Profilowanie fenotypowe fenotypów behawioralnych podobnych do parkinsońskiego wywołanych MPTP u larw danio pręgowanego na podstawie eksperymentu behawioralnego

Podsumowanie

Protokół ten ustanawia paradygmat fenotypowania behawioralnego u larw danio objętych zabiegiem MPTP, aby ocenić deficyty ruchowe i niemotoryczne podobne do choroby Parkinsona.

Streszczenie

W tym artykule przedstawiono unikalny, wieloparametryczny protokół fenotypowania behawioralnego dla choroby Parkinsona (PD) wywołanej MPTP u larw danio pręgowanych. Chemiczna indukcja patologii podobnej do PD u danio danych zapewnia system o wysokiej wydajności, genetycznie podatny na leczenie, jednak większość badań koncentrowała się wąsko na podstawowych testach lokomotorycznych lub prostych przejściach między światłem a ciemnością. Takie ograniczone podejścia nie oddają szerszego spektrum zaburzeń związanych z Parkinsonem, od bradykinezji i deficytów sensorycycyjnych po zachowania podobne do lęku i zaburzenia snu. Aby wypełnić tę lukę, opracowano zintegrowany zestaw 6 komplementarnych testów: test lokomotoryczny do oceny ogólnego napędu lokomotorycznego i eksploracyjnego; ocena thigmotaksy w celu wykrycia zachowań związanych z lękiem związanych z preferencjami krawędzi; test reakcji na startle, aby zarejestrować bradykinezję i upośledzoną reaktywność motoryczną; testy wyzwania światło-ciemne do oceny podejmowania ryzyka i reakcji na stres; paradygmaty odpowiedzi fotomotorycznej (w tym stymulację światłem stroboskopowym) do ilościowego określenia ruchu sensoryczno-odruchowego i odruchowego; oraz monitorowanie regulacji snu i czuwania w celu pomiaru zachowań sen-czuwanie. Larwy danio są narażone na subletalne stężenia MPTP od 1 dnia po zapłodnieniu (dpf) do 5 dpf, przy czym oceny behawioralne rozpoczynają się od 4 do 6 dpf. Automatyczne śledzenie o wysokiej rozdzielczości generuje kilka punktów końcowych zachowań na jeden test. Takie podejście ujawnia wcześniej niewykryte zmiany podobne do Parkinsona, takie jak zaburzenia architektury snu, zaburzenia uczenia się w habituacji, ruchy sensoryczno-odruchowe i refleksyjne, odzwierciedlające wczesne objawy niemotoryczne. Łącząc te testy, naukowcy uzyskują kompleksowy objaw behawioralny, który lepiej odzwierciedla złożoność ludzkiego zaburzenia Parkinsona. Protokół ten rozszerza paradygmat badania patogenezy PD, badania przesiewowych terapii kandydatów oraz badania modulatorów środowiskowych. Jest to przykład celu kolekcji, jakim jest prezentowanie innowacyjnych modeli zwierzęcych, które zwiększają znaczenie translacyjne poprzez solidne, wieloaspektowe fenotypowanie.

Wprowadzenie

Choroba Parkinsona (PD) jest drugą najczęściej występującą chorobą neurodegeneracyjną po chorobie Alzheimera¹. Jego rozpowszechnienie i liczba osób systematycznie rosną w ostatnich latach, co stanowi poważne wyzwanie dla zdrowia publicznego na całym świecie². Wskaźnik zachorowalności na Parkinsony wyraźnie wzrasta w wieku ^{3,4 lat}. Klinicznie Parkinsonowość objawia się zarówno poprzez objawy motoryczne — takie jak dyskineza, bradykinezja, drżenie spoczynkowe i niestabilność postury — jak i przez różne objawy niemotoryczne, w tym zaburzenia poznawcze, lęk i zaburzenia snu⁵. Obecnie diagnoza Parkinsona zależy przede wszystkim od obecności objawów ruchowych⁶; Jednak w momencie ujawnienia tych objawów ponad 60% neuronów dopaminowych w substantia nigra zostało już utraconych⁷. Chociaż objawy niemotoryczne często pojawiają się wcześniej, brak konkretnych i obiektywnych kryteriów oceny komplikuje wczesną diagnozę i interwencję⁸. Obecnie podstawowym leczeniem PD jest podawanie lewodopy⁹, która w mózgu przekształca się w dopaminę, co pozwala na odbudowę poziomu dopaminy w prążkowiu. Chociaż to leczenie może tymczasowo złagodzić objawy, nie zatrzymuje postępu choroby¹⁰. W związku z tym niezbędne są dalsze badania nad patogenezą Parkinsona i badania przesiewowe na narkotyki.

Tworzenie odpowiednich modeli zwierzęcych jest kluczowe dla badań nad patogenezą PD i przesiewem leków anty-PD. Obecnie istnieją trzy główne modele badań nad Parksonem Parkinsonem: model indukcji chemicznej¹¹, model edycji genów¹² oraz model ksenotransplantacji człowieka¹³. Często używane modele zwierząt to gryzonie, takie jak myszy¹⁴, oraz naczelne nieludzkie, jak małpy¹⁵. Ostatnio danio pręgowane (Danio rerio) zyskują coraz większą uwagę w badaniach nad Parkinsonem ze względu na swoje zalety, takie jak mały rozmiar, szybki wzrost, wysoka homologia genetyczna z ludźmi oraz przezroczyste embriony¹⁶. Wykorzystanie neurotoksyny MPTP (1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna) do inwestowania uszkodzenia neuronów dopaminowych^17,18 jest klasyczną metodą konstrukcji modelu PD. Danio pręgowane poddane subletalnym stężeniom MPTP wykazują różne fenotypy zachowań podobnych do PD¹⁹.

Jednak większość badań PD u danio pręgowanego koncentruje się obecnie głównie na podstawowych zachowaniach lokomotorycznych lub prostych przejściach światła do ciemności^16,20, a jednowymiarowe testy behawioralne trudno w pełni odzwierciedlić złożone cechy behawioralne PD, zwłaszcza zmiany behawioralne w funkcjach nieruchowych. Biorąc pod uwagę, że PD jest chorobą obejmującą wiele układów neurobehawioralnych wykraczających poza kontrolę motoryczną ^21,22,23, pilnie potrzebna jest wieloparametryczna metoda oceny fenotypów behawioralnych, aby uchwycić jej fenotypy wielosystemowe²⁴.

W związku z tym badanie to tworzy wielofunkcyjny, parametryczny i szybki protokół testu fenotypowania behawioralnego, aby bardziej kompleksowo opisać fenotypy zachowań podobnych do PD u larw danio danych traktowanych metodą MPTP. Dawkę podśmiercionośną MPTP (50 μM)²⁵ podano larwam od 1 do 5 dni po zapłodnieniu (dpf)16,20,26. Od 4 do 6 dpf^{16, 20, 24} przeprowadziliśmy 6 testów behawioralnych: monitorowanie regulacji snu i czuwania, paradygmaty odpowiedzi fotomotorycznej, ocenę thigmotaksy, ocenę lokomotoryczną, test reakcji na przestrząsanie oraz testy wyzwania światło-ciemność. Oceny behawioralne obejmują zarówno aspekty motoryczne, jak i niemotoryczne, takie jak deficyty ruchowe, uczenie się sensoryczno-motoryczne, uczenie się na przyzwyczajenie, podejmowanie ryzyka, reagowanie na stres oraz rytm snu i czuwania.

Wykorzystując system śledzenia wideo o wysokiej przepustowości Zebrabox oraz metodę analizy ilościowej, wyodrębniliśmy i ilościowo określiliśmy różne parametry behawioralne oraz porównaliśmy różnice behawioralne między grupą traktowaną MPTP a grupą typu dzikiego (WT) za pomocą statystyk. W porównaniu z istniejącymi testami PB danio pręgowanych, ten multiparametryczny zestaw behawioralny rejestruje fenotypy motoryczne i niemotoryczne w ramach standaryzowanych ram. Zautomatyzowany system śledzenia zapewnia obiektywne pozyskiwanie danych behawioralnych i wysoką powtarzalność. Dodatkowo, niewielki rozmiar ciała larw pozwala umieścić pojedyncze zwierzęta w wielodołowych płytkach, co umożliwia ocenę o wysokiej przepustowości. Powyższe zalety są korzystne przy dogłębnej analizie mechanizmu patologicznego PD, przesiewaniu leków lub związków kandydatów oraz badaniu wpływu czynników środowiskowych na występowanie lub rozwój PD.

Protokół

Badanie to z udziałem danio danio zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki i stosowania zwierząt i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Szkoły Nauk Farmaceutycznych Uniwersytetu Shandong (nr YXDW2025-0056). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie do MPTP

1. Przygotuj podłoże 1× E3, rozcieńczając roztwór 100× E3 w skali 1:100 z wodą ultraczystą (np. wymieszaj 5 mL 100× E3 z 495 mL wody ultraczystej, aby uzyskać 500 ml medium 1× E3).
   UWAGA: Przygotuj E3 medium świeżo w dniu użycia.
2. Przygotuj 1 mM roztwór zapasowy MPTP, dodając 5,0 mg proszku MPTP do rurki wirówki 50 mL i dodając medium E3 do końcowej objętości 25 mL (użyj rurki wirówki jako pojemnika do mieszania, ale nie jest wymagana wirowanie). Oznacz rozwiązanie jako 1 mM MPTP w zapasach. Przechowuj roztwór bulionowy w ciemności.
3. Przygotowanie roztworu MPTP 50 μM: przelanie 2,5 mL roztworu zapasowego MPTP o pojemności 1 mM do czystego pojemnika i rozcieńczenie 47,5 mL medium E3, aby uzyskać końcową objętość 50 mL przy końcowym stężeniu 50 μM MPTP. Pozostała część roztworu zapasowego była nadal przechowywana w ciemności.
   UWAGA: MPTP to silna neurotoksyna i należy z nią postępować z dużą ostrożnością. Zawsze noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE), w tym rękawiczki, fartuch laboratoryjny oraz okulary ochronne. Utylizacja odpadów MPTP zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa.

2. Przygotowanie i grupowanie zarodków danio dano pręgowanego

1. Wybieraj dojrzałego płciowo samca i samicę dorosłego danio i przeprowadzaj kontrolowany rozmnażacz w zbiornikach hodowlanych z odłączanymi przegrodami. O godzinie 20:00 umieszczaj samca i samice danio osobno w zbiornikach lęgowych w stosunku 2:3 i rozdzielaj je przegrodami.
2. Następnego dnia usuń przegrody o 8:00 rano, aby umożliwić rozmnażanie i tym samym rozpocząć tarło. Po 1 godzinie zbieraj zarodki i myj je trzy razy czystą wodą z systemu.
3. Umieść zarodki w szalkach Petriego o średnicy 100 mm ze świeżym medium E3 i wysiabuj je w temperaturze 28 °C w cyklu 14 godzin światła / 10 godzin ciemności (światło włączone od 08:00 do 22:00).
   UWAGA: Nie przekraczaj 50 zarodków na miskę z 20 mL podłożem, aby zapewnić prawidłowy rozwój.
4. Po 1 dpf ostrożnie usuń niezapłodnione, zdeformowane i nieprawidłowe zarodki za pomocą pipety Pasteura i włóż roztwór zawierający zarodki danio pręgowane. W grupie WT zastąpić istniejące podłoże świeżym podłożem zarodkowym E3. Dla grupy poddanej przez zabieg MPTP zastąpić ośrodek roztworem MPTP 50 μM (rysunek 1A), a następnie zwrócić obie grupy do inkubatora.
5. W obu grupach należy zastąpić roztwór i usuwać martwe lub niezdrowe zarodki co 24 godziny. W grupie poddawanej zabiegowi MPTP wymieniaj roztwór MPTP codziennie od rana 1 dpf do rana 4 dpf (Rysunek 1A). Następnie przejście grupy poddanych zabiegom MPTP do medium E3 od rana 5 dpf aż do końca eksperymentu.
   UWAGA: Delikatnie uzupełnij roztwór pipetą Pasteur. Aspiruj medium powoli od krawędzi szalki Petriego i dodaj świeży roztwór wzdłuż ściany szalki, aby zminimalizować zakłócenia zarodków.

3. Monitorowanie snu – regulacji czuwania

1. Przy 4 dpf wybierz larwy danio dano z każdej grupy o 18:00 i przenieś je na płytkę z 96 dołkami za pomocą zmodyfikowanej 3 mL pipety Pasteura z odciętą końcówką, po jednej larwie na dołek (Rysunek 1B). Pierwsze cztery wiersze reprezentują grupy WT, a ostatnie cztery wiersze grupy MPTP (po 48 danio w każdej grupie).
   UWAGA: Aby uniknąć stymulacji lub uszkodzenia danio pręgowanego, modyfikuj pipety Pasteura, przycinając czubek (10 mm), aby uzyskać szeroką średnicę większą niż 4 długości larwy danio pręgowanego (długość ciała przekracza 3,7 mm^27,28).
2. Obserwuj każdą jamkę mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że każda larwa danio jest zdrowa, płetwy są otwarte i regularnie się poruszają, ciało jest wyprostowane, a pęcherz pływający napompowany^{o 29}. Po upewnieniu się, że danio w każdej dołce jest w zdrowym stanie, napełnij każdą jamkę podłożem E3.
   UWAGA: Wypełnij każdą jamkę E3 o średnim do prawie wypuklenym poziomie, dbając o utrzymanie napięcia powierzchniowego. Ostrożnie dodaj płyn, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków i przelewowi studni.
3. Po przelaniu ryby i płynu do płytki z 96 dołkami umieść je w komorze Zebrabox, aby aklimatyzowała się na 30 minut przed testem zachowań snu i czuwania.
   UWAGA: Przed umieszczeniem płyty z 96 dołkami w komorze Zebrabox, dokładnie oczyść dno płyty, aby nie wpływać na wyniki śledzenia wideo w brudzie.
4. Otwórz oprogramowanie do śledzenia wideo Zebralab, wybierz tryb kwantyzacji i upewnij się, że płytka z 96 dołkami jest umieszczona centralnie na dole komory Zebrabox.
5. Ustaw regulację światła tak, aby wyłączyła światło o 22:00 i włączyła o 8:00, co jest zgodne z warunkami światła podczas hodowli danio danio. W ciągu dnia białe światło wynosi zazwyczaj około 1000 luksów. Ustaw parametry oprogramowania następująco:²⁹: próg wykrywania, 40; burst, 25 (próg dla ruchu na ruch); zamrożenie (próg dla ruchu przy ruchu), 4; rozmiar pojemnika, 60 s; Całkowity czas monitoringu: 52 godziny (od 20:00 pierwszego dnia do 00:00 trzeciego dnia). Rozpocznij procedurę sen-czuwania o 20:00.
   UWAGA: Po rozpoczęciu zabiegu zakaz hałasu i drgań z zewnątrz przez cały czas trwania eksperymentu, aby nie wpływać na normalny rytm snu i czuwania danio danio. Aby zapobiec parowaniu wody podczas długoterminowego monitoringu, przykryj płytkę z 96 dołkami przezroczystą folią plastikową.
6. Po 52 godzinach zatrzymaj eksperyment sen-czuwania i zapisz plik danych. Wyjmij płytkę z 96 dołkami z ZebraBoxa.
   UWAGA: Korzystając z MATLAB-a i Excela, niezbędne parametry, takie jak liczba epizodów snu (okres snu definiowany jest jako okresy bezczynności trwające co najmniej 1 minutę)²⁹, średnia długość snu (średnia długość okresów snu), całkowity czas snu (cały czas trwania okresów snu w okresie monitorowania), opóźnienie snu (czas od lekkiego przejścia do początku pierwszego okresu snu), Średnia aktywność (zdefiniowana jako aktywność lokomotoryczna przez cały okres monitoringu) oraz aktywność lokomotoryczna (zdefiniowana jako aktywność lokomotoryczna tylko w okresie czuwania, z wyłączeniem okresów snu) zostały wyodrębnione i przeanalizowane z pliku danych.
   1. Użyj testu t Studenta, aby porównać różnice między grupą WT a grupą leczoną MPTP. Dodatkowo narysuj krzywą snu, krzywą aktywności na jawie oraz średnią krzywą aktywności danio pręgowanego przez 52 godziny za pomocą oprogramowania MATLAB.

4. Paradygmaty odpowiedzi fotomotorycznej

UWAGA: Paradygmaty odpowiedzi fotomotorycznej (w tym światło stroboskopowe) to wysokoprzepustowe testy behawioralne u larw 5 dpf, mające na celu ilościowe określenie zmian lokomotorycznych i odruchowych w odpowiedzi na nagłe przejście światła. Test ten przeprowadzono na płycie z 96 dołkami, obejmującą 2 paradygmaty: (1) przejście światła z 1 minuty ciemności do 1 minuty stałego światła (1000 lx) oraz (2) odpowiedź światła stroboskopowego polegającą na przejściu z 1 minuty ciemności do 1 minuty światła stroboskopowego przy częstotliwości 10 Hz.

1. Umieść larwy o pojemności 5 dpf w talerzu z 96 dołkami (1 larwa na dołek) (rysunek 1B) i napełnij każdą jamkę podłożem E3. Średnio dziel łącznie 96 larw na grupę WT i grupę MPTP.
2. Paradygmat ciemno-stałe światło:
   1. Umieść płytkę z 96 dołkami i 5 larwami o średnicy na 5 dołków do Zebraboxa i pozwól larwam aklimatyzować się przez 5 minut w ciemności przed testem.
   2. Otwórz tryb analizy Śledzenia online.
   3. Ustaw program przejścia światła następująco: 0-60 s: ciemno, 60-120s: stałe światło (1000 lx).
   4. Rozpocznij protokół, zbieraj powiązane parametry ruchu co 6 sekund przez cały test 120 sekund.
   5. Zatrzymaj protokół na 120^sekundach , wyeksportuj plik danych. Umieść larwy w całkowitej ciemności na 5 minut, aby przyzwyczaiły się do środowiska, przygotowując je do następnego testu światła ciemnego i stroboskopowego.
3. Paradygmat ciemnego światła stroboskopowego:
   1. Ustaw program przejścia światła następująco: 0-60 s: ciemno, 60-120 s: światło stroboskopowe (1000 lx) przy 10 Hz.
      UWAGA: Stroboskop o częstotliwości 10 Hz odpowiada 10 impulsom świetlnym na sekundę. W ZebraLab implementuj to, zmieniając natężenie światła od 0 do 1000 lx co 100 ms.
   2. Po zakończeniu 5-minutowej adaptacji do ciemności rozpocznij badanie z ciemnego na stroboskopowe światło. Zbieraj parametry ruchu co 6 sekund podczas testu 120 sekund.
4. Analiza danych: Po zakończeniu testu wyeksportuj plik danych. Używaj oprogramowania MATLAB, aby wyodrębnić dystans pływania co 6 sekund. Wyrysuj całkowity dystans (średnią wartość na 6 s) przepłynięty w ciągu 2 minut dla obu testów. Oblicz wskaźnik zamrożenia, odejmując całkowitą odległość pokonaną w ciągu 1 minuty w ciemności od przebytej w świetle³⁰.
   UWAGA: Indeks zamrożenia < 0 wskazuje na zachowanie zamrożenia; Indeks zamrożenia > 0 oznacza ucieczkę; Wskaźnik zamrożenia = 0 oznacza brak reakcji. Użyj testu Student t-test oraz dwukierunkowego ANOVA, aby porównać różnice między grupą WT a grupą leczoną MPTP. Łącznie użyto 48 larw danio pręgowanych (n = 48) dla każdej grupy.

5. Ocena thigmotaktyki

1. Wybierz dwie płytki z 6 dołkami, napełnij każdą warstwą 4 mL E3 medium.
2. W 5 dpf zebrano larwy danio pręgowanego z grup WT i grupy poddanych MPTP i umieszczono je w dwóch płytkach z 6 dołkami (jedna to grupa WT, druga to grupa MPTP, 1 larwa na dołek) (Rysunek 1C).
   UWAGA: Upewnij się, że początkowa pozycja larw znajduje się w centrum studni.
3. Przed oceną thigmotaxis płytki studni powinny być umieszczone w odpowiedniej pozycji Zebrabox na 15 minut wcześniej, aby się dostosować do tego miejsca.
4. Zbieranie i analiza danych: Korzystając z funkcji Draw Area , narysuj dwa koncentryczne okręgi w obszarze obserwacji każdego odwiertu (promień okręgu centralnego odpowiada 1/2 promienia otworu) (Rysunek 1C), a pozostałe parametry są ustawione tak, aby były takie same jak w ocenie lokomotorycznej. Rozpocznij protokół 5-minutowej oceny thigmotaxis i przeprowadź eksperyment równoległy.
   UWAGA: Po zakończeniu programu oprogramowanie Zebralab wygeneruje trajektorię larw danio pręgowanego w ciągu 5 minut oraz różne powiązane parametry ruchu. W pliku danych an1 oznacza całą powierzchnię każdego dołka, a an2 strefę wewnętrzną każdego dołka. Tak więc całkowity dis(an1) i całkowity czas trwania trwania oznaczają całkowity dystans pływania i czas spędzony w całej studni, natomiast całkowity dis(an2) i całkowity czas trwania trwania oznaczają odpowiednio dystans i czas spędzony w strefie wewnętrznej.
   1. Oblicz thigmottaksję według następujących wzorów:
      Oblicz procent przepłynięcia dystansu w strefie zewnętrznej:
      
      Oblicz procent czasu spędzonego w strefie zewnętrznej:
      
   2. Wykorzystaj test t ucznia do porównania różnic w thigmotaksji między grupą WT a grupą leczoną MPTP. Łącznie użyto 24 larw danio dano (n = 24) dla każdej grupy.

6. Ocena lokomotoryczna

1. Po 5 dpf wybierz larwy danio pręgowanego z grupy WT i grupy poddanej MPTP, które odpowiednio przeniesiono na dwie płytki z 12 dołkami (jedna to grupa WT, druga to grupa MPTP, 1 larwa na dołek z 2 mL E3 podłożem) (Rysunek 1D).
   UWAGA: Upewnij się, że rozmiary larw danio pręgowanego są podobne, a wybrane larwy powinny mieć otwarte płetwy, wyprostowaną postawę, dobre rozprężanie pęcherza pławnego i regularne ruchy.
2. Przed oceną lokomotoryczną umieść płytkę studni w pozycji testowej Zebraboxa na 15 minut wcześniej, aby się dostosować.
   UWAGA: Upewnij się, że warunki świetlne podczas adaptacji są zgodne z warunkami świetlnymi podczas testu.
3. Po 15-minutowym okresie aklimatyzacji wybierz tryb śledzenia – analizę online, rejestruj aktywność lokomotoryczną każdej larwy przez 5 minut za pomocą zautomatyzowanego, komputerowego systemu śledzenia wideo. Korzystając z oprogramowania Zebralab do zbierania śladów ruchu i różnych powiązanych parametrów lokomotorycznych co 60 sekund, eksportu pełnego pliku danych oraz analizie całkowitej odległości i średniej prędkości każdej larwy w ciągu 5 minut, używając MATLAB.
   1. Użyj testu Student t-test oraz dwukierunkowego ANOVA, aby porównać różnice między grupą WT a grupą leczoną MPTP. Łącznie użyto 24 larw danio dano (n = 24) dla każdej grupy.

7. Test reakcji na przestraszenie

UWAGA: Test ten mierzy reakcję na przeskok wzrokowy (VSR), znaną również jako przeskok wywołany błyskiem ciemności, wywołaną nagłymi przejściami w ciemność. Ten test reakcji na przeskok ocenia wzrokowy przeskok wywołany przez foto wywołany nagłymi, mrocznymi błyskami w skali milisekundy. W przeciwieństwie do paradygmatu ciemnego światła stroboskopowego, który polega na powtarzających się impulsach świetlnych do oceny długotrwałych reakcji behawioralnych, ten test koncentruje się na szybkich, odruchowych reakcjach motorycznych na ostry bodziec wzrokowy.

1. Preparaty: przy 5 dpf wybierz larwy danio z grupy WT i grupy poddanej MPTP i przenieś je odpowiednio na dwie płytki z 12 dołkami (jedna to grupa WT, druga grupa MPTP, 1 larwa na dołek z 2 mL E3 w podłożu) (Rysunek 1D).
2. Przed testem reakcji na start umieść płytkę w pozycji testowej Zebraboxa 5 minut wcześniej, aby się dostosować.
3. Ustaw parametry stymulacji: otwórz oprogramowanie Zebralab , uruchom tryb analizy Śledzenie online , otwórz interfejs wyzwalania światła , wybierz Użyj jednej z trzech poniższych metod wyzwalania, włącz Enhanced bodźce, ustaw na Gdy sesja się rozpoczęła; w harmonogramie przejścia rytm ciemnego błysku definiuje się następująco (program zaczyna się uruchamiać po 21 sekundach): Przejście 1: 5 ms, 100% intensywności światła; Przejście 2: 2890 ms, 100% natężenie światła; Przejście 3: 5 ms, 0% natężenia światła; Przejście 4: 100 ms, 0% intensywności światła; zaznacz Powtórz listę przejść , aby zapewnić okresowe miganie.
4. Protokół startowy: upewnij się, że funkcja nagrywania wideo w Numeriscope jest włączona, a wysokoprzepustowe automatyczne śledzenie wygeneruje wielowymiarowy zbiór danych obejmujący 30 punktów behawioralnych w tym teście z lat 90.
5. Analiza danych: Po zakończeniu testu reakcji startle, eksportuj surowe pliki danych i importuj je do oprogramowania MATLAB do analizy. Oblicz odległość pływania każdej larwy w odstępach 3 sekund, wraz ze średnią prędkością pływania.
   1. Zidentyfikuj maksymalną odległość ruchu, szczytową prędkość lub opóźnienie odpowiedzi po bodźcu błyskowym dla każdej grupy. Użyj testu Student t-test oraz dwukierunkowego ANOVA, aby porównać różnice między grupą WT a grupą leczoną MPTP. Łącznie użyto 24 larw danio dano (n = 24) dla każdej grupy.

8. Testy wyzwania światło-ciemność

1. Przy 5 dpf przenieś larwy danio pręgowanego pojedynczo na dwie płytki o 24 dołkach (rysunek 1E), po jednej larwie na dołek i 1 mL medium E3 na dołek. Każda płytka zawierała 24 larwy, a dwie płytki z 24 dołkami były równomiernie podzielone na grupę WT i grupę poddaną MPTP (n = 24 na grupę).
2. Przed testami umieść płytkę z 24 dołkami w wyznaczonym obszarze testowym wewnątrz Zebraboxa na 5-minutowy okres aklimatyzacji światła, aby dostosować się do środowiska testowego. Aktywuj tryb analizy śledzenia online. Konfiguruj program oświetlenia następująco: 6 minut stałego światła, a następnie 4 minuty całkowitej ciemności (Rysunek 1E). Całkowity czas testowania to 10 minut, a czas interwału na zbieranie punktów danych to 60 sekund.
   UWAGA: Globalne 6 minut światła służy aklimatyzacji i habituacji, zapewniając stabilną bazę ruchową oraz specjalne odpowiedzi światła-ciemności^31,32.
3. Na^dziesiątą minucie zatrzymaj rejestrowanie zachowań i zapisz dane. Ostrożnie wyjmij talerz z Zebraboxa.
4. Dla każdej larwy wyodrębnij odległość pływania w każdym odstępie 60 sekund. Oblicz odległość pokonaną w fazie światła (^{0-6 min} ), fazie ciemności (^{7-10 min)} oraz całkowity okres 10 minut. Ilościowo określ zachowanie thigmotaksji i wydajność uczenia się habituacji w fazie ciemności.
   UWAGA: Uczenie się habituacyjne definiuje się jako zmniejszenie reakcji behawioralnej, gdy zwierzę jest narażone na ciągły bodziec/środowisko^33,34, i oceniono to statystycznie poprzez porównanie średniej całkowitej odległości przejścia (mm) w ciągu 1^{. i 4.} minuty po przejściu z jasnego do ciemnego. Użyj testu Student t-test oraz dwukierunkowego ANOVA, aby porównać różnice między grupą WT a grupą leczoną MPTP. Łącznie użyto 24 larw danio dano (n = 24) dla każdej grupy.

9. Utylizacja odpadów MPTP

UWAGA: Po każdym eksperymencie behawioralnym spryskaj i przetrzyj powierzchnie stykające się z MPTP (np. stoły laboratoryjne i ZebraBox) świeżo przygotowanym podchlorynem sodu (wybielacz; ≥10% v/v).

1. Zbieraj ciekłe odpady (w tym pozostałe roztwory naświetlające i media płuczne) oraz odpady stałe (np. pipety Pasteura, rękawiczki, szalki Petriego i wielodołkowe płytki) MPTP. Wyraźnie oznaczaj je jako niebezpieczne odpady neurotoksyczne.
2. Należy przez co najmniej 24 godziny obejmować skażone odpady cieczowe i materiały stałe świeżo przygotowanym podchlorynem sodu (wybielacz; ≥10% v/v) w celu zapewnienia dekontaminacji, po czym należy do utylizacji zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
3. Uśpie larwy danio obrobione MPTP, zanurzając je w rozcieńczonym roztworze podchlorynu sodu (np. stosunek 1:5 6% wybielacza do wody) przez 5 minut^{i 35 minut}. Potwierdzona śmierć z powodu braku ruchu i bicia serca. Traktować zdeskażone larwy i podłoża jako niebezpieczne odpady biologiczne do utylizacji instytucjonalnej (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).

Wyniki

Monitorowanie regulacji snu i czuwania
Monitorowanie regulacji snu i czuwania trwającego 52 godziny rozpoczęło się od 4 dpf i było przeprowadzane przy użyciu płytki z 96 dołkami. Danio pręgowane w leczeniu MPTP wykazały istotne zaburzenia struktury snu w porównaniu do grupy WT. Reprezentatywne krzywe snu, wykresy aktywności czuwaniowej oraz uśrednione ślady aktywności przedstawione są na Rysunku 2. Parametry analizy regulacji snu i czuwania u larw danio zostały przedsta...

Dyskusja

Badanie to opracowało i zweryfikowało kompleksowy protokół oceny i analizy fenotypu behawioralnego podobnego do Parksono-Indukowanego przez MPTP. Protokół ten integrował 6 różnych testów: ocenę lokomotoryczną, test thigmotaksy, test reakcji na przeskok, paradygmaty odpowiedzi fotomotorycznej (w tym stymulację światłem stroboskopowym), test wyzwania jasno-ciemny oraz monitorowanie regulacji snu i czuwania, aby ocenić i przedstawić defekty ruchowe i niemotoryczne PD. Wyniki wskazały, że w porównaniu z grupą WT, larwy danio...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 razy; Rozwiązanie stockowe E3	Shanghai Feixi Biotechnology	Nie ma	zawierające 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2· 2H2O oraz 9,78 g MgCl2· 6H2O na litr
Płytka hodowla komórek 12-dołkowa	NEST Biotechnology	712011	Nieobróbczyone, niepirogeniczne, bezpłodne, polistyrenowe. Stosowane do badań behawioralnych larw danio pręgowanych
Płytka hodowla komórek z 24 dołkami	NEST Biotechnology	702011	Nieobróbczyone, niepirogeniczne, bezpłodne, polistyrenowe. Stosowane do badań behawioralnych larw danio pręgowanych
3 mL Pasteur Pipette	Biologix	30-0238A1
Płytka hodowla komórek 6-dołkowa	NEST Biotechnology	703011	Nieobróbczyone, niepirogeniczne, bezpłodne, polistyrenowe. Stosowane do badań behawioralnych larw danio pręgowanych
Płytka hodowla komórek 96-dołkowa	NEST Biotechnology	701011	Nieobróbczyone, niepirogeniczne, bezpłodne, polistyrenowe. Stosowane do badań behawioralnych larw danio pręgowanych
MATLAB R2020a	MathWorks, USA	Nie ma	MATLAB R2020a, licencja kampusowa uzyskana z portalu oprogramowania Uniwersytetu Shandong (softms.sdu.edu.cn). Wykorzystywane do statystycznej analizy danych behawioralnych larw danio pręgowanych.
Microsoft Excel	Microsoft	Nie ma	Microsoft Excel (część Microsoft Office), wersja zainstalowana za pośrednictwem licencjonowanego portalu oprogramowania Uniwersytetu Shandong (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna) i nbsp;	Beyotime	41125281	5 mg
Szalka Petriego	NEST Biotechnology	704202	100 mm, sterylny, łatwy w chwytaniu, TC-Processed
Roztwór podchlorynu sodu	Macklin	S817439	Roztwór wybielacza domowego (6-14% aktywnego chloru), rozcieńczony do ≥ 10% V/V dla dekontaminacji powierzchni i odpadów; rozcieńczony także w stosunku 1:5 (wybielacz 6% w wodzie) do eutanazji larw danio poddanych MPTP.
Mikroskop stereo	Olympus	Seria SZX2
Zebrabox High-Resolution Video Tracking System	Viewpoint, Francja	Nie ma
Zebralab Software	Viewpoint, Francja	Nie ma	Wersja (3,52,3,87)