Dwukolorowe wielowłóknowe fotometriczne zapisy sieci zachowań społecznych u myszy

Eartha Mae Guthman; Jorge M. Iravedra-García; Polina Cherepanova; Sae Yokoyama; Sophie E. Lockwood; Stefan N. Oline; Annegret L. Falkner

doi:10.3791/70049

Artykuł metodologiczny

Dwukolorowe wielowłóknowe fotometriczne zapisy sieci zachowań społecznych u myszy

DOI:

10.3791/70049

⸱

17 marca 2026

Eartha Mae Guthman^*¹ , Jorge M. Iravedra-García^*¹ , Polina Cherepanova¹ , Sae Yokoyama¹ , Sophie E. Lockwood¹ , Stefan N. Oline¹ , Annegret L. Falkner¹

¹Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotometria włókien jest jedną z najczęściej stosowanych technik rejestrowania aktywności wapnia w populacjach neuronalnych głębokich mózgów. Tutaj opisujemy protokół umożliwiający dostosowane, wielomiejscowe dwukolorowe obrazowanie aktywności wapnia i innych dynamicznych sygnałów fluorescencjowych z głębokich populacji neuronalnych u myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotometria światłowodowa, czyli masowe rejestrowanie sygnałów za pomocą światłowodu, jest użyteczną metodą rejestrowania aktywności wapnia z grup neuronów w swobodnie poruszającym się gryzoniu. W szczególności ta metoda sprawia, że celowanie w małe populacje genetycznie określonych neuronów w bardziej brzusznych i mniej dostępnych obszarach mózgu jest problemem do rozwiązania, ponieważ nadal trudno jest je rejestrować w rozdzielczości komórkowej. Technika ta może być skalowana do rejestrowania z wielu miejsc jednocześnie za pomocą podejścia wielowłóknowego i może celować w różne typy komórek, stosując strategie genetyczne w każdym zarejestrowanym miejscu. Tutaj przedstawiamy protokół dotyczący budowy i wstawiania spersonalizowanych macierzy multifiber do targetowania sieci społecznego zachowań myszy (do 12 lokalizacji). Protokół ten szczegółowo opisuje procedury chirurgiczne niezbędne do skutecznego celowania wielu miejsc z wykorzystaniem naszych spersonalizowanych wielowłóknowych matryc oraz podejście wirusowe do dostarczania zielono- i czerwienio-przesuniętych fluorescencjowych wskaźników aktywności wapnia do jednoczesnego obrazowania dwóch genetycznie zidentyfikowanych populacji nerwowych w każdym miejscu. Pokazujemy, jak nagrywać z tych obszarów za pomocą komercyjnie dostępnego systemu kamer z komplementarnym metalem i tlenkiem (CMOS) podczas zachowań społecznych. Ponadto protokół ten demonstruje metody kontroli jakości oraz szczegółowo opisuje proces wstępnego przetwarzania do korekcji i standaryzacji szumów. Na koniec omawiamy potencjalne zastosowania tego narzędzia do odkrywania nowych odkryć dotyczących sieci mózgowych na dużą skalę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotometria światłowodowa, czyli masowe rejestrowanie sygnałów fluorescencjowych za pomocą światłowodów, stała się potężną techniką pomiaru aktywności populacji nerwowej w głębokich obszarach mózgu. Często te obszary nie są łatwo dostępne za pomocą mikroendoskopii lub tradycyjnych metod elektrofizjologicznych ^1,2,3. Głównym celem współczesnej neurobiologii systemowej jest identyfikacja i rozwikłanie obliczeń stosowanych przez wielkoskalowe, specyficzne dla typu komórek sieci mózgowe zaangażowane w generowanie zachowań. Sondy neuropikselowe i komercyjnie dostępne tulejki wielowłóknowe doskonale rejestrują populacje neuronalne wyrównane liniowo 4,5,6,7, podczas gdy obrazowanie kory szerokopolowej zapewnia doskonałe pokrycie powierzchownej dynamiki kory ^8,9. Jednak jednoczesne rejestrowanie z przestrzennie rozproszonych, lecz funkcjonalnie połączonych populacji nerwowych podkorowych pozostaje^technicznie trudne 5,10,11,12. Ponadto, choć możliwe jest celowanie w wiele głębokich struktur mózgu za pomocą wielu pojedynczych ferruli do fotometrii, to podejście to ogranicza się do populacji nerwowych wystarczająco odległych od siebie, by można było wszczepić wiele ferruli¹². Dedykowane wielowłóknowe matryce fotometryczne wypełniają tę lukę, umożliwiając jednoczesne nagrywanie z wielu obszarów podkorowych u swobodnie zachowujących się zwierząt z minimalnymi ograniczeniami, zapewniając unikalne okno na koordynację na poziomie sieci podczas złożonych zachowań.

Sieć behawioralna (SBN) stanowi idealny system do badania dynamiki sieci mózgowych na dużą skalę. SBN to gęsto połączony i ewolucyjnie zachowany zbiór struktur podkorowych zaangażowanych w generowanie zachowań społecznych, które zostały zidentyfikowane we wszystkich klasach kręgowców¹³^, ¹⁴^, ¹⁵. Struktury te tradycyjnie obejmują, ale nie ograniczają się do: przegrody bocznej, okolicy przedwzrokowej, jądra łożyska mięśnia końcowego, przedniego i brzusznego jądra podwzgórza przedniego i brzusznego, ciało migdałowate przyśrodkowe, jądro naciągające oraz szare okołowowódkowe 13,14,15. W ramach SBN specyficzne populacje neuronalne zdefiniowane przez markery molekularne odgrywają kluczową rolę w regulacji zachowań społecznych. Neurony SBN ɣ-aminomasłowe-ergiczne (GABAergicalne) (oznaczone ekspresją transportera GABA pęcherzykowego, VGAT) oraz neurony glutamatergiczne (oznaczone ekspresją transportera glutaminianu pęcherzykowego, VGlut) reprezentują główne typy komórek pobudzających i hamujących w sieci i prawdopodobnie odgrywają dysocjacyjne role w modulacji działań społecznych 16,17,18,19. Poza tymi klasycznymi systemami neuroprzekaźnikowymi, sygnalizacja hormonów płciowych odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu sieci. Na przykład wiele zachowań społecznych mężczyzn i kobiet wymaga ekspresji receptora alfa estrogenu, a aktywność neuronów SBN wyrażających te receptory przyczynowo napędza te zachowania 16,20,21,22,23,24,25,26. Ponadto populacje neuronów SBN są wzbogacone o ligandy i receptory wielu układów neuromodulacyjnych, w tym dopaminę, wazopresinę argininową, oksytocynę, opioidy, tachininę, neuropeptyd Y, prolaktynę, oreksinę, peptyd związany z agouti, melanokortyny, kisspeptynę oraz hormon uwalniający gonadotropinę 17,18,19,27,28,29,30,³¹, a najnowsze osiągnięcia w sensorach kodowanych genetycznie pozwalają teraz śledzić wiele z tych różnorodnych cząsteczek sygnalizacyjnych 32,33,34,35,36,37,38. Ponieważ populacje neuronalne SBN są przestrzennie rozproszone w strukturach podkorowych, tradycyjne przygotowania eksperymentalne (np. elektrofizjologia zewnątrzkomórkowa, obrazowanie powierzchni kory oraz wcześniejsze podejścia do fotometrii wielowłóknowej) nie są w stanie uchwycić dynamiki aktywności chwilowej w tej dużej sieci mózgowej. Niemniej jednak, monitorując dynamikę wapnia w genetycznie zdefiniowanych populacjach neuronalnych wraz z wzorcami uwalniania neuromodulatorów, dedykowane wielomiejscowe platformy fotometrii włókien mogą ujawnić, które konkretne typy komórek i cząsteczki sygnalizacyjne kodują określone cechy zachowań społecznych, dostarczając nowatorskich mechanistycznych wniosków.

Tutaj opracowaliśmy konfigurowalną platformę do wielomiejscowej, dwukolorowej fotometrii światłowodowej, która umożliwia jednoczesne nagrywanie z nawet 12 obszarów mózgu u swobodnie zachowujących się myszy. Stosując to podejście, przeprowadziliśmy dwukolorowe fotometriczne zapisy aktywności wapnia z 22 zidentyfikowanych populacji nerwowych rozmieszczonych w 11 obszarach mózgu SBN, obok pomiarów fluktuacji dopaminy w jądrze akumbnym za pomocą czujnika DA opartego na aktywacji GPCR (GRAB-DA1m)³³ (Tabela 1). Protokół ten (Rysunek 1) szczegółowo opisuje budowę niestandardowych macierzy wielowłóknowych, procedury chirurgiczne celowania w wiele miejsc głębokiego mózgu, strategie dostarczania wirusów do wyrażania podwójnych wskaźników wapnia (GCaMP³⁹ i RCaMP⁴⁰), pozyskiwanie danych za pomocą komercyjnie dostępnego systemu fotometrii światłowodowej opartej na kamerze CMOS, metody kontroli jakości oraz pipeline wstępnego przetwarzania do korekcji szumów i standaryzacji sygnałów. Co istotne, nasz pipeline wstępnego przetwarzania zawiera izobesticzne nagrania długości fali sterującej, co pozwala nam na korekcję artefaktów ruchu. Stosujemy podejście oparte na regresji⁴¹, aby skorygować artefakty ruchu, zapewniając wierność sygnału podczas intensywnych zachowań społecznych, takich jak dosiadanie czy walka. Ponieważ nasza dedykowana metoda fotometrii wielowłóknowej może jednocześnie monitorować aktywność rozproszoną zarówno w strukturach głębokich mózgu bliższych, jak i dalszych, zachowując specyficzność komórek w zapisach dzięki celowaniu genetycznemu^42,43, oferuje znaczące przewagi w porównaniu z alternatywnymi podejściami do rejestrowania dynamiki aktywności nerwowej w głębokich, dużych sieciach mózgowych.

Protokół ten jest optymalnie odpowiedni do eksperymentów wymagających jednoczesnych nagrań z przestrzennie rozproszonych podkorowych obszarów mózgu (≥4 miejsca) u swobodnie zachowujących się zwierząt, szczególnie podczas badania dynamiki na poziomie sieci w genetycznie zdefiniowanych typach komórek lub śledzenia uwalniania neuromodulatorów obok aktywności neuronowej. Podejście to jest szczególnie cenne przy badaniu naturalistycznych zachowań związanych z intensywnym ruchem (np. interakcji społecznych), gdzie nasz potok korekcji artefaktów ruchu zapewnia wierność sygnału. Jednak badacze poszukujący rozdzielczości pojedynczych komórek, rozróżnienia sygnałów somatycznych i aksonalnych lub nagrań z powierzchownych obszarów kory mogą uznać alternatywne metody (np. mikroskopię miniaturową, neuropiksele lub obrazowanie szerokokątne) za bardziej odpowiednie. Kluczowe praktyczne kwestie obejmują złożoność chirurgiczną, potrzebę wykonania niestandardowych wieloświatłowodowych matryc oraz ustanowienie odpowiedniej infrastruktury materiałowej (możliwości druku 3D, narzędzia światłowodowe).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Protokół ten został przetestowany i zatwierdzony na dorosłych myszach w wieku 8–25 tygodni. Myszy trzymano w temperaturze 21–26 °C i wilgotności 30%-70% w 12-godzinnym odwróconym cyklu ciemno-światła (WYŁĄCZONE: 10:00; WŁĄCZONO: 22:00). Eksperymenty prowadzono wyłącznie podczas subiektywnej fazy aktywnej (ciemnej). Jedzenie i woda były zapewniane ad libitum. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Princeton i były zgodne ze standardami National Institutes of Health.

1. Wytwarzanie sieci wielowłóknowych i patchcordów (Rysunek 1A)

Wykonaj patchcord (Rysunek 2A).
1. Zdobądź patchcord o rozgałęzieniu 12 i wydrukuj dostarczone złącze patchcorda oraz akcesoria do wiercenia stereotaktycznego (Plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3) z żywicy (wytrzymałość na rozciąganie: 8,7 kilofunta/cal kwadratowy [ksi], moduł e: 377 ksi, ugięcie cieplne: 138 °F, wydłużenie: 8%).
2. Zbuduj dostarczony krążek do polerowania (Plik uzupełniający 4) z pręta ze stali nierdzewnej o średnicy 2 cali i umieść wycięcie wielkości wielowłóknowego układu w centrum krążka.
3. Ręcznie usuń nadmiar żywicy z otworów przez sworzeń kołka w wielowłóknowej matryce wiertłem 1,22 mm x 11 mm. Nawet przy precyzyjnym druku 3D otwory na kołki są nieco za małe, by kołek mógł przez niego przejść.
4. Wywierć otwory przez włókna.
  1. Włóż stalowe kołki (1,19 mm x 12,7 mm) do wszystkich otworów na 4 sworznie w dodatku wiertniczym stereotaktycznym i umieść złącze patchcorda od dołu do góry do dodatku wiertnicowego stereotaktycznego, a kołki przechodzą przez otwory na kołki matrycy wielowłóknowej.
  2. Dokręć śruby wciśnieniowe M4 w otworach na śruby gwintowane, aby zabezpieczyć złącze patchcorda i zabezpieczyć sprzęt do wiercenia stereotaktycznego w ramie stereotaktycznej.
  3. Włóż wiertło 0,25 mm x 5,5 mm do wiertarki stereotaktycznej i zamontuj je na ramie stereotaktycznej. Za pomocą tego wiertła wypoziomuj kąt odchylenia, kąta i przechylenia układu wielowłóknowego z maksymalną tolerancją odchylenia ±0,03 mm.
    UWAGA: Poziomuj yaw i pitch w najbardziej przednich i tylnych pozycjach wydruku 3D, roluj poziomo na czterech rogach wielowłóknowej matrycy.
  4. Wywierć w centrum nad jednym z 3D wydrukowanych otworów światłowodowych i ustaw układ stereotaktyczny w układach X/Y współrzędne ML (X) i AP (Y) powiązanego obszaru mózgu (Tabela 1). Przesuń wiertło na nowe (0, 0) współrzędne na ramie stereotaktycznej, aby wycentrować wiertło nad otworem przez przedni kołek.
  5. Użyj wiertła 0,25 mm x 5,5 mm, aby wywiercić każdy otwór przez włókno na głębokość 5,5 mm na współrzędnych stereotaktycznych (Tabela 1).
    UWAGA: Użyj długiego kawałka nadmiaru światłowodu, aby sprawdzić, czy wszystkie otwory są całkowicie usunięte, zanim wyjmiesz matrycę wielowłóknową z ramy stereotaktycznej. To ograniczy liczbę razy, gdy wielowłóknowa matryca będzie wymagana do wyrównania i wiercenia, aby usunąć otwory przejściowe.
5. Podłącz konektor patchcorda i rozgałęziony patchcord
  1. Odsłonić >10 cm włókien patchcordu. Przytnij włókna za pomocą skrabowa, aby zapewnić równą długość. Następnie umieść po jednym kawałku rurki termokurczliwej o szerokości 3/16" i 5/16" wokół 12 włókien na przewodzie patchcord.
    UWAGA: Rurka ochroni wszelkie odsłonięte włókna po przyklejeniu do złącza.
  2. Każde włókno należy włożyć do jednego z otworów w złączu patchcorda tak, aby na dolnej powierzchni odsłonięto około 0,3 mm światłowodu. Po włożeniu wszystkich włókien użyj końcówki igły o pojemności 21–27 G, aby nałożyć superglue na górną powierzchnię złącza patchcorda, aby utrzymać włókna na miejscu.
  3. Nałóż epoksyd na górną powierzchnię złącza patchcorda w kształcie piramidy o wysokości 0,5–1 cm. Upewnij się, że żadna epoksydowa powłoka nie pokrywa żadnego obszaru poza powierzchnią górnej, gdzie włożono włókna. Pozwól epoksydowi utwardzić się w temperaturze pokojowej przez noc.
  4. Użyj opalarki na najniższym ustawieniu, aby skurczyć rurkę termokurczliwą nad epoksydem i odsłoniętym włóknem powyżej (<3–5 cm).
    UWAGA: Unikaj dotykania rurki termokurczliwej podczas tego zabiegu, aby zapobiec oparzeniom.
  5. Przetnij kawałek miękkiej plastikowej rurki o średnicy 3 mm na długość pozostałych odsłoniętych włókien, przetnij szczelinę wzdłuż krawędzi rurki i otocz pozostałe odsłonięte włókna w rurce.
  6. Pokoloruj przezroczystą rurkę nieprzezroczystym czarnym markerem, aby włókna nie były już widoczne, minimalizując oświetlenie przez odsłonięte włókna podczas eksperymentów obrazowania.
6. Wypolerował patchcord.
  1. Zabezpiecz złącze patchcorda od dolnej powierzchni w specjalnym pucku do polerowania. Poleruj złącze patchcorda na arkuszach polerskich o grubości 6 μm, 3 μm, 1 μm, a następnie o ziarnistości 0,01 μm, stosując 10–20 ruchów w kształcie symbolu/arkusza nieskończoności. W arkuszach o ziarnistości 1 μm i 0,01 μm przed polerowaniem należy nasypać 5 kropel wody destylowanej.
  2. Wytrzyj powierzchnię złącza, aby pozbyć się nadmiaru wody destylowanej. Sprawdź pod kątem mikroskopu brightfield pod kątem niedoskonałości lub pęknięć na wypolerowanej powierzchni złącza patchcorda, a jeśli takie występują, powtórz polerowanie.
7. Sprawdź wyjście patchcorda.
  1. Podłącz końcówkę wtyczki Sub-miniature wersji A (SMA) do systemu fotometrii światłowodowej opartej na kamerze CMOS. Korzystając z oprogramowania do kodowania wizualnego, należy postępować zgodnie z instrukcją systemu obrazowania fotometrycznego i ustawić kamerę CMOS na końcu przewodu patchcorda SMA.
    UWAGA: Instrukcja jest regularnie aktualizowana, aby dostosować się do aktualizacji oprogramowania. Ponieważ kod wizualny systemu fotometrii często się zmienia wraz z nowymi wydaniami oprogramowania, ten podręcznik zawiera najnowsze informacje o aktualnych wersjach oprogramowania.
  2. Zmierz wyjście patchcorda 470 nm przy mocy 20% za pomocą optycznego miernika. Powtórz krok 1.1.7, jeśli wyjście patchcordu wynosi < 2,5 mW.
Wykonaj sieć wielowłóknową.
1. Wydrukuj dostarczoną matrycę wielowłóknową (plik uzupełniający 5, plik uzupełniający 6) z żywicy, zgodnie ze specyfikacją techniczną opisaną w kroku 1.1.1.
2. Przygotuj sieć wielowłóknowa.
  1. Włóż mosiężne nakrętki sześciokątne M0.6 do każdego z czterech otworów w bocznych narożnikach wielowłóknowej matrycy i wyrównaj otwór nakrętki sześciokątnej w centrum otworu.
  2. Nałóż jedną kroplę super glue z boku każdego szczelina na nakrętkę sześciokątną z końcówką igły o masie 21–27 G, dodając dodatkowe krople dla wzmocnienia, jeśli to konieczne. Pozwól klejowi wyschnąć w temperaturze pokojowej przez 5 minut, zanim przejdziesz do kolejnego kroku.
  3. Usuń klej z boków wielowłóknowej matrycy żyletką, aby upewnić się, że pasuje do polerującej krążka.
  4. Jeśli nadmiar superglue zaschnie po stronie powierzchni układu wielowłóknowego, poleruj powierzchnię tego zestawu za pomocą niestandardowego pucku polerującego i arkuszy polerskich o ziarnistości 30 μm, aż klej zostanie usunięty i powierzchnia matrycy wielowłóknowej stanie się równa.
  5. Ręcznie usuń nadmiar żywicy z otworów przez sworzeń kołka w wielowłóknowej matryce wiertłem o średnicy 1,22 mm.
3. Wywierć otwory przepuszczające światłowód (rysunek 2B-C).
  1. Włóż stalowe kołki (1,19 mm x 12,7 mm) do wszystkich 4 otworów na sworznie w dodatku wiertniczym stereotaktycznym i umieść wielowłóknową matrycę powierzchniową (płaską stroną) do góry do dodatku wiercenia stereotaktycznego, z kołkami przechodzącymi przez otwory przez otwory kołków matrycy wielowłóknowej.
  2. Powtórz krok 1.4.2 – krok 1.4.5.
4. Przygotuj światłowody do sieci multifiber.
  1. Zdzierz plastikową obudowę z fragmentu światłowodu o średnicy 200 μm, 0,39 NA za pomocą zmywarki do światłowodów. Oczyść błonnik etanolem.
  2. Rozcinaj włókna na odcinki o długości ~3–5 cm za pomocą tasaka do włókien. Dodatkowo przeciąć te fragmenty na pół za pomocą sklejacza do włókien. Użyj mikroskopu brightfield, aby upewnić się, że przynajmniej jeden koniec przeciętych sekcji jest wolny od odprysk i skaz. Używaj tylko włókien z przynajmniej jednym nieskazitelnym końcem.
  3. Pod mikroskopem jasnego pola przyklej precyzyjną linijkę o długości co najmniej 15 mm. Umieść nieskazitelną stronę włókna w pozycji 0 mm na linijce (rysunek 2D). Przycinaj włókna do pożądanej długości dla każdego docelowego regionu (Tabela 1).
    UWAGA: Długość światłowodu oblicza się, dodając 6 mm do stereotaktycznej współrzędnej D/V dla najgłębszego światłowodu, a następnie korygując tę wartość dla wszystkich światłowodów, aby odpowiadała różnicy między ich współrzędną D/V a współrzędną D/V najgłębszego światłowodu.
5. Włóż światłowody do sieci multifiber.
  1. Umieść matrycę wielowłóknową w uchwytie produkcyjnym powierzchnią do dołu. Wyrównaj i zabezpiecz element za pomocą kołków kołkowych.
  2. Dopasuj długość włókna do miejsca (Tabela 1) i włóż przecięte włókna do odpowiednich otworów przelotowych w wielowłóknowej matryce, tak że nieskazitelna strona jest skierowana do góry. Upewnij się, że wszystkie włókna są całkowicie wciśnięte przed kolejnym krokiem.
  3. Nałóż superglue końcówką igły o masie 21–27 G, aby przykleić wszystkie włókna na miejscu. Pozwól klejowi rozłożyć się co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej, zanim kontynuję.
6. Poleruj matrycę wielowłóknową, powtarzając krok 1.1.6 z matrycą wielowłóknową powierzchnią w dół (Rysunek 2E).
7. Sprawdź efektywność sieci wieloświatłowodowej.
  1. Oczyść wypolerowaną powierzchnię wielowłóknowego układu etanolem, a następnie nałóż na nią żel do dopasowania indeksu. Włóż 4 piny do złącza patchcorda i przymocuj do niego matrycę multifiber za pomocą śrub napędowych G5 i powiązanego śrubokręta (rysunek 2F).
  2. Użyj miernika mocy, aby zmierzyć emisję LED 470 nm i 560 nm z sieci multifiber. Oblicz efektywność na podstawie następujących wartości:
  3. Jeśli efektywność wynosi <75%, powtórz kroki 1.2.7.1–1.2.7.2.
    UWAGA: Jeśli ponowne polerowanie nie poprawi efektywności i nie ma żadnych skazek na włóknach, możliwe, że włókna w matryce wielowłóknowej są niewyrównane z złączem patchcorda.
8. Przygotuj wielowłóknową matrycę do użytku (Rysunek 2G).
  1. Włóż 4 piny do otworów w sieci multifiber. Upewnij się, że sworznie kołków nie wystawają dalej niż 1 mm od strony mózgowej układu wielowłóknowego.
  2. Umieść superglue po stronie mózgu na kołkach. Pozwól klejowi wyschnąć co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem wielowłóknowej matrycy.

2. Chirurgia (Rysunek 1B)

Przygotuj przestrzeń chirurgiczną i narzędzia.
1. Czyść stereotaktyczną ramę, aby zapewnić aseptyczną przestrzeń roboczą.
2. Zdobądź sterylne, wchłanialne szwy.
3. Autoklaw – parę cienkich kleszczy, cienkie nożyczki i dwie zaciski buldoga.
4. Upewnij się, że waporyzator jest wypełniony izofluranem. Upewnij się, że rurki do linii izoflurancji, podciśnienia i tlenu są dobrze połączone z waporyzatorem, komorą indukcyjną oraz nosem stereotaktycznej ramy.
Pobierz wirusy związane z adenoplazmą jRCaMP1b, GCaMP6f i GRAB-DA1m.
UWAGA: Zawsze nosz środki ochrony osobistej podczas kontaktu z wirusami.
1. Rozcieńcz wirusy do stężenia roboczego między 1x10,¹³ i 4x10, jeśli to konieczne,¹³ części/mililitr.
2. Przygotuj mieszankę 1:1 wirusów związanych z adenoplazmą jRCaMP1b i GCaMP6f.
3. Umieść na lodzie aliquot mieszanki wirusa jRCaMP1b:GcaMP6f oraz aliquot wirusa GRAB-DA1m, aby utrzymać temperaturę na poziomie 4 °C.
Wprowadź znieczulenie.
1. Włóż mysz do komory indukcyjnej i zamknij drzwi komory. Rozpocznij dopływ tlenu do waporyzatora z prędkością 1 L/min.
2. Skieruj przepływ gazu do komory indukcyjnej i włącz linię próżniową, aby usunąć nadmiar gazu z komory. Ustaw waporyzator na stężenie izofluranu w zakresie 3% – 5%.
Przenieś mysz do stereotaktycznej ramki.
1. Gdy oddech myszy zwolni do 1 oddechu/s, przenieś mysz na stereotaktyczną ramę. Zaczepiaj przednie siekacze myszy w szczelinie w ustniku stożka nosowego i mocno go zaciskaj na nosze myszy.
2. Przełącz przepływ gazu do stereotaktycznego układu z stężeniem izofluranu ustawionym na 1%–2%, aby utrzymać znieczulenie. Przełącz linię próżniową, aby usunąć gaz z nosa.
  UWAGA: Monitoruj oddech myszy podczas operacji i dostosowuj stężenie izofluranu w razie potrzeby, aby utrzymać głęboką anestezję z tempem oddechu 1 oddech/s. Głęboka anestezja powinna być regularnie potwierdzana podczas zabiegu, zapewniając, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca.
3. Ustaw system grzewczy na temperaturę ciała 35 °C i nałóż maść optyczną na oczy myszy, aby zapobiec ich wysychaniu.
4. Włóż stereotaktyczne pręty do uszu, aby naciskały po obu stronach czaszki, lekko grzbietowej i przed kanałami słuchowymi. Dokręć nauszniki i upewnij się, że czaszka myszy jest przymocowana na miejscu, delikatnie naciskając na czubek głowy.
Przygotuj skórę głowy do nacięcia.
1. Przytnij lub ogol włosy na czubku głowy myszy, aż będą krótkie. Nałóż żel do usuwania włosów na czubek głowy myszy i pozostaw na około minutę. Usuń pozostałe żel czystą waciczką.
2. Powtarzaj 2.5.1 według potrzeby, aż wszystkie włosy na czubku głowy zostaną usunięte.
3. Dezynfekuj skórę na czubku głowy, stosując patyczki watowe do nałożenia betadyny (10% roztwór povidon-jodu), a następnie 70% roztworu etanolu.
Odsłonić czaszkę.
1. Wytnij nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki, rozciągając się od nieco tylnej części lambda do nieco przedniej części żyły nosa rostralnego.
  UWAGA: Żyła nosowa nosa nosonosna to naczynie krwionośne znajdujące się na grzbietowej powierzchni mózgu, pomiędzy bulwą węchową a korą przedczołową.
2. Przetnij i usuń ogoloną skórę wokół boków tego nacięcia, aby utworzyć nacięcie w kształcie kropli, odsłaniające kości ciemieniowe, przedni koniec kości wewnątrzciemieniowej oraz część kości nosa przed żyłą nosową (rysunek 2H).
3. Delikatnie czyść powierzchnię czaszki roztworem soli fizjologicznej 0,9% i czystym patykiem watowym.
Wyrównaj czaszkę.
1. Zlokalizuj miejsce, gdzie żyła rostralna w ręce styka się ze szwem strzałkowym. Oznacz ten punkt sterylnym ostrzem skalpela.
2. Włóż wiertło węglikowe #92 do wiertarki stereotaktycznej i zamontuj je na ramie stereotaktycznej. Użyj manipulatora stereotaktycznego, aby ustawić końcówkę wiertła na powierzchni czaszki w wyznaczonym punkcie i wyzerować współrzędne X, Y i Z wiertła.
3. Zmierzyć wyrównany kąt czaszki, mierząc głębokość Z w wyznaczonym punkcie i -8,25 mm z tyłu od niego. Wyrównaj kąt odchylenia czaszki, mierząc boczną odległość między oznaczonym punktem a pozycją -8,25 z tyłu. Wyrównuj tocz, mierząc głębokość Z w pozycjach ±2,0–2,5 mm od linii środkowej na pozycjach -2,0, -4,5 i -7,0 mm względem wyznaczonego punktu.
Wykonaj kraniotomię i duratomię.
1. Wymień wiertło na wiertło węglikowe #76 lub #78. Wyzeruj wiertło w wyznaczonym miejscu na styku szwu strzałkowego, żyły rostralnej i powierzchni czaszki.
2. Przenieś wiertło na współrzędne A/P i M/L każdego obszaru mózgu (Tabela 1). W każdym miejscu wykonaj wykonanie kraniotomii i ostrożnie usuń oponę twardą przy każdej kraniotomii, używając pustej końcówki strzykawki 27G lub mniejszej.
Wstrzyknij wirusa.
1. Szklane mikropipety wyciągają tak, aby ich końcówka zwężała się co najmniej 7 mm i miała otwór końcówki o średnicy 10–30 μm.
  UWAGA: Ponownie rozpocznij kroki 2.9.2–2.9.12, jeśli mikropipeta zawiera pęcherzyki powietrza po kolejnych etapach.
2. Wypełnij pustą szklaną końcówkę mikropipety olejem mineralnym. Włóż i zabezpiecz końcówkę mikropipety w nanolitrowym wtryskiwaczu. Użyj interfejsu nanolitrowego wtryskiwacza, aby wyrzucić jak najwięcej oleju mineralnego z mikropipety.
3. Zamontuj nanolitrowy wtryskiwacz na stereotaktycznej ramie. Wytnij mały kawałek folii wosku parafinowego i połóż go na głowie myszy.
4. Pipeta 1 μL mieszaniny wirusa jRCaMP1b:GCaMP6f na wosk parafinowy. Obniż końcówkę nanolitrowego wtryskiwacza, aby szklana mikropipeta znalazła się w mieszance wirusów, a następnie wypełnij mikropipetę wirusem za pomocą interfejsu wtryskiwacza.
5. Powtarzaj 2.9.4, aż wszystkie wirusy, które zostaną użyte, zostaną przeniesione do nanolitrowego wtryskiwacza (Tabela 1). Usuń i uśmieć wosk parafinowy w pojemniku na odpady niebezpieczne.
6. Wyzeruj końcówkę mikropipety wtryskiwaczej w wyznaczonym miejscu na styku szwu strzałkowego, żyły nosa rostralnego i powierzchni czaszki.
7. Zaczynając od najbardziej brzusznego do najbardziej grzbietowego miejsca wstrzyknięcia (Tabela 1), przesuń końcówkę mikropipety do każdego miejsca, obniż ją do powierzchni mózgu i zeruj pozycję Z na stereotaktycznym układzie.
8. W każdym miejscu opuszczaj końcówkę mikropipety do mózgu, aż będzie 0,1 mm brzuszna względem miejsca wkłucia. Następnie unieś końcówkę mikropipety o 0,1 mm do miejsca finałowego wstrzyknięcia. Pozwól otaczającej tkance osiąść wokół końcówki mikropipety przez 30 sekund.
9. Korzystając z interfejsu nanolitrowego wtryskiwacza, wstrzyknij 300 nL mieszaniny wirusów 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f z prędkością 1–2 nL/s, aby rozproszyć mieszaninę w miejscu obecnego wstrzyknięcia.
10. Pozwól, aby końcówka mikropipety pozostała w miejscu wstrzyknięcia przez co najmniej 5 minut po zakończeniu wstrzyknięcia. Powoli wyciągaj końcówkę mikropipety z mózgu, aby zmniejszyć ryzyko rozprzestrzeniania się wirusa grzbietową wzdłuż ścieżki wstrzyknięcia.
11. Po wstrzyknięciu mieszaniny wirusowej 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f w każdym miejscu, użyj interfejsu nanolitrowego, aby przywrócić tłok nanolitrowego wtryskiwacza do pierwotnej pozycji. Usuń mikropipetę i wyrzuć ją do pojemnika na odpady z ostrymi substancjami biologicznymi.
12. W razie potrzeby powtórz kroki 2.9.2–2.9.11 dla każdego regionu mózgu przeznaczonego do ekspresji GRAB-DA1m. W każdym docelowym miejscu wstrzyknij 150 nL zamiast 300 nL używanych do mieszanki wirusa.
Implantuj wielowłóknową matrycę.
1. Przymocuj matrycę wielowłóknową do ramy stereotaktycznej za pomocą dowolnego uchwytu, który może utrzymać matrycę wielowłóknową za kołki, aby utrzymać jej stabilność podczas implantacji (Rysunek 2I).
2. Dostosuj pozycję matrycy wielowłóknowej tak, aby każde włókno było wyrównane ze środkiem swojej czaszki, a najdłuższe włókno spoczywało na powierzchni mózgu. Wyzeruj manipulator stereotaktyczny w tym miejscu i powoli opuszczaj wielowłóknową matrycę, aż będzie 0,25 mm powyżej pozycji D/V najgłębszego zastrzyku wirusa (Tabela 1, Rysunek 2J).
3. Umieść zimną miskę do mieszania na lodzie i dodaj 1 miarkę proszku cementowego, 4 krople płynnej bazy i 1 kroplę katalizatora. Mieszaj przez 20 sekund.
  UWAGA: Powtarzaj ten krok za każdym razem, gdy używasz cementu ciekłego i wymagane jest więcej użycia.
4. Użyj strzykawki i igły 23–31 G, aby przenieść ciekły cement w przestrzeń między wielowłóknową matrycą a czaszką.
5. Nałóż ciekły cement za pomocą cienkiego plastikowego aplikatora lub igły do strzykawki, aby całkowicie pokryć cztery strony wielowłóknowego układu, tworząc kształt piramidy z czaszki (rysunek 2K). Pozwól cementowi wyschnąć co najmniej 15 minut.
6. Zszyj skórę razem wzdłuż nacięcia, aby nie odsłonić czaszki.
Pozwól myszy na odzyskanie sił.
1. Zmniejsz stężenie izofluranów do 0.
2. Przenieś mysz z ramki stereotaktycznej na termoforę i poczekaj, aż mysz stanie się czujna i poruszająca, zanim przeniesiesz ją z powrotem do klatki.
3. Pozwól myszy odpoczywać co najmniej dwa tygodnie przed rozpoczęciem eksperymentów.

3. Wielomiejscowe, dwukolorowe obrazowanie wapnia (rysunek 1C)

Konfiguruj urządzenie do akwizycji danych (DAQ).
1. Podłącz GND do portu AGND powyżej portu Ch7 za pomocą przewodu elektrycznego.
2. Podłącz DIO0 do portu Ch0 za pomocą przewodu elektrycznego.
Podłącz system fotometryczny do DAQ.
1. Podłącz koniec złącza Baby Neill Constant (BNC) rozdzielonego kabla BNC (złącze BNC na jednym końcu, czerwone i czarne przewody elektryczne na drugim) do portu wejściowego systemu fotometrycznego. Podłącz koniec złącza BNC innego rozdzielonego kabla BNC do portu wyjściowego w systemie fotometrycznym.
2. Weź rozdzielony kabel BNC podłączony do portu wejściowego systemu fotometrycznego i podłącz jego czerwony przewód do portu DIO1 w DAQ. Weź rozdzielony kabel BNC podłączony do portu wyjściowego systemu fotometrycznego i podłącz jego czerwony przewód do portu Ch1 w DAQ.
3. Podłącz czarne przewody uziemiające z obu rozdzielonych kabli BNC do portu DAQ GND.
Synchronizuj kamery do zachowania i fotometrii.
1. Łańcuch wielu kamer behawioralnych łączy się razem, aby jednocześnie rejestrować zachowania z różnych kątów.
  1. Podłącz wyjście izolowane opto (pin 4, biały przewód) kamery o zachowaniu pierwotnym do nieizolowanego wejścia kamery wtórnej (pin 1, zielony przewód) za pomocą rezystora 3,3 KΩ. Podłącz wyjście 3,3 V głównego aparatu (pin 3, czerwony przewód) do tego samego rezystora 3,3 KΩ i do Ch2 w DAQ.
  2. Podłącz wyjście optoizolowane każdej kamery wtórnej do jej wyjścia 3,3 V za pomocą rezystora 3,3 KΩ.
  3. Podłącz masę kamery głównej (pin 6, brązowy przewód) do masy każdej kamery drugoplanowej. Podłącz wszystkie przewody uziemienia kamery do portu DAQ AGND powyżej portu Ch2 oraz do masy wyjściowej systemu fotometrycznego.
Konfiguruj ustawienia aparatu zachowawczego za pomocą powiązanego oprogramowania do obrazowania.
1. Ustaw "Akwizycyjną Liczbę Klatek na Sekundę" na 45 Hz, a wzmocnienie na 1.
2. Ustaw czas naświetlania na 2998 μs, dolną granicę ekspozycji na 100 μs, a górną na 150000 μs.
  UWAGA: "Akwizycyjne Liczba Klatek Na Sekundę" może nie być faktyczną liczbą klatek, która zostanie zarejestrowana. W zależności od czasu ekspozycji i żądanej szerokości pasma danych, wartość ta może wymagać ustawienia powyżej końcowej częstotliwości obrazowania. W razie potrzeby dostosuj "Akwizycyjną liczbę klatek na sekundę" tak, aby wyświetlana "Liczba klatek wynikowych" wynosiła 40 Hz.
Konfiguruj oprogramowanie DAQ (Plik uzupełniający 7).
1. W oprogramowaniu DAQ dodaj DAQ jako 'Urządzenie' i przełącz się do 'Panelu konfiguracyjnego'.
2. W zakładce 'Kanały', w sekcji 'Wejście analogowe', aktywuj kanały 0–2. W sekcji 'Cyfrowe' aktywuj kanał 0.
  UWAGA: Kanał 0 odpowiada sygnałowi logiki tranzytor-tranzytor (TTL), kanał 1 układowi fotometrycznemu, a kanał 2 kamerom łańcuchowym w łańcuchu.
3. W sekcji 'Analog Input' nazwij kanał 0 "TTL", kanał 1 "Photometry_system", a kanał 2 "Behavior_cameras", co oznacza "Transitor-Transistor Logic". Pod 'Cyfrowym' nazwij kanał 0 "TTL_trigger".
4. W zakładce 'Triggers' ustaw spusty na manualne. W zakładce 'Sample Rates' ustaw częstotliwość próbkowania na 350 Hz.
5. Przełącz się na 'Panel wyświetlania' i umieść okna 'Strip', 'Scalar' oraz 'Output' w graficznym interfejsie użytkownika.
Konfiguruj oprogramowanie systemu fotometrycznego (Plik Uzupełniający 8).
1. Opracuj workflow w oprogramowaniu wizualnym, który zaakceptuje impuls TTL 5 V w celu wyzwalania nagrań oraz zapisuje znacznik czasu dla każdej klatki, emisję fluorescencji dla kanałów czerwonych i zielonych dla każdego światłowodu oraz surowe wideo, zgodnie z podręcznikiem systemu fotometrycznego.
2. Korzystając z węzła systemu fotometrycznego w procesie, upewnij się, że system jest skonfigurowany do nagrywania naprzemiennych klatek diod LED 560, 470 i 415 nm przy częstotliwości 120 Hz, co daje funkcjonalną liczbę klatek na sekundę 40 Hz.
  UWAGA: To podejście do podziału czasu (TDM) rozwiązuje nakładanie się spektralne między GCaMP a RCaMP poprzez rozdzielenie ich wzbudzeń w czasie, zapewniając, że każdy wskaźnik jest wzbudzany niezależnie w kolejnych klatkach. System rejestracji stosowany tutaj wykorzystuje zoptymalizowane filtry emisyjne pasma (kanał zielony: 500–530 nm; kanał czerwony: >580 nm długoprzepustowy), które dodatkowo minimalizują przesłuchy widmowe poprzez ograniczenie wykrytych fotonów do długości fal emitowanych głównie przez każdy wskaźnik. Długość fali izobesticznej 415 nm wzbudza zarówno GCaMP, jak i RCaMP jednakowo, ale powoduje minimalne zmiany fluorescencji zależne od wapnia, zapewniając sygnał sterowania artefaktem ruchu. Razem wzbudzenie TDM i filtrowanie spektralne zapewniają, że klatki 470 nm rejestrują głównie aktywność GCaMP (Rysunek 3A), klatki 560 nm przechwytują głównie aktywność RCaMP (Rysunek 3B), a klatki 415 nm dostarczają sygnały referencyjne niezależne od wapnia do korekcji ruchu.
Wykonuj nagrania fotometryczne in vivo .
1. Pobierz mysz, która przeszła zastrzyki wirusowe i wszczepienie wielowłóknowej matrycy zgodnie z Krokiem 2.
2. Oczyścić powierzchnie połączenia patchcorda i wszczepionej wielowłóknowej matrycy etanolem oraz patyczkiem kosmetycznym. Korzystając z węzła systemu fotometrycznego w procesie wizualnego kodowania oraz fotometru, ustawił każdy z poziomów mocy diod LED 415, 470 i 560 tak, aby generowały około 1,2 mW oświetlenia z patchcorda.
3. Nałóż żel do dopasowania indeksu na powierzchnię połączenia patchcorda. Wyrównaj patchcord z wbudowaną matrycą wielowłóknową myszy wraz z pinami kołkami i przesuń patchcord w dół, aż będzie równo z powierzchnią wbudowanej matrycy multifiber.
4. Dokręć śruby patchcorda, aby zabezpieczyć matrycę multifiber w patchcordze. Pozwól myszy przyzwyczaić się przed rozpoczęciem eksperymentów (Rysunek 2L–M).
5. Ustaw nazwy plików.
  1. Dla każdej kamery behawioralnej naciśnij czerwony przycisk 'nagrywaj', aby otworzyć okno nagrywania w oprogramowaniu do nagrywania zachowań i podać nazwę pliku.
  2. Otwórz program DAQ, kliknij przycisk koła zębatego i przejdź do 'opcji logowania', a następnie podaj nazwę pliku.
  3. Kliknij na węzeł 'PhotometryWriter' w procesie wizualnego kodowania systemu fotometrii, aby określić nazwę pliku.
6. W oknach oprogramowania do nagrywania kamer zachowań kliknij 'rozpocznij nagrywanie' dla każdej kamery. Następnie naciśnij przycisk odtwarzania w workflow wizualnego kodowania systemu fotometrycznego i naciśnij nagrywanie w oprogramowaniu DAQ.
7. Kliknij przełącznik TTL, aby rozpocząć nagrywanie synchronicznie na wszystkich kamerach.
8. Koniec nagrania.
  1. Kliknij przełącznik TTL, aby zakończyć synchroniczne nagrania kamery
  2. Naciśnij przycisk stop w procesie wizualnego kodowania dla systemu fotometrycznego, "zatrzymaj nagrywanie" w oknach nagrywania kamery zachowania.
9. Powtarzaj kroki 3.7.5–3.7.8 aż do końca eksperymentów i odłącz mysz.
  UWAGA: Po eksperymentach strumienie fotometrii i danych z kamery zachowań mogą być wyrównane z niestandardowym kodem za pomocą wyjścia oprogramowania DAQ. Konkretnie, (1) zmiana napięcia TTL wskazuje czas wejścia i przesunięcia TTL, (2) zmiany w zachowaniu napięcia kamery wskazują, kiedy migawka aparatu otwiera się i zamyka, aby uchwycić każdą klatkę wideo zachowania, oraz (3) początkowa zmiana napięcia systemu fotometrycznego zarejestrowana na DAQ może być porównana z czasem wejścia TTL oraz znacznikami czasu kamery z oprogramowania do wizualnego kodowania, aby określić znaczniki czasu fotometryczne kamery.

4. Przetwarzanie danych (Rysunek 1D, Plik Uzupełniający 9)

Dane obrazowe wapnia przed przetwarzaniem.
1. Usuń klatki z danych obrazowania wapnia, aby uzyskać oddzielne strumienie sygnału rejestrowane w odpowiedzi na diody LED o częstotliwości 415 nm, 470 nm i 560 nm.
2. Do korekty dryfu bazowego stosuj algorytm Adaptive Iteratively Reweighted Penalized Least Squares (airPLS)⁴⁴ .
3. Oblicz ΔF/F używając:
  
  UWAGA: Okres wyjściowy powinien być stabilną epoką przed eksperymentalną manipulacją (np. przed wprowadzeniem partnera społecznego). Jeśli okres bazowy jest zbyt krótki (<2–3 min) lub wykazuje duże wahania, które mogą być skażone artefaktami ruchu, rozważ normalizację przy użyciu średniej fluorescencji przez całą sesję zamiast ograniczonego okresu bazowego.
Poprawne dla artefaktów ruchu (rysunek 4A).
1. Stosuj podejście oparte na regresji, choć odpowiednie są alternatywne metody (patrz Tabela 2)
2. Sygnały Z-score ΔF/F wykorzystujące medianę do normalizacji amplitudy sygnału w różnych regionach:
3. Zastosuj regresję Lasso z regularizacją L1. Lasso (operator najmniejszego bezwzględnego kurczenia i selekcji) wykonuje automatyczny wybór cech poprzez zmniejszanie współczynników nieinformacyjnych predyktorów w kierunku zera.
  1. Przeprowadź przeszukiwanie siatki według parametrów regularizacyjnych (α = 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100). Przeszukiwanie siatki identyfikuje optymalną równowagę między złożonością modelu a nadmiernym dopasowaniem. Ten krok można w pełni zautomatyzować za pomocą procedur walidacji krzyżowych dostępnych w standardowych bibliotekach uczenia maszynowego (np. scikit-learn w Pythonie).
  2. Dla fotometrii dwukolorowej (nasze zalecane podejście) użyj wszystkich dostępnych 415 nm izozbesticznych kanałów kontrolnych w 12 obszarach rejestracji jako predyktorów (patrz Rysunek 4B–C i Wyniki dla uzasadnienia). Dla fotometrii jednokolorowej (tylko GCaMP lub tylko RCaMP) ogranicz macierz predyktorową tylko do sygnału izobesticznego z tego samego włókna, co korygowany sygnał wapniowy.
  3. Wybierz model, który minimalizuje średni kwadratowy błąd między sygnałem przewidywanym a obserwowanym.
4. Odejmij przewidywaną składową ruchu od sygnału, aby uzyskać skorygowaną aktywność.
Wygładz sygnał za pomocą filtra Savitzky-Golay z czasem 725 ms.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby jednocześnie rejestrować z maksymalnie 12 obszarów mózgu SBN, zbudowaliśmy konfigurowalną matrycę wielowłóknową zgodnie z powyższym protokołem. Po powrocie do zdrowia po operacji myszy były rejestrowane podczas interakcji społecznych (Rysunek 5). We wszystkich eksperymentach samce myszy z grupy CD1 mogły wchodzić w interakcje z samcami myszy Balb/c w ich domowej klatce. Użyliśmy myszy Vgat-Cre do ekspresji jRCaMP1b⁴⁰ w neuronach GABAergicznych w sposób zależny od Cre w 11 obszarach mózgu SBN, GCaMP6f³⁹ w komórkach nie-GABAergicznych w sposób wykluczający Cre⁴⁵ w tych samych obszarach mózgu oraz GRAB-DA1m³³ w jądrze accumbens⁴² (Tabela 1). Histologiczne potwierdzenie targetowania światłowodów można znaleźć w naszych wcześniejszych publikacjach^42,43. Tutaj chcieliśmy przetestować wydajność różnych metod korekcji artefaktów ruchu. Konkretnie porównaliśmy skuteczność stosowania: (1) samego filtra mediany; (2) regresja lasowa z regularizacją L1, wykorzystująca wyłącznie sygnały izosbesticzne tego samego światła (podejście pojedynczego predyktora)¹¹ oraz (3) regresja lassowa z wykorzystaniem sygnałów izobesticznych ze wszystkich światłowodów jako predyktorów (podejście multi-predyktorów)^41,42 (Rysunek 4A). Co istotne, metody oparte na Lasso korygują sygnał surowy, wykorzystując niezależny od aktywności sygnał fluorescencjonalny generowany w odpowiedzi na diodę LED o częstotliwości izobestowej (415 nm), podczas gdy wygładzanie filtra medianowego nie uwzględnia sygnału niezależnego od aktywności.

Ocenialiśmy korekcję ruchu za pomocą dwóch różnych miar: absolutnego szumu wysokiej częstotliwości oraz drgań. Szum wysokich częstotliwości został zdefiniowany jako odchylenie standardowe pierwszej pochodnej sygnału, które odzwierciedla wielkość szybkich fluktuacji sygnału. Jitter definiowano jako współczynnik zmienności pochodnej sygnału, który odzwierciedla wielkość zmienności sygnału klatka do klatki względem średniej pochodnej sygnału. Stwierdziliśmy, że oba podejścia oparte na Lasso (pojedynczy i wielopredyktorowy) znacznie przewyższały medianowy filtr pod względem redukcji zarówno szumu wysokich częstotliwości, jak i jitterów, przy czym korekcja wielopredyktorowa nieznacznie przewyższała korekcję pojedynczej predyktorowej (Rysunek 4C–D; Szum wysokich częstotliwości, n=414 dla 23 sygnałów na 18 sesjach nagraniowych: test Kruskala-Wallisa, H = 501,9420, s. < 0,001; Post-hoc testy Mann-Whitney U z korektą Bonferroniego: Regresja wygładzona vs jednomiejscowa ***p < 0,001, wygładzona vs wielomiejscowa regresja***p < 0,001, jednomiejscowa vs wielomiejscowa **p = 0,0073; Jitter: test Kruskala-Wallisa, H = 495,6685, s. < 0,001; post-hoc testy Mann-Whitney U z korektą Bonferroniego: Wygładzony vs regresja pojedynczego miejsca ***p < 0,001, Wygładzony vs regresja wielomiejscowa***p < 0,001, Jednomiejscowy vs wielomiejscowy ***p = 0,0006). Konkretnie, podejście multi-predyktorowe (wykorzystujące wszystkie izozbestiki światłowodowe) wykazało korzyści dla sygnałów kanału czerwonego (RCaMP): 5 z 12 sygnałów czerwonych wykazywało znacząco niższy szum resztkowy w porównaniu z korekcją pojedynczego predyktora (n = 18 nagrań/region). Dla jittera BNST (t-test, t = 5,42, ***p < 0,001), POA (t-test, t = 2,68, *p = 0,011), AH (t-test, t = 2,66, *p = 0,012) oraz PAG (test Mann-Whitney U, U = 279, ***p < 0,001) wykazały przewagę w multi-predyktorach. Dla szumu wysokich częstotliwości BNST (test Mann-Whitney U, U = 285, ***p < 0,001), POA (test Mann-Whitney U, U = 292, ***p < 0,001), AH (test t, t = 7,10, ***p < 0,001), PAG (test t, t = 13,72, ***p < 0,001) oraz LHb (test t, t = 5,47, ***p < 0,001) wykazały przewagę w multi-predyktorach. Sygnały Green Channel (GCaMP) nie wykazały istotnych różnic między dwoma podejściami Lasso we wszystkich 12 regionach pod względem zarówno metryk szumu jitter, jak i wysokiej częstotliwości (wszystkie na stronie s>0.05, pełna lista testów statystycznych zobaczy Tabelę 3). Sugeruje to, że w fotometrii dwukolorowej włączenie informacji izobesticznych międzykanałowych poprawia korekcję ruchu sygnałów czerwonych, prawdopodobnie dlatego, że izozbestia z zielonych kanałów dostarcza czystszych informacji o ruchu. Dane te pokazują, że korekcja artefaktów ruchu z wykorzystaniem metod regresji opartej na izobestie znacznie przewyższa proste metody filtrowania, a regresja wielokanałowa zapewnia szczególne zalety dla nagrań dwukolorowych.

figure-results-1
Rysunek 1. Rejestrowanie z Social Behavior Network za pomocą wielomiejscowej, dwukolorowej fotometrii światłowodowej. (A) Schematyczne przedstawienie sposobu budowy wieloświatłowodowej matrycy. (B) Schematyczne przedstawienie przepływu pracy chirurgicznej. (C) Schematyczne przedstawienie dwukolorowych eksperymentów obrazowania wapnia. (D) Przykład wykorzystania sygnału izobesticznego do obliczenia sygnału korygowanego ruchem. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2. Zdjęcia kluczowych procedur w produkcji i operacji. (A) Wykonany patchcord gotowy do nagrywania. (B) Wielowłóknowa matryca umieszczona w niestandardowym stereotaktycznym uchwytie z wiertłem 0,25 mm x 5,5 mm umieszczonym nad otworem przez światłowód. (C) Wielowłóknowa matryca z oczyszczonymi otworami przez włókna i przyklejonymi nakrętkami sześciokątnymi. (D) Cięcie włókna za pomocą skrybatora do włókien. (E) Wielowłóknowa matryca, z wszystkimi włóknami sklejonymi superglue i umieszczonymi na niestandardowym płycie do polerowania. (F) Powiększony widok sposobu ustawienia i przykręcenia złącza patchcorda do wieloświatłowodowej matrycy. (G) W pełni zbudowana sieć wielowłóknowa z przyklejonymi kołkami do kołków. (H) Mysz przymocowana do stereotaktycznej ramy z nacięciem na skórze głowy odsłaniając czaszkę. (I) Wykonana matryca wielowłóknowa przymocowana do manipulatora stereotaktycznego do manewrowania matrycą wielowłóknową podczas operacji. (J) Powiększony widok na wielowłóknową matrycę opuszczaną do mózgu. (K) Wielowłóknowa matryca całkowicie opuszczona i przymocowana do czaszki cementem dentystycznym. (L) Wielowłóknowa matryca na zwierzęciu, która jest bezpiecznie podłączona do patchcorda przed nagraniem. (M) Widok z oddalonym widokiem zwierzęcia w klatce z podłączonym kablem patch przed i/lub podczas nagrywania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3. Spektralne rozdzielenie. Przykładowe ślady wykazujące minimalne przesłuchy spektralne między wskaźnikami wapnia. Sygnały GCaMP6f (niebieskie) wykazują solidną aktywację podczas wzbudzenia 470 nm, ale pomijalną odpowiedź na wzbudzenie 560 nm. sygnały jRCaMP1b (czerwone) wykazują odwrotny wzór z silną aktywacją od 560 nm, ale minimalną odpowiedzią na oświetlenie 470 nm. (A) Jednocześnie nagrywał sygnały GCaMP6f i jRCaMP1b z oświetleniem tylko 470 nm. (B) To samo co (a), ale z oświetleniem tylko 560 nm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4. Porównanie różnych metod przetwarzania sygnałów wielowłóknowych. (A) Schemat przedstawiający wielomiejscową korektę regresji sygnału fotometrycznego. Podejście to obejmuje kolejne etapy przetwarzania, w których wszystkie dostępne sygnały izobesticzne 415nm są liniowo mapowane na każdy sygnał zależny od wapnia. Przewidywane składowe ruchu są odejmowane od tego sygnału, aby uzyskać końcowy odczyt aktywności. sygnały ΔF/F z dwóch sygnałów o silnej obecności artefaktów ruchu. (B) Od góry do dołu: sygnał izobesticzny z tego samego kanału światłowodowy/obrazującego przedstawiający artefakty ruchu, sygnał RCaMP (tylko wygładzony) lub GCaMP (prawy) (filtrowany medianą, zielony), ten sam sygnał regresji światłowodowej/kanału obrazowego (cyjan), sygnał regresji wieloświatłowodowej (niebieski). (C) Left: Średni wynik szumu wysokich częstotliwości dla każdego nagranego sygnału (n = 21 sesji). Szum wysokich częstotliwości obliczany jest jako odchylenie standardowe pierwszej pochodnej każdego sygnału. Wyniki szumów są pokazane dla 1) sygnału skorygowanego linią bazową, ale nieskorygowanego (szary), 2) sygnału skorygowanego i filtrowanego przez medianę (różowy), 3) sygnału regresji bazowej i jednowłóknowej z wygładzeniem Savitsky-Golay (cyjan) oraz 4) sygnału regresji bazowej i wielowłóknowej z wygładzeniem Savitsky-Golay (niebieski). Center: Średni procent szumu usuniętego wyłącznie przy użyciu wygładzania, regresji pojedynczego światłowodu lub wieloświatłowowowy, zagregowany przez wszystkie 23 sygnały. Procent usuniętego szumu oblicza się jako ułamek szumu wysokich częstotliwości powstałego w wyniku korekcji względem całkowitego poziomu szumu w surowym, bazowo skorygowanym sygnale. Dane podawane są jako średnia ± SEM (test Kruskala-Wallisa, H = 501,9420, s. < 0,001; post-hoc testy Mann-Whitney U z korektą Bonferroniego: Wygładzony vs regresja pojedynczego miejsca ***p < 0,001, Wygładzony vs regresja wielomiejscowa***p < 0,001, Jednoomiejscowy vs wielomiejscowy **p = 0,0073). Po prawej: Procent sygnałów, w których szum wysokiej częstotliwości jest statystycznie różny po korekcji opartej na regresji pojedynczego światłowodu i wieloświatłowodowej, rozdzielony według typu sygnału. Dla każdego z 23 sygnałów poziomy szumu po korekcie pojedynczego miejsca porównywano z poziomami szumu po korekcie wielomiejscowej za pomocą niezależnych testów t (jeśli są normalnie rozłożone) lub testów Mann-Whitney U (alternatywa nieparametryczna). Segmenty niebieskie wskazują sygnały, w których korekcja wielomiejscowa skutkowała znacznie mniejszym szumem niż korekcja pojedynczej lokalizacji (p < 0,05). Segmenty szare wskazują sygnały bez istotnych różnic między metodami korekcji. Segmenty cyjanowe wskazują sygnały, w których korekcja pojedynczego miejsca skutkowała znacznie mniejszym szumem. E: Vgat- GCaMP6f. DA: GRAB-DA. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) To samo co (C), ale przedstawiające zmienność klatki do klatki (jitter), obliczane jako pochodna współczynnika zmienności każdego sygnału (test Kruskala-Wallisa, H = 495,6685, s. < 0,001; testy post-hoc Mann-Whitney U z korektą Bonferroniego: Smoothed vs Single-site regression ***p < 0,001, Smoothed vs Multi-site regresse***p < 0,001, Single-site vs Multi-site ***p = 0,0006). Pełną listę testów i wyników statystycznych można znaleźć w Tabeli 3. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5. Wielomiejscowa prezentacja dwukolorowej fotometrii światłowodowej. Reprezentatywne sygnały z wielu typów wskaźników rejestrowane jednocześnie podczas zachowań społecznych (test mieszkanie-intruz, epoka wejścia intruza). Ślady wykazują nieznormalizowane i odejmowane według wartości bazowej, ale nie korygowane przez artefakty ruchu, GCaMP6f (neurony Cre-ujemne), jRCaMP1b (neurony GABAergiczne Vgat-Cre+) oraz GRAB-DA1m (czujnik dopaminy w jądrze przyściennym) w miejscach sieci zachowań społecznych u tego samego zwierzęcia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1. Współrzędne wirusa i długości włókien dla każdego docelowego obszaru mózgu Sieci Zachowań Społecznych. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2. Porównanie metod korekcji artefaktów ruchu dla fotometrii światłowodowej na wielu miejscach. Podstawowe zasady, optymalne zastosowania, zalety i ograniczenia następujących metod korekcji artefaktów ruchu: prosta regresja liniowa, regresja Lasso z regularizacją L1 (z użyciem podejścia wielopredyktorowego), bayesowskie modelowanie generatywne, skalowanie oparte na częstotliwości oraz iteracyjne ponownie ważone metody najmniejszych kwadratów. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3. Szczegóły i wyniki testów statystycznych użytych na Rysunku 4. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1. Plik druku 3D do złącza patchcorda.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. 3D plik druku dla złącza patchcord bez otworów przejściowych.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3. 3D plik druku dla akcesorium do wiercenia stereotaktycznego.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4. Niestandardowy plan do polerowania krążków.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5. 3D plik druku dla wielomiejscowej matrycy fotometrycznej skierowanej do 12 stacji SBN.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6. 3D plik druku dla wielomiejscowej tablicy fotometrycznej bez przejścia przez otwory celujące w lokalizacje.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7. Plik konfiguracyjny DAQ dla oprogramowania DAQ.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8. Plik kodowania wizualnego dla systemu fotometrycznego.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 9. Kod Pythona używany w kroku 4 protokołu oraz do porównań z poprawą artefaktów ruchu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotometria włókien to użyteczna i opłacalna technika rejestrowania aktywności wapnia w populacji z głębokich obszarów mózgu lub określonych typów komórek u swobodnie poruszającego się zwierzęcia³. Jednoczesne nagrywanie z wielu obszarów mózgu pozwala użytkownikowi porównać dynamikę między obszarami lub projekcjami podczas zachowań naturalistycznych lub przygotowań z głową ^5,7,12. Tutaj szczegółowo przedstawiamy metody nagrywania w dwóch kolorach z maksymalnie 12 obszarów mózgu w podkorowej "sieci zachowań społecznych" mózgu, wykorzystując specjalną matrycę światłowodową oraz komercyjnie dostępny system kamer. Poniżej omawiamy kluczowe kroki we wdrażaniu tej metody, potencjalne modyfikacje i strategie rozwiązywania problemów oraz jej znaczenie i ograniczenia w porównaniu z istniejącymi podejściami.

Protokół składa się z trzech głównych faz. Po pierwsze, produkcja wielowłóknowych matryc i patchcordów wymaga wywiercenia niestandardowych części drukowanych 3D w współrzędnych stereotaktycznych, następnie wstawiania światłowodów, polerowania i kontroli jakości, aby zapewnić ≥75% efektywności transmisji światła. Precyzyjne wyrównanie wiercenia (tolerancja ±0,03 mm) oraz dokładne polerowanie są kluczowe. Typowe awarie to wydajność transmisji światła przy słabym poziomie (<75%) oraz zablokowane otwory przez światłowody. Niska wydajność zwykle wynika z niedoskonałości włókna podczas cięcia lub nieprawidłowego polerowania. Rozwiązania obejmują weryfikację, że każdy koniec włókna jest nienaruszony pod mikroskopią jasną przed włożeniem (krok 1.1.6.2), ponowne polerowanie przy użyciu pełnego przesunięcia ziarnistości (6 μm → 0,01 μm, krok 1.1.6.1) oraz upewnienie się, że ostrze tasaka jest ostre. Aby zwiększyć przepustowość, laboratoria mogą wdrażać modyfikacje workflow, takie jak niestandardowe przyrządy do cięcia włókien z wykorzystaniem precyzyjnych etapów translacji lub systemów cięcia laserowego (krok 1.2.4). Producenci komercyjnego druku 3D z wysokoprecyzyjnymi systemami mogą zmniejszyć potrzebę ręcznego wiercenia (kroki 1.1.3–1.1.4, krok 1.2.3), choć dokładność wymiarowa może się różnić w zależności od partii.

Po drugie, implantacja chirurgiczna obejmuje wyrównanie czaszki (tolerancja ±0,03 mm), iniekcje wirusowe w 11–12 miejscach oraz implantację wielowłóknową matrycą, a następnie utrwalenie cementem. Celność celowania jest ograniczona, gdy poziomowanie czaszki przekracza tolerancję. Można to złagodzić, mierząc wysokość wysokości dźwięku w kilku punktach przednich i tylnych oddalonych od siebie o 8,25 mm oraz mierząc przewrót w pozycjach bocznych ±2,0–2,5 mm, przy jednoczesnym zapewnieniu, że drążki na uszach całkowicie stabilizują czaszkę. Pęcherzyki powietrza w mikropipetach do zastrzyków wirusa uniemożliwiają dokładne podanie i wymagają ponownego rozpoczęcia przygotowania mikropipety (krok 2.9). Podczas implantacji wielowłóknowej matrycy unikaj kontaktu cementu z końcówkami włókien, budując cementowe piramidy od powierzchni czaszki w górę (kroki 2.10.3–2.10.5) i pozwól sobie odpowiedni czas schnięcia (≥15 min).

Po trzecie, nagrywanie i przetwarzanie danych obejmuje synchronizację kamer za pomocą systemu DAQ, kalibrację mocy diod LED (0,1 mW wyjście/światłowód, 1,2 mW wyjściowa/12-światłowodny patchcord) oraz wstępne przetwarzanie sygnału za pomocą kontroli izobesticznej. Przedstawiony tutaj potok korekcji ruchu wykorzystuje regresję Lasso, która jest dobrze przystosowana do konfiguracji predyktorów wielokanałowych, ponieważ automatycznie zmniejsza nieinformacyjne predyktory do zera, zachowując tylko te, które znacząco przyczyniają się do korekcji artefaktów. Ta właściwość czyni ją szczególnie korzystną dla fotometrii dwukolorowej: poprzez uwzględnienie sygnałów izobesticznych zarówno z kanałów czerwonych, jak i zielonych jako predyktorów, Lasso selektywnie wykorzystuje kanały przenoszące rzeczywiste informacje o ruchu, co daje znacznie lepszą redukcję szumów w sygnałach kanałów czerwonych (RCaMP) w porównaniu z samą korektą tego samego światłowodu (Rysunek 4C–D). Ponieważ Lasso automatycznie identyfikuje najbardziej informacyjne predyktory, zaleca się stosowanie wszystkich dostępnych kanałów izobesticznych jako wejścia. Niemniej jednak, regresja Lasso jest jedną z kilku poprawnych metod korekcji; alternatywy to bayesowskie modelowanie generatywne⁴⁶, skalowanie oparte na częstotliwości⁴⁷ oraz iteracyjne ważone metody najmniejszych kwadratów (IRLS)⁴⁸, z których wszystkie prawdopodobnie dają porównywalną redukcję artefaktów, z wytycznymi implementacyjnymi podanymi w Tabeli 2. Utrzymująca się niska jakość sygnału mimo zoptymalizowanego wstępnego przetwarzania prawdopodobnie wskazuje na problemy sprzętowe lub chirurgiczne, dlatego należy ponownie przeanalizować kroki 1–2

Poza tymi proceduralnymi względami, fotometria dwukolorowa wprowadza dodatkowe wyzwania techniczne związane z separacją spektralną. Kluczowym aspektem w fotometrii dwukolorowej jest zarządzanie nakładaniem się spektralnym między zielonymi a czerwonymi wskaźnikami wapnia. Choć całkowite wyeliminowanie przesłuchu widmowego jest trudne ze względu na nakładające się widma emisji GCaMP i RCaMP, nasze podejście do multipleksacji czasowej z przeplatanym wzbudzeniem LED (470 nm dla GCaMP, 560 nm dla RCaMP, 415 nm izobesticznym) oraz zoptymalizowanymi filtrami emisyjnymi pasma znacznie łagodzi ten problem. W praktyce obserwujemy minimalne przesłuchy: stymulacja 470 nm wywołuje znikomą aktywność w czerwonym kanale, a odwrotnie w zielonym kanale 560 nm (Rysunek 3). Naukowcy zaniepokojeni pozostałym nakładaniem się spektrów mogą dodatkowo optymalizować swoje systemy, wybierając filtry emisyjne o wąskopasmowym zakresie z maksymalną separacją spektralną w zależności od ich specyficznych kombinacji wskaźników.

W porównaniu z innymi podejściami do dużych rejestracji neuronowych, dedykowana dwukolorowa wielomiejscowa fotometria światłowodowa oferuje wiele istotnych zalet. Po pierwsze, podczas gdy fotometria pojedynczych włókien ^1,2,3, współczesne zapisy zewnątrzkomórkowe ^4,6 ^{czy obrazowanie} powierzchni kory ^8,9 są ograniczone do pojedynczego lub przestrzennie ograniczonego zestawu obszarów mózgu (np. na powierzchni kory), konfigurowalny projekt druku 3D, który tutaj przedstawiamy, pozwala na celowanie do 12 obszarów mózgu w dowolnym miejscu mózgu z 200 μm światłowody. Dla porównania, komercyjnie dostępne tulejki wielowłóknowe ^5,7 obsługują tylko światłowody o średnicy 100 μm i są podobnie ograniczone do ograniczonego zestawu obszarów mózgu bezpośrednio brzusznych względem liniowej matrycy tulejki. Jeśli chodzi o celowanie i rejestrowanie z konkretnych obszarów mózgu, głównym kompromisem jest średnica włókna a pole widzenia systemu fotometrycznego. Trójwymiarowe matryce wielowłóknowe wyposażone w światłowody o średnicy 200 μm rejestrują z większego obszaru na każdym miejscu w porównaniu do komercyjnie dostępnych tulejek wielowłóknowych. W obecnym protokole pole widzenia kamery systemu fotometrycznego ogranicza nagrywanie do 12 światłowodów na 200 μm. Ograniczenie to można przezwyciężyć, zmniejszając średnicę światłowodu do 100 μm dla maksymalnie 60 światłowodow lub budując niestandardowy system fotometryczny z większym obiektywem kamery.

Wreszcie, ta konfigurowalna, dwukolorowa wielomiejscowa platforma fotometrii światłowodowej została wykorzystana do podłużnego śledzenia dynamiki aktywności nerwowej dwóch genetycznie różnych populacji nerwowych w 11-12 regionach mózgu. Stosując strategię Cre-in/Cre-wykluczającą wyrażającą zależne od Cre RCaMP i wykluczające Cre GCaMP w populacjach SBN u myszy Vgat-cre, zarówno agresywne doświadczenia, jak i obserwacje wykazały wspólne wzorce dynamiki aktywności w skali SBN podczas przyszłych defensywnych interakcji społecznych⁴². Stosując tę samą strategię wirusową u myszy Esr1-cre do rejestrowania z neuronów ekspresji i nieekspresji receptora alfa estrogenu, specyficzne dla terytorium wzorce zachowań społecznych zostały powiązane z szybkim, hormonalnie wrażliwym reskalowaniem kodu działania społecznego obejmującym SBN, zwiększając aktywność związaną z zachowaniem na terytorium macierzystym⁴³. Te specyficzne dla terytorium różnice w zachowaniu i kodowaniu sieci wymagają krążenia testosteronu u samców myszy. Podczas gdy te badania wykorzystywały podejście wirusowe i jedną linię Cre, przyszłe badania mogą rozszerzyć te metody o intersekcyjne podejścia wirusowe, genetycznie ekspresyjne wskaźniki wapnia lub fluorescencyjne raportery sygnalizacji neuromodulatorów i neuropeptydów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie pochodziło od NIH K99MH135212 (dla E.M.G.), NIH F32MH126562 (dla E.M.G.), DP2MH126375 (dla A.L.F.), NIH R01MH126035 (dla A.L.F.), NYSCF (do A.L.F.), Simons Foundation (SCGB) (dla A.L.F.), Klingenstein Foundation (dla A.L.F.) oraz Alfred P. Sloan Fellowship (dla A.L.F.), McKnight Foundation (A.L.F). Instytut Allena (A.L.F). A.L.F. jest badaczem Robertsona w New York Stem Cell Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wiertło #76	Miasto wiertła	#76
Wiertło #78	Miasto wiertła	#78
Wiertło #92	Miasto wiertła	#92
0,01 μ Arkusze polerskie m grit	ThorLabs	LFCF2
Wiertła 0,25 mm x 5,5 mm	Miasto wiertła	Produkt niestandardowy	Wiertło 0,25 x 5,5 mm, skontaktowano się z firmą w celu budowy
1 μ Arkusze polerskie m grit	ThorLabs	LF1D
12 rozgałęzień światłowodow	Soczewka doryjska	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 μ Światłowód m	ThorLabs	FT200UMT
3 μ Arkusze polerskie m grit	ThorLabs	LF3D
30 μ Arkusze polerskie m grit	ThorLabs	LF30D
6 μ Arkusze polerskie m grit	ThorLabs	LF6D
Szwy chłonne	Ethicon	J421H
Dokumentacja adaptacyjnej iteracyjnie ważonej metody najmniejszych kwadratów	Google	Nie ma	https://code.google.com/archive/p/airpls/
Stalowe kołki kołkowe	McMaster-Carr	98381a983
Kamery behawiacyjne	Teledyne FLIR	Blackfly S
Bonsai	Fundacja Bonsai Software	Wersja 2.9.0
Mikroskop Brightfield	Leica	ES2
Zaciski bulldog	FineScienceTools	18038-45
DAQ	Obliczenia pomiarowe	Seria DAQ MC USB-200
Oprogramowanie DAQ	Obliczenia pomiarowe	DAQami
Ćwiczenie	Instrumenty Kopf	Model 1911 Stereotaksowy Drill
Tasak do włókien	ThorLabs	XL411/CLVB
System fotometrii światłowodowej	Neurofotometria	FP3002
Instrukcja systemu fotometrii światłowodowej	Neurofotometria	Nie ma	Instrukcja obsługi urządzenia do hostingu stron internetowych: https://neurophotometrics.com/documentation
Skryb światłowodny	ThorLabs	S90C
Zbieracz włókna	ThorLabs	T10S13
Cienkie kleszcze	FineScienceTools	11252-00
Nożyczki cienkie	FineScienceTools	14084-08
Śruby napędowe G5	Otwarte miejsce produkcji Ephys	OEPS-7105
Śrubokręt G5	Otwarte miejsce produkcji Ephys	OEPS-7121
GCaMP6f	Laboratorium Neuroinżynierii Wirusów PNI	EF1a-Cre out-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
GRAB-DA	Addgene	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
Poduszka grzewcza	Zręczne Materiały Medyczne	HTP-1500
System grzewczy	Kent Scientific	RT-0515
Izofluran	Covetrus	29405
jRCaMP1b	Addgene	pAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
M0.6 Mosiężne nakrętki sześciokątne	MetricScrews.us	21614
Odczynniki i narzędzia cementowe metabond	Parkell	S380
MicroFine wydruki 3D z żywicy podobnej do ABS	ProtoLabs	Produkt niestandardowy	Zobacz Pliki Kodu Uzupełniającego 1-3, 5, 6
Nanolitrowy wtryskiwacz	Drummond Scientific Company	Nanoject II	Nanolitrowy wtryskiwacz
Arkusze wosku parafinowego	Amcor	ParaFilm M Wielofunkcyjny Laboratoryjny
Pipetter	ThermoFisher Scientific	4641310N
Polerowanie krążka	Warsztat maszynowy Wydziału Fizyki Uniwersytetu Princeton	Produkt niestandardowy	Zobacz Plik Kodu Uzupełniającego 4
Miernik mocy	ThorLabs	PM100D
Maść optyczna puraluby	Dechra	P1490-1
Python	Python Software Foundation	Nie ma
Miękka plastikowa rurka do patchcorda	McMaster-Carr	3774N4
SpinView	Teledyne FLIR	Wersja 1.25.0.52	Oprogramowanie do obrazowania sterujące kamerami zachowania
Stereotaktyczna rama	Instrumenty Kopf	Model 1900
Dokumentacja TMAC	Nie ma	Nie ma	Kod TMAC: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
Rurki do ramy stereotaktycznej	Saint-Gobain	E-3603
Waporyzator	Kent Scientific	VetFlo Vaporizer

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494 (7436), 238-242 (2013).
Adelsberger, H., Zainos, A., Alvarez, M., Romo, R., Konnerth, A. Local domains of motor cortical activity revealed by fiber-optic calcium recordings in behaving nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (1), 463-468 (2014).
Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
Steinmetz, N. A., et al. Neuropixels 2.0: A miniaturized high-density probe for stable, long-term brain recordings. Science. 372 (6539), (2021).
Guo, Z., et al. Neural dynamics in the limbic system during male social behaviors. Neuron. 111 (20), 3288-3306.e4 (2023).
Ma, Y., et al. Wide-field optical mapping of neural activity and brain haemodynamics: considerations and novel approaches. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1705), 20150360(2016).
Musall, S., Kaufman, M. T., Juavinett, A. L., Gluf, S., Churchland, A. K. Single-trial neural dynamics are dominated by richly varied movements. Nature Neuroscience. 22 (10), 1677-1686 (2019).
Zhou, Z. C., et al. Deep-brain optical recording of neural dynamics during behavior. Neuron. 111 (23), 3716-3738 (2023).
Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. JoVE. (152), e60278(2019).
Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
Newman, S. W. The Medial Extended Amygdala in Male Reproductive Behavior A Node in the Mammalian Social Behavior Network. Annals of the New York Academy of Sciences. 877, 242-257 (1999).
Goodson, J. L. The vertebrate social behavior network: Evolutionary themes and variations. Hormones and Behavior. 48 (1), 11-22 (2005).
O’Connell, L. A., Hofmann, H. A. Evolution of a Vertebrate Social Decision-Making Network. Science. 336 (6085), 1154-1157 (2012).
Wu, M. V., Tollkuhn, J. Estrogen receptor alpha is required in GABAergic, but not glutamatergic, neurons to masculinize behavior. Hormones and Behavior. 95, 3-12 (2017).
Moffitt, J. R., et al. spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region. Science. 362 (6416), eaau5324(2018).
Gegenhuber, B., Wu, M. V., Bronstein, R., Tollkuhn, J. Gene regulation by gonadal hormone receptors underlies brain sex differences. Nature. 606 (7912), 153-159 (2022).
Knoedler, J. R., et al. A functional cellular framework for sex and estrous cycle-dependent gene expression and behavior. Cell. 185 (4), 654-671.e22 (2022).
Musatov, S., Chen, W., Pfaff, D. W., Kaplitt, M. G., Ogawa, S. RNAi-mediated silencing of estrogen receptor in the ventromedial nucleus of hypothalamus abolishes female sexual behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (27), 10456-10460 (2006).
Lee, H., et al. Scalable control of mounting and attack by Esr1+ neurons in the ventromedial hypothalamus. Nature. 509 (7502), 627-632 (2014).
Hashikawa, K., et al. Esr1+ cells in the ventromedial hypothalamus control female aggression. Nature Neuroscience. 20 (11), 1580-1590 (2017).
Fang, Y. -Y., Yamaguchi, T., Song, S. C., Tritsch, N. X., Lin, D. A Hypothalamic Midbrain Pathway Essential for Driving Maternal Behaviors. Neuron. 98 (1), 192-207.e10 (2018).
Wei, Y. -C., et al. Medial preoptic area in mice is capable of mediating sexually dimorphic behaviors regardless of gender. Nature Communications. 9 (1), 279(2018).
Yamaguchi, T., Wei, D., Song, S. C., Lim, B., Tritsch, N. X., Lin, D. Posterior amygdala regulates sexual and aggressive behaviors in male mice. Nature Neuroscience. 23 (9), 1111-1124 (2020).
Yang, B., Karigo, T., Anderson, D. J. Transformations of neural representations in a social behaviour network. Nature. , (2022).
Jacobowitz, D. M., O’Donohue, T. L. alpha-Melanocyte stimulating hormone: immunohistochemical identification and mapping in neurons of rat brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (12), 6300-6304 (1978).
Flanigan, M. E., et al. Orexin signaling in GABAergic lateral habenula neurons modulates aggressive behavior in male mice. Nature Neuroscience. 23 (5), 638-650 (2020).
Bayless, D. W., et al. A neural circuit for male sexual behavior and reward. Cell. 186 (18), 3862-3881.e28 (2023).
Dawson, M., et al. Hypocretin/orexin neurons encode social discrimination and exhibit a sex-dependent necessity for social interaction. Cell Reports. 42 (7), 112815(2023).
Iyilikci, O., et al. Age-specific regulation of sociability by hypothalamic Agrp neurons. bioRxiv. , (2025).
Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), eaat4422(2018).
Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496.e19 (2018).
Sun, F., et al. Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo. Nature Methods. 17 (11), 1156-1166 (2020).
Duffet, L., et al. A genetically encoded sensor for in vivo imaging of orexin neuropeptides. Nature Methods. 19 (2), 231-241 (2022).
Ino, D., Tanaka, Y., Hibino, H., Nishiyama, M. A fluorescent sensor for real-time measurement of extracellular oxytocin dynamics in the brain. Nature Methods. 19 (10), 1286-1294 (2022).
Wang, H., et al. A tool kit of highly selective and sensitive genetically encoded neuropeptide sensors. Science. 382 (6672), eabq8173(2023).
Dong, C., et al. Unlocking opioid neuropeptide dynamics with genetically encoded biosensors. Nature Neuroscience. 27 (9), 1844-1857 (2024).
Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, e12727(2016).
Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
Iravedra-Garcia, J. M., Guthman, E. M., Cuturela, L., Ocasio-Arce, E. J., Pillow, J. W., Falkner, A. L. Aggression experience and observation promote shared behavioral and neural changes. bioRxiv. , (2024).
Guthman, E. M., Iravedra-Garcia, J. M., Sirrs, L., Le, A., Falkner, A. L. Context rescales a social action code in a hormone-sensitive network. bioRxiv. , (2025).
Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
Saunders, A., Johnson, C. A., Sabatini, B. L. Novel recombinant adeno-associated viruses for Cre activated and inactivated transgene expression in neurons. Frontiers in Neural Circuits. 6, (2012).
Creamer, M. S., Chen, K. S., Leifer, A. M., Pillow, J. W. Correcting motion induced fluorescence artifacts in two-channel neural imaging. PLOS Computational Biology. 18 (9), e1010421(2022).
Donka, R. M., Loh, M. K., Konanur, V. R., Roitman, M. F., Roitman, J. D. PASTa: An Open-Source Analysis and Signal Processing Toolbox for Fiber Photometry Data. Current Protocols. 5 (7), e70161(2025).
Keevers, L. J., Jean-Richard-dit-Bressel, P. Obtaining artifact-corrected signals in fiber photometry via isosbestic signals, robust regression, and dF/F calculations. Neurophotonics. 12 (02), (2025).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fotometria wiat owodowa aktywno wapniowa neurony genetycznie specyficzne rejestracja w m zgu myszy dostarczanie wirusowe wska niki fluorescencyjne kamera CMOS obrazowanie populacji neuron w

Dwukolorowe wielowłóknowe fotometriczne zapisy sieci zachowań społecznych u myszy

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły