Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowa analiza ratiometryczna biosensorów opartych na FRET w Arabidopsis thaliana umożliwia na żywo pomiar analitów w przedziałach podkomórkowych

365 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70028

⸱

24 lutego 2026

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół analizy ilościowej cząsteczek lub jonów w subkomórkowych przedziałach żywych komórek, wykorzystując biosensory oparte na rezonansie Förstera (FRET). Obejmuje ono standaryzowane obrazowanie, przetwarzanie maski binarnej oraz analizę ratiometryczną z regresją liniową zastosowaną do fosforanu u Arabidopsis thaliana (A. thaliana), ale jest szeroko stosowalna w innych biosensorach i organizmach.

Streszczenie

Biosensory fluorescencyjne zapewniają nieinwazyjne i wszechstronne podejście do monitorowania dynamicznych zmian stężenia metabolitów lub jonów w komórkach żywych. Konkretnie, biosensory oparte na FRET umożliwiają pomiary ratiometryczne, które raportują poziomy subkomórkowych analizów, jednocześnie niezależne od poziomów ekspresji biosensorów. Opisujemy kompleksowy i ustandaryzowany protokół ilościowej analizy ratiometrycznej biosensorów opartych na FRET u roślin. Protokół prowadzi użytkowników przez przygotowanie próbki na żywo, pozyskiwanie obrazów konfokalnych dawców, kanały FRET i akceptorów, generowanie maski binarnej dla interesujących obszarów subkomórkowych, a następnie analizę danych proporcjonalnych opartą na regresji. Głównym wynikiem jest odczyt ratiometryczny pochodzący z regresji, który umożliwia ilościowe porównania genotypów, tkanek, etapów rozwojowych i warunków leczenia. Na przykładzie biosensora cpFLIPPi-5,3m dla fosforanów nieorganicznych demonstrujemy pomiar poziomu fosforanów nieorganicznych w stromie chloroplastowym A. thaliana. Ten framework analityczny jest szeroko stosowany w innych biosensorach i modelach opartych na FRET, umożliwiając precyzyjną kwantyfikację przestrzenno-czasową metabolitów i jonów in vivo. Ta strategia dostarcza mierzalnych wglądów w dynamikę podkomórkową metabolitów i jonów, wspierając porównania w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Monitorowanie dynamiki metabolitów i jonów w żywych komórkach roślinnych jest niezbędne do zrozumienia, jak szlaki metaboliczne i sieci sygnalizacyjne są koordynowane w przestrzeni i czasie, aby wspierać wzrost i rozwój 1,2. Poziomy metabolitów komórkowych szybko zmieniają się w odpowiedzi na sygnały środowiskowe, takie jak dostępność składników odżywczych, intensywność światła i stres3. Wśród nich szczególnie istotny jest poziom nieorganicznych fosforanów (Pi), który odgrywa kluczową rolę w transferze energii, sygnalizacji i regulacji metabolicznej, jednak jego dynamika podkomórkowa pozostaje trudna do zmierzenia4.

Standardowe testy kolorymetryczne oraz jądrowa rezonans magnetyczny fosfor-31 (³¹P)-NMR mogą oszacować całkowite lub przedziałowe Pi, ale nie mają rozdzielczości pojedynczej komórki i ograniczoną precyzję czasową 5,6. Chociaż spektrometria rentgenowska synchrotronowa i obrazowanie radiotracowe dostarczają informacji podkomórkowej lub strumieniowej, nie są w stanie niezawodnie odróżnić Pi od fosforylowanych metabolitów i często są inwazyjne. Frakcjonowanie niewodne oraz testy kinetyczne oparte na enzymach oferują pośrednie szacunki stromalnych i cytosolowych Pi, jednak te podejścia są pracochłonne i podatne na skażenie 7,8. Te ograniczenia podkreślają potrzebę stosowania metod niedestrukcyjnych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej do monitorowania metabolitów takich jak Pi, takich jak obrazowanie na żywo biosensorów opartych na FRET.

Genetycznie kodowane biosensory oparte na FRET są potężnymi narzędziami do analiz in vivo dynamiki jonów i metabolitów wewnątrzkomórkowych. Wczesne badania wykazały użyteczność takich biosensorów w monitorowaniu stężenia glukozy, sacharozy i ATP w komórkach 9,10,11. Nowsze osiągnięcia rozszerzyły to podejście o monitorowanie wapnia, azotanów, fosforanów, auxiny, kwasu abscyzowego i gibbereliny, dostarczając cennych informacji na temat regulacji składników odżywczych i hormonów 12,13,14,15,16.

cpFLIPPi-5.3m to biosensor Pi oparty na FRET zoptymalizowany do monitorowania poziomów Pi podkomórkowych w komórkach roślinnych17. Ten biosensor składa się z białka wiążącego Pi z cyjanobakterią, otoczonego przez dawcę FRET (eCFP, wzmocnione białko fluorescencyjne cyjanu) oraz akceptor FRET (cpVenus, zmodyfikowany wariant żółtego białka fluorescencyjnego Wenus), a po wiązaniu Pi przechodzi zmianę konformacyjną. Ta zmiana zmienia sygnał fluorescencyjny pochodzący od Pi z FRET, który jest rejestrowany w obrazowaniu konfokalnym, tak że wzrost stężenia Pi skutkuje obniżeniem stosunku FRET do dawcy. Analiza proporcjonalna zależna od pi jest wykonywana podczas obróbki zdjęć poprzez porównanie intensywności emisji akceptora i dawcy18.

Ilościowa analiza stosunkowo-frekwencyjna w żywych tkankach roślinnych wymaga korekty dla spektralnego przepuszczania i wzbudzania krzyżowego fluoroforów dawcy (CFP) i akceptora (cpVenus), odpowiednio18. Przepuszczanie przez przepust powstaje, gdy emisja CFP jest wykrywana w kanale FRET, natomiast wzbudzenie krzyżowe powstaje w wyniku wzbudzenia cpWenus podczas wzbudzenia CFP. Te artefakty spektralne mogą różnić się w zależności od komórek i przedziałów podkomórkowych, szczególnie w tkankach roślinnych o pigmentacji, co zakłóca pomiary proporcjonalne. Aby uzyskać skorygowaną lub uwrażliwioną emisję FRET, wkłady przepuszczania i wzbudzania krzyżowego odejmuje się od surowego sygnału FRET w następujący sposób:

Emisja FRET z wrażliwością = Surowa emisja FRET - przepuszczanie - wzbudzenie krzyżowe

Współczynniki korekcji dla przepuszczania i wzbudzenia krzyżowego są określane przez obrazowanie roślin ekspresujących CFP lub cpVenus indywidualnie w tych samych miejscach komórkowych i subkomórkowych co biosensor18. Następnie oblicza się emisję z uwrażliwionym FRET w następujący sposób:

Emisja FRET z uwrażliwieniem = Surowa emisja FRET - (emisja CFP × współczynnik korekcji przepuszczenia) - (współczynnik korekcji emisji cpVenus × współczynnik korekcji wzbudzenia krzyżowego)

Stosunek wrażliwej emisji FRET do emisji dawcy (FRET ratio) raportuje względne zmiany stężenia ligandów i jest niezależny od poziomów ekspresji biosensorów19.

Biosensor cpFLIPPi-5,3m został z powodzeniem skierowany na odrębne podkomórkowe przedziały A. thaliana i innych gatunków, umożliwiając wizualizację dynamiki Pi 18,20,21,22. Ten biosensor wykazał heterogeniczność w rozkładzie i transporcie Pi cytosolowym między tkankami oraz powiązał fluktuacje stromalnych Pi chloroplastów z aktywnością transportera i wydajnością fotosyntezy20,21. Ponieważ biosensor raportuje zmiany w określonym zakresie dynamicznym, interpretacja wymaga, aby zakres obejmował poziomy Pi in vivo w warunkach stabilnych obrazowania. Nierówne oświetlenie lub bardzo niska obfitość biosensorów mogą wpływać na pomiary proporcjonalne, podkreślając znaczenie standaryzowanych ustawień akwizycji i odpowiednich negatywnych kontroli, takich jak czujnik sterowania Piinsensitive control 20. Gdy zmienność współczynnika FRET między obszarami zainteresowania (ROI) jest minimalna, analiza regresji może nie być odpowiednia, dlatego zaleca się łączenie średnich ROI.

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ilościowej analizy ratiometrycznej cpFLIPPi-5,3m w A. thaliana, w tym obrazowanie konfokalne, segmentację obrazów z użyciem masek binarnych oraz obliczenia współczynników FRET do dynamicznego monitorowania Pi w komórkach żywych. Metoda ta zapewnia powtarzalny przepływ pracy do analizy sygnałów biosensorowych opartych na FRET, z analizą danych ratiometrycznych za pomocą regresji liniowej i porównań statystycznych w warunkach eksperymentalnych. Reprezentatywne dane przedstawiono na podstawie zmodyfikowanej akumulacji Pi ze stromy chloroplastów w pht2; 1, mutant transportera chloroplastu Pi ekspresujący sensor cpFLIPPi-5,3m 21,23. Protokół ten pomoże naukowcom zastosować obrazowanie ratiometryczne oparte na FRET w innych systemach eksperymentalnych, szczegółowo opisując korekty spektralne biosensorów, ustawienia obrazowania oraz kroki analizy ilościowej. Dzięki standaryzacji akwizycji obrazów i analizy regresyjnej w określonych kontekstach eksperymentalnych, workflow umożliwia spójne porównanie odpowiedzi FRET między próbkami analizowanymi w dopasowanych warunkach. Jest odpowiedni dla osób chcących mierzyć szybkie i specyficzne dla przedziału zmiany poziomu analitów w żywych tkankach roślinnych, w tym mutantów lub linii transgenicznych z zmienionym transportem lub metabolizmem metabolitów. To ustandaryzowane podejście ułatwi powtarzalność ilościowych badań obrazowania żywych komórek w biologii roślin. Oprócz opisanego tutaj biosensoru Pi zlokalizowanego przez chloroplast, strategia analityczna może być dostosowana do innych biosensorów opartych na FRET oraz tkanek specyficznych dla organizmu, pod warunkiem ustanowienia kalibracji i kontroli specyficznych dla biosensorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wcześniej wygenerowano linie transgeniczne Arabidopsis wyrażające cpFLIPPi-5,3m i cpFLIPPi-null (warianty cytosolowe i ukierunkowane na plastydy), które zostały wygenerowanewcześniej 17,18 oraz pht2; 1-1 (CS19883) uzyskano z Arabidopsis Biological Resource Center, medium MS, okulary osłonowe, perfluorodekalina, mikroskop konfokalny oraz obiektyw immersyjny 40x (apertura numeryczna 1.3), lasery wzbudzające (CFP/445 nm i cpVenus/515 nm lub odpowiednie dla instrumentu długości fal emisyjnych), filtry emisyjne dla CFP, cpVenus/FRET i akceptora cpVenus, kamery lub detektory, stanowisko analityczne, FIJI24 oraz Excel.

1 . Przygotowanie próbki

  1. Generowanie transgenicznych linii A. thaliana
    1. Sklonuj biosensor cpFLIPPi-5,3m oraz kontrolę bezwrażliwą na Pi (cpFLIPPi-Null), tylko dawcę (CFP) oraz akceptorową (cpVenus) do wektorów ekspresji roślin17.
    2. Aby uzyskać stabilną ekspresję, przekształcić rośliny A. thaliana w tle mutantów sgs3-13 za pomocą roślinnego dipu Agrobacterium tumefaciens , zebrać nasiona T1 i wybrać transformanty na 0,5x płytach agarowych Murashige & Skoog (MS) zawierających odpowiedni środek selekcyjny, np. fosfinofrycynę (10 μg/mL).
    3. Sterylizuj nasiona A. thaliana wydzielające biosensory, zanurzając je w 70% etanolu na 1 minutę, następnie przelewaj do wybielacza 50% na 1 minutę, a następnie przepłukuj 6-10 razy sterylną wodą.
      UWAGA: Etanol i wybielacz są drażniącymi i należy je obchodzić się z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej (PPE). Sterylizacja nasion należy przeprowadzić w chemicznym okapie lub dobrze wentylowanym miejscu, aby uniknąć wdychania oparów i nigdy nie mieszaj wybielacza bezpośrednio z etanolem. Utylizacja roztworów odpadów zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa chemicznego instytucji.
    4. Stratyfikuj nasiona w temperaturze 4°C w ciemności przez 2-3 dni, aby zsynchronizować kiełkowanie, następnie przenieś nasiona do agaru zastygłego lub płynnego medium o stężeniu 0,5x MS zawierającym 0,25% sacharozy i pożądane stężenie Pi (250 μM) do projektu eksperymentalnego. Uwzględnij agenta selekcji, jeśli wybierasz transformanty.
    5. Przenieś płytki do kontrolowanej komory wzrostu ustawionej na 21°C, 16 godzin światła: 8 godzin ciemnego fotocyklu, natężenie światła 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ oraz ~60% wilgotności względnej. Uprawiaj siewki przez 4-7 dni, aby odtworzyć korzenie lub przenieść sadzonki do ziemi na 21 dni, aby naobrazować liście.
    6. W przypadku testowania terapii Pi przenieś siewki do pożądanego podłoża Pi (np. 250 μM Pi dla Pi refille; 10 μM Pi dla Pi-deficytowanych) i utrzymuj leczenie przez określony czas (np. 48 h przy ostrym niedoborze Pi).
    7. Jeśli to możliwe, przesiewaj badania pod kątem odpowiedniej ekspresji sensorów poprzez obrazowanie pod kątem fluorescencji dawcy lub akceptora (wzbudzenie o niskiej intensywności) za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie 7-10x).
    8. Ocena linii w tym samym tle genetycznym, które wyrażają cpFLIPPi-null, jako grupy kontrolne niewrażliwe na ligand.

2 . Obrazowanie konfokalne

  1. Jeśli chodzi o korzenie, montuj siewki w ich podłożu/sterylnej wodzie na szklanym podkładce. Delikatnie nałóż mały pokrywak, aby spłaszczyć korzenie bez uciskania. Obraz natychmiast.
  2. Dla liści wyciąć docelowy liść (np. trzeci lub czwarty liść u roślin mających 21 dni), umieścić powierzchnię adaksialną w szkiełku.
  3. Infiltruj 10-15 μL perfluorodekaliny, aby oczyścić przestrzeń powietrzną, jeśli to konieczne, i delikatnie nałóż mały szklany ciężarek, aby spłaszczyć próbkę. Obraz natychmiast.
  4. Użyj obiektywu o wysokiej zawartości NA, odpowiedniego dla żywych komórek (np. 40× / 1,2-1,3 NA). Używaj tego samego celu dla wszystkich próbek, aby zachować porównywalność.
  5. Za pomocą oprogramowania Metamorph ustaw kanały wzbudzenia i emisji oraz rejestruj obrazy (Rysunek 1).
    UWAGA: Do przechwytywania emisji dawcy (CFP): można zastosować wzbudzenie przy ~445 nm (lub odpowiednia dla instrumentu linia CFP) oraz zbieranie emisji dawcy (np. pasmo 470-500 nm). Na przykład wzbudzenie lasera 445 nm przy 70% (rysunek 1A) z czasem ekspozycji 1000 ms (rysunek 1B) zostało użyte do rejestrowania emisji CFP. Do wychwytywania FRET (emisji akceptora wrażliwej): wzbudzenie przy długości fali dawcy (445 nm) oraz zbieranie pasma emisji akceptora (np. 530-560 nm). Do przechwytywania kanału akceptora bezpośredniego: wzbudzenie przy wzbudzeniu akceptora (np. 500-515 nm) oraz zbieranie tego samego pasma emisji akceptora co dla FRET.
  6. Pobieraj zdjęcia sekwencyjnie: rejestruj pobudzenie/emisję dawcy, wzbudzanie dawcy/emisję FRET, a następnie wzbudzanie akceptora/emisję akceptorową. Czas obrazowania na polu jest krótki, aby ograniczyć fotobielenie (500-1000 ms).
    UWAGA: Dla każdej lokalizacji komórkowej (cytosol korzeniowy, cytosol mezofylowy liścia, stroma chloroplastów) określ optymalną moc lasera, wzmocnienie detektora i czas ekspozycji (Rysunek 1) tak, aby średnie intensywności pikseli były powyżej lokalnego tła, ale poniżej nasycenia detektora. Utrzymuj identyczne ustawienia przechwytu dla kanałów pochodzących z wzbudzenia donora (dawca i FRET) dla danego miejsca. Parametry obrazowania zależą od próbki, mikroskopu, źródła światła i systemu detekcji, dlatego muszą być określane empirycznie, a akceptowalne zakresy są oceniane i dokumentowane za pomocą analizy regresji opisanej w tym protokole. Oprogramowanie do przechwytywania obrazu używane tutaj to Metamorph w wersji 7.
  7. Użyj tej samej czułości detektora (na przykład tutaj wzmocnienie 2,4x i zerowe przesunięcie) na wszystkich obrazach dla lokalizacji celu. Jeśli używasz wielu detektorów, scharakteryzuj odpowiedzi spektralne dla każdego detektora i dokumentuj je.
  8. Zrób zdjęcia kontrolne dla każdego interesującego tkanki/genotypu.
    1. Obrazuj nieprzekształconą tkankę dzikiego typu, aby określić autofluorescencję tła dla każdego kanału.
    2. Zakłady obrazowe wyrażające tylko dawcę (CFP) i akceptor-only (cpVenus) na tych samych ustawieniach przechwytu dla każdej lokalizacji, aby wyprowadzić współczynniki korekty spektralnej (przepuszczanie i wzbudzanie krzyżowe). Rejestruj zdjęcia wielu osób (≥6-8) o różnych intensywnościach emisji.

3 . Przetwarzanie obrazu

  1. Otwórz surowe obrazy kanałów dawcy (określanego jako CC dla wzbudzenia/emisji dawcy), FRET (określanego jako CY dla wzbudzenia/emisji akceptora przez dawcę) oraz akceptora (określanego jako YY dla wzbudzania/emisji akceptorów) w programach analitycznych, takich jak FIJI lub ImageJ. (Rysunek 2).
  2. Określ średnią intensywność tła na kanał poprzez pobieranie próbek wielokrotnych (5-10) zwrotów z inwestycji w równoważnych miejscach z nieprzekształconych roślin obrazowanych przy tych samych ustawieniach. Odejmij średnią wartość tła od każdego odpowiadającego mu obrazu kanału.
  3. Kroki do podjęcia na FIDŻI
    1. Kliknij zakładkę Analizuj> Ustaw pomiary > Wybierz średnią wartość szarości. Mierz intensywność tła, wybierając konkretny zwrot z inwestycji lub średnią całego obrazu.
    2. Kliknij zakładkę Analizuj> Mierz. Zapisz wartości w arkuszu Excel i oblicz średnie wartości tła dla każdego kanału. Próg obrazu dawcy (CFP), aby zdefiniować przestrzenną granicę biosensora (dawca zazwyczaj ma najniższy sygnał). Przekonwertuj obraz donora z progiem na maskę binarną (Rysunek 3 A).
    3. Kliknij na kartę obrazu> Dostosuj> próg.
    4. Otworzy się okno na prog. Wybierz metodę maksymalnej entropii do progowania. Ustal granicę przestrzenną, w tym przypadku stroma chloroplastowego, i zastosuj próg. Generuje to czarno-biały obraz binarny (Rysunek 3 B).
    5. Kliknij zakładkę Matematyka> Podziel> Wpisz wartość 255. Obraz stanie się całkowicie biały. Zapisz ten obraz maski binarnej jako plik .tiff.
    6. Pomnóż maskę binarną ze wszystkimi trzema obrazami odejmowanymi przez tło, aby uzyskać obrazy maskowane do analizy (Rysunek 3C).
    7. Otwórz plik maski binarnej na FIJI.
    8. Kliknij na zakładkę Proces> Matematyka>Mnożenie.
    9. Wybierz maskę binarną jako jeden z obrazów, a obraz CC bez tła jako drugi.
    10. Powtórz kroki dla CY i YY.
    11. Na obrazach maskowanych należy narysować ROI odpowiednie dla badanej struktury (cała komórka, cytosol, stromal chloroplastów). Dla każdego zwrotu z inwestycji wyodrębnić średnie intensywności pikseli dla kanałów dawcy, FRET i bezpośredniego akceptora. Zachowaj metadane ROI (nazwa obrazu, współrzędne, stan eksperymentalny, replikuj ID) do dalszej analizy statystycznej.
    12. Otwórz obrazy CC, CY i YY.
    13. Kliknij na zakładkę Matematyka> Odjęć> Wpisz wartość tła średniego. Alternatywnie, można to zrobić tuż przed obliczeniem wrażliwego FRET w Excelu.
    14. Otwórz plik CC z maską.
    15. Kliknij na zakładkę Proces > kalkulator obrazu. Pomnóż CC z maskowanym plikiem obrazu CC. To otworzy nowy 32-bitowy plik obrazu.
    16. Rysuj zwroty z inwestycji za pomocą odpowiednich narzędzi FIJI na głównym pasku zadań. Na przykład tutaj chloroplastowy stroma jest wybierany za pomocą narzędzia "Oval" ROI. Dodaj zwroty z inwestycji do menedżera ROI (ctrl+T). Wybierz 5-10 zwrotów z inwestycji na obraz. Sprawdź "Pokaż wszystko". Te zwroty z inwestycji mogą być przechowywane jako osobny metaplik (rysunek 3D). Nie zamykaj menedżera ROI.
    17. Kliknij zakładkę Analizuj> Ustaw pomiary> Wybierz średnią wartość szarości.
    18. Kliknij "Mierz" w menedżerze ROI.
    19. Średnie wartości pikseli wybranych ROI pojawią się jako lista w osobnym oknie.
    20. Skopiuj te dane do Excela. Nie zamykaj menedżera ROI.
    21. Powtórz mnożenie zamaskowanego pliku CC z obrazami CY i YY, aby uzyskać pomiary tych samych ROI za pomocą menedżera ROI w każdym pojedynczym kanale. Zapisz wartości w Excelu.

4. Analiza ratiometryczna

  1. Otwórz Microsoft Excel, aby wykonać następujące operacje (Rysunek 4).
  2. Obliczanie współczynników korekcyjnych.
    1. Dla każdej lokalizacji komórkowej wykreśl intensywności kanału FRET (oś Y) z roślin tylko dawcy w porównaniu z intensywnością dawcy (oś X). Dopasuj regresję liniową. Nachylenie to współczynnik przepuszczania przez dawcę (oznaczony jako a).
    2. Powtórz, wyznaczając intensywności kanału FRET z roślin akceptorowych (oś Y) względem intensywności akceptora bezpośredniego (oś X). Nachylenie to współczynnik wzbudzenia poprzecznego akceptora (oznaczony jako b).
    3. Wykorzystaj zwrot z inwestycji ≥15-20 z wielu zakładów, aby uzyskać solidne współczynniki. Dla stromy chloroplastów wybiera się 50-60 chloroplastów.
  3. Oblicz wrażliwy FRET dla każdego ROI jako
    Wrażliwy FRET = Surowy FRET - ( dawca ×) - (akceptor ×)
    gdzie a i b są współczynnikami specyficznymi dla lokalizacji wyprowadzonymi powyżej (Rysunek 4).
  4. Wykres wrażliwy FRET (oś Y) vs. intensywności kanału dawcy (oś X) dla łączonych zwrotów z inwestycji. Dopasowując regresję liniową, Excel zapewni dopasowanie w formacie y = mx + c, gdzie y odpowiada wrażliwym intensywnościom FRET, x intensywności dawcy, c przecięciu y, a m nachyleniu regresji. Zwróć uwagę na R² dla regresji dopasowanych. Zazwyczaj R² mieści się w zakresie od 0,8 do 1, co reprezentuje dobre dopasowanie (Rysunek 4).
  5. Do pomiarów cytosolowych i stromalnych obliczaj i używaj nachylenia FRET/dawca (Sensytyzowany FRET ÷ dawca) jako odczytu ratiometrycznego, zwanego także współczynnikiem FRET.
    UWAGA: Błąd dopasowania regresji reprezentuje standardowy błąd nachylenia (użyj funkcji LINEST w Excelu). Stosuj konsekwentny wybór lokalizacyjny w różnych próbkach i genotypach zainteresowania. Regresja liniowa zastosowana do danych z wielu ROI i niezależnych zakładów potwierdza, że współczynnik FRET jest niezależny od obfitości czujników.
  6. Kalibracja, kontrola i rozróżnianie efektów niespecyficznych.
    1. Użyj cpFLIPPi-null (wariant niewrażliwy na ligand) wyrażanego równolegle i przetwarzanego identycznie, aby odróżnić potencjalne niespecyficzne zmiany stosunku FRET (pH, siła jonowa, fotofizyka) od zmian specyficznych dla Pi.
    2. Zagreguj dane na poziomie ROI z polami: genotyp, przedział, replikowany ID ROŚLINY, ROI ID, dawca, akceptor, surowy FRET, uwrażliwiony FRET, stosunek dopasowania (w zależności od zastosowania). Zachowaj surowe intensywności.
    3. Do porównań populacji używaj nachyleń pochodzących z regresji jako statystyki podstawowej; raportuj nachylenia ± SE i procentowy błąd względny.
    4. Stosuj odpowiednie statystyki wnioskowe (np. test Student's t lub ANOVA) do parametrów pochodzących z regresji. Stosuj testy nieparametryczne, jeśli rozkłady naruszają normalność. Poprawiaj wielokrotne porównania, jeśli to możliwe.
  7. Lista kontrolna kontroli jakości (przed zaakceptowaniem danych)
    1. Potwierdź, że wszystkie trzy kanały dla każdego obrazu są poniżej nasycenia detektora i mają odpowiedni stosunek sygnału do szumu (>2-10x tło).
    2. Potwierdź, że kontrolne dawki dawcy i akceptorów pojedynczych fluoroforów zostały zobrazowane na identycznych ustawieniach i uzyskały liniowe zależności do wyprowadzenia współczynników korekcyjnych a i b.
    3. Potwierdzaj, że rejestracja obrazów jest poprawna oraz że maski poprawnie definiują obszary zawierające biosensory.
    4. Potwierdź, że kontrola cpFLIPPi-null pokazuje oczekiwany brak czułości na Pi.
  8. Reprezentatywne metryki kontroli jakości ułatwiające wykluczanie obrazów
    1. Wskaźnik nasycenia: Mniej niż 1-2% pikseli osiąga maksymalną intensywność (65 535) dla obrazów 16-bitowych.
    2. Poziom tła: Średnia intensywność w obszarach wolnych komórek waha się od ~50 do 200 jednostek.
    3. Zakres intensywności pikseli: Średnie intensywności są znacznie powyżej tła, ale pozostają poniżej nasycenia (~2 000-20 000 jednostek).
    4. Stosunek sygnału do szumu (SNR): Wartości powinny przekraczać 2-10.

5. Test statystyczny różnicy między dwoma nachyleniami regresji

  1. Określić, czy dwa nachylenia (stosunek FRET pochodzący z regresji z dwóch genotypów lub terapii) różnią się istotnie25.
  2. Oblicz statystykę testową i stopnie swobody w następujący sposób
    figure-protocol-1
    z stopniami swobody df = n1 + n2 - 4. m1 i m2 odpowiadają nachyleniom regresji liniowej, sb1 i sb2 odnoszą się do błędu standardowego każdego nachylenia (uzyskanego z LINEST lub wyjścia regresji), a n1 i n 2 to rozmiary próbek (liczba zwrotów z inwestycji używanych do dopasowania każdej regresji).
  3. Uzyskaj dwustronną wartość p dla t z df (np. użyj tabeli rozkładu t lub kalkulatora online26). Korzystając z kalkulatora online (Rysunek 5C), wprowadź sb1 i s b2 oraz n1 i n2 uzyskane w poprzednim kroku, aby obliczyć wartość p i statystyki testowe.
  4. Interpretacja będzie taka, że odrzuci hipotezę zerową (nachylenia nie różnią się istotnie), jeśli p < α (np. α = 0,05). Raport b1, b2, sb1, sb2, t, df i p.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazowanie konfokalne

Za pomocą mikroskopii konfokalnej i oprogramowania Metamorph uzyskano oddzielne kanały do wizualizacji sygnałów dawcy i akceptora FRET w tkankach liści A. thaliana typu dzikiego (WT) oraz pht2; 1 mutant transportera chloroplastu Pi (Rysunek 2). Reprezentatywne obrazy ilustrują wyraźną podkomórkową lokalizację biosensora Pi, gdzie chloroplasty można łatwo rozróżnić nie tylko w obrębie poszczególnych komórek,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia ustandaryzowane podejście do ilościowej identyfikacji metabolitów lub jonów w żywych komórkach z wykorzystaniem biosensorów opartych na FRET. Kluczowe zalety obejmują nieinwazyjne pomiary proporcjonalne oraz zastosowanie w wielu przedziałach podkomórkowych 17,20,21,22. Zastosowanie masek binarnych i regresji liniowej poprawia precyzję i powtarzalność. Choć tutaj zademonstr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów związanych z tą pracą.

Podziękowania

Doceniamy wkład byłych członków laboratorium W.K.V., których wysiłki wspierały rozwój tego protokołu. Wsparcie finansowe zapewniły Departament Energii USA, Biuro Nauki, Program Technologii Bioobrazowania (DE-SC0014037) oraz Podstawowe Nauki Energetyczne (DE-FG02-04ER15559). A.S.R. było częściowo wspierane przez fundusze Hagler Institute for Advanced Study, Texas A&M University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
40X obiektyw do zanurzenia olejowego Olympushttps://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4PSoczewka obiektywna do obrazowania 
Okulary okładkowe / okładkiVWR48393-081Listew do umieszczania próbki
FIJI (ImageJ)Open source2.9.0Oprogramowanie do analizy obrazów
Odwrócony mikroskop Olympus IX81Olympushttp://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdfSystem obrazowania konfokalnego
iXon3 897 kamera EMCCD Technologia Andorhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897Część systemu obrazowania konfokalnego
Oprogramowanie MetaMorph V7Urządzenia molekularne. LLCWersja 7Stacja robocza analizy obrazu
Microsoft Excel & nbsp;Microsoft Suitev16.68Oprogramowanie do analizy danych
Murashige & Skoog (MS) średnio KaissonMSP11-10LTPodłoże roślinne
Perfluorodekalina (Acros Organic)Acros OrganicsP9900-25GMedium obrazujące
FosfinotrycynaSigma77182-82-2Antybiotyk
Komora wzrostu roślinConvironZwyczajKomora wzrostu
Koncentracja konfokalna obrotowa dysku Yokogawa CSU-X1Yokogawahttps://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/Część systemu obrazowania konfokalnego

Bibliografia

  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
  2. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
  3. Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation. Nat Communications. 9 (1), 2136(2018).
  4. Plaxton, W. C., Tran, H. T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants. Plant Physiol. 156 (3), 1006-1015 (2011).
  5. Mimura, T. Regulation of phosphate transport and homeostasis in plant cells. Int. Rev. Cytol. 191, 149-200 (1999).
  6. Roberts, J. K., Wemmer, D., Ray, P. M., Jardetzky, O. Regulation of cytoplasmic and vacuolar pH in maize root tips under different experimental conditions. Plant Physiol. 69 (6), 1344-1347 (1982).
  7. Gerhardt, R., Heldt, H. W. Measurement of subcellular metabolite levels in leaves by fractionation of freeze-stopped material in nonaqueous media. Plant Physiol. 75, 542-547 (1984).
  8. Farquhar, G. D., Caemmerer, S. V., Berry, J. A. A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta. 149 (1), 78-90 (1980).
  9. Deuschle, K., Chaudhuri, B., Okumoto, S., Lager, I., Lalonde, S., Frommer, W. B. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18 (9), 2314-2325 (2006).
  10. Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-capacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol Cell Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
  11. Imamura, H., Nhat, K. P. H., Togowa, H., Noji, H. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  12. Lanquar, V., Grossman, G., Vinkenborg, J. L., Merkx, M., Thomine, S., Frommer, W. B. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytol. 202 (1), 198-208 (2014).
  13. Sadoine, M., De Michele, R., Župunski, M., Grossmann, G., Castro-Rodríguez, V. Monitoring nutrients in plants with genetically encoded sensors: achievements and perspectives. Plant Physiol. (1), 195-216 (2023).
  14. Tagliani, A. AuxSens, a FRET-based auxin biosensor. Mol Plant. 14 (7), 1051-1052 (2021).
  15. Rowe, J., Grangé-Guermente, M., Exposito-Rodriguez, M. Next-generation ABACUS biosensors reveal cellular ABA dynamics driving root growth at low aerial humidity. Nat Plants. 9 (7), 1103-1115 (2023).
  16. Rowe, J. H., Rizza, A., Jones, A. M. Quantifying Phytohormones in vivo with FRET Biosensors and the FRETENATOR Analysis Toolset. Meth Mol Biol. 2494, 239-253 (2022).
  17. Mukherjee, P., Banerjee, S., Wheeler, A., Ratliff, L. A., Irigoyen, S., Garcia, L. R., Lockless, S. W., Versaw, W. K. Live imaging of inorganic phosphate in plants with cellular and subcellular resolution. Plant Physiol. 167 (3), 628-638 (2015).
  18. Banerjee, S., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Quantitative imaging of FRET-based sensors for cell and organelle-specifc analyses in plants. Microsc Microanal. 22, 300-310 (2016).
  19. Xia, Z., Liu, Y. Reliable and global measurement of fluorescence resonance energy transfer using fluorescence microscopes. Biophys J. 81 (4), 2395-2402 (2001).
  20. Sahu, A., Banerjee, S., Raju, A. S., Chiou, T., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Spatial profiles of phosphate in roots indicate developmental control of uptake, recycling, and sequestration. Plant Physiol. 184 (4), 2064-2077 (2020).
  21. Raju, A. S., Kramer, D. M., Versaw, W. K. Genetically manipulated chloroplast stromal phosphate levels alter photosynthetic efficiency. Plant Physiol. 196 (1), 385-396 (2024).
  22. Zhang, S., Daniels, D. A., Ivanov, S., Jurgensen, L., Müller, L. M., Versaw, W. K., Harrison, M. J. A genetically encoded biosensor reveals spatiotemporal variation in cellular phosphate content in Brachypodium distachyon mycorrhizal roots. New Phytol. 234 (5), 1817-1831 (2022).
  23. Versaw, W. K., Harrison, M. J. A chloroplast phosphate transporter, PHT2;1, influences allocation of phosphate within the plant and phosphate-starvation responses. Plant Cell. 14 (8), 1751-1766 (2002).
  24. Schindelin, J., Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Cohen, J. Applied multiple regression/correlation analysis for the behavioral sciences. , https://psycnet.apa.org/record/2002-18109-000 (2003).
  26. Soper, D. S. Significance of the difference between two slopes calculator. , https://www.danielsoper.com/statcalc (2025).
  27. Castellani, C. M., Torres-Ocampo, A. P., Breffke, J., White, A. B., Chambers, J. J., Stratton, M. M., Maresca, T. J. Live-cell FLIM-FRET using a commercially available system. Meth Cell Biol. 158, 63-89 (2020).
  28. Kanno, S., Cuyas, L., Javot, H., Bligny, R., Gout, E., Dartevelle, T., Hanchi, M., Nakanishi, T. M., Thibaud, M. C., Nussaume, L. Performance and limitations of phosphate quantification: guidelines for plant biologists. Plant and Cell Physiol. 57 (4), 690-706 (2016).
  29. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: principle applications recent advances and challenges. Diagnostics. 13 (8), 1375(2023).
  30. Banerjee, S., Versaw, W. K., Garcia, L. R. Imaging cellular inorganic phosphate in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded FRET-based biosensor. PLoS One. 10 (10), e0141128(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biosensory FRETobrazowanie ywych kom rekmikroskopia konfokalnaanaliza regresjipomiar fosforanu nieorganicznegostroma chloroplast wilo ciowe oznaczanie metabolit w
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.