Artykuł metodologiczny

Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji płynu mózgowo-rdzeniowego do wykrywania patogenów ośrodkowego układu nerwowego

287 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70075

⸱

17 kwietnia 2026

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół badawczy określa zoptymalizowany sposób pracy dla metagenomicznego sekwencjonowania nowej generacji (mNGS) płynu mózgowo-rdzeniowego. Poprzez rozwiązywanie wyzwań unikalnych dla próbek o niskiej biomasie, metoda umożliwia solidne wykrywanie patogenów w różnych środowiskach zasobów, zapewniając wszechstronną podstawę dla zastosowań badań nad chorobami neurozakaźnymi.

Streszczenie

Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji (mNGS) stało się potężnym narzędziem do bezstronnego wykrywania patogenów oraz profilowania transkrypcyjnego gospodarza w środowiskach klinicznych i badawczych. Chociaż jego przydatność w diagnozowaniu zakażeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest coraz bardziej uznawana, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) stanowią wyjątkowe wyzwania ze względu na niską zawartość kwasów nukleinowych i podatność na degradację. Niniejsze badanie przedstawia zoptymalizowany, oparty na badaniach protokół dla platform sekwencjonowania Illumina, dostosowany do mNGS płynowo-rdzeniowego, obejmującego obsługę próbek, ekstrakcję kwasów nukleinowych, przygotowanie bibliotek, sekwencjonowanie oraz analizę bioinformatyczną. Dostępne są również metody kontroli jakości, dostosowane zarówno do warunków o wysokim, jak i niskich zasobach, w tym alternatywy dla elektroforezy kapilarnej. Badanie to pokazuje odporność protokołu poprzez dwie reprezentatywne grupy: zaawansowany workflow oparty na NovaSeq oraz efektywny na kosztach oparty na NextSeq. W tych kohortach patogeny wykryto w ponad 50% przypadków, co podkreśla potencjał diagnostyczny metody nawet przy adaptacjach ograniczonych zasobami. Protokół ten ułatwia powtarzalne mNGS płynu mózgowo-rdzeniowego, zapewniając podstawę dla różnorodnych zastosowań w badaniach i diagnostyce chorób neurozakaźnych.

Wprowadzenie

Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji (mNGS) to coraz częściej wykorzystywana technika molekularna umożliwiająca wykrywanie szerokiego spektrum kwasów nukleinowych w danej próbce środowiskowej lub gospodarza1. Poprzez amplifikację i sekwencjonowanie zdecydowanej większości materiału genetycznego w próbce, mNGS nie wymaga z góry ustalonej hipotezy dotyczącej konkretnych mikroorganizmów, które mogą być obecne. mNGS wykazał zastosowanie jako narzędzie diagnostyczne w różnych środowiskach klinicznych, takich jak wykrywanie rzadkich patogenów lub nietypowych objawów chorób zakaźnych 1,2,3. Ponadto profil transkrypcji gospodarza jest również rejestrowany przez dane sekwencjonujące RNA generowane przez test mNGS, co pozwala naukowcom lepiej zrozumieć odpowiedź immunologiczną gospodarza na różne stany chorobowe4. Zastosowanie mNGS w szerokim zakresie kontekstów klinicznych i badawczych, wraz z dramatycznym spadkiem kosztów sekwencjonowania generycznego w ostatnich dekadach, doprowadziło do ogromnego wzrostu wykorzystania tej technologii5.

W szczególności mNGS wykazuje obiecujące wyniki w wykrywaniu zakażeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN), które nadal trudno jest zdiagnozować 2,6,7. Przed wprowadzeniem klinicznych testów mNGS, California Encephalitis Project badał przyczyny zapalenia mózgu w całym stanie i stwierdził, że ponad połowa przypadków pozostawała niezdiagnozowana, mimo wykorzystania rozszerzonego panelu badań molekularnych i szczegółowej oceny klinicznej8. Teraz, ponad dwie dekady później, klinicznie potwierdzony test mNGS płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) wykazał obecność patogennych organizmów w płynie możliwym u prawie 15% pacjentów z podejrzeniem zakażeń OUNw ciągu siedmiu lat 7. Ponadto wśród pacjentów z potwierdzoną diagnozą zakaźną jeden na pięciu został zdiagnozowany wyłącznie za pomocą tego klinicznego testu mNGS z mózgowo-rdzeniowym rdzeniem, co podkreśla przydatność tego podejściatestowego 7. Ponadto badania wykazały potencjał przewidywania prawdopodobieństwa różnych zakażeń OUN na podstawie transkryptomu gospodarza generowanego przez test mNGS 9,10,11.

Jednak dostępność tej obiecującej techniki jest ograniczona wyzwaniami charakterystycznymi dla obsługi i przetwarzania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego. W szczególności ilość DNA i RNA z CSF jest często niższa niż minimalna ilość określona przez zestawy przygotowawcze biblioteki12,13. Jakość kwasów nukleinowych może być również nieoptymalna, ponieważ próbki płynu mózgowo-rdzeniowego pobierane do celów klinicznych są często przechowywane w temperaturach, przy których DNA i RNA mogą pozostać aktywne14. Niniejszy artykuł opisuje oparty na badaniach oparty na badaniach protokół mNGS CSF dla platform sekwencjonowania Illumina, który został zoptymalizowany tak, aby zmaksymalizować szanse na generowanie użytecznych danych do wykrywania patogenów (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten został opracowany i przetestowany na podstawie próbek zebranych w ramach badań zatwierdzonych przez Instytucjonalną Radę Przeglądową UCSF.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji (mNGS) i analityczny workflow wykrywania patogenów w zakresie wykrywania patogenów. Ten diagram pokazuje podstawowe etapy w szlakach mNGS w laboratorium i bioinformatycznym mózgowo-rdzeniowym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

1. Rozważania dotyczące obsługi próbek CSF

UWAGA: wyniki mNGS są optymalne, jeśli przygotowanie biblioteki CSF odbywa się w momencie pobierania, lub jeśli próbki CSF są zachowane przez szybkie zamrażanie w ciekłym azocie, a następnie długotrwałe przechowywanie w temperaturze -80 °C15. Alternatywnie, stosowanie roztworów konserwujących, takich jak osłona DNA/RNA, w momencie pobierania próbki może umożliwić przechowywanie w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas16,17. Może to być korzystne w sytuacjach, gdy pojawiają się obawy dotyczące niezawodności łańcucha chłodniczego. Ponadto unikanie niepotrzebnych cykli zamrożenia i rozmrażania może również pomóc zachować integralność kwasów nukleinowych, a zaleca się wcześniejsze aliquotowanie próbek w momencie pobrania, jeśli przewiduje się wiele procesów analitycznych dla próbek CSF18,19.

2. Ekstrakcja kwasu nukleinowego z CSF

UWAGA: Wykonuj pracę w odpowiedniej szafce o poziomie bezpieczeństwa biologicznego, w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym, aby zmniejszyć ryzyko przenoszenia organizmów zakaźnych. Odczynniki są szkodliwe, jeśli zostaną połknięte, wdychane lub mają kontakt ze skórą. Utylizacja zużytych materiałów jako niebezpiecznych odpadów chemicznych zgodnie z lokalnymi przepisami.

  1. Zestaw Quick-DNA/RNA zazwyczaj dobrze sprawdza się w próbkach o niskiej zawartości kwasów nukleinowych.
  2. Rozmroz próbki CSF na lodzie, następnie przelej 100 μL–1 mL każdej próbki do probówki o pojemności 1,5 mL i wiruj w 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  3. Ostrożnie odpipetuj supernatant, pozostawiając za sobą granulkę (która często jest niewidoczna gołym okiem) oraz 100 μL supernatantu.
  4. Dodaj 100 μL tarczy DNA/RNA do pozostałych 100 μL supernatantu i pelletu, a następnie dokładnie wymieszaj pipetą.
  5. Następnie dodaj 600 μL buforu lizycznego DNA/RNA i mieszanki pipet, aż roztwór stanie się jednorodny.
  6. Postępować zgodnie z resztą protokołu ekstrakcji DNA/RNA, opisanym przez producenta w dodatkach uzupełniających A, z następującymi istotnymi modyfikacjami specyficznymi dla płynu mózgowo-rdzeniowego:
    1. Wszystkie etapy wirowania wykonuj przez 1 minutę z maksymalną prędkością (~21 000 x g), z wyjątkiem ostatniego etapu płukania DNA/RNA, który powinien trwać 3 minuty przy maksymalnej prędkości.
    2. Elautuj próbkę, dodając 22 μL (zamiast 25 μL) wody wolnej od nukleazy bezpośrednio do matrycy kolumny, a następnie inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Większa objętość zazwyczaj powoduje większą całkowitą ilość kwasu nukleinowego udzielonego z kolumny.
    3. Po elucii pipetować przepływ z powrotem na matrycę kolumny i ponownie wirować przez minutę z maksymalną prędkością. Przełóż próbkę do nowej probówki magazynowej 1,5 mL i natychmiast przystąpi do przygotowania bibliotecznego lub przechowuj w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie biblioteki RNA CSF

UWAGA: Wykonuj pracę w odpowiedniej szafce zabezpieczeń biologicznych, w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym. Odczynniki są szkodliwe, jeśli zostaną połknięte, wdychane lub mają kontakt ze skórą. Utylizacja zużytych materiałów jako niebezpiecznych odpadów chemicznych zgodnie z lokalnymi przepisami.

UWAGA: Ważne kwestie przed rozpoczęciem: Redukcja rRNA jest preferowana przed wzbogaceniem poliadenylacji przy izolacji mRNA, ponieważ wyczerpanie rRNA nie wymaga dodatkowych kroków czyszczenia kulek (co może zmniejszyć wydajność użytecznego mRNA), a niektóre transkrypcje wirusa RNA neuroinwazyjnego nie mają poliadenylacji. ERCC (Konsorcjum Kontroli Zewnętrznego RNA) RNA Spike-In może być dodane jako środek kontroli jakości, choć nie jest to ściśle konieczne. Jeśli RNA było przechowywane w temperaturze -80 °C po ekstrakcji, rozmrozić na lodzie przed rozpoczęciem.

  1. Fragmentacja i priming RNA: Pipeta miesza następujące składniki w probówce reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR): próbkę RNA o pojemności 3,5 μL, 0,5 μL rozcieńczonego spike-in ERCC spike-in, 4 μL buforu reakcji pierwszej nici (5x), 1 μL zapalników losowych oraz 1 μL rozcieńczonego rRNA w skali 1:100 (Tabela materiałów). W termocyklerze ustaw podgrzewaną pokrywę na 105 °C i inkubuj próbki w temperaturze 75 °C przez 2 minuty, 70 °C przez 2 minuty, 65 °C przez 2 minuty, 60 °C przez 2 minuty, 55 °C przez 2 minuty, 37 °C przez 5 minut i 25 °C przez 5 minut.
  2. Synteza cDNA w pierwszej nici: Pipette miesza rozdrobnione i przygotowane RNA (10 μL) z 8 μL wodą wolną od nukleazy oraz 2 μL mieszanką enzymów do syntezy pierwszej nici. W termocyklerze ustaw podgrzewaną pokrywę na 105 °C i inkubuj próbki w temperaturze 25 °C przez 10 minut, 42 °C przez 15 minut oraz 70 °C przez 15 minut.
  3. Synteza cDNA na drugiej nici: Pipette miesza DNA syntetyzowane z pierwszej nici (20 μL) z buforem reakcji reakcyjnej syntezy drugiej nici o pojemności 8 μL, mieszanką enzymów syntezy drugiej nici oraz 48 μL wodą wolną od nukleazy. W termocyklerze inkubuj próbki przez 1 godzinę w temperaturze 16 °C, z zamkniętą podgrzewaną pokrywką.
  4. Wykonaj oczyszczenie kulek magnetycznych (Supplementary Appendices B) z użyciem proporcji 1,8x kulek magnetycznych SPRI (144 μL). Elutuj do wody wolnej od nukleazy 53 μL i przelej 50 μL ostatniego supernatantu (zawierającego oczyszczone dwuniciowe cDNA) do czystej rurki PCR wolnej od nukleazy. W tym momencie próbki można bezpiecznie zamrozić w temperaturze -20 °C przez noc, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  5. Końcowe przygotowanie biblioteki cDNA: Jeśli próbka była przechowywana w nocy w temperaturze -20 °C, przed ponownym uruchomieniem próbki rozmrozić na lodzie. Pipette miesza oczyszczone ds-cDNA (50 μL) z 7 μL buforu reakcji końcowej oraz 3 μL mieszanki enzymów końcowych.
  6. W termocyklerze inkubuj próbki w temperaturze 20 °C przez 30 minut oraz w 65 °C przez 30 minut, z zamkniętą podgrzewaną pokrywką.
  7. Ligacja adaptera (wykonaj ten krok na lodzie): Stwórz rozcieńczenie adaptera w stosunku 1:100 w wodzie wolnej od nukleazy. Pipetą przełóż mieszaninę reakcji końcowej (60 μL) do probówki zawierającej 30 μL mieszankę ligacyjną, 1 μL wzmacniacz ligacji oraz 2,5 μL rozcieńczony adapter 1:100. Upewnij się, że adapter jest dodawany osobno (np. nie jest wstępnie mieszany z mieszanką ligation master lub wzmacniaczem ligacji), aby uniknąć powstawania dimera adaptera.
  8. W termocyklerze inkubuj próbki w temperaturze 20 °C przez 15 minut, z zamkniętą podgrzewaną pokrywką.
  9. Natychmiast przejść do oczyszczania kulek magnetycznych (Dodatek 2) przy użyciu proporcji 0,9x kulek magnetycznych SPRI (87 μL).
  10. Elutuj do wody wolnej od nukleazy o pojemności 17 μL i przelej 15 μL ostatniego supernatantu do czystej, beznukleazowej rurki PCR
  11. PCR: Pipeta oczyszczone, adapterowo ligowane cDNA (15 μL) do probówki z enzymem USER o pojemności 3 μL, 25 μL mieszanką Q5 Master Mix oraz 10 μL unikalnymi zapalnikami z kodami kreskowymi. W termocyklerze ustaw podgrzewaną pokrywę na 105 °C, inkubuj próbki w 37 °C przez 15 minut, następnie 98 °C przez 30 s, a następnie wykonaj 19 cykli 98 °C przez 10 s i 65 °C przez 75 s. Zakończ PCR inkubacją w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
  12. Wykonaj końcowe oczyszczenie kulek magnetycznych, używając proporcji 0,8x kulek magnetycznych (43 μL). Eluluj do wody wolnej od nukleazy o pojemności 23 μL, a po ostatnim etapie oddzielania kulek przelej 20 μL do czystej rurki PCR wolnej od nukleazy. W tym momencie próbki można bezpiecznie zamrozić w temperaturze -20 °C przez noc, jeśli zajdzie taka potrzeba.

4. Przygotowanie biblioteki DNA w CSF

UWAGA: Wykonuj pracę w odpowiednim szafie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego, w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym. Odczynniki są szkodliwe, jeśli zostaną połknięte, wdychane lub mają kontakt ze skórą. Utylizacja zużytych materiałów jako niebezpiecznych odpadów chemicznych zgodnie z lokalnymi przepisami.

  1. Jeśli wyodrębnione DNA przechowywano w nocy w temperaturze -20 °C, rozmrozić na lodzie przed ponownym uruchomieniem.
  2. Fragmentacja DNA i przygotowanie końcowe: Dokładnie wymieszaj bufor reakcji pierwszej nici, wykonując wiry i mieszając pipetą roztwór, aby ponownie zawiesować wytrącanie. Pipeta miesza 3,5 μL wyodrębnionego DNA, 22,5 μL wody wolnej od nukleazy, 7 μL buforu reakcji pierwszej nici oraz 2 μL mieszanki enzymów pierwszej nici.
  3. W termocyklerze ustaw podgrzewaną pokrywę na 105 °C i inkubuj próbki w 37 °C przez 5 minut, a następnie 65 °C przez 30 minut.
  4. Proces ligacji i kodowania kreskowego PCR jest identyczny dla bibliotek DNA i RNA. Powtórz sekcje 7–10 "Przygotowania biblioteki RNA CSF" z fragmentowanym i przygotowanym DNA, aby zakończyć przygotowanie biblioteki DNA.

5. Kontrola jakości bibliotek i łączenie w puli

  1. Ilościowo określ stężenie bibliotek próbek za pomocą zestawu do ilościowania DNA i odpowiadającego fluorometru. Kontrola wody powinna mieć znacznie niższe (lub niemierzalne) stężenia w porównaniu do pozostałych próbek.
  2. Oceń rozmiar biblioteki próbek, uruchamiając je na zautomatyzowanej maszynie do elektroforezy kapilarnej.
  3. Alternatywnie, jeśli nie jest dostępna zautomatyzowana maszyna do elektroforezy kapilarnej, można dodatkowo wzmocnić 1-2 μL próbki poprzez reakcję PCR z uniwersalnymi zapalnikami Illumina, a następnie wykonać elektroforezę 10 μL produktu końcowego na żelu agarozowym o stężeniu 2%. Utylizacja zużytych materiałów jako niebezpiecznych odpadów chemicznych zgodnie z lokalnymi przepisami.
    UWAGA: Optymalna długość biblioteki to około 400–500 par zasad, dlatego przyszłe inkubacje fragmentacyjne powinny być odpowiednio dostosowane, jeśli rozmiary bibliotek będą większe lub krótsze niż pożądane. Ponadto kluczowe jest ocenenie obecności dimerów adaptera, które mają około 150 par zasad długości i występują, gdy dwie cząsteczki adaptera przypadkowo się ze sobą łączą bez sekwencji wstawek. Nawet jeśli są obecne w niewielkich ilościach, dymery adapterowe mają tendencję do efektywnego skupiania się i sekwencjonowania na komórce przepływowej, zmniejszając udział użytecznych odczytów podczas sekwencjonowania. W związku z tym, jeśli obecne są dimery adaptera, wykonaj dodatkowe oczyszczanie kulek magnetycznych z 0,8x stosunkiem kulek magnetycznych SPRI. (Warto zauważyć, że jeśli >10% próbki to ściemniacz z adaptera, może być potrzebne 2-3 rundy oczyszczania kulek magnetycznych, aby usunąć większość dimerów adaptera).
  4. Aby zapewnić podobną głębokość sekwencjonowania między próbkami w ramach tego samego cyklu sekwencjonowania, konieczne jest połączenie ilości równomolowych każdej próbki. Jeśli rozmiary bibliotek są porównywalne we wszystkich próbkach, wystarczy zgrupować równoważne masy każdej biblioteki RNA i powtórzyć oddzielnie dla każdej biblioteki DNA.

6. Rozważania dotyczące sekwencjonowania

  1. Zebrane próbki są już gotowe do sekwencjonowania na urządzeniach sekwencjonujących Illumina. Jeśli sekwencjonowanie odbywa się wewnętrznie (a nie przez specjalistyczną bazę sekwencjonową), starannie denaturuj i rozcieńczaj zgromadzone biblioteki zgodnie z instrukcjami urządzenia sekwencjonującego przed załadowaniem puli na wkład odczynnikowy (typowe stężenie wynosi 4 nM dla większości platform sekwencjonowania Illumina).
  2. Oblicz szacowaną głębokość sekwencjonowania, dzieląc oczekiwaną wydajność danych dla komórki przepływowej Illumina przez liczbę multipleksowanych próbek w cyklu.
    UWAGA: Określenie pożądanej głębokości sekwencjonowania zależy od kilku czynników, w tym kosztu, używanego urządzenia sekwencjonującego oraz celów eksperymentu. Dwa przykłady różnych głębokości sekwencjonowania przedstawiono poniżej w sekcji Reprezentatywne Rezultaty.

7. Analiza danych w celu wykrywania patogenów

  1. Wykorzystaj otwartoźródłową platformę internetową Chan Zuckerberg ID (CZID, https://www.czid.org, Illumina mNGS Pipeline v8.3) do przeprowadzenia analizy metagenomowej wykrywania patogenów. CZID zawiera także opcje przesyłania próbek przez interfejs wiersza poleceń oraz bezpośredniego przesyłania z konta Illumina BaseSpace do CZID. Szczegółowy przegląd analizy danych mNGS CZID jest dostępny na https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis
  2. Zaloguj się do CZID, kliknij "upload", wybierz "metagenomics" dla typu analizy i wybierz wejściowe pliki fastq z uruchomienia sekwencjonowania. Wprowadź niezbędne informacje dla każdej próbki, w tym nazwę próbki, typ próbki (CSF) oraz nukleotyd (RNA lub DNA).
    UWAGA: Przesłane pliki przechodzą automatyczne przetwarzanie za pomocą pipeline'u CZID, który wykorzystuje kilka narzędzi obliczeniowych, takich jak STAR, Bowtie2, Trimmomatic, PriceSeq i GSNAP, między innymi, aby usunąć niskiej jakości odczyty i sekwencje odczytu ludzkiego. Następnie proces wyrównuje i składa filtrowane sekwencje, wykorzystując bazy danych nukleotydów (NT) i białek (NR) National Center for Biotechnology Information (NCBI) odpowiednio za pośrednictwem programów Minimap2 i DIAMOND. Ostateczny wynik CZID obejmuje liczby taksonów NT/NR oraz liczby kontigów (ciągłe, nakładające się segmenty generowane podczas montażu) dla każdej próbki.
  3. Po przetworzeniu kliknij folder projektu zawierający próbki i przejdź do pulpitu podsumowań.
  4. Przewiń w dół, aby sprawdzić liczbę odczytów na próbkę (i porównaj z oczekiwaną liczbą odczytów na podstawie użytej komórki przepływowej Illumina oraz liczby próbek multipleksowanych w sekwencjonacji), procent odczytów przechodzących przez filtrację kontroli jakości oraz duplikatowy współczynnik kompresji, aby ocenić przejęcie nadmiernego wzmocnienia PCR z użyciem stronniczości.
  5. Obecność skażenia fragmentami kwasów nukleinowych środowiskowych – pozyskanych podczas pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego lub podczas ekstrakcji i przygotowania biblioteki – jest częstym zjawiskiem20. Aby ustalić, czy odczyty bakterialne, grzybicze i pasożytnicze są prawdziwymi pozytywnymi wynikami, można rozważyć potencjalne metody wykorzystujące znormalizowane liczby odczytów (odczyty na milion, czyli rPM):
    1. Stwórz model tła (np. używając próbek wody, które zostały wyekstrahowane, przygotowane i zsekwencjonowane) bezpośrednio w CZID, aby odfiltrować taksony z rPM podobnymi lub mniejszymi pod względem liczebności względem modelu tła (a więc prawdopodobnie reprezentującymi skażenie). W folderze projektu sprawdź każdą próbkę kontroli wody, a następnie kliknij "model tła", aby utworzyć. Podczas analizy każdej próbki wybierz model tła i kliknij "filtry progowe", aby zastosować "NTZ Score" > 1 (lub wyższym), aby odfiltrować prawdopodobne zanieczyszczenia.
    2. Wykorzystaj wcześniej określone progi rPM, takie jakrpM próba > 10* (średnie rPM kontrolne) lub log10 (próba rPM) co najmniej o 1 log większy niż log 10 (średnia rPMcałej kohorty). Najpierw pobierz specyficzny dla taksonu wskaźnik wydajności dla każdej próbki, sprawdzając każdą próbkę na stronie projektu, klikając "Pobierz i wybierając "Combined Sample Taxon Results". Powstały plik .csv można przeanalizować za pomocą oprogramowania statystycznego takiego jak R lub Stata, w zależności od potrzeby.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę niższą względną częstość patogenów wirusowych, każdy wirus o znanym potencjale neuroinwazyjnym oraz przynajmniej jednym odczytie zgodnym z genomem wirusa powinien być uznany za wynik pozytywny (a najlepiej potwierdzony poprzez powtarzające się mNGS lub testy kliniczne specyficzne dla patogenów). Ponadto potok analityczny wymaga, aby każdy odczyt w pliku fastq był wyrównany obliczeniowo z najbardziej prawdopodobnym genomem referencyjnym w bazie danych NCBI. W rezultacie niektóre odczyty mogą być stosunkowo niespecyficzne dla konkretnego patogenu i teoretycznie mogły być powiązane z szerokim zakresem organizmów, a nie z konkretnym taksonem przypisanym do CZID. Biorąc pod uwagę to ryzyko, ręczne potwierdzenie pozytywnych wywołań powinno być przeprowadzone poprzez potwierdzenie wyrównania za pomocą internetowego narzędzia NCBI BLAST (konkretne odczyty taksonu można bezpośrednio przesłać z CZID do NCBI BLAST, klikając ikonę blast obok odpowiedniego taksonu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kontrola jakości biblioteki
Po ekstrakcji DNA/RNA zmierzone stężenie wyekstrahowanego DNA wynosi zazwyczaj 1–10 ng/μL. Jednak stężenie wyodrębnionego RNA często wynosi pg/μL, dlatego jest często niewykrywalne przez spektrofotometry. Po przygotowaniu bibliotek oczyszczone i amplifikowane biblioteki cDNA oraz DNA mają zazwyczaj stężenie odpowiednio 0,5–10 ng/μL i 10–30 ng/μL. Dane z elektroforezy kapilarnej i elektroferograficznej na Rysunku 2A pokazują bibliotekę próbek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieją istotne kwestie, które mogą wymagać zmian w tym protokole, w zależności od pożądanej głębokości sekwencjonowania, zastosowanej platformy sekwencjonowania oraz dostępności sprzętu do kontroli jakości. Niemniej jednak dwie reprezentatywne kohorty przedstawione tutaj pokazują, że silne wykrywanie patogenów jest możliwe w szerokim zakresie warunków eksperymentalnych. Konkretnie, Kohorta B wykazała, że pomimo kilku środków oszczędnościowych – sekwencjonowania na płytkich głębokościach, wykluczenia kontroli ERCC, mini...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

M.R.W. otrzymuje niezwiązane z tym fundusze badawcze od Roche/Genentech, Novartis i Kyverna Therapeutics oraz jest założycielem i członkiem zarządu Delve Bio Inc. Świadczył usługi doradcze dla firm Pfizer, Vertex Pharmaceuticals, Ouro Medicines oraz Indapta Therapeutics.

Podziękowania

Badanie to zostało wsparte finansowo z Fogarty International Center of the National Institutes of Health w ramach Nagrody nr D43TW009343. Chcielibyśmy podziękować wielu badaczom z Wilson Lab, UCSF i CZI, którzy w ciągu ostatnich kilku lat przyczynili się do rozwoju i optymalizacji protokołów mNGS dla różnorodnych zastosowań badawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pasek rurki PCR 0,2 mLEppendorf30124359
1,5 mL rurek LoBind DNAEppendorf30108051
1,5 mL rurek Safe LockEppendorf30120191
ERCC RNA Spike-In MixThermo Fisher4456740
Odczynniki D1000 o wysokiej czułościAgilent5067-5585
Invitrogen Collibri Biblioteka Wzmacniacz MasterMixThermo FisherA38539050
Mastercycler x50Thermo Fisher6311000010
NEBNext multipleksowe oligos dla IlluminaNew England Biolabs7335S/L
NEBNext Ultra II Zestaw Biblioteki DNA Prep KitNew England BiolabsE7645
NEBNext Ultra II Zestaw Biblioteczny RNA Przygotowawczy dla IlluminaNew England BiolabsE7770
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 cykli)Illumina20024907
NextSeq 550IlluminaNie ma
QIAseq FastSelect -rRNA HMR KitQuiagen334386
Qubit 1X dsDNA zestaw do testów wysokiej czułościQubitQ33230
Fluorometr Qubit 4Thermo FisherNie ma
Quick-DNA/RNA Microprep Plus Kit & nbsp;ZymoD7005
TapeStation 4150AgilentG2992AA

Bibliografia

  1. Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
  2. Wilson, M. R., et al. Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis. N Engl J Med. 380 (24), 2327-2340 (2019).
  3. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: the next culture-independent game changer. Front. Microbiol. 8, (2017).
  4. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  5. DNA Sequencing Costs: Data. , National Human Genome Research Institute (US). https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-Costs-Data (2026).
  6. Wilson, M. R., et al. Chronic meningitis investigated via metagenomic next-generation sequencing. JAMA Neurology. 75 (8), 947-955 (2018).
  7. Benoit, P., et al. Seven-year performance of a clinical metagenomic next-generation sequencing test for diagnosis of central nervous system infections. Nat Med. 30 (12), 3522-3533 (2024).
  8. Glaser, C. A., et al. In search of encephalitis etiologies: diagnostic challenges in the California encephalitis project, 1998-2000. Clinical Infectious Diseases. 36 (6), 731-742 (2003).
  9. Ramachandran, P. S., et al. Integrating central nervous system metagenomics and host response for diagnosis of tuberculosis meningitis and its mimics. Nat Commun. 13, 1675(2022).
  10. Xing, Z., et al. Integrating DNA/RNA microbe detection and host response for accurate diagnosis, treatment, and prognosis of childhood infectious meningitis and encephalitis. J Transl Med. 22, 583(2024).
  11. Omura, C., et al. 298. Host response profiling from clinical metagenomic sequencing data for diagnosis of central nervous system infections. Open Forum Infect Dis. 12 (1), (2025).
  12. Andriuk, L. V., Skochiĭ, P. G. Nucleic acids of the cerebrospinal fluid in acute disorders of cerebral circulation. Zh Nevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova. 88 (7), 32-34 (1988).
  13. Olausson, J., et al. Optimization of cerebrospinal fluid microbial DNA metagenomic sequencing diagnostics. Sci Rep. 12 (1), 3378(2022).
  14. Becskei, A., Rahaman, S. The life and death of RNA across temperatures. Comput Struct Biotechnol J. 20, 4325-4336 (2022).
  15. Wang, C., Liu, H. Factors influencing degradation kinetics of mRNAs and half-lives of microRNAs, circRNAs, lncRNAs in blood in vitro using quantitative PCR. Sci Rep. 12 (1), 7259(2022).
  16. Cb, T., et al. DNA/RNA preservation in glacial snow and ice samples. Frontiers in microbiology. 13, (2022).
  17. Kazantseva, J., et al. Optimisation of sample storage and DNA extraction for human gut microbiota studies. BMC microbiology. 21 (1), (2021).
  18. Xiaoli, J., et al. The impact of repeated freeze-thaw cycles on the quality of biomolecules in four different tissues. Biopreservation and biobanking. 15 (5), (2017).
  19. Kellman, B. P., et al. Multiple freeze-thaw cycles lead to a loss of consistency in poly(A)-enriched RNA sequencing. BMC genomics. 22 (1), (2021).
  20. Zinter, M. S., Mayday, M. Y., Ryckman, K. K., Jelliffe-Pawlowski, L. L., DeRisi, J. L. Towards precision quantification of contamination in metagenomic sequencing experiments. Microbiome. 7 (1), 62(2019).
  21. Mayday, M. Y., Khan, L. M., Chow, E. D., Zinter, M. S., DeRisi, J. L. Miniaturization and optimization of 384-well compatible RNA sequencing library preparation. PLoS One. 14 (1), e0206194(2019).
  22. Sakiyama, Y., et al. Brain biopsy and metagenomic sequencing enhance aetiological diagnosis of encephalitis. Brain Commun. 7 (3), fcaf1650(2025).
  23. Sakiyama, Y., Yuan, J., Yoshimura, A., Takei, J., Ando, M., Takashima, H. Etiological insights of encephalitis and encephalitis-like central nervous system diseases: brain tissue metagenomic next-generation sequencing. Neurology. 102 (7-1), 3782(2024).
  24. Sun, J., et al. Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules. Nat Methods. 21 (3), 401-405 (2024).
  25. Tan, J. K., et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic next-generation sequencing assay for respiratory virus detection and discovery. Nat Commun. 15 (1), 9016(2024).
  26. Prasanna, A. kshatha Clin-mNGS: Automated pipeline for pathogen detection from clinical metagenomic data. , https://github.com/AkshathaPrasanna/Clin-mNGS (2025).
  27. Marra, P. S., et al. Metagenomic next-generation sequencing in patients with infectious meningoencephalitis: a comprehensive systematic literature review and meta-analysis. Open Forum Infect Dis. 12 (5), ofaf274(2025).
  28. Ramachandran, P. S., Wilson, M. R. Metagenomics for neurological infections - expanding our imagination. Nat Rev Neurol. 16 (10), 547-556 (2020).
  29. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  30. Simner, P. J., Miller, S., Carroll, K. C. Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases. Clin Infect Dis. 66 (5), 778-788 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie metagenomicznewykrywanie patogen wekstrakcja kwas w nukleinowychprzygotowanie bibliotekioczyszczanie za pomoc kulek magnetycznychelektroforeza kapilarnaanaliza bioinformatycznatranskryptomika gospodarza

Powiązane artykuły