resztkowej minimalnej (MRD) i statusu oporu na terapię. Podobnie krążące komórki nowotworowe (CTC), oddzielone od pierwotnego miejsca guza do naczyń krwionośnych, ostatnio ewoluowały jako obiecujące biomarkery, których istnienie i ilość we krwi wykazują ścisłą korelację z postępem choroby i potencjalnym nawrotami. Podczas gdy bardzo wczesne wstępne badania nad CTC opierały się głównie na ich ekspresji markerów białkowych i liczeniu², w badaniach CTC na poziomie molekularnym, w tym wykrywaniu mutacji genomowych w receptorze estrogenu 1 (ESR1) w przypadku raka piersi i genu czynnika wzrostu naskórka (EGFR) dla różnych nowotworów, osiągnięto znaczący postęp.

Mutacje EGFR są kluczowe zarówno dla określenia patogenezy i rokowania, jak i decydowania o najskuteczniejszych leczenach dla pacjentów z rakiem płuc³. Rutynowe testowanie na mutacje EGFR może przyjąć formę biopsji twardego guza w momencie rozpoznania lub progresji lub, coraz częściej, pobierania ctDNA z osocza pacjentów z nawracającym/opornym rakiem płuc⁴. Jednak, w przeciwieństwie do podejść opartych na ctDNA, analiza materiału genomowego pochodzącego z CTC umożliwia bezpośrednią ocenę całych komórek nowotworowych i ich profili mutacyjnych. Wraz z badaniami MRD ctDNA, wykrywanie mutacji w genie EGFR rzadkich CTC może zapewnić dodatkowe zrozumienie potencjalnej skuteczności schematów leczenia i poza tym, rokowania pacjenta, szczególnie w przypadku raka płuc niedrobnokomórkowego (NSCLC). Rzadkość CTC i brak ustalonych protokołów wykorzystujących przyjazne dla użytkownika narzędzia dla klinik stanowią poważną przeszkodę w szerszym przyjęciu. Ta ograniczona dostępność podkreśla potrzebę stworzenia znormalizowanego i przystępnego przepływu pracy, który umożliwia zarówno efektywne izolację CTC, jak i dalszą analizę molekularną. Dlatego celem niniejszego badania jest przedstawienie powtarzalnego przepływu pracy do wzbogacania krążących komórek nowotworowych i kolejnego wykrywania mutacji EGFR przy użyciu połączonego podejścia do izolacji komórek i cyfrowej analizy PCR.

System izolacji komórek Genesis z mikrofluidycznymi ślizgami do chwytania komórek może chwytać CTC w półautomatycznym procesie z wysoką żywotnością i wysoką efektywnością chwytania, w oparciu o ich większą wielkość i mniejszą deformowalność w porównaniu z podstawową populacją białymi i czerwonymi krwinkami krwi^5,6. Uchwycone CTC mogą następnie być odzyskiwane z mikrofluidycznych ślizgów do chwytania komórek przez odpływ wsteczny z ślizgu do dalszej analizy genomowej. Aby określić obecność określonych mutacji EGFR w genomowym DNA uchwyconych komórek, wykonano ddPCR na genomowym DNA pochodzącym od CTC przy użyciu testów na mutacje EGFR T790M i L858R.

Ten protokół, wykorzystujący modelową próbkę CTC i komercyjnie dostępne testy ddPCR, jest zaprojektowany tak, aby stanowić punkt wejścia do ukierunkowanego wykrywania mutacji związanych z rakiem w CTC. Ten protokół zapewnia praktyczne podejście do wykrywania mutacji związanych z rakiem w krążących komórkach nowotworowych i może wspierać dalsze badania nad zastosowaniami biopsji płynowych.

Protocol

Oświadczenie etyczne:

Probki krwi zostały uzyskane z autoryzowanych źródeł do badań i pisemna zgoda została uzyskana od wszystkich darczyńców przed pobraniem próbki. Wszystkie protokoły eksperymentalne z użyciem ludzkich próbek krwi zostały przeglądnięte i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Dostawcy Krwi, Discovery Life Sciences (Alabama, USA). Wszystkie procedury związane z ludzkimi próbkami krwi zostały przeprowadzone zgodnie z etycznymi standardami komitetu badawczego instytucjonalnego i z Deklaracją Helsińską.

1. Obogacanie komórek nowotworowych za pomocą półautomatycznego systemu izolacji komórek

Uwaga: W tej sekcji opisano wzbogacanie krążących komórek nowotworowych (CKN) za pomocą półautomatycznej platformy izolacji komórek, z wykrywaniem mutacji EGFR metodą kropelkową techniki PCR cyfrowej. Do prezentacji wyników użyto modelowej próbki CKN, a przed zastosowaniem klinicznym zaleca się walidację testu. Do eksperymentu użyto dwie linie komórek raka płuca niedrobnokomórkowego (NSCLC): NCI-H1975 (mutacje EGFR L858R/T790M) i A549 (EGFR typu dzikiego), które służyły jako negatywna kontrola dla wykrywania mutacji.

1. Próbka krwi
   1. Upewnić się, że uzyskano pisemną zgodę od darczyńców/pacjentów przed pobraniem krwi. Uzyskać aprobatę Instytucjonalnej Rady ds. Badań (IRB), gdy jest to wymagane, w przypadku badań z użyciem ludzkich próbek, w tym krwi.
   2. Do testu wykonalności, uzyskać próbkę krwi od autoryzowanego dostawcy stron trzeciej wyłącznie do badań.
   3. Pobrać krew obwodową w probówkach z kwasem etilenodiaminotetraoctowym (EDTA) i przetworzyć próbkę według protokołu Genesis Enrichment w ciągu 48 godzin.
      Uwaga. Do analizy dalszej i protokołu Genesis Enrichment zalecane są probówki EDTA. Do barwienia na szklanym slajdzie z protokołami Genesis Enumeration (bezpośrednie/pośrednie) można użyć probówki Streck i EDTA.
   4. Przechowywać próbki krwi pobranych do probówek EDTA w temperaturze 2-8 °C do momentu użycia. Do izolacji komórek z użyciem Genesis nie jest wymagane żadne wstępne leczenie, a do protokołu wzbogacania można użyć krwi pełnej do 10 ml.
2. Przygotowanie próbki modelowej CKN/próbki klinicznej
   1. Przygotować roztwór komórek w stężeniu 100-1000 komórek w 10 μl odpowiedniego pożywka do hodowli komórek lub buforu fosforanowego buforu fosforanowego (PBS). Pominąć ten krok, jeśli używane są próbki kliniczne.
      UWAGA: Stężenia dodatków użyte w tym badaniu są wyższe niż zazwyczaj obserwowane stężenia CKN w próbkach klinicznych i są przeznaczone wyłącznie do demonstracji metody.
   2. Dodać 10 μl roztworu komórek do 10 ml krwi całkowitej od zdrowego darczyńcy, aby przygotować modelową próbkę CKN. W przypadku próbek klinicznych, nie dodawać żadnych komórek nowotworowych do krwi całkowitej pacjentów.
   3. Wymieszać próbkę krwi z równą objętością PBS (1x) i delikatnie mieszać na krętaku krwi w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Jeśli przechowywanie przekracza godzinę, przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Wzbogacanie CKN
   1. Włączyć system izolacji komórek Genesis i odczekać, aż system zostanie zainicjowany. Może to zająć do 5 min.
   2. Umieścić pojemnik na odpady w pozycji u podstawy stacji i podłączyć przewód pojemnika na odpady do pojemnika na odpady.
   3. Wcisnąć przewód do zaciśnięcia zaworu, aż poczujesz, jak się kliknie na miejscu i podłączyć przewód systemu Genesis do wylotu pojemnika na odpady.
   4. Uruchomić test własny, naciskając "start" z ekranu głównego i dotykając "Self-Test" na ekranie.
   5. Gdy test własny się zakończy, wybrać "2.0 Kit Enrichment" z opcji protokołu.
   6. Postępować zgodnie z instrukcjami na ekranie, wypełnić wymagane pola danych i zakończyć procedurę zaciskania i montażu. Skuteczne zaciskanie za pomocą 70% etanolu i 1x PBS daje najlepszą wydajność i odzyskiwanie komórek dla ekstrakcji DNA. Zaciskanie trwa około 20 min.
   7. Upewnić się, że wybrany jest właściwy program wzbogacania (2.0 Kit Enrichment) i że wszystkie połączenia przewodowe i umieszczenie ślizgów są odpowiednio zabezpieczone przed rozpoczęciem uruchomienia. Unikać wprowadzania bąbelek powietrza podczas ładowania próbki, ponieważ może to wpłynąć na spójność przepływu i wydajność uchwytywania.
   8. Delikatnie wlać modelową próbkę przygotowaną z kroku 1.2.3 (Modelowa próbka CKN/Próbka kliniczna) do lejka wejściowego i kontynuować protokół wzbogacania, naciskając "Resume" na ekranie systemu.
   9. Gdy uchwycenie CKN zostanie zakończone, półautomatyczny system izolacji komórek wezmą użytkownikowi, aby usunąć pojemnik na odpady i ponownie podłączyć zbiornik do zaciskania.
   10. Odłączyć przewód systemu Genesis od pojem

Results

System izolacji komórek Genesis z przesiarka komórek mikrofluidalnych odizolował średnio 84% dodanych komórek nowotworowych w próbkach krwi o stężeniu 25–250 komórek·mL^-1 (Rysunek 3A). Ta wysoka efektywność przechwytywania pokazuje skuteczność etapu wzbogacania w izolowanie rzadkich krążących komórek nowotworowych z pełnej próbki krwi. Opcjonalne immunobarwienie komórek przechwyconych na przesierkach komórek mikrofluidalnych przy użyciu protokołu Enumeracji systemu wykazało identyfikację rzadkich komórek przy użyciu dwóch dodatnich przeciwciał przeciwko cytokeratynie, DAPI do identyfikacji komórek z jądrem oraz jednego przeciwciała ujemnego przeciwko CD45, które jest wyrażane na większości białych krwinek, ale zazwyczaj nie na CTC (Rysunek 3B). Ten wzór barwienia potwierdza pomyślną identyfikację krążących komórek nowotworowych, wyłączając jednocześnie tło białych krwinek.

Testy wykrywania mutacji ddPCR umożliwiły identyfikację i profilowanie mutacji EGFR w wzbogaconych komórkach nowotworowych. To badanie wykazało wykrywanie mutacji gDNA w komórkach, początkowo wzbogaconych przez platformę Genesis, za pomocą ddPCR i Testów Wykrywania Mutacji. Wykresy ddPCR (Rysunek 4) linii komórek nowotworowych A549 (typ dziki EGFR) i H1975 (L858R/T790M) dla dwóch testowanych mutacji EGFR wykazały, że ddPCR może wrażliwie wykrywać mutacje obecne w linii komórkowej H1975 po dodaniu do pełnej krwi i następnej wzbogaceniu za pomocą platformy Genesis. Pozytywne sygnały mutacji obserwowano w komórkach H1975, podczas gdy żadne sygnały mutacji nie zostały wykryte w komórkach A549, co potwierdza specyficzność testu. Próbki dodane z kontrolną linią komórek A549 nie wykazywały obecności kropli z mutacjami potwierdzając, że wykrywanie mutacji na L858R i T790M są związane specyficznie z linią komórek H1975. Ta demonstracja izolacji CTC na platformie Genesis, poprzedzona analizą molekularną przy użyciu ddPCR, może oferować potężne molekularne narzędzie diagnostyczne dla badań biopsji płynowej i badań przedklinicznych z wykorzystaniem próbek klinicznych do monitorowania progresji choroby i leczenia personalizowanego. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wykazują, że połączona metoda wzbogacania i ddPCR może niezawodnie wykrywać i ilościowo określać mutacje EGFR w krążących komórkach nowotworowych.

Rysunek 1: Przepływ biopsji płynowej do profilowania mutacji DNA EGFR w raku płuc. (A) Ilustracja heterogeniczności nowotworu przedstawiająca różne profile mutacji EGFR wykryte przy użyciu konwencjonalnej biopsji tkankowej i krążących komórek nowotworowych (CTC) z biopsji płynowej. (B) Schematyczny przepływ profilowania mutacji DNA EGFR w krążących komórkach nowotworowych za pomocą biopsji płynowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Demonstracja profilowania mutacji DNA EGFR przy użyciu sztucznych próbek. (A) Przygotowanie modelowej próbki CTC poprzez dodanie linii komórek nowotworów płuc o zdefiniowanym statusie mutacji EGFR do pełnej krwi od zdrowego dawcy. (B) Przepływ wykrywania mutacji DNA EGFR w krążących komórkach nowotworowych przy użyciu komercyjnie dostępnych platform. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Bezznacznikowe izolacja i identyfikacja krążących komórek nowotworowych. (A) Efektywność przechwytywania linii komórek nowotworów płuc (A549 i H1975) dodanych do próbek pełnej krwi od zdrowych dawcy za pomocą półautomatycznej platformy izolacji rzadkich komórek. (B) Immunobarwienie przechwyconych komórek pokazujących komórki nowotworowe cytokeratyno-dodatnie. Skala bara = 10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Profilowanie mutacji EGFR przy użyciu cyfrowej PCR opartej na kroplach. Dwuwymiarowe wy

Discussion

Obecność komórek nowotworowych krążących we krwi pacjentów z guzami litym przedmiotem badań od ponad 60 lat⁷ i jest rozpoznawana jako pierwotna biopsja płynna od czasu ich pierwszego włączenia do zbiorczego terminu w 2010 roku⁸. Jednakże, CTC są rzadkie i trudne do selektywnego izolowywania z pełnej krwi⁹. Istnieją jednak liczne metody przechwytywania i wzbogacania CTC, jak to ilustrują poniższe przeglądy^10,11, obejmujące podejścia fizyczne/mikrofluidyczne, jak również metody selekcji markerów powierzchniowych komórek. Wiele z tych metod jest czasochłonnych, wymagających dużo pracy i często obejmuje wiele etapów/systemów, aby osiągnąć wymaganą selektywność.

Przechwytywanie CTC z pełnej krwi w tym protokole opiera się na ich wielkości (> 8 µm) i braku deformacji na tle fenotypowo normalnych czerwonych i białych krwinek, które przechodzą przez mikrofluidyczne pory w mikrofluidycznych ślizgach do przechwytywania komórek. Dlatego prawidłowe ładowanie próbki, właściwe przygotowanie ślizgu i zapobieganie zatykaniu są kluczowymi krokami dla utrzymania efektywności przechwytywania i odzyskiwania próbki.

Aby przepływ pracy był udany, zarządzanie próbkami krwi jest kluczowym czynnikiem; upewnienie się, że świeża krew jest wykorzystywana do przetwarzania próbek i utrzymanie właściwych warunków transportu i przechowywania, aby zapobiec hemolizie. Degradacja czerwonych krwinek lub białych krwinek spowoduje wpływ na jakość przechwytywania CTC i czułość wykrywania rzadkich wariantów genomowych, odpowiednio. Jeśli zaobserwuje się hemolizę, skrzepowanie lub widoczne zniszczenie próbki, próbka nie powinna być przetwarzana, ponieważ te warunki mogą zmniejszyć odzyskiwanie CTC i czułość wykrywania mutacji w dalszym biegu.

Ponieważ CTC mogą być obecne na poziomie poniżej 1 CTC na 10 milionów białych krwinek w pełnej krwi, konieczne jest przechwytywanie tak dużej objętości, jak to jest dozwolone dla wzbogacenia. Mikrofluidyczne ślizgi do przechwytywania komórek mogą pomieścić 10 ml krwi zgodnie ze standardowymi rurką do pobierania krwi takimi jak Streck i EDTA, które zazwyczaj zawierają ~7,5–10 ml krwi. Zmniejszenie pobranej objętości krwi wpłynie bezpośrednio na wrażliwość przechwytywania CTC i późniejsze wykrywanie wariantów genomowych. Uzyskanie objętości poza tym rutynowym od pacjentów leczonych może być wyzwaniem zarówno klinicznie, jak i etycznie. Poza zwiększeniem objętości ponad 10 ml lub wykorzystaniem próbek diagnostycznych leukaferezy, aby zwiększyć populacje WBC/CTC¹², zwiększenie czułości z większymi objętościami wykracza poza zakres platformy Genesis obecnie.

Protokół został przeprowadzony zgodnie ze standardowym SOP, ale ze szczególną troską o zapewnienie świeżego pobierania krwi, kompleksowe mieszanie EDTA z krwią przy pobieraniu i staranne przechowywanie pobranej krwi przed użyciem, ilustrując potencjał tego protokołu do zastosowania w środowisku klinicznym, gdzie rutynowe standardowe procedury operacyjne są cenione. Jednakże, ponieważ ten protokół został pokazany za pomocą sztucznych próbek, potwierdzenie z klinicznymi próbkami pacjentów jest wymagane przed rutynową implementacją kliniczną.

Czułość wykrywania mutacji w populacji CTC zależy zarówno od obecności CTC w standardowej próbce pełnej krwi, jak i od wykrycia mutacji somatycznych w tej populacji CTC, co zależy od częstości mutacji w podpopulacji CTC. Te dwa czynniki zakłócające ostatecznie ograniczają ogólną czułość wykrywania mutacji w przechwyconej populacji CTC; mając większy wpływ na wczesne próbki wykrywania, w porównaniu z późnymi próbkami, które prawdopodobnie mają wyższe liczby CTC i wyższe populacje CTC noszące mutacje.

Obecne badania nad biopsją płynną opartą na krwi są mocno skoncentrowane na krążącym DNA nowotworowym obecnym w osoczu jako wskaźnik obecności guza. Zazwyczaj wykrycie ctDNA opiera się na obecności markerów genomowych specyficznych dla nowotworu np. SNVs, warianty strukturalne, MSI-H, TMB i CGP. CTC jako mniej wykorzystywany, ale równie dopuszczalny biomarker w biopsji płynnej są znane z przedostawania się do krwioobiegu z rosnących i potencjalnie metastazujących guzów⁸. Analiza CTC koncentruje się głównie na markerach powierzchniowych komórek stosowanych do ich przechwytywania lub do potwierdzenia po przechwytywaniu za pomocą ustanowionych lub niestandardowych paneli przeciwciał np. pan-Cytokeratin, Wimentyna, PD-L1, EpCAM itp. Natomiast analiza molekularna CTC jest ograniczona w przyjęciu ze względu na wyzwania związane z selektywnym wzbogacaniem i przechwytywaniem CTC z pełnej krwi, a następnie precyzyjną analizą podpopulacji CTC. Obecna metoda wykorzystuje standaryzowany przepływ pracy obejmujący ustanowione protokoły przechwytywania CTC, następnie analizę molekularną za pomocą ddPCR z gotowymi zestawami dla znanych patologicznie istotnych mutacji genomowych w sztucznych próbkach pełnej krwi. Takie podejście jest znaczące, poniewa

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Instrument (Określany jako „półautomatyczny system izolacji komórek”)
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Instrument
QX200 Droplet Reader lub QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 lub 12013328	Instrument (Określany jako „instrument Droplet Reader”)
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Instrument
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad Laboratories	1851197	Instrument
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Instrument
Celselect Slides			Materiał eksploatacyjny (Określany jako mikrofluidyczne slajdy do kapsułowania komórek)
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Materiał eksploatacyjny
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Reagent
MseI restriction enzyme	New England Biolabs	R0525S	Reagent
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	Test
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	Test
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q33230	Zestaw testowy
DG8 Cartridges for QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Materiał eksploatacyjny
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1863005	Materiał eksploatacyjny
Automated Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1864110	Materiał eksploatacyjny (opcjonalny)
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Reagent
PCR Plate Heat Seal	Bio-Rad Laboratories	1814040	Odtwarzalna folia
DNA LoBind Microcentrifuge Tube, 1.5 ml	Eppendorf	022431021	Materiał eksploatacyjny
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories	12001925	Materiał eksploatacyjny