Method Article

Trójwymiarowa metoda współhodowli do badania pośrednich interakcji między różnymi typami komórek na zrekonstituowanej błonie podstawowej

DOI:

10.3791/70027

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, 2Beatrice Hunter Cancer Research Institute, 3Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional & University Research Institute for Health Sciences (IUNICS), Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa) & University of the Balearic Islands, 4Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03), Instituto Salud Carlos III, 5Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł ten opisuje prostą metodę trójwymiarowej współhodowli dwóch typów komórek oddzielonych odtworzoną błoną podstawną, która wymaga niewielkiego specjalistycznego sprzętu i może być łatwo analizowana za pomocą różnych technik eksperymentalnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowa (3D) kokultura to szybko rozwijająca się technika dla badaczy chcących dokładnie badać interakcje międzykomórkowe za pomocą eksperymentów in vitro . Ograniczenia hodowli jednowarstwowych, w tym ograniczone interakcje między środowiskiem komórkowym a zewnątrzkomórkowym oraz zaburzenia morfologii komórkowej, są uwzględniane poprzez symulację środowiska komórkowego in vivo . Wykorzystując rusztowanie do wsparcia strukturalnego oraz włączając biologicznie aktywne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, hodowle 3D wykazują zachowania i morfologie bardziej zgodne z tkanką. Włączenie wielu typów komórek do tego typu środowiska 3D pozwala na badanie interakcji między komórkami wewnątrz biomimetycznego systemu modelowego. Pojawiło się szerokie spektrum technologii kokultury 3D, z których każda ma swoje zalety i wyzwania. Często te technologie wymagają specjalistycznego sprzętu, złożonego zestawu lub specjalistycznej wiedzy technicznej. Ponadto istnieje kilka ustandaryzowanych metod badania pośrednich interakcji między komórkami pomiędzy dwoma typami komórek oddzielonymi odtworzoną błoną podstawową. Opisujemy tutaj metodę kokultury 3D, która wymaga jedynie podstawowych umiejętności technicznych i wykorzystuje bardziej powszechnie stosowane materiały do skutecznego powtórzenia pośrednich interakcji komórek międzykomórkowych na błonie podstawowej. Monowarstwa komórek pokryta jest warstwą macierzy zewnątrzkomórkowej w postaci matrigelu, a na wierzchu jest zasiewany drugi typ komórek. Powstała kokultura jest utrzymywana przez pięć dni, po czym komórki są analizowane pod kątem zmian morfologicznych za pomocą immunofluorescencji lub wyodrębniane z kokultury w celu bardziej szczegółowych analiz genomowych, transkryptomicznych lub proteomicznych. Protokół ten jest idealny do badania wpływu komunikacji między komórkami na zachowanie komórek, gdy fizyczny kontakt jest zablokowany przez błonę podstawową. W miarę jak naukowcy coraz częściej wybierają metody hodowli komórkowej istotne dla in vivo , konieczne jest uproszczone podejście, aby uniknąć wysokich barier wejścia.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla komórek in vitro to solidna, szybka i szeroko stosowana technika badawcza. Chociaż tradycyjne metody hodowli komórkowej są skuteczne, znacznie różnią się od środowiska in vivo. Przestrzennie ograniczony charakter monowarstwowej hodowli komórkowej prowadzi do zmian w ekspresji genów, morfologii i biochemii 1,2,3. Techniki hodowli trójwymiarowej (3D) rozwiązują tę dysproporcję, ponieważ komórki hodowane są na rusztowaniu symulującym macierz zewnątrzkomórkową (ECM) obecną w narządach i tkankach. W hodowli 3D komórki wykazują morfologię i zachowanie bardziej podobne do tego, co obserwuje się in vivo 4,5. Jednak sama kultura 3D nie oddaje w pełni wielu składników mikrośrodowiska in vivo, ponieważ brakuje jej wkładu innych typów komórek6.

Bezpośrednie (kontakt między komórkami) i pośrednie interakcje między komórkami odgrywają kluczową rolę w zachowaniu komórek in vivo 7,8. Powtórzenie tych interakcji wymaga trójwymiarowych modeli współkultury, w których wiele typów komórek jest hodowanych razem w środowisku 3D. Stosując te techniki, można stworzyć środowisko wzrostu podobne in vivo, poprawiając biologiczną istotność wyników 9,10. Jednak im bardziej specyficzne jest środowisko wymagane dla danego eksperymentu, tym bardziej skomplikowana staje się metodologia. Brakuje ustandaryzowanego systemu modelowego, który mógłby być użyty do badania interakcji między komórkami oddzielonymi matrycą błony bazowej. W związku z tym protokół ten został zaprojektowany, aby symulować interakcje międzykomórkowe, które zachodzą na macierzy błony podstawnej w solidny, powtarzalny sposób. Technika ta wykorzystywała wcześniej opracowany model hodowli 3D11, wykorzystująca warstwę Matrigelu, zwaną ECM żelem, do fizycznego rozdzielania dwóch różnych typów komórek w hodowli, jednocześnie umożliwiając przejście wydzielonych czynników. Początkowo został zaprojektowany do badania pośredniego wpływu adipocytów na komórki raka piersi mezenchymalnego, ale można go łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić różne typy komórek. Należy dokładnie rozważyć, czy ta metoda jest odpowiednia dla danego projektu eksperymentalnego. Metoda ta nie pozwala na bezpośrednią interakcję komórka-komórka i powinna być ograniczona do modelowania scenariuszy in vivo, które obejmują pośrednią komunikację między komórkami przez matrycę błony podstawnej. Na przykład taki układ nie byłby idealny do modelowania interakcji między cytotoksycznymi limfocytami T a komórkami nowotworowymi, ponieważ często oddziałują one bezpośrednio. Zamiast tego rozważmy scenariusze biologiczne, w których błona podstawna naturalnie oddziela dwa typy komórek, które są przedmiotem zainteresowania. Na przykład ta metoda mogłaby być stosowana do badania interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami śródbłonka naczyniowego przed wdrożeniem do naczyń.

Popularną alternatywną metodą współkultury 3D jest użycie specjalistycznych chipów mikrofluidycznych, zwanych "organ-on-a-chip (OoC)". Systemy OoC są potężne i można je dostosować do indywidualnych eksperymentów, ale wymagają znacznego czasu i zasobów poświęconych na projektowanie układów scalonych, wybór materiałów, wyposażenie peryferyjne, optymalizację oraz zbieranie danych12,13. Ponadto obecnie nie istnieje standardowy materiał ani metoda, która mogłaby dostarczyć biologicznych i fizycznych sygnałów matrycy błony podstawowej, nie zakłócając przepływu mikrofluidycznego14. W związku z tym zastosowanie technologii OoC do badań interakcji międzykomórkowych w błonie podstawnej stanowi dodatkowe wyzwania. Metoda opisana w tym protokole ma na celu zaoferowanie standaryzowanej alternatywy, która zachowuje biologiczną istotność i dostępność.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten (Rysunek 1A) przedstawia trójwymiarowy system współhodowli zaprojektowany do odtwarzania interakcji między komórkami na macierzy błony bazalnej. Analiza dalsza jest możliwa za pomocą mikroskopii konfokalnej (rysunek 1B) lub poprzez pobieranie komórek z wewnątrz współkultury (rysunek 1C). Dzięki zastosowaniu konstrukcji "sandwich", gdzie warstwa żelu ECM jest umieszczona między dwoma populacjami komórek, protokół nie wymaga specjalistycznego aparatu i może być wykonywany z podstawową wiedzą nowoczesnych technik hodowli komórek.

1. 3D Przygotowania do współkultury

UWAGA: Opisany protokół ma być reprezentatywnym zastosowaniem metody kohodowli 3D z wykorzystaniem adipocytów 3T3-L1 oraz komórek raka piersi MDA-MB-231. Zastosowanie różnych typów komórek będzie wymagało optymalizacji gęstości zasiewania komórek oraz wstępnego testowania partii żelu ECM, aby zapewnić skuteczność. Protokół ten dotyczy stosowania kontroli bez adipocytów oraz kontroli warunkowanej ośrodka. W zależności od celu eksperymentalnego mogą być potrzebne dodatkowe kontrole.

  1. Hodowla komórkowa i przygotowanie roztworu
    1. Pozyskanie i utworzenie hodowli linii komórkowych raka piersi 3T3-L1 pre-adipocytów oraz MDA-MB-231. Hodować i samodzielnie utrzymywać wszystkie komórki za pomocą techniki aseptycznej w szafce bezpieczeństwa biologicznej klasy II oraz standardowych metodach hodowli komórek15. Utrzymuj komórki 3T3-L1 w zmodyfikowanym Eagle Media (DMEM) Dulbecco, uzupełnionym o 10% (v/v) noworodkowe serum cielęte (NBCS) oraz 1% penicylin-streptomycyny (10 000 U/mL). Utrzymuj komórki MDA-MB-231 w RPMI 1640, uzupełnione 10% płodową surowiką bydłą (FBS) oraz 1% penicylin-streptomycyną (10 000 U/mL).
      UWAGA: Nigdy nie pozwól, by komórki 3T3-L1 przekroczyły 80% konfluencji podczas utrzymania i nie stosuj hodowli powyżej 20. przejścia .
    2. Pobierz lub przygotuj roztwór zapasowy 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanem (PBS) o stężeniach 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4.
    3. Przygotuj 50 mL roztworu PBS-glycyna, dodając 0,375 g glicyny do 50 mL PBS, aby uzyskać końcowe stężenie glicyny 100 mM. Przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 12 miesięcy.
    4. Przygotuj 10 mL buforu permeabilizacyjnego, dodając 50 μL Triton X-100 do 9,5 mL PBS. Napełnić do 10 mL, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5% (v/v) Triton X-100. Przechowuj w temperaturze 4 °C i użyj w ciągu miesiąca.
    5. Przygotuj 50 mL buforu immunofluorescencyjnego (IF), dodając 50 μg albuminy surowicy bydłej (BSA), 100 μL Triton X-100 oraz 25 μL Tween-20 do 45 mL PBS. Napełnij do 50 mL, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% (w/v) BSA, 0,2% (v/v) Triton X-100 oraz 0,05% (v/v) Tween-20. Przechowuj w temperaturze 4 °C i użyj w ciągu miesiąca.
    6. Przygotuj 10 mL buforu blokującego, dodając 1 ml surowicy zwierzęcej do 9 ml buforu IF dla końcowego stężenia 10% surowicy. Przechowuj w temperaturze 4 °C i użyj w ciągu miesiąca.
      UWAGA: Tożsamość gatunkowa surowicy zależy od gatunku gospodarza zastosowanych przeciwciał fluorescencyjnych wtórnych (patrz 2.2.4).
    7. Żel ECM do rozmrażania (całkowite stężenie białka ~9-9,5 mg/mL) w temperaturze 4 °C przez noc. Przygotuj alikwoty o pojemności 500 μL w rurkach mikrowirówek o pojemności 1,5 mL i przechowywaj w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Żel ECM jest bardzo zmienny i musi być zweryfikowany, aby wywołać oczekiwane zachowanie w każdym typie komórek. Różne typy komórek mogą wymagać różnych stężeń białek lub sztywności macierzy.
      UWAGA: Zawsze używaj wcześniej schłodzonych końcówek i pojemników do pipet podczas obsługi żelu ECM, aby uniknąć polimeryzacji w temperaturze pokojowej. Zawsze trzymaj żel ECM na lodzie podczas manipulacji.
  2. Różnicowanie adipocytów
    1. Zasiew 50 000 do 80 000 pre-adipocytów 3T3-L1 w 0,5 mL standardowego podłoża wzrostu do 2 dołków szkiełka komorowego z 4 dołkami. Puste dołki będą używane do kontroli ośrodka bez adipocytów oraz warunkowanego.
      UWAGA: Hodowle komórkowe w komorach są podatne na zakłócenia mechaniczne. Unikaj aspiracji próżniowej mediów i stosuj delikatną technikę pipetowania z pipetatorami manualnymi.
    2. Nasiać 50 000 do 80 000 pre-adipocytów 3T3-L1 w 0,5 mL standardowego podłoża wzrostu do pojedynczego dołka z 24-dołkową płytką do hodowli tkankowej. Będzie on używany do zbierania mediów warunkowanych do sterowania nośnikiem warunkowanym.
    3. Pozwól obu kulturom osiągnąć 100% konfluencji w ciągu 24 godzin.
    4. Rozpocznij adipogenezę poprzez zastąpienie podłoża wzrostu pożywką inicjującą adipogenezę, składającą się z DMEM uzupełnionego 10% FBS, 0,5 mM 3-izobutyl-1-metyloksantyny (IBMX) oraz 1 μM deksametazonu. Inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5%CO2 .
    5. Po 48 godzinach zastąpić zużyte podłoże świeżym medium progresyjnym adipogenezy, składającym się z DMEM o stężeniu 10% FBS i insuliny 10 μg/mL. Inkubuj komórki przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5%CO2 .
    6. Przed kontynuacją kokultury 3D powtór się wizualnie obecność kropelek lipidowych w >60% komórek. Jeśli gromadzenie się kropelek lipidowych jest powolne, zamień medium progresyjne na DMEM z 10% FBS i monitoruj zawartość lipidów co 24 godziny.
  3. Nakładanie i utrzymanie współkultury 3D
    1. Rozmraź żel ECM w 4 °C przez noc, a następnie kontynuuj nakładkę.
      UWAGA: Aby uniknąć zmienności między partiami, zaleca się stosowanie tej samej partii żelu ECM we wszystkich eksperymentach w ramach jednego badania.
    2. Po udanym rozróżnieniu 3T3-L1 usunąć zużyte medium hodowlane, pozostawiając mały bufor o pojemności ~50 μL podłoża.
    3. Ostrożnie dodaj 110 μL żelu ECM do każdej jamki komory zawierającej adipocyty, uważając, aby nie zakłócić monowarstwy adipocytów.
      UWAGA: Żel ECM szybko twardnie w temperaturze pokojowej. Aby uniknąć przedwczesnej polimeryzacji matrycy, zawsze trzymaj żel ECM na lodzie i używaj końcówek schłodzonych w temperaturze -20°C.
    4. Dodaj 110 μL żelu ECM do pustej studni kontrolnej bez adipocytów. Aby zapewnić równomierne rozłożenie Matrigelu, dodaj kropelki w rogi studni i środek studni. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie rozprowadzić Matrigel po powierzchni hodowli bez skrobania.
    5. Inkubuj szkiełko przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić polimeryzację żelu ECM.
    6. Podczas tego etapu inkubacji zbieraj i licz komórki MDA-MB-231
      OPCJONALNIE: Zobacz krok 1.4, aby poznać szczegóły dotyczące fluorescencyjnego oznaczania tych komórek.
    7. Przygotuj rozcieńczoną zawiesinę komórek MDA-MB-231 w dawce 30 000 komórek/mL w pożywce wzrostu mlekowej zawierającej 2% żel ECM (v/v).
      UWAGA: Optymalna gęstość zasiewów komórek różni się w zależności od typu komórek i musi być zoptymalizowana przed eksperymentami. UWAGA: Medium wzrostu mlecza to komercyjnie dostępne podłoże do hodowli komórek zoptymalizowane pod kątem komórek nabłonka mlecznego. Zawiera 0,4 % ekstraktu przysadki bydlęcej, 10 ng/mL czynnika wzrostu naskórka (rekombinowany człowiek), 5 μg/mL insuliny (rekombinowany człowiek) oraz 0,5 μg/mL hydrokortyzonu. Medium do kokultury musi być starannie dobrane, aby odpowiadać potrzebom obu typów komórek.
    8. Gdy żel ECM się spolimeryzuje, delikatnie dodaj 450 μL zawiesiny MDA-MB-231 do każdego otworu. Daje to łączną liczbę komórek 13 500 komórek na studnię.
      UWAGA: Na tym etapie możliwe jest nierówne nałożenie zawiesiny komórkowej na żel. Oceń wizualnie boki komory i delikatnie stukaj po wszystkich stronach, aby równomiernie rozłożyć ściany.
    9. Do hodowli adipocytów na 24-dołkowej płytce dodaj 450 μL pożywki wzrostu mlekowej zawierającej 2% żel ECM (v/v). Zbieraj i wymieniaj podłoża co 48 godzin.
    10. Utrzymuj współkulturę maksymalnie przez 5 dni, z wymianami mediów co 48 godzin.
      UWAGA: Powstrzymaj się od aspiracji próżniowej i stosuj delikatne pipetowanie. Odłączenie żelu ECM to możliwy problem, który może pojawić się podczas utrzymania kokultury.
    11. Dla dobrze kontrolnego medium warunkowanego użyto rozcieńczonego adipocytu (z kroku 1.3.9) w formie 1:1 świeżym podłożem, a następnie zastąpiono zużyte podłoże kokulturowe w dniach 2 i 4.
      UWAGA: W tym momencie okres współhodowli dobiega końca i musi być przeanalizowany albo poprzez utrwalenie i barwienie hodowli w celu określenia morfologii i ekspresji markerów (patrz sekcja 2), albo poprzez wyodrębnienie komórek ze środowiska współhodowli i przygotowanie komórek do dalszej analizy (patrz sekcja 3).
  4. Oznaczanie ogniw fluorescencjonalnych (opcjonalnie)
    UWAGA: Znakowanie komórek nakładających się na nich można przeprowadzić przed krokiem 1.3.7, aby pomóc w identyfikacji komórek nakładających się podczas rejestracji obrazów immunofluorescencyjnych.
    1. Przygotuj 5 mM roztwór zapasowy karboksyfluoresceinowego diacetatu succinimidyl esteru (CFSE) poprzez rozpuszczenie 10 mg CFSE w 4,22 mL DMSO. Przechowuj w alikwotach 500 μL w temperaturze -20 °C, chronionych przed światłem.
    2. Po liczeniu komórek od kroku 1.3.6, przemyj komórki raz 5 mL PBS. Ponownie zawiesij powstały pellet w 1x PBS do końcowego stężenia 1 000 000 komórek/mL.
    3. Dodaj 1 μL 5 mM CFSE na mL zawiesiny komórkowej, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 5 μM. Inkubuj zawiesinę ogniwa przez 20 minut w temperaturze pokojowej, chronioną przed światłem.
    4. Schłodzić zabarwienie CFSE, dodając 5 woluminów podłoża hodowlanego. Inkubuj dodatkowe 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Komórki granulowane i dwukrotnie myj PBS, aby usunąć pozostałości CFSE. Ponownie zawiesnij komórki w podgrzanym podłożu wzrostu mlecza. Inkubuj przez kolejne 10 minut w temperaturze pokojowej, aby nie pozostał żaden barwnik.
    6. Nasiona fluorescencyjnie oznakowane komórki, jak opisano w kroku 1.3.7. Pozostałą część protokołu można wykonać zgodnie z opisem.

2. Immunofluorescencja

  1. Fiksacja
    UWAGA: Aby uniknąć depolimeryzacji żelu ECM i utraty próbek podczas płukania, pozwól wszystkim odczynnikom wyrównać się do temperatury pokojowej przez ~30 minut przed użyciem.
    1. Po 5 dniach współkultury zastąpić nośniki 500 μL PBS.
      UWAGA: Kroki 2.1.2 do 2.3.7 mogą być wykonywane w warunkach niesterylnych.
    2. Usuń PBS i zamień go na 2% paradehyd (PFA) w PBS (przygotowanym na świeżo) w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
      UWAGA: Żel ECM jest wrażliwy na PFA i może prowadzić do odklejania się warstwy żelu.
      UWAGA: PFA z czasem rozkłada się na formaldehyd. Unikaj wdychania oparów, zapewnij odpowiednią wentylację i zawsze nosz odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (np. rękawice, fartuch laboratoryjny, ochronę oczu) podczas kontaktu z PFA.
    3. Usuń PFA i płucz studnie 500 μL roztworu PBS-Glycine przez 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
      UWAGA: Zastosowanie płukania PBS-Glycine jest kluczowe, aby zapobiec powstawaniu fluorescencji tła wolnym aldehydom. Nie myj w PBS bez glicyny.
    4. Powtórz krok 2.1.3 dwa razy, co daje łącznie trzy prania. Zobacz 2.1.5 dla warunków przechowywania, przejdź do kroku 2.2.2, jeśli nie jest to konieczne.
    5. Na tym etapie protokół można zawieść na maksymalnie tydzień, a preparat można przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby przechować szkieł, napełnij wszystkie otwory 1 mL PBS i uszczelnij pokrywę zamka komory cienką wstążką parafilmu. Umieść preparat płasko w lekkoodpornym pojemniku, na zwilżonej, delikatnej tkance, aby hodowle nie wyschły.
  2. Barwienie przeciwciał
    1. Wcześniej przechowywane preparaty podgrzewaj do temperatury pokojowej, usuń PBS i myj studnie 500 μL świeżego PBS przez 15 minut z delikatnym mieszaniem. Pomiń ten krok, jeśli kontynuujesz bezpośrednio od kroku 2.1.4.
    2. Przepuszczać komórki 500 μL buforu permeabilizacyjnego przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania.
    3. Płucz studnie 500 μL PBS, z 15 minutami delikatnego mieszania. Powtórz dwa razy, co daje łącznie 3 prania.
    4. Dodaj 500 μL buforu blokującego do każdej studni i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
      UWAGA: Upewnij się, że źródłowy gatunek surowicy w buforze blokującym odpowiada gatunkowi przeciwciała wtórnego. W tym protokole używamy surowicy osła i przeciwciał wtórnych przeciwciał dla osła.
    5. Rozcieńcz przeciwciała pierwotne interesujące bufor IF, zgodnie z zaleceniami producenta. Usuń bufor blokujący i dodaj 300 μL rozcieńczonego roztworu przeciwciał do każdego dołku.
    6. Zabezpiecz pokrywę zamka komory parafilmem i umieść szkiełko w światłoodpornym pojemniku. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnym podsycaniem.
    7. Płucz studnie 500 μL bufora IF, z 15 minutami delikatnego mieszania. Powtórz dwa razy, co daje łącznie 3 prania.
    8. Rozcieńczaj odpowiednie, fluorescencyjnie oznakowane przeciwciała wtórne w buforze IF, zgodnie z zaleceniami producenta. Dodaj 300 μL wtórnego rozcieńczenia przeciwciał do każdej dołki i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
      UWAGA: Unikaj długotrwałej ekspozycji na światło po tym etapie, aby ograniczyć fotobielenie.
    9. Powtórz krok 2.2.7.
    10. Rozcieńcz roztwór zapasowy 300 μM 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) 1:800 w PBS. Dodaj 300 μL do każdego dołka i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.
    11. Myj komórki 500 μL PBS przez 5 minut delikatnie mieszając. Powtórz raz.
  3. Montaż zamka
    1. Usuń jak najwięcej resztek PBS, nie naruszając hodowli kultur. Zmień pokrywkę i oddziel komorę od szkła za pomocą narzędzia dostarczonego przez producenta komory.
    2. Używając delikatnej chusteczki roboczej, wytrzyj krawędzie szkiełka, aby usunąć pozostałości PBS bez naruszania żelu ECM.
    3. Powoli naklejaj silikonowy uszczelniacz krawędzie zamka za pomocą strzykawki i igły 18G. Pozwól silikonowi 3 minuty na zastygnięcie.
    4. Podczas gdy silikon się zastyga, dodaj 1-2 krople medium antyfade do każdego otworu. Unikaj bąbelków. Jeśli pojawią się pęcherzyki, użyj pipety, aby ostrożnie je usunąć, nie szkodząc kulturze.
    5. Po zastygnięciu silikonu delikatnie opuszczaj szklaną pokrywkę pod niewielkim kątem. Użyj kleszczy lub końcówki pipety, aby wypchać pęcherzyki powietrza podczas opuszczania pokrywy. Stosuj delikatny nacisk, aby nie rozbić pokrywy pokrywowej.
    6. Włóż szkiełko do światłoodpornego pojemnika w temperaturze pokojowej i pozwól mu zastygnąć na noc. Preparat można przechowywać w temperaturze 4 °C, a protokół można zatrzymywać na maksymalnie tydzień.
      UWAGA (opcjonalnie): Aby lepiej uszczelnić szkiełki, nałóż przezroczysty lakier do paznokci na krawędzie slipu 1 godzinę po coverslipie.
    7. Slajdy obrazowe wykonuję za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 10-20x. Uchwyć pięć losowych pól widzenia, aby zminimalizować stronnictwo operatora.

3. Zbiory kokultur do analizy dalszej

UWAGA: Pobieranie komórek lub biomolekuł jest niezgodne z immunofluorescencją. Zaleca się uprawę współkultur przeznaczonych do innych analiz w standardowych miskach hodowli 24-dołkowej, używając tych samych stężeń i objętości komórek, jak opisano w sekcjach 1 i 2.

  1. Ekstrakcja komórek
    1. Usuń zużyte medium i delikatnie myj studnie lodowatym PBS. Powtórz raz, co daje łącznie dwa prania.
    2. Używając końcówki pipety o szerokim przekształceniu, dodaj 1 mL roztworu do odzyskiwania lodowatych ogniw, zwanego dalej roztworem odzyskującym. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić warstwę żelu ECM. Przelej ciecz do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
      UWAGA: Roztwór do odzyskiwania komórek to dostępny komercyjnie nieenzymatyczny roztwór zaprojektowany do delikatnego uwalniania komórek osadzonych w żelu ECM. Jest to kompozycja własnościowa i może być niekompatybilna z niektórymi typami komórek. Alternatywnie można rozważyć enzymatyczną depolimeryzację żelu ECM przy użyciu łagodnych białaz, takich jak Dispase lub Accutase. Wymaga to inkubacji w temperaturze 37 °C oraz optymalizacji czasu inkubacji.
    3. Do każdego odwiertu należy dodać 250 μl lodowatego roztworu odzysku, aby zebrać pozostałe komórki. Przenieś do odpowiedniej rurki mikrowirówki.
    4. Odwracaj rurki 4-5 razy, żeby wymieszać.
    5. Przełóż probówki na lód i inkubuj przez 60 minut z delikatnym poruszeniem. Co 10 minut odwracaj rurki 2-3 razy, aby zapobiec osiadaniu zawartości rurek.
    6. Rurki wirówkowe w 300 x g przez 5 minut w 4 °C
    7. Sprawdź obecność widocznego osadu komórkowego. Ostrożnie usuń supernatant i dodaj 1 ml lodowatego 1x PBS. Wirować w 300 x g przez 5 minut w 4 °C. Powtórz raz, co daje łącznie dwa płukania. Spodziewaj się, że pellet będzie zawierał 80-90% początkowo zasianych komórek, przy czym proporcje poszczególnych typów komórek pozostaną stałe.
      UWAGA: W tym momencie pellet komórkowy może zostać zlizowany, aby zebrać białko lub kwasy nukleinowe. Lizowane pellety można przechowywać w temperaturze -80 °C, a protokół można zawiesić na 3 miesiące. Lysis jest niekompatybilny z wersją 3.2.
  2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
    1. Ponownie zawiesić granulki w 200 μL o stężeniu 0,25% trypsyny-EDTA. Następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3-4 minuty.
    2. Dodaj 600 μL kompletnego podłoża wzrostowego, aby schłodzić trawienie trypsyny.
    3. Wiruj w 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant i dodaj 500 μL PBS w temperaturze pokojowej.
    4. Wiruj w 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz raz, co daje łącznie dwa prania.
    5. Ponownie zawiesz pellet w 80 μL PBS z 0,04% BSA, filtruj zawiesinę za pomocą sitego ogniwowego 40 μm.
    6. Rozcieńcz 5 μL zawieszenia w 5 μL trypanowego niebieskiego. Liczyć komórki i oceniać żywotność na hemacytometrze. Komórki są już gotowe do analizy w dalszej fazie rozwodu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wykazać skuteczność tego protokołu w badaniu efektów interakcji międzykomórkowych na błonie podstawnej, Rysunek 2 i Rysunek 3 zostały wykorzystane z wcześniejszej publikacji (Pallegar i in.16) jako reprezentatywne wyniki. Rysunek 4 i 5 to nowe dane, które zostały opracowane, aby pokazać zdolność tego protokołu do komórek niezwiązanych z rakiem piersi oraz zdolność do pobieran...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak złożonych interakcji komórkowych w tradycyjnej hodowli komórkowej podkreśla potrzebę ulepszenia modeli narządów i tkanek, aby dokładniej badać odpowiedzi na leki i postęp choroby in vivo. Rozwój systemów kohodowania 3D przyczynił się do wypełnienia tej luki, umożliwiając badanie konsekwencji interakcji komórka-komórka bez potrzeby badań in vivo 9,12. Jednak wiele z tych metod może być mechanicznie złożonych, wymagając znacznych zasobów, cza...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój metody był częściowo finansowany przez Cancer Research Society. GRK była finansowana przez Carol Ann Cole Graduate Scholarship Kanadyjskiego Towarzystwa Onkologicznego w ramach programu szkoleniowego Cancer Research Training Institute. PMMB zostało wsparte grantem programu MOBILITAS (2024) od Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa). Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytka do hodowli tkanek 24 dołkówCorning3524
Szkło okładkowe 24 x 60 mmUltident Scientific170-C2460
4% paraformaldehydu w PBSInvitrogenJ61899. AKRozcieńczony do 2% w 1x PBS
Szkiełka hodowlane z 4 komoramiFalcon354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.705-607-003
Hemacytometr jasnej liniiHausser Scientific3120
Zestaw do Proliferacji CFSE CellTraceInvitrogenC34570
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253
DAPISigma-Aldrich Canada Co.D9542
Przeciwciało przeciw mysłom IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową wtórną, DyLight 594InvitrogenSA5-10168
Przeciwciało przeciwwtórne przeciw przeciw królikom osiołkiemu (H+L) wysoce krzyżowo adsorbowane, Alexa Fluor 647InvitrogenA31573
DMEM/F-12, bez czerwieni fenolowejGibco21041025
Zmodyfikowane medium orła Dulbecco, wysokoglukozowe, piruwanieGibco11995-065
Serum krówego płodu, pochodzenie w KanadzieGibco12483-020
Filtry komórkowe Flowmi, 40 & mikro; MBel-Art136800040
GE Advanced silikonowe okno i drzwi, przezroczysteHenkel International2811093
Poliklonalny anty-ZO-1 dla kozSantaCruz BiotechnologySC8146Pierwotne przeciwciało zostało odstawione
Monoklonalny anty-ZO-1 dla szczurówSantaCruz BiotechnologySC33725Alternatywne pierwotne przeciwciało zastępujące wycofany SC8416 anty-ZO-1
Podstawowe ośrodek nabłonkowy komórki mleczkowyPromocellC-21210
Matrigel, bez fenolu czerwonego, czynnik wzrostu obniżony, bez LDEV.Corning356231Stężenie białka: 9-9,6 mg/mL
Myszy monoklonalny anty-vimentynaSigma-Aldrich Canada Co.V2258Przeciwciało pierwotne
Serum dla noworodków, pochodzenie nowozelandzkieGibco16010159
Penicylina-streptomycynaGibco15140-122
Sól fizjologiczna z buforem fosforanow, pH 7,4Gibco10010023
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36934
Oczyszczona mysz anty-E-KadherynaBD Biosciences610181Przeciwciało pierwotne
Króliczy Poliklonalny Anty-Claudin 7 AbcamAB27487Przeciwciało pierwotne
RPMI 1640, glutaminaGibco11875-093
SupplementMixPromocellC-39115
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061
Trypsyna 0,25%-EDTAGibco25200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of medical science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  5. Lagies, S., et al. Cells grown in three-dimensional spheroids mirror in vivo metabolic response of epithelial cells. Communications Biology. 3 (1), 246(2020).
  6. Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Developmental Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
  7. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 9 (1), 196(2024).
  8. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Current biology: CB. 30 (16), R921-R925 (2020).
  9. Abuwatfa, W. H., Pitt, W. G., Husseini, G. A. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. Journal of Biomedical Science. 31 (1), 7(2024).
  10. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7 (1), 45270(2017).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Leung, C. M., et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 33(2022).
  13. Srivastava, S. K., Foo, G. W., Aggarwal, N., Chang, M. W. Organ-on-chip technology: Opportunities and challenges. Biotechnology Notes. 5, 8-12 (2024).
  14. Gu, P., Xu, A. Interplay between adipose tissue and blood vessels in obesity and vascular dysfunction. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 14 (1), 49-58 (2013).
  15. Noel, V., Berry, M. D. Culture of Adherent Cancer Cell Lines. Cancer Cell Biology: Methods and Protocols. , 19-29 (2022).
  16. Pallegar, N. K., Garland, C. J., Mahendralingam, M., Viloria-Petit, A. M., Christian, S. L. A Novel 3-Dimensional Co-culture Method Reveals a Partial Mesenchymal to Epithelial Transition in Breast Cancer Cells Induced by Adipocytes. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 24 (1), 85-97 (2019).
  17. Martin, T. A., Ye, L., Sanders, A. J., Lane, J., Jiang, W. G. Cancer Invasion and Metastasis: Molecular and Cellular Perspective. Madame Curie Bioscience Database [Internet]. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK164700/ (2013).
  18. Ma, W., Tavakoli, T., Derby, E., Serebryakova, Y., Rao, M. S., Mattson, M. P. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC developmental biology. 8, 90(2008).
  19. Kim, Y. J., Lee, H. S., Kim, D., Byun, H. K., Koom, W. S., Koh, W. Bilayer 3D co-culture platform inducing the differentiation of normal fibroblasts into cancer-associated fibroblast like cells: New in vitro source to obtain cancer-associated fibroblasts. Bioengineering & Translational Medicine. 10 (1), e10708(2024).
  20. Sourouni, M., et al. Establishment of a 3D co-culture model to investigate the role of primary fibroblasts in ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer Reports. 6 (4), e1771(2023).
  21. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Materials Today Bio. 15, 100301(2022).
  22. Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of mammary epithelial cells from three-dimensional mixed-cell spheroid co-culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3760(2012).
  23. Ooi, J. Y. Y., Tsang, Y. S., McMahon, L. P., Wong, L. Protocol for in vitro immunofluorescence staining in a Transwell co-culture system. STAR protocols. 6 (4), 104162(2025).
  24. Wallisch, S., et al. Protocol for establishing a coculture with fibroblasts and colorectal cancer organoids. STAR Protocols. 4 (3), 102481(2023).
  25. Ildiz, E. S., Gvozdenovic, A., Kovacs, W. J., Aceto, N. Travelling under pressure - hypoxia and shear stress in the metastatic journey. Clinical & Experimental Metastasis. 40 (5), 375-394 (2023).
  26. Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Experimental Cell Research. 202 (1), 1-8 (1992).
  27. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1387(2021).
  28. Ahmad, Z., et al. Versatility of Hydrogels: From Synthetic Strategies, Classification, and Properties to Biomedical Applications. Gels. 8 (3), 167(2022).
  29. Jinka, R., Kapoor, R., Sistla, P. G., Raj, T. A., Pande, G. Alterations in Cell-Extracellular Matrix Interactions during Progression of Cancers. International Journal of Cell Biology. 2012, 219196(2012).
  30. Short, A. R., Czeisler, C., Stocker, B., Cole, S., Otero, J. J., Winter, J. O. Imaging Cell-Matrix Interactions in 3D Collagen Hydrogel Culture Systems. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  31. Zeng, F., Yang, W., Huang, J., Chen, Y., Chen, Y. Determination of the lowest concentrations of aldehyde fixatives for completely fixing various cellular structures by real-time imaging and quantification. Histochemistry and Cell Biology. 139 (5), 735-749 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Dimensional Co CultureBasement MembraneIndirect Cell InteractionsCell Cell CommunicationExtracellular MatrixBiomimetic ModelImmunofluorescence AnalysisMorphological ChangesIn Vitro Cell CultureMatrigel Scaffold
Video Coming Soon

Related Articles