Zintegrowana mikropłytka i strategia HPTLC do określania i profilowania całkowitych fenolików i flawonolów w ekstraktach skórek cytrusowych

Podsumowanie

Niniejsze badanie przedstawia połączone podejście AlCl₃/Folin–Ciocalteu do profilowania HPTLC i ilościowego określenia flawonoli/5-hydroksyflawonów oraz związków fenolowych w skórkach cytrusowych, uzupełnione analizą mikropłyt.

Streszczenie

Związki fenolowe i flawonoidy znacząco przyczyniają się do aktywności antyoksydacyjnej i funkcjonalnej wartości produktów ubocznych cytrusów. Jednak konwencjonalne testy kolorymetryczne, choć szeroko stosowane, nie wykazują separacji chromatograficznej i mogą być podatne na zakłócenia chemiczne. Protokół ten oferuje zintegrowany proces analityczny łączący mikropłytkowe spektrofotometryczne testy z wysokowydajną chromatografią cienkowarstwową (HPTLC) w celu określenia i profilowania całkowitej zawartości fenolowej (TPC) oraz całkowitej zawartości flawonolów oraz zawartości 5 hydroksyflawonów (TFHC) w ekstraktach ze skórek cytrusów. Ekstrakty etanolowe skórek wapna (Citrus aurantifolia) i mandarynki (Citrus reticulata) oceniono za pomocą testów Folin–Ciocalteu (FC) i chlorku glinu (AlCl₃) w formacie mikropłytkowym z 96 dołków, a następnie przeprowadzono analizę HPTLC z wykorzystaniem dwóch kolejnych faz mobilnych oraz podwójnej derwatyzacji postchromatograficznej. Pomiary mikropłyt wykazały wartości TPC 74,2 mmol/g dla wapna i 72,8 mmol/g dla mandarynki, podczas gdy wartości TFHC wynosiły odpowiednio 15,5 mmol/g i 6,0 mmol/g. Separacja HPTLC rozwiązała cztery pasma fenolowe w wapnie i sześć w mandarynie. Po derytaczacji AlCl₃ wybiórczo zobrazowano dwa pasma wapnia, zgodne z flawonolami lub 5-hydroksyflawonami. Suma badów fenolowych szacowana przez HPTLC wynosiła odpowiednio 22,0 i 20,8 mmol/g suchej materii dla wapna i mandarynki, podczas gdy TFHC osiągnęła 13,4 mmol/g w wapnie i nie została wykryta w mandarynce. Wyniki te pokazują, że testy mikropłytowe umożliwiają szybkie i czułe oszacowanie całkowitej zawartości, podczas gdy HPTLC zwiększa selektywność poprzez separację związków i specyficzną dla grupy funkcjonalnej deriwatyzację. Połączona strategia umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie, a następnie potwierdzenie chromatograficzne, oferując praktyczną i powtarzalną platformę do charakteryzacji fitochemicznej złożonych macierzy roślinnych.

Wprowadzenie

Skórki cytrusowe są produktem ubocznym przemysłu sokowego i wykazały obecność związków funkcjonalnych, takich jak antyoksydanty¹. Były stosowane jako produkty neuroprotekcyjne², przeciwzapalne, przeciwtrądzikowe 3 oraz dodatki do żywności⁴. Kilka z tych bioaktywności przypisuje się flawonoidom⁵, a związkom fenolowym⁶. W literaturze ustalono ogólne metody szacowania całkowitej ilości flawonoidów i fenoli, z których najczęściej stosuje się Folin-Ciocalteu dla całkowitej zawartości fenolowej (TPC)⁸ oraz chlorek glinu dla całkowitych związków flawonoidowych (TFC)⁹ za pomocą spektrofotometrii. Metoda Folin-Ciocalteau została po raz pierwszy opublikowana w 1927 roku¹⁰, oparta na modyfikacji reakcji Folin-Denis¹¹, obie oparte na reakcji redoksowej związków fosfotungstycznych i fosfomolibdowych. Metoda Folin-Ciocalteau mierzy zdolność redukcyjną związków fenolowych¹². Test chlorku glinu i flawonoidów został po raz pierwszy zaproponowany w 1960 roku, oparty na kompleksach między ligandami metalu i flawonoidów¹³.

Oba testy spektrofotometryczne są użytecznymi narzędziami do szacowania i porównywania ogólnej zawartości fitozwiązków powszechnie występujących w materiałach roślinnych. Jednak podlegają różnym ograniczeniom. Na przykład pewne ograniczenia wynikają z zastosowania zewnętrznych standardów¹⁴, gdzie zazwyczaj zakłada się, że chemiczny charakter normy nie wpływa znacząco na odpowiedź sygnału. W praktyce to założenie jest trudne do zweryfikowania, ponieważ absorpcja molowa zależy od takich czynników jak sprzężenie i inne cechy strukturalne, które trudno jest ustandaryzować w produktach naturalnych. Na przykład Appel i in.¹⁵ ocenili TPC na jedenastu gatunkach dębu i opracowali tzw. podejście "samostandardowe", raportując różnice powyżej 50% w nachyleniu krzywych kalibracyjnych. Samostandardowe wykorzystanie to strategia mająca na celu oddanie tej samej mieszaniny składowej związków, co obecna w próbce, co zapewnia bliższe dopasowanie do rzeczywistej całkowitej zawartości fenolowej (TPC) w próbce¹⁶. Standardy własne dostarczają również pewnych informacji o stosunku grup reaktywnych do średniej masy cząsteczkowej; jednak jest to żmudne i trudne do standaryzacji.

Całkowity test związków flawonoidowych oparty na kompleksacji chlorku glinu został krytycznie oceniony w najnowszych badaniach^17,18, które wykazały, że AlCl₃ tworzy kompleksy z dwoma podgrupami flawonoidów: flawonolami i 5-hydroksyflawonami. Zazwyczaj flawonole wykazują maksymalną absorpcję około 440 nm, podczas gdy 5-hydroksyflawony absorbują około 415 nm. Ponadto niektóre flawonoidy mogą wykazywać wewnętrzne absorbancję w zakresie 415–440 nm nawet bez deriwatyzacji, a wzrost absorpcji w wyniku złożenia różni się w zależności od poszczególnych związków. Ponadto oba testy kolorymetryczne nie mają separacji, dlatego nie mogą rozróżnić różnych składników fenolowych; Choć ta cecha może być korzystna przy szacowaniu całkowitej zawartości, skutkuje ograniczoną szczegółowością. Te rozważania podkreślają potrzebę strategii analitycznej, która rozstrzyga poszczególne składniki przed detekcją kolorymetryczną, odróżniając prawdziwe odpowiedzi testu od interferencji spektralnych lub chemicznych.

Pomimo tych ograniczeń, takie testy pozostają cennym narzędziem do ogólnego badania bioaktywnych związków fenolowych w ekstraktach roślinnych i owocowych¹⁹. Aby ocenić potencjalne zakłócenia, skuteczne podejście jest zastosowanie wysokowydajnej metody chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC), która została ujawniona zarówno przy użyciu odczynników Folin–Ciocalteu, jak i AlCl₃. Separacja chromatograficzna umożliwia wykrywanie substancji interferujących z istniejącymi wcześniej pasmami absorpcyjnymi przed złożeniem, natomiast dokumentacja fotograficzna umożliwia jednoczesną analizę wielu maksimum absorpcji. Ponadto analiza HPTLC oferuje kilka zalet w porównaniu z bardziej kompleksowymi technikami chromatograficznymi, takimi jak HPLC–MS/MS, w tym niższe zużycie rozpuszczalników, krótszy czas analizy dzięki jednoczesnemu przetwarzaniu wielu próbek (do 18 na płytę)²⁰ oraz ułatwioną interpretację złożonych mieszanin dzięki selektywności derytyzacji postchromatograficznej21.

W niniejszej pracy przedstawiamy zintegrowany protokół określania konkretnych związków składających się na całkowitą zawartość polifenolową (TPC) oraz całkowitą zawartość flawonolów oraz 5-hydroksyflawony (TFHC) w ekstraktach ze skórek cytrusowych za pomocą wysokiej efektywnej separacji chromatograficznej cienkiej warstwy (HPTLC), wraz z ogólną estymacją zawartością opartą na mikropłytkowym kolorymetrycznym badaniu. Planarna chromatografia ilościowa związków fenolowych przeprowadza się za pomocą odczynnika Folin–Ciocalteu, natomiast derywacja chlorku glinu stosuje się wyłącznie do chromatograficznej identyfikacji pasm odpowiadających flawonolom i 5-hydroksyflawonom. W tym podejściu determinacja TFHC opiera się na odpowiedzi Folin–Ciocalteu związków chromatograficznie rozdzielonych i chemicznie zidentyfikowanych, a nie na kompleksacji chlorku glinu do ilościowego określenia. Analiza HPTLC umożliwia separację i wizualizację specyficzną dla związków, umożliwiając identyfikację poszczególnych składników fenolowych oraz wykrywanie potencjalnych interferencji widmowych. Ponadto przedstawiono metodę spektrofotometryczną opartą na mikropłytach do szybkiego oszacowania całkowitych TPC i TFHC, zapewniając uzupełniające narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewania dla złożonych macierzy roślin.

Protokół

1. Przygotowanie skórek owocowych

1. Usuń około 50 g skórek z każdego owocu, oddzielając je od części jadalnej. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, mandarynki kupowano w lokalnym sklepie (importowane z Chile, odmiana Isabelline), a lipki zebrano z drzewa w pobliżu San José w Kostaryce (okaz voucherowy JVR-16434).
2. Włóż oskórki do plastikowego woreczka strunowego i zamroź w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny.
3. Przełóż mrożone obierki do schłodzonej liofilizacji, trzymaj torby otwarte i przystosuj próżnię (0,1 mbar) przez noc, aż całkowicie wyschną.
4. Zmiel każdy wysuszony materiał do około 0,1 mm za pomocą młynka z ostrzami.

2. Ekstrakcja

1. Waż około 100 mg suchej, mielonej skórki cytrusów (limonki lub mandarynki) i umieść ją w szklanej tubce o pojemności 15 mL.
2. Dodaj 3 mL etanolu 60% do rurki.
3. Sonikować mieszaninę w kąpieli ultradźwiękowej przez 10 minut w temperaturze 40 °C, aby rozbić komórki roślinne i ułatwić uwalnianie fitochemikaliów.
4. Wiruj próbkę w 850 × g przez 10 minut.
5. Ostrożnie przenieś etanolowy supernatant do kolby objętościowej 10 mL za pomocą pipety Pasteura, unikając zakłóceń osadów.
6. Dodaj dodatkowe 3 mL etanolu 60% do rurki zawierającej wilgotny osad stały.
7. Powtórz kroki sonikacji i wirowania opisane powyżej w krokach 2.3 i 2.4.
8. Przelej supernatant do tej samej kolby objętościowej i połącz go z poprzednim ekstraktem.
9. Wykonaj trzecią ekstrakcję, powtarzając poprzednie kroki (2.6–2.8).
10. Zakwasuj ekstrakt połączony (≈9 mL) dwoma kroplami po 0,1 mol/L HCl (aby zwiększyć stabilność antocjanin i innych związków fenolowych) i poddaj objętość do 10 mL metanolem.
11. Wykonaj ten zabieg w trzech egzemplarzach dla każdej próbki.

3. Całkowita zawartość flawonolów i 5-hydroksyflawonów (TFHC) za pomocą mikropłytowej spektrofotometrii

1. Przygotuj roztwór zapasowy kwercetyny (100 μg/mL) lub równoważny standard flawonoidów.
   1. Waż 10 mg kwercetyny, stosując równowagę o precyzji 0,1 mg.
   2. Rozpuść kwercetynę w około 5 mL etanolu 95% i przelać roztwór do kolby objętościowej o pojemności 10 mL oznaczonej jako roztwór zapasowy.
   3. Przepłucz zlewkę dwukrotnie 2 mL etanolu 95% i dodaj płukane do kolbyki.
   4. Zrób maksymalną ilość z 60% etanolu.
   5. Przygotuj standardowe roztwory (10–100 μg/mL) i pustą naczynię w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 mL zgodnie z Tabelą 1.
   6. Upewnij się, że wszystkie próbki i standardy mieszczą się w zakresie absorpcji od 0,2 do 0,8, dostosowując stężenia w razie potrzeby.
   7. Przygotuj układ mikropłyty, dostarczając 60 μL pustego otworu, próbki lub standardu do każdego dołka zgodnie z Rysunkiem 1. Wykonaj trzy replikacje na próbkę lub standard.
   8. Roztwóry wodne zawierające 2% chlorku glinu, 5% octana sodu i 80% metanolu należy do oddzielnych zbiorników odczynników.
      UWAGA: Ostrożnie obchodz się z chlorkiem glinu i roztworami metanolu. Roztwory chlorku glinu są drażniące, a metanol jest toksyczny przez spożycie, wdychanie i wchłanianie przez skórę. Unikaj kontaktu ze skórą i wzrokami oraz noszę odpowiednie środki ochrony osobistej
   9. Używając pipety wielokanałowej z 8 kanałami, dodaj 10 μL roztworu AlCl₃, 10 μL roztworu octana sodu oraz 200 μL 80% metanolu do każdego dołku.
   10. Potrząsaj płytką z pośrednią intensywnością przez 10 sekund i inkubuj ją w ciemności przez 30 minut.
   11. Zmierz absorpcję na 415 nm. Jeśli nie jest możliwe potrząsanie, wymieszaj ręcznie mikropipetą przed inkubacją (Rysunek 2).
   12. Interpoluj wartości absorpcji próbki z krzywej kalibracyjnej i stosuj współczynniki korekcji rozcieńczania, objętości i masy w razie potrzeby.

Tabela 1: Ilości standardów kwercetyny dla całkowitej zawartości flawonolów i krzywej kalibracyjnej 5-hydroksyflawonów (TFHC). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek 1: Układ mikropłyt do analizy całkowitych flawonoli i zawartości 5-hydroksyflawonów (TFHC). (A) Schemat mikropłyt. (B) Program do układu oprogramowania Gen5. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Konfiguracja oprogramowania mikropłyt do analizy całkowitej zawartości flawonolów i 5-hydroksyflawonów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Całkowita zawartość polifenolowa (TPC) za pomocą mikropłytowej spektrofotometrii

1. Przygotuj krzywą standardową kwasu galowego (0,000–0,120 mg/mL).
   1. Waż około 0,0123 g kwasu galowego (98% czystości) przy użyciu wagi analitycznej i rozpuszczaj go w wodzie destylowanej.
   2. Przelej roztwór do kolby objętościowej 10 mL, przepłukaj dwukrotnie i napełnij do miejsca wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór bulwarowy.
   3. Przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając 1 mL roztworu bulwarowego do 10 mL wodą destylowaną.
   4. Przygotuj standardy kalibracyjne poprzez dalsze rozcieńczenie roztworu roboczego zgodnie z Tabelą 2.
   5. Dostosuj stężenia, jeśli wartości absorpcji wykraczają poza zakres 0,2–0,8.
   6. Przygotuj działający odczynnik Folin–Ciocalteu, rozcieńczając komercyjny odczynnik w stosunku 1:14 wodą destylowaną.
      UWAGA: Odczynnik Folin–Ciocalteu oraz roztwory kwasu solnego są żrące. Unikaj rozbryzgów i bezpośredniego kontaktu. Wykonaj obsługę odczynników w okapie wyparowym.
   7. Pipeta 30 μL każdej próbki, standardowej lub pustej płyty do mikropłytki z 96 dołkami zgodnie z układem na Rysunku 3A, używając trzech replikatów na próbkę.
   8. Dodaj 215 μL odczynnika roboczego Folin–Ciocalteu do każdej studni za pomocą pipety wielokanałowej.
   9. Dodaj 50 μL roztworu węglanu sodu 20% do każdego dołka i dokładnie wymieszaj mikropipetą.
   10. Inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze 40 °C z mieszaniem (Rysunek 3B).
   11. Zmierz absorpcję na poziomie 755 nm.

Tabela 2: Ilości standardów kwasu galowego dla krzywej kalibracji całkowitej zawartości fenolu (TPC). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek 3: Układ mikropłyt i konfiguracja oprogramowania do analizy całkowitej zawartości fenolowej (TPC) mikropłyt. (A) Układ. (B) Program programowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

5. Warunki ogólne stosowane do wysokiej wydajności analizy chromatografii cienkowarstwowej

1. Krzywe standardowe
   1. Przygotuj roztwory zapasowe kwercetyny i kwasu galowego (po 100 μg/mL każdy), jak opisano powyżej w sekcji 3 i 4.
   2. Stosuj kwas galowy na sześć ścieżek o objętościach 2, 4, 6, 8, 10 i 12 μL.
   3. Należy nałożyć 5 μL kwasu galowego i kwercetyny osobno na oddzielne tory identyfikacji.
2. Układ tablic:
   1. Jako fazę stacjonarną użyj płyty TLC o podłożu aluminiowym o średnicy 10 × 20 cm, żelu krzemionkowego, 60 F₂₅₄�.
   2. Ustaw parametry zastosowań następująco: pozycja Y 7,0 mm, długość pasma 6,0 mm, pierwsza pozycja X 14,0 mm, odległość między torami 9,4 mm.
   3. Nakładaj 10 μL każdego ekstraktu na pas, używając azotu jako gazu do natrysku.
   4. Ustaw odległość frontu rozpuszczalnika na 70 mm.
3. Rozwój płyty:
   1. Otworzyć płytki w ręcznej komorze zawierającej 40 mL fazy ruchomej i pozwolić na nasycenie komory 10 minut, używając papieru filtrującego w kontakcie z fazą ruchomą i ścianą komory, aby pomóc parom fazy mobilnej nasycić atmosferę komory.
   2. Wywołuj płyty używając MP1 lub MP2, wykonując podwójne wywołanie, gdy jest to wskazane. Faza Mobilna 1 (MP1), składająca się z octana etylu:kwasu mrówkowego:kwasu octowego:wody:100:11:11:26); oraz MP2 z toluenu:octanem etylu: kwasem mrówkowym (5:4:1).
      UWAGA: Wywołaj płytki HPTLC w okapie spalinowym. Składniki fazy komórkowej (octan etylu, toluen, kwas mrówkowy i kwas octowy) są lotne, a toluen i octan etylu są wysoce łatwopalne. Unikaj wdychania pary i eliminuj źródła zapłonu.
   3. Pozwól wyschnąć talerze w temperaturze pokojowej.
4. Deriwacja
   1. Płyty natryskowe z odczynnikiem Folin–Ciocalteu (300 μL odczynnika + 600 μL 50% etanolu), krótko wysusz za pomocą opalarki i spryskuj 1 mL 10% węglanu sodu w 50% etanolu.
   2. Osobno spryskuj inne płyty 1% chlorkiem glinu w 50% etanolu.
5. Płyty grzewcze równomiernie używaj opalarki, aż rozwój koloru się ustabilizuje i płyty całkowicie wyschną.

6. Opracowanie analizy całkowitej zawartości flawonolów oraz 5-hydroksyflawonów (TFHC) i całkowitej zawartości fenolowej (TPC) za pomocą wysokowydajnej chromatografii cienkowarstwowej

1. Stosuj próbki na potrójnych torach wraz z kwas galowy i kwercetyną (do identyfikacji, jak opisano w kroku 5.1.4).
2. Wypracuj płytę z użyciem MP1.
3. Wywołaj płytę ponownie za pomocą MP2.
4. Derytatuj płytę za pomocą odczynnika FC, jak opisano wcześniej.
5. Dokumentuj płytę fotodokumentacją za pomocą białego oświetlenia oraz oświetlenia UV o rozdzielczości 254 nm i 366 nm.
6. Powtórz procedurę, zastępując ostatni etap wyprowadzenia AlCl₃ , jak pokazano na Rysunku 4.

Rysunek 4: Kroki VisionCats do analizy TPC i TFHC przez HPTLC. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Warunki ekstrakcji
Ogólny protokół ekstrakcyjny opisany tutaj wykorzystuje 60% etanolu, jak wcześniej podawano,²²%. Po ekstrapolacji na inne źródła roślinne warunki ekstrakcji można optymalizować pod względem polaryzacji rozpuszczalnika oraz liczby cykli. Szczegółowe uzasadnienie wyboru zarówno rozpuszczalnika, jak i liczby cykli zostało opisane w innym miejscu¹⁶. Wybór rozpuszczalnika może być prowadzony przez wcześniejszą literaturę i indeksy polaryzacji; Ogólnie zaleca się mieszanki hydroalkoholowe etanolu lub metanolu, a także aceton. Optymalną liczbę cykli ekstrakcyjnych (n) można ocenić, dzieląc stałą całkowitą objętość 10 mL na 1–5 cykli po 10/n mL, a następnie gromadząc ekstrakty ciekłe. Następnie statystycznie porównuje się wydajność różnych liczb cykli ekstrakcyjnych, aby zidentyfikować warunek zapewniający maksymalną absorpcję w teście TPC.

Ilościowość mikropłyt i HPTLC
Standardowe krzywe kalibracyjne zarówno dla testu mikropłytkowego, jak i analizy HPTLC przedstawiono na Rysunku 5. Do określenia całkowitej zawartości fenolu (TPC) metodą mikropłyt Folin–Ciocalteu oraz dla płytek HPTLC derivatyzowanych tym samym odczynnikiem, ustalono krzywe kalibracyjne z użyciem kwasu galowego jako związku referencyjnego. Kwas galowy wybrano nie tylko dlatego, że jest jednym z najczęściej stosowanych standardów do ilościowania TPC, ale także dlatego, że może być eluowany w tych samych warunkach fazy mobilnej, co próbki wapna i mandarynki. Kwercetyna została również oceniona jako potencjalny standard do testu HPTLC; jednak okazał się nieodpowiedni dla tego układu chromatograficznego, ponieważ współeluował z frontem rozpuszczalnika i nie dało się go wiarygodnie zmierzyć. Niemniej jednak TFHC został wyznaczony na podstawie kwercetyny jako standardu odniesienia, ponieważ kwas galowy nie tworzy barwionego kompleksu z chlorkiem glinu, ponieważ nie jest ani flawonolem, ani 5-hydroksyflawonem.

Rysunek 5: Płyta HPTLC zawierająca wapno, mandarynkę, kwas galowy i kwercetynę wywoływana kolejno z MP1, następnie MP2, a oddzielnie wywożona z chlorkiem glinu (AlCl₃) i odczynnikami Folin–Ciocalteu (FC). Profil chromatograficzny po wyprowadzeniu AlCl₃ jest przedstawiony. Skróty: FC, derywacja Folin–Ciocalteu; AlCl₃, derytacja chlorku glinu; W, oświetlenie białym światłem; 366, oświetlenie UV na 366 nm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wyniki dotyczące całkowitej zawartości fenolu (TPC) oraz całkowitej zawartości flawonoidów i kwasu hydroksycynaminowego (TFHC) przedstawiono w Tabeli 3. Jak można się spodziewać, wartości TFHC były istotnie niższe niż wartości TPC, około pięciokrotnie niższe w próbkach wapna i dwanaście razy niższe w próbkach mandarynki.

Tabela 3: Wyniki dla całkowitej zawartości fenolowej mandarynki i wapna metodą mikropłytki. Skróty: Abs: absorbancja, CV: współczynnik zmienności, DF: współczynnik rozcieńczenia, GAE: równoważniki kwasu galowego, IR: niezależna replikacja, QE: ekwiwalenty kwercetyny, Rep: powtarzalność, SD: odchylenie standardowe, TFHC: całkowite flawonole i związki 5-hydroksyflawonu, TPC: całkowita zawartość fenolowa oraz średnia. *Obliczane na podstawie suchej materii. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Podobnie wyniki uzyskane z analizy HPTLC są podsumowane w Tabeli 4. Separacja chromatograficzna umożliwia wizualizację poszczególnych pasm odpowiadających odrębnym związkom. W próbkach wapna wykryto cztery składniki fenolowe, a w próbkach mandarynki sześć. Żadne z tych pasm nie spełniało współczynników retencji stosowanych standardów referencyjnych (kwas galowy i kwercetyna), co jest zgodne z oczekiwaniami.

Tabela 4: Wyniki dotyczące całkowitej zawartości fenolowej i pasm odpowiadających AlCl₃ ujawniły związki HPTLC pochodzone z AlCl₃. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4 przedstawia również całkowitą zawartość fenolową oszacowaną na podstawie analizy HPTLC, obliczaną jako suma poszczególnych związków wykrytych chromatograficznie (analogicznie do TPC). Dodatkowo tabela zawiera skumulowaną zawartość pasm przypisanych do flawonolów lub 5-hydroksyflawanów (Rf = 0,46 i 0,62 w wapnie; brak wykryty w mandarynie). Te pasma po wyprowadzeniu AlCl₃ pojawiły się żółte i wykazywały żółtawą fluorescencję pod oświetleniem UV 366 nm. Jednak przed derwatyzacją nie zaobserwowano widocznych barw, jak pokazano na Rysunku 5.

Do analizy HPTLC derytacja metodą Folin-Ciocalteu (FC) zapewnia kompleksowe wykrywanie związków fenolowych, choć mogą wystąpić drobne interferencje. Ponadto derytacja chlorku glinu (AlCl₃) selektywnie barwi podzbiór flawonoidów. Połączone zastosowanie obu odczynników poprawia standaryzację metod i łagodzi niektóre z inherentnych ograniczeń obu podejść. Co istotne, mało prawdopodobne jest, aby związek nie-flawonoidowy wykazywał zarówno charakterystyczne niebieskie zabarwienie pod FC, jak i żółto-czerwone absorbancje pod wpływem AlCl₃. Dodatkowo, istniejące wcześniej chromofory można wykluczyć jako interferencje, jeśli są widoczne o tej samej intensywności przed deriwatyzacją.

Jak pokazano na Rysunku 5, ekstrakt wapno-wapnowy wykazywał dwa pasma przy Rf 0,62 i 0,46, które nie były wykrywalne na niewywołanej płycie, ale stały się wyraźnie widoczne po derwatyzacji Folin–Ciocalteu (FC) i AlCl₃. To zachowanie potwierdza ich flawonoidalny charakter, prawdopodobnie odpowiadający neoeriocytrynie i hesperydynie²³. Dodatkowe składniki fenolowe zaobserwowano w stężeniach Rf 0,21 i 0,37 w wapnie oraz przy Rf 0,36, 0,39, 0,42, 0,46, 0,54 i 0,89 w mandarynie. Te pasma były wykrywalne po deriwatyzacji FC, ale nie po leczeniu AlCl₃, co sugeruje, że mogą odpowiadać związkom fenolowym nie-flawonoidowym. Według literatury, główne nie-flawonoidowe fenole zgłaszane w mandarynce to kwas chlorogenowy i kwas transferulowy^24,25. W wapnie inne wcześniej opisane związki to kwas kumarowy i kwas dihydroksyferulowy²³. Niemniej jednak potwierdzenie tych przydziałów wymaga analizy z dodatkowymi standardami odniesienia.

Porównanie faz mobilnych HPTLC
Obie fazy mobilne zostały opracowane jako modyfikacja wcześniej zgłaszanych systemów 26,27,28. Faza bardziej biegunowa (MP1, rysunek 6A) zapewniała lepsze rozdzielenie składników fenolowych w porównaniu do MP2. Dla porównania, mniej biegunowa faza ruchoma (MP2) (Rysunek 6B) umożliwiała jednoczesne zachowanie zarówno komponentów próbki, jak i standardów referencyjnych w tym samym przebiegu chromatograficznym. Jednak w warunkach MP2 wartości Rf składników próbki były stosunkowo niskie, a niektóre związki pozostawały blisko początku, jak pokazano na Rysunku 6. Aby rozwiązać to ograniczenie, wprowadzono podwójną procedurę wywoływania z użyciem MP1, a następnie MP2. Strategia ta zapewniła lepszą migrację i rozdzielczość składników próbki, jednocześnie umożliwiając ilościową identyfikację względem standardów kwasu galowego na tej samej płycie w identycznych warunkach chromatograficznych. Kwercetyna wykazywała delikatne żółte zabarwienie przed obejrzeniem AlCl₃, które nasiliło się po derwatyźacji. Zarówno dla ekstraktów z wapna, jak i mandarynki zaobserwowano dwa odrębne pasma, oprócz jednego pasma pozostałego u źródła. Ponadto po pochodzeniu AlCl₃ wyraźnie widoczny stał się żółty pas o wartości Rf 0,14.

Rysunek 6: Płyty HPTLC z wapnem, mandarynem, kwasem galowym i kwercetyną wywołane z fazą ruchomą 1 (A) i fazą 2 (B). Dla każdej płyty ścieżki od lewej do prawej odpowiadają: wywołanym (niepochodnym), pochodnym Folin–Ciocalteu oraz AlCl₃ derywacyjnym. Wizualizacja została wykonana pod białym światłem. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Pobieranie i przechowywanie próbek to kluczowe kroki zapewniające integralność analiz fitochemicznych. Po zebraniu próbki powinny być transportowane w warunkach chłodnych i liofilizowane tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować degradację. Podczas gdy suszone materiały biologiczne są zazwyczaj stabilne, ekstrakty w roztworze są znacznie bardziej elastyczne, nawet przechowywane w lodówce. Dlatego najlepiej oceniać analizy na świeżo przygotowanych ekstraktach. Długotrwałe przechowywanie, nawet przez kilka dni w warunkach chronionych przed zimnem i światłem lub przez kilka godzin w temperaturze pokojowej, może prowadzić do obserwowalnych zmian w profilach chromatograficznych, w tym zmian intensywności pasma i powstawania osadów. Zmiany te zazwyczaj wiążą się z przemianami chemicznymi, takimi jak utlenianie, hydroliza czy reakcje kompleksacyjne. W związku z tym wszystkie odczynniki i ekstrakty powinny być przechowywane i przetwarzane w warunkach zimnych i ciemnych, aby zachować ich stabilność chemiczną.

Porównując obie techniki (Tabela 3 i Tabela 4), widoczne są systematyczne różnice ilościowe. Zarówno w wapnie, jak i mandarynce wartości TPC uzyskane przez test mikropłytkowy były około trzykrotnie wyższe niż te oszacowane przez HPTLC. W wapnie TPC wynosiło 74,2 mmol/g na mikropłytce, podczas gdy HPTLC 22,0 mmol/g DM, podczas gdy wartości TFHC wynosiły odpowiednio 15,5 mmol/g i 13,4 mmol/g. W mandaryńskim TPC osiągnęło 72,8 mmol/g na mikropłytce, w porównaniu do 20,8 mmol/g według HPTLC. Dla TFHC metoda mikropłyt dała 6,0 mmol/g, podczas gdy HPTLC nie wykryła odpowiadających pasm.

Te rozbieżności można wyjaśnić wewnętrznymi ograniczeniami i mechanizmami odpowiedzi każdej metody. Test Folin–Ciocalteu (FC) jest znany z reakcji nie tylko ze związkami fenolowymi, ale także z różnymi substancjami redukującymi bez fenolu, w tym kwasem askorbinowym, tyrozyną, kwasem mrówkowym i kwasem octowym²⁹, a także innymi reduktorami o niskiej masie molekularnej. Takie związki przyczyniają się do ogólnego sygnału spektrofotometrycznego, co może prowadzić do przeszacowania TPC. Dodatkowo, drobne składniki fenolowe mogą łącznie zwiększać całkowite absorbowanie w testie mikropłytki, nawet jeśli ich indywidualne stężenia są zbyt niskie, by uzyskać wyraźne, ilościowe pasma w HPTLC. Niektóre małe lub bardzo polarne metabolity mogą również nie być zatrzymane, rozdzielone lub zobrazowane w stosowanych warunkach chromatograficznych.

Rysunek 7: Schematyczne przedstawienie kompleksów AlCl₃ utworzonych z flawonolów i 5-hydroksyflawonów. (A) Flawonole i (B) 5-hydroksyflawony. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Różnice metodologiczne w chemii detekcji dodatkowo przyczyniają się do obserwowanych różnic. Reakcja FC powoduje znaczny wzrost absorpcji dzięki redukcji odczynnika, co skutkuje wysoką czułością analityczną. Natomiast metoda AlCl₃ jest stosunkowo niespecyficzna i opiera się na złożonej formacji z użyciem niektórych flawonoidów. Flawonole zazwyczaj wykazują maksymalną absorpcję około 410 nm, podczas gdy 5-hydroksyflawony absorbują około 440 nm¹⁸, a ich kompleksy z Al³⁺ są przedstawione na Rysunku 7. Jednak wzrost absorpcji po złożeniu jest stosunkowo niewielki, co czyni test AlCl₃ bardziej podatnym na interferencję ze strony kolorowych składników matrycy, w tym samych flawonoidów.

Pomimo tych ograniczeń, połączone wykorzystanie derwatyzacji FC i AlCl₃ w HPTLC stanowi potężną uzupełniającą strategię w analizie fenolowej. To podejście łączy wysoką czułość reakcji FC z rozróżnieniem strukturalnym zapewnianym przez kompleksowanie AlCl₃ i separację chromatograficzną. Ponadto wiadomo, że kilka flawonolów wykazuje charakterystyczne żółtawe pasy pod oświetleniem UV³⁰, co dodatkowo wspiera klasyfikację i potwierdzenie związków.

Metody mikropłyt są szczególnie korzystne dla przesiewania wysokoprzepustowego. Wymagają minimalnego przygotowania próbki, niskiego zużycia odczynników i umożliwiają jednoczesną analizę dziesiątek próbek. W typowych warunkach laboratoryjnych pełny test mikropłytowy można wykonać w około 4 godziny, korzystając z szeroko dostępnych instrumentów. Te cechy sprawiają, że testy mikropłytkowe są wysoce odpowiednie do szybkich badań porównawczych, rutynowej kontroli jakości oraz wstępnej oceny dużych zbiorów próbek. Dla porównania, HPTLC jest bardziej czasochłonne i pracopracochłonne, a pełny proces analityczny zwykle zajmuje 7–8 godzin. Opiera się także na specjalistycznym urządzeniu, które może nie być dostępne we wszystkich laboratoriach, a zastosowanie dedykowanych płytek i odczynników derytatywnych zwiększa koszt analizy na każdą analizę. Kolejnym ograniczeniem jest to, że metabolity obecne w bardzo niskich stężeniach mogą pozostać niewykrywalne w standardowych warunkach wizualizacji. Jednak te praktyczne i związane z czułością ograniczenia są równoważone przez kluczową zaletę separacji chromatograficznej^30,31. HPTLC umożliwia rozdzielanie poszczególnych składników w złożonych macierzach roślinnych, potwierdzanie autentycznych odpowiedzi testowych oraz wykrywanie potencjalnych związków interferujących. Ponadto selektywna derwatyzacja postchromatograficzna umożliwia prostą klasyfikację związków w grupy funkcjonalne (np. flawonole i 5-hydroksyflawony), co zwiększa interpretację chemiczną wykraczającą poza szacowanie całkowitej zawartości.

W związku z tym, w badaniach na dużą skalę, proces analityczny może rozpoczynać się od testów mikropłytowych, aby szybko zidentyfikować próbki z podwyższonym poziomem związków docelowych. Wybrane próbki mogą następnie zostać poddane analizie HPTLC w celu wizualizacji poszczególnych składników, oceny selektywności oraz oceny możliwych interferencji poprzez podwójną derwaryzację. Ta zintegrowana strategia (zilustrowana na Rysunku 8) łączy szybkość i przepustowość z chemiczną specyficznością i wglądem strukturalnym.

Rysunek 8: Proponowany sposób pracy do przesiewania i analizy próbek. (A) Wysokoprzepustowe przesiewanie mikropłyt dużej partii próbek. (B) Analiza HPTLC wybranych próbek do ilościowania metodą Folin–Ciocalteu oraz identyfikacji flawonolów i 5-hydroksyflawonów za pomocą derwacji AlCl₃. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

W porównaniu z HPTLC, HPLC sprzężony z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (HPLC–HRMS) — najczęściej zgłaszaną alternatywą w literaturze — oferuje niezrównaną czułość i jednoznaczną identyfikację strukturalną poszczególnych związków³². Niemniej jednak analizy HPLC–HRMS są z natury wolniejsze, ponieważ każdy przebieg chromatograficzny musi być wykonywany sekwencyjnie, a koszty związane z instrumentacją, wymaganiami dotyczącymi czystości rozpuszczalnika oraz zużyciem rozpuszczalników. Ponadto screening klas funkcjonalnych często wymaga złożonego przetwarzania danych i interpretacji specyficznej dla związku, podczas gdy HPTLC umożliwia bezpośrednie wizualne grupowanie związków po deriwacji. W związku z tym HPTLC stanowi skuteczną platformę pośrednią pomiędzy szybkim przesiewem mikropłyt a kompleksową analizą HPLC–MS, równoważąc przepustowość, koszty i selektywność chemiczną.

Analiza flawonoidów i fenolowych ma szerokie zastosowanie w nauce o żywności, nutraceutykach, farmaceutykach, rolnictwie oraz badaniach nad materiałami. W naukach o żywności stosuje się go do oceny zdolności antyoksydacyjnej, autentyczności, okresu przydatności oraz kontroli jakości produktów takich jak soki, wina i herbaty, a także do wspierania badań agronomicznych, w tym ustalania optymalnego czasu zbiorów na podstawie dojrzałości fenolowej³³. W sektorze nutraceutycznym profilowanie fenolowe jest niezbędne dla standaryzacji i zapewnienia jakości ekstraktów roślinnych oraz produktów komercyjnych, takich jak kapsułki z ekstraktem z zielonej herbaty, suplementy z pestek winogron, tabletki kwercetyny oraz formuły bioflawonoidów cytrusowych. W badaniach farmaceutycznych i biomedycznych analizy te wspierają przesiewowe badania związków bioaktywnych o potencjale antyoksydacyjnym, przeciwzapalnym i przeciwbakteryjnym⁶. W rolnictwie i fizjologii roślin determinacja fenolowa pomaga ocenić reakcje roślin na stres i kierować strategiami poprawy upraw. Dodatkowo, w nauce o materiałach — szczególnie w badaniach nad inhibitorami korozji pochodzącymi z roślin^{34,35 —} charakterystyka fenolowa pomaga korelować skład chemiczny z zachowaniem adsorpcyjnym i efektywnością ochronną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 mL lamp Eppendorfa	Eppendorf
Kolby objętościowe 10 mL	Eisco Labs	CH0451B	10/19 Korek polipropylenowy, szkło borokrzemowe, bursztyn – biały znak podziału, tolerancja i plusmn; 0,025 ml
100 &mikro; L i 1000 & micro; Końcówki mikropipety L	Generyka
100– 1000 &mikro; Mikropipeta L	Eppendorf	Research Plus
10– 100 &mikro; Mikropipeta L	Eppendorf	Research Plus
15 mL szklane rurki z zakręceniem	Generyka
Zlewki 50 mL	Generyka
8-kanałowa mikropipeta wielokanałowa	ThermoScienttific
Mikropłytki z 96 dołkami	Greiner	655891	Policykloolefina, szklane dno,
Analityczna waga			± 0,0001 g
Automatyczny sampler TLC	CAMAG	ATS4
Wirówka	ThermoScienttific	Sorvall ST8R	≥ 850 i razy; g
Papier filtracyjny	Co, człowieku		Dla nasycenia komory
Liofilizacja	LABCONCO	Model 10
Plastikowe rezerwuary odczynników	Eppendorf
Szpatułka z płaskim końcem i końcem łyżki	Merck Chemicals	HS15906
Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader	BioTek Instruments	Synergy HT
TLC krzemionkowy żel 60 F254 płyty aluminiowe (10 & razy; 20 cm)	Merck
Sprzątacz TLC	Sigma-Aldrich		20 mL
TLC Visualizer	CAMAG	2
Kąpiel/czyszczenie ultradźwiękowe	Creworks	ZX-040	z regulacją temperatury na poziomie 40 i stopni; C
UV Lamb	UPV	UVGL-58
Oprogramowanie VisionCATS	CAMAG
Woreczki strunowe	Ogólne		1/4 ćwierć galona