Oczyszczanie i identyfikacja białka przeciwdrobnoustrojowego z zielonej glony Tetraspora Sp. CU2551

Tanaporn Klinsanit; Yothawut Tonawut; Natwikar Laokua; Rawirat Pansomsuay; Wanthanee Khetkorn; Cherdsak Maneeruttanarungroj

doi:10.3791/70066

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie i identyfikacja białka przeciwdrobnoustrojowego z zielonej glony Tetraspora Sp. CU2551

328 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70066

⸱

17 lutego 2026

Tanaporn Klinsanit¹ , Yothawut Tonawut¹ , Natwikar Laokua¹ , Rawirat Pansomsuay¹ , Wanthanee Khetkorn² , Cherdsak Maneeruttanarungroj¹^,³

¹Department of Biology, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang, ²Division of Biology, Faculty of Science and Technology, Rajamangala University of Technology Thanyaburi, ³Bioenergy Research Unit, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje sposób badania nienaruszonych białek przeciwdrobnoustrojowych przy użyciu wielu technik, w tym optymalizacji buforów ekstrakcji białek, rozbicia komórek glonowych, frakcjonowania białek za pomocą chromatografii jonowymiennej, separacji białek za pomocą SDS-PAGE oraz testów aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Aktywne białko zostało następnie potwierdzone i zidentyfikowane za pomocą analizy LC-MS/MALDI-TOF.

Streszczenie

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) to narastające globalne zagrożenie zdrowotne, które wymaga odkrycia nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Białka i peptydy pochodzące z alg zyskują coraz większą uwagę ze względu na swój potencjał bioaktywny; jednak ustandaryzowane protokoły badania peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) w zielonych glonach, szczególnie Tetraspora sp. CU2551, pozostają ograniczone. Protokół ten opisuje krok po kroku proces izolacji, oczyszczania i charakteryzacji nienaruszonych białek przeciwdrobnoustrojowych z zielonej glony Tetraspora sp. CU2551. Procedura integruje zoptymalizowaną ekstrakcję białek, frakcjonowanie chromatograficzne, separację elektroforetyczną, przesiewowe badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz identyfikację białek. Warunki ekstrakcji białek są najpierw optymalizowane w celu zmniejszenia tła hamującego efektu pochodzącego z komponentów buforowych. Gdy tożsamość aktywnego peptydu jest nieznana, stosuje się test pull-down, aby ocenić wiązanie białek między różnymi żywicami jonowymiennymi oraz poprowadzić wybór odpowiedniej matrycy oczyszczającej. Chromatografia jonowa DEAE-Sepharoza jest odpowiednią metodą wzbogacania frakcji białek przeciwdrobnoustrojowych. Wszystkie frakcje są systematycznie oceniane pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej i analizowane przez SDS-PAGE. Pasmok białkowy odpowiadający najwyższej aktywności antybakteryjnej, wraz z wyraźnym profilem elektroforetycznym, jest usuwany i poddawany analizie LC-MS/MALDI-TOF w celu identyfikacji białka. Proces ten jest dodatkowo uzupełniany analizami in silico , które pozwalają przewidywać właściwości antybakteryjne związane z peptydami za pomocą publicznie dostępnych narzędzi bioinformatycznych. Protokół ten zapewnia wszechstronne ramy do odkrywania białek przeciwdrobnoustrojowych i może być łatwo adaptowany do innych gatunków glonów oraz powiązanych zastosowań biotechnologicznych.

Wprowadzenie

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stanowi rosnące globalne wyzwanie zdrowotne¹, podkreślając znaczenie bieżących strategii identyfikacji nowych środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzących ze źródeł naturalnych. Chociaż coraz więcej badań nad właściwościami antybakteryjnymi białek i peptydów pochodzących z glonów ^2,3. Większość badań koncentruje się na podejściach opartych na peptydach lub hydrolizacie⁴, a standaryzowane metody zachowania i oceny aktywności całych białek gon pozostają ograniczone⁵. Niniejszy artykuł opisuje metodę mająca na celu izolowanie, oczyszczanie i ocenę nienaruszonych białek z zielonej glony Tetraspora sp. CU2551 pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej.

Protokół opisuje krok po kroku proces obejmujący ekstrakcję całych białek, frakcjonowanie za pomocą chromatografii jonieniennej, ocenę właściwości antybakteryjnych, separację białek na bazie żelu, identyfikację białek za pomocą spektrometrii masowej oraz prognozowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych z wykorzystaniem technik in silico. Skuteczność środków antybakteryjnych ocenia się za pomocą standardowych testów dyfuzji agarowej i hamowania wzrostu w cieczy na typowych szczepach bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych ^4,6. Takie podejście umożliwia powiązanie zidentyfikowanej aktywności przeciwdrobnoustrojowej z konkretnymi frakcjami białek lub pasmami elektroforetycznymi, zamiast polegać na trawionych mieszaninach peptydowych lub wyłącznie na przewidywaniach obliczeniowych, które mogą nie identyfikować białek przeciwdrobnoustrojowych lub sekwencji podobnych do AMP poza kanonicznymi definicjami bazy^danych ^7,8.

Stosowanie tego protokołu pozwala czytelnikom niezawodnie uzyskać bioaktywne frakcje białkowe zawierające potencjalne sekwencje białek przeciwdrobnoustrojowych, odpowiednie do przyszłej walidacji i oceny funkcjonalnej. Reprezentatywne wyniki wskazują na identyfikację frakcji bioaktywnych zawierających zarówno znane, jak i nieznane kandydaty na białka. Protokół ten zapewnia wszechstronne i praktyczne ramy do identyfikacji substancji przeciwdrobnoustrojowych z nienaruszonych białek pozyskiwanych z glonów i innych źródeł biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to nie obejmowało uczestników ludzkich, zwierząt ani kręgowców. Wszystkie procedury eksperymentalne były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa i etyki badań Szkoły Nauk, Instytutu Technologii Króla Mongkuta w Ladkrabang (KMITL), Tajlandia. Wszystkie eksperymenty mikrobiologiczne przeprowadzono w warunkach laboratoryjnych poziomu 2 (BSL-2) według WHO oraz krajowego standardu biobezpieczeństwa⁹.

Noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego, w tym fartuchów laboratoryjnych, rękawiczek i masek na twarz, przez wszystkie procedury eksperymentalne. Zbieranie i utylizacja odpadów chemicznych oraz zawierających srebro zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego zarządzania odpadami niebezpiecznymi przed wysłaniem ich do licencjonowanej firmy zajmującej się gospodarką odpadami.

Przygotuj skoncentrowane roztwory zapasowe niebezpiecznych chemikaliów, w tym siarczan sodu dodecylowy, β-merkaptoetanol oraz odczynniki do barwienia srebra zawierające formaldehyd, w okapie oparniowym. Przeprowadzaj eksperymenty z użyciem niskich stężeń roboczych i małych objętości na stole laboratoryjnym zgodnie ze standardowymi praktykami bezpieczeństwa laboratoryjnego.

1. Kultura glonów

UWAGA: Utrzymuj warunki aseptyczne przez cały okres uprawy glonów.

Przygotowanie hodowli startowej
1. Przygotuj sterylne medium TAP (pH 7,0)¹⁰ i podaj 150 mL do sterylnych kolb Erlenmeyer o pojemności 500 mL.
2. Zaszczep podłoże nocną hodowlą 1% (v/v) Tetraspora sp. CU2551 w ośrodku aseptycznym w szafce klasy I.
3. Inkubuj hodowle w inkubatorze wstrząsającym wyposażonym w światło w temperaturze 35 °C, 120 obr./min i 45,9 μmol/m²/s przez 48 godzin. Wykorzystaj w pełni dorosłą kulturę jako punkt wyjścia do kultury skalowania.
Hodowla skalowa i pobieranie komórek
1. Przelej 25 mL hodowli zakwasowej do 275 mL świeżego, sterylnego medium TAP. Inkubować hodowle w tych samych warunkach przez 48 godzin.
2. Komórki glonów należy pozyskać przez wirowanie w dawce 3 800 × g przez 15 minut w temperaturze 25 °C.
3. Osusz granulki komórki raz sterylnie destylowaną wodą i ponownie wiruj w 3 800 × g przez 15 minut w temperaturze 25 °C.
4. Całkowicie usuń supernatant i przechowuj pellety z komórek glonowych w temperaturze −20 °C do dalszego przetwarzania.

2. Formułowanie buforu lizyzowego i przesiewowe hamowanie tła

UWAGA: Obchodz się z SDS i β-merkaptoetanolem w rękawiczkach gumowych lub nitrylowych. Otwórz skoncentrowaną butelkę β-merkaptoetanolu w okapie chemicznym.

Przygotowanie buforu lizy
1. Przygotuj referencyjny bufor^{lizowy 11} , składający się z 10 mM Tris-HCl (pH 9,0) wzbogaconego 0,1% SDS w/v oraz 38 mM β-merkaptoetanolu.
  UWAGA: Kluczowy krok: Optymalizacja stężeń SDS i β-merkaptoetanolu, aby uniknąć fałszywie dodatniej aktywności przeciwdrobnoustrojowej.
2. Przygotuj pełne zestawy czynnikowe buforu lizy, zmieniając zawartość siarczanu sodu dodecylosiarczanu (SDS) (0, 0,01, 0,05 lub 0,1% w/v) oraz β-merkaptoetanolu (0, 0,5, 1 lub 2 mM), co daje 16 formuł.
  UWAGA: Skład wszystkich testowanych formuł buforu lizy jest podsumowany w Tabeli 1. Dodaj β-merkaptoetanol tuż przed użyciem.
Tło badań antybakteryjnych
1. Użyj dziurkacza do papieru, aby przygotować dyski 6 mm z papieru No. 42 Whatman. Nałóż 5 μL każdej formuły buforu lizy na papierowy dysk i wykonaj testy dyfuzji dyskowej zgodnie z wytycznymi CLSI⁶. Inkubuj płytki testowe w temperaturze 37 °C przez 20 godzin i oceniaj strefy hamowania.
  1. Testowe formuły przeciwko Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 oraz Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370.
2. Wybierz formułę bez aktywności hamującej do kolejnej ekstrakcji białka.

3. Ekstrakcja białka

UWAGA: Utrzymywać próbki w niskiej temperaturze podczas sonifikacji i wirowania.

Rozmroź zamrożone pellety glonów (od kroku 1.2.5) w 37 °C i ponownie zamroz w −20 °C. Powtórz cykle zamrażania i rozmrażania (-20 °C / 37 °C) 3 razy.
Dodaj optymalny bufor lizowy (10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,01% SDS, 2 mM β-merkaptoetanolu) do końcowej objętości 5 mL i utrzymuj próbki w lodzie przez cały proces dalszego przetwarzania. Rozbij komórki sondą sondową (25 kHz, 500 W, 40% amplitudy, 1 s włącz/wyłącz, 5 min).
Dodaj koktajl inhibitorów proteazy zgodnie z zaleceniami producenta i delikatnie wymieszaj.
Lizaty w wirówce są w dawce 3 800 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zbierają supernatant jako surowy ekstrakt białkowy.
Ekstrakty przeklarować przez wirowanie w 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zbierać i przechowywać supernatanty w temperaturze 4 °C.

4. Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej

Testy dyfuzji dyskowej
1. Hodować bakterie patogenne (Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 oraz Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370) na agarze odżywczym w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.
2. Za pomocą sterylnej pętli aluminiowej zeskrobaj kolonie z powierzchni agaru i ponownie zawiesij w 0,9% (w/w) NaCl. Dostosuj zawiesiany bakteryjne do standardu 0,5 McFarlanda i równomiernie wymazuj na płytki agaru Mueller-Hinton.
3. Umieść sterylne dyski papierowe na zaszczepionych powierzchniach agaru i nałóż 5 μL próbek testowych. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 16-20 godzin i mierz strefy hamujące za pomocą zacisku Verniera.
  UWAGA: Zachowaj równe odstępy między wszystkimi dyskami.
Determinacja MIC i MBC
1. Przygotuj zawiesiny bakteryjne w stężeniu 2 × 10⁶ CFU/mL w bulionie Mueller-Hinton 4x.
2. Pipeta 50 μL zawiesin bakteryjnych i 100 μL seryjnie rozcieńczonych próbek białek na płytki 96-dołkowe, a wszystkie dołki dostosuj do końcowej objętości 200 μL przy użyciu buforu Tris-HCl o pojemności 10 mM (pH 7,5).
3. Stosuj 5 μL streptomycyny (50 μg) jako dodatniej kontroli. Stosuj 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) oraz 0,9% (z p/w) NaCl jako środki antykoncepcyjne.
4. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 20 godzin i określaj MIC jako najniższe stężenie bez widocznego wzrostu bakterii.
5. Płytowe alikwoty z czystych odwiertów na agar Mueller-Hinton w celu określenia MBC.
Określanie krzywej wzrostu bakterii
1. Przygotuj zawiesiny bakteryjne w stężeniu 1× 10⁶ CFU/mL w 2x bulionie Mueller-Hinton.
2. Inkubuj 100 μL hodowli bakteryjnej z 100 μL próbek białka na płytce z 96 dołkami w temperaturze 37 °C przez 20 godzin.
3. Stosuj 5 μL streptomycyny (50 μg) jako dodatniej kontroli. Stosuj sterylną wodę destylowaną, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) oraz 500 mM NaCl w 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) jako kontrolę.
4. Mierz OD₆₀₀ co 30 minut za pomocą czytnika mikropłyt z orbitalnym przerywanym wstrząsaniem (2 minuty przed pomiarem).
5. Oblicz krzywe wzrostu i konkretne tempo wzrostu.
  UWAGA: Wysokie stężenia białka mogą zakłócać pomiary gęstości optycznej.

5. Analiza pull-down i oczyszczanie białek

Analiza z rozciąganiem w dół
1. Wyrównuj żywicę DEAE-Sepharozę z buforem Tris-HCl o pojemności 10 mM (pH 8,0) lub żywicę CM-Sepharozową z buforem fosforanowym 10 mM (pH 7,0).
2. Wymieszaj 100 μL żywicy zrównoważonej z 500 μL surowego ekstraktu białkowego, a następnie dodaj 100 μL odpowiedniego buforu równowagowego (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 dla DEAE; 10 mM buforu fosforanowego, pH 7,0 dla CM). Inkubuj delikatną inwersją (10 inwersji).
3. Krótko wiruj, pobierz supernatant i oceń aktywność przeciwdrobnoustrojową za pomocą testu dyfuzji dysku.
4. Wybierz żywicę roboczą (DEAE-Sepharose). Do optymalizacji pH wyrównaj żywicę z 10 mM Tris-HCl przy pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 lub 9,0 i wykonaj kroki 5.1.1-5.1.3.
5. Wybierz stan pH wykazujący aktywność przeciwdrobnoustrojową do chromatografii jonowymiennej.
Oczyszczenie białek oparte na chromatografii jonowymienieniowej
1. Upakuj żywicę DEAE-Sepharozową do kolumny chromatografii szklanej (objętość 16 mL łóżka) i wyrównuj z buforem Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) w temperaturze 25 °C dla objętości 10 kolumn.
2. Załaduj 15 mL surowego ekstraktu białkowego (sekcja 3.6) z przepływem 8 mL/min.
3. Przemyj kolumnę buforem równoważającym aż absorpcja przy 280 nm spadnie poniżej 0,05.
4. Białka związane z elutem wykorzystują liniowy gradient NaCl 0-500 mM w 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) na 500 mL przy 8 mL/min.
5. Zbieraj frakcje 5 mL, monitoruj absorpcję na 280 i 220 nm i utrzymuj ułamki na lodzie. Frakcje przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu przesiewu antybakteryjnego i analizy białek.

6. SDS-PAGE i bejcowanie srebrem

UWAGA: Przygotuj roztwory do zabarwiania srebra w okapie chemicznym i noś odpowiedni sprzęt ochronny. Przygotuj wszystkie roztwory na świeżo.

Rozdziel frakcje białkowe za pomocą 12% SDS-PAGE¹² i wizualizuj pasma przez barwienie^{srebrem 13}.
Usuwanie docelowych pasm białek i przesyłanie próbek do analizy MALDI-TOF MS.
Zidentyfikuj białka poprzez wyszukiwanie w bazie danych w NCBInr.

7. Przewidywanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych

Pobierz sekwencje kandydatów białek na podstawie analizy NCBInr.
Ocena potencjału antybakteryjnego za pomocą publicznie dostępnych narzędzi predykcyjnych AMP (np. DBAASP, APD3, AMPScanner, CAMPR4) oraz baz danych.
Ekstrakt wyników predykcji, w tym oceny prawdopodobieństwa antybakteryjnego, klasyfikacji przewidywanej oraz właściwości fizykochemicznych (ładunek netto, zawartość pozostałości hydrofobowych, indeks GRAVY [ExPASy ProtParam] oraz amfipaticzność).
Integruj wyniki obliczeniowe na różnych platformach, aby priorytetowo ustalić kandydatów na białka przeciwdrobnoustrojowe do dalszej weryfikacji.
UWAGA: Przewidywania in silico wspierają selekcję kandydatów i nie stanowią ostatecznej klasyfikacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych.

8. Testy statystyczne

Wszystkie eksperymenty wykonuj w biologicznych trzech egzemplarzach. Analizuj dane za pomocą jednokierunkowej metody ANOVA, a następnie wykonaj test wielokrotnego zakresu Duncana lub odpowiednie analizy post hoc z poziomem ufności 95%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowany workflow oparty na nienaruszonych białkach, integrujący zoptymalizowaną ekstrakcję białek, frakcjonowanie jonowe, przesiewowe badania antybakteryjne oraz identyfikację białek, skutecznie umożliwił wykrywanie bioaktywnych frakcji białek z Tetraspora sp. CU2551. Protokół ten został zaprojektowany tak, aby minimalizować artefakty tła, jednocześnie zachowując integralność natywnych białek, umożliwiając bezpośrednie powiązanie aktywności antybakteryjnej z określonymi frakcjami chromatograficznymi i pasmami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby uzyskać wiarygodne odczyty antybakteryjne za pomocą tego protokołu, należy starannie kontrolować kilka kluczowych kroków, szczególnie podczas ekstrakcji białek i wczesnego przesiewania bioaktywności. Optymalizacja buforu lizy jest niezbędna, ponieważ tło tłumienia ze strony składników buforu jest częstym źródłem fałszywie pozytywnych wyników w przesiewaniu białek przeciwdrobnoustrojowych. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa obserwowana w oryginalnej formulacji buforu¹¹ podkreśla ten problem, bior...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez granty badawcze ze Szkoły Nauk, Instytutu Technologii Króla Mongkuta w Ladkrabang, przyznane C. Maneeruttanarungrojowi (RA/TA-2566-M-013) oraz z Instytutu Technologii Króla Mongkuta w Ladkrabang, przekazanymi Y. Tonawutowi (KREF016329). Analizę spektrometryczną mas przeprowadziła Proteomics Service Unit, Wydział Technologii Medycznej Uniwersytetu Mahidol w Tajlandii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór akrylamidu/bisakrylamidu	Laboratoria Bio-Rad	1610156	Jeśli chodzi o przygotowanie żelu SDS-PAGE Kategoria: Chemikalia
Lampa alkoholowa / Palnik Bunsena	Różne	—	Dla techniki aseptycznej Kategoria: Instrument
AMPScanner	George Mason University (Veltri i in.)	—	Narzędzie do predykcji AMP oparte na głębokim uczeniu Kategoria: Oprogramowanie / Baza danych
Narzędzia do przewidywania peptydów przeciwdrobnoustrojowych (DBAASP, APD3, AMPscanner, CAMPR4)	Różne źródła naukowe	—	Analiza AMP in silico Kategoria: Oprogramowanie / Baza danych
APD3	Laboratorium Wanga, Uniwersytet Nebraski	—	Baza danych peptydów przeciwdrobnoustrojowych Kategoria: Oprogramowanie / Baza danych
Autoklaw	Tomy	—	Sterylizacja mediów i materiałów Kategoria: Instrument
Szafka do Bezpieczeństwa Biologicznego Klasa I/II	Różne	—	Obsługa aseptyczna Kategoria: Instrumenty
BioTool 2.0	Bruker Daltonics	—	Narzędzie do wizualizacji widm i peptydów MS Kategoria: Oprogramowanie
Bradford Reagent	Merck	B6916	Ilościowa ilościowość białek Kategoria: Chemiczne
CAMPR4	Indyjski Instytut Technologii w Bombaju	—	Kolekcja peptydów przeciwdrobnoustrojowych Kategoria: Oprogramowanie / Baza danych
Wirówka, chłodzenie mikrowirówka Eppendorf 5415R	Eppendorf	—	Mikrowirowanie Kategoria: Instrument
Wirówka, Thermo Scientific Megafuge 8R	Thermo Fisher Scientific	—	Wirowanie dużych objętości Kategoria: Instrumenty
Kolumna chromatograficzna (szklana)	Różne	—	Chromatografia jonowo-wymienna Kategoria: Szkło
CM-Sepharose Resin	Merck	CEF100	Żywica kationowo-wymienna Kategoria: Chemikalia (żywica)
Patyczek watowy	Różne	—	Szczepienia bakteryjne< b./> Kategoria: Plastik
Cuvette, Quartz	Hellma Analytics	—	Spektrofotometria UV Kategoria: Szkło
DBAASP	Instytut Chemii Bioorganicznej (Rosja)	—	Baza danych aktywności antybakteryjnej i struktur peptydowych Kategoria: Oprogramowanie / Baza danych
Żywica DEAE-Sepharose	Merck	DEFF100	Żywica wymiany anionowej Kategoria: Chemikalia (żywica)
Kolba Erlenmeyera, 100 mL	Różne	—	Uprawa glonów Kategoria: Szkło
Kolba Erlenmeyera, 500 mL	Różne	—	Uprawa glonów Kategoria: Szkło
Escherichia coli TISTR 074	TISTR, Tajlandia	—	Mikroorganizmy testowe Kategoria: Materiał biologiczny
ExPASy ProtParam	Szwajcarski Instytut Bioinformatyki	—	Narzędzie online do obliczania właściwości fizykochemicznych białek Kategoria: Oprogramowanie / Baza danych
Formaldehyd	Merck	1.04002	Barwienie srebra Kategoria: Chemiczne
Zamrażarka (-20 i stopni; C)	Różne	—	Przechowywanie próbek Kategoria: Instrument
System elektroforezy żelowej (Mini-PROTEAN Tetra)	Laboratoria Bio-Rad	—	SDS-PAGE Kategoria: Instrument
Szklana probówka (16 & razy; 150 mm)	Pyrex / Duran	—	Przykładowe handling Kategoria: Szkło
Rękawice, nitrylowe	Różne	—	Ochrona osobista Kategoria: Plastik
Koktajl inhibitorów proteazy Stop (100x)	Thermo Fisher Scientific	87786	Hamowanie proteazy Kategoria: Chemiczne
Inkubator	Różne	—	Hodowla bakteryjna Kategoria: Instrument
Shaker inkubatorowy	Różne	—	Kultura glonów Kategoria: Instrument
Pętla inokulacyjna	Każdy dostawca laboratoryjny	—	Transfer mikroorganizmów Kategoria: Materiały konsumpcyjne
KCl	Merck	P5405	Przygotowanie buforowe Kategoria: Chemikali
Spektrometr mas MALDI-TOF (Reflex IV)	Bruker Daltonics	—	Identyfikacja białek Kategoria: Instrument
MASKOTKA	Matrix Science	—	Wyszukiwarka do identyfikacji białek za pomocą danych MS Kategoria: Oprogramowanie / Baza danych
MASKOTKA 2.2	Matrix Science	—	Identyfikacja białek Kategoria: Oprogramowanie
Cylinder pomiarowy	Pyrex	—	Pomiar objętości Kategoria: Szkło
Rurka mikrowirówki (1,5 mL)	-	—	Obróbka próbek Kategoria: Plastik
Rurka mikrowirówki (2,0 mL)	-	—	Obróbka próbek Kategoria: Plastik
Mikropipeta (100 i pasek; 1000 &mikro; L)	-	—	Obsługa cieczy Kategoria: Instrumenty
Mikropipeta (1– 10 & mikro; L)	-	—	Obsługa cieczy Kategoria: Instrumenty
Mikropipeta (1– 5 & mikro; L)	-	—	Obsługa cieczy Kategoria: Instrumenty
Mikropipeta (1– 5 mL)	-	—	Obsługa cieczy Kategoria: Instrumenty
Mikropipeta (20 i dodatek; 200 & mikro; L)	-	—	Obsługa cieczy Kategoria: Instrumenty
Czytnik mikropłyt	BioTek	—	Pomiar OD600 Kategoria: Instrument
Mueller & dash; Agar/Bulion Hinton	Różne	—	Testy antybakteryjne Kategoria: Medium
Nanodrop / Biodrop spektrofotometr	Różne	—	Pomiar białek Kategoria: Instrument
Baza danych NCBInr	Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej	—	Nieredundantna baza danych białek Kategoria: Oprogramowanie / Baza danych
Agar odżywczy	-	—	Hodowla bakteryjna Kategoria: Medium
Papierowy dysk (6 mm)	Whatman nr 42	—	Test dyfuzji dyskowej Kategoria: Plastik
Szalka Petriego	Różne	—	Kultura mikroorganizmów Kategoria: Plastik
Miernik pH	Mettler Toledo	—	Regulacja pH Kategoria: Instrument
Bufor fosforanowy (10 mM, pH 7,0)	-	—	Bufor chromatograficzny Kategoria: Bufor
Sonicator sondy (VCX500)	Soniki i Materials Inc.	—	Zakłócenie komórek 500 W, 20 kHz, z sondą Kategoria: Instrument
Lodówka (4 i stopnie; C)	Różne	—	Przechowywanie próbek Kategoria: Instrument
Azotan srebra	Laboratoria Badawcze Sisco	94118	Barwienie srebra Kategoria: Chemiczne
Chlorek sodu (NaCl)	Merck	S9888	Bufor elucijny Kategoria: Chemikalia
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Laboratoria Bio-Rad	11667289001	Liza i PAGE Kategoria: Chemikalia
Spektrofotometr	Shimadzu	—	Pomiar absorpcji Kategoria: Instrument
Wirówka z wyłączeniem obrotu	Eppendorf	—	Szybka wirowanie Kategoria: Instrument
Gronkowec aureus TISTR 746	TISTR, Tajlandia	—	Mikroorganizmy testowe Kategoria: Materiał biologiczny
Streptomycyna	Merck	S9137-25G	Pozytywna kontrola Kategoria: Chemikalia
Tetraspora sp. CU2551	Kolekcja Kultury KMITL	—	Szczep glonów Kategoria: Materiał biologiczny
Medium Tris Acetane Phosphate (TAP)	-	—	Kultura glonów Kategoria: Medium
Tris-HCl	Merck	—	Przygotowanie buforu Kategoria: Bufor
Zacisk Vernier	Różne	—	Pomiar strefowy Kategoria: Instrument
Kąpiel wodna	Różne	—	Kontrola temperatury Kategoria: Instrument
XMASS	Bruker Daltonics	—	Oprogramowanie do spektrometrii mas MALDI-TOF Kategoria: Oprogramowanie
&alfa;-Cyjano-4-hydroksycynaminowy kwas (CHCA)	Bruker Daltonics	—	Macierz MALDI Kategoria: Chemikalia

Bibliografia

Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
Vasquez-Moscoso, C. A., Merlano, J. A. R., Olivera Gálvez, A., Volcan Almeida, D. Antimicrobial peptides (AMPs) from microalgae as an alternative to conventional antibiotics in aquaculture. Prep Biochem Biotechnol. 55 (1), 26-35 (2025).
Mekhalfi, M., Berteina-Raboin, S. Microalgae, cell factories for antimicrobial peptides: a promising response to antibiotic resistance. Antibiotics. 14 (10), 959(2025).
Singh, L. A., et al. Microalgae-derived antioxidants and antimicrobials: a sustainable approach for natural food preservatives. Front Sustain Food Syst. 9, 1669731(2025).
Wang, X., Ma, S., Kong, F. Microalgae biotechnology: methods and applications. Bioengineering. 11 (10), 965(2024).
Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI supplement M100. , 35th ed, Standards Institute Clinical and Laboratory. (2025).
Sun, S. Progress in the identification and design of novel antimicrobial peptides against pathogenic microorganisms. Probiotics Antimicrob Proteins. 17 (2), 918-936 (2025).
Yang, R., et al. Advances in antimicrobial peptides: from mechanistic insights to chemical modifications. Biotechnol Adv. 81, 108570(2025).
Laboratorybiosafety manual. , 4th ed, World Health Organization. (2020).
Bolton, J. Algal culturing techniques. J Exp Mar Biol Ecol. 336, 262-262 (2006).
Tonawut, Y., et al. In silico encrypted peptide from green alga Tetraspora sp. CU2551 showed high antimicrobial activities. Algal Res. 78, 103382(2024).
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
Oakley, B. R., Kirsch, D. R., Morris, N. R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 105 (1), 361-363 (1980).
Zhu, Q., et al. Effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) on microbial community structure and function in lake-terrestrial ecotones: a simulation experiment. Environ Technol Innov. 34, 103594(2024).
Mattern, K. L., Evans, C. A., Lara, J. C. Selective antibacterial action of 2-mercaptoethanol on propionibacteria in skin cultures. Appl Environ Microbiol. 37 (1), 177-179 (1979).
Click, R. E. Review: 2-mercaptoethanol alteration of in vitro immune functions of species other than murine. J Immunol Methods. 402 (1-2), 1-8 (2014).
Ishak, A., Mazonakis, N., Spernovasilis, N., Akinosoglou, K., Tsioutis, C. Bactericidal versus bacteriostatic antibacterials: clinical significance, differences and synergistic potential in clinical practice. J Antimicrob Chemother. 80 (1), 1-17 (2025).
Vaisbourd, E., et al. Principles of bacteriostatic and bactericidal antibiotics at subinhibitory concentrations. mBio. 16 (11), e0206625(2025).
Marciano, C. L., et al. A comprehensive overview of antimicrobial peptides: broad-spectrum activity, computational approaches, and applications. Antibiotics. 14 (11), 1115(2025).
Lu, Z., et al. Studies on the antibacterial activity of the antimicrobial peptide Mastoparan X against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1552872(2025).
Keeratikunakorn, K., Aunpad, R., Ngamwongsatit, N., Kaeoket, K. The effect of antimicrobial peptide (PA-13) on Escherichia coli carrying antibiotic-resistant genes isolated from boar semen. Antibiotics. 13 (2), 138(2024).
Maneeruttanarungroj, C., Lindblad, P., Incharoensakdi, A. A newly isolated green alga, Tetraspora sp. CU2551, from Thailand with efficient hydrogen production. Int J Hydrogen Energy. 35, 13193-13199 (2010).
Brizuela, C. A., Liu, G., Stokes, J. M., de la Fuente-Nunez, C. AI methods for antimicrobial peptides: progress and challenges. Microb Biotechnol. 18 (1), e70072(2025).
Maccari, G., Di Luca, M., Nifosì, R. In silico design of antimicrobial peptides. Methods Mol Biol. 1268, 195-219 (2015).
Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: classification, design, application and research progress in multiple fields. Front Microbiol. 11, 582779(2020).
Alzain, M., et al. Antimicrobial peptides: mechanisms, applications, and therapeutic potential. Infect Drug Resist. 18, 4385-4426 (2025).
Rivero-Pino, F., Millan-Linares, M. C., Montserrat-de-la-Paz, S. Strengths and limitations of in silico tools to assess physicochemical properties, bioactivity, and bioavailability of food-derived peptides. Trends Food Sci Technol. 138, 433-440 (2023).
Curnutte, J. T., Babior, B. M. Biological defense mechanisms: the effect of bacteria and serum on superoxide production by granulocytes. J Clin Invest. 53 (6), 1662-1672 (1974).
Eleftheriadis, T., Pissas, G., Liakopoulos, V., Stefanidis, I. Cytochrome c as a potentially clinically useful marker of mitochondrial and cellular damage. Front Immunol. 7, 279(2016).
Min, L., Jian-xing, X. Detoxifying function of cytochrome c against oxygen toxicity. Mitochondrion. 7 (1), 13-16 (2007).
Mühlhaus, T., et al. Quantitative shotgun proteomics using a uniform N-labeled standard reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol Cell Proteomics. 10 (9), M110.004739(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie bia ek Tetraspora CU2551 ekstrakcja bia ek chromatografia wymiany jonowej przesiewowe badanie aktywno ci przeciwdrobnoustrojowej analiza SDS PAGE identyfikacja LC MS analiza bioinformatyczna

Oczyszczanie i identyfikacja białka przeciwdrobnoustrojowego z zielonej glony Tetraspora Sp. CU2551

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły