Ten protokół opisuje dwufazowy metod ekstrakcji kwasowo-rozpuszczalnikowej do izolowania krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych z próbek kału myszy o niskiej mocy bez pochodnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekstrakcja kwasów tłuszczowych krótkiego łańcucha z kału myszy za pomocą dwufazowej metody kwasowo-rozpuszczalnikowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji kwasów tłuszczowych krótkołańcuchowych (SCFA) z małych próbek kału myszy przy użyciu strategii ekstrakcji dwuetapowej z kwasem i rozpuszczalnikiem. Metoda jest zaprojektowana dla pojedynczych próbek kału o masie około 20-50 mg i wykorzystuje rozcieńczony kwas chlorowodorowy oraz octan etylu, aby umożliwić separację faz bez konieczności pochodzenia. Protokół składa się z homogenizacji kału, zakwaszenia, podziału na fazę organiczną i niskotemperaturowej wirowania i może być przeprowadzony przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, powszechnie dostępnego w laboratoriach badawczych. Po ekstrakcji SCFA nadają się do dalszej analizy na platformach opartych na chromatografii gazowej. Pomyślne wykonanie protokołu jest wskazane przez wykrycie wyraźnie rozdzielonych szczytów SCFA w charakterystycznych czasach retencji powyżej poziomu szumu, jak pokazano dla głównych SCFA z kału, w tym octanu, propionianu i masła, pochodzących z pojedynczych próbek myszy. Ten protokół rozwiązuje powszechne wyzwanie proceduralne w badaniach na małych zwierzętach, zapewniając standaryzowany proces ekstrakcji SCFA z ograniczonej ilości materiału próbkowego, przy zachowaniu zgodności z rutynowymi przepływami analitycznymi.
Wprowadzenie
Ten protokół został opracowany w celu umożliwienia ekstrakcji kwasów tłuszczowych o krótkim łańcuchu (SCFA) z małych próbek kału myszy w formacie zgodnym z rutynową analizą opartą na chromatografii gazowej (GC)–. Kwasy SCFA to lotne organiczne kwasy tłuszczowe z mniej niż sześcioma atomami węgla, głównie kwas octowy, kwas propionowy i kwas masłowy, które są produkowane przez mikrobiomę jelitową poprzez fermentację niestrawnych włókien pokarmowych1. Ilościowa ocena tych metabolitów u pojedynczych myszy jest często wymagana w badaniach na małych zwierzętach, gdzie materiał kałowy jest ograniczony, a próbki są powiązane z fenotypami behawioralnymi, metabolicznymi lub fizjologicznymi2,3,4,5,6. Dlatego konieczny jest praktyczny, nisko-inputowy proces ekstrakcji, aby wspierać projekty eksperymentalne, które polegają na pomiarach SCFA na poziomie pojedynczych zwierząt.
Obecne metody analizy SCFA w kale mają kilka ograniczeń metodologicznych. Ilościowa ocena SCFA w próbkach kału jest nadal analitycznie wymagająca ze względu na ich lotność, niską obfitość i złożoność matryc biologicznych7. Standardowe metody często wymagają etapów derywatyzacji, dużych objętości próbek i wyspecjalizowanego sprzętu, takiego jak automatyczne manipulowanie płynami, specjalistyczne platformy do homogenizacji lub kolumny do ekstrakcji fazy stałej8,9,10,11. Te wymagania mogą ograniczać dostępność i skalowalność, szczególnie w badaniach na myszach, gdzie wydalanie kału na jedno zwierzę jest minimalne, a longitudinalne lub specyficzne dla genotypu pobieranie próbek jest powszechne12,13,14. W rezultacie istnieje luka metodologiczna w protokołach, które pozwalają na ekstrakcje SCFA z małych ilości kału bez derywatyzacji, a jednocześnie są zgodne ze standardowymi metodami chromatografii gazowej.
Opisany tutaj protokół wypełnia tę lukę, stosując strategię ekstrakcji dwufazowej kwasowo-rozpuszczalnikowej z użyciem rozcieńczonego kwasu solnego i octanu etylu. Proces składa się z homogenizacji kału, zakwaszania, podziału rozpuszczalników organicznych i wirowania w niskiej temperaturze, i jest zaprojektowany do pracy z małymi masami wejściowymi kału. W przeciwieństwie do metod opartych na derywatyzacji, które wymagają dodatkowych etapów modyfikacji chemicznej lub specjalistycznych platform do przygotowania próbek, ten protokół umożliwia bezpośrednią ekstrakcję SCFA w formacie zgodnym z rutynową analizą opartą na GC za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego2.
Ta metoda jest przeznaczona do badań, które wymagają ekstrakcji SCFA z ograniczonych ilości kału mysiego, szczególnie gdy potrzebne są pomiary na poziomie pojedynczych osobników lub gdy dostępność próbek ogranicza projekt eksperymentalny. Jest odpowiednia do analizy GC wspólnych SCFA (C2–C6) w próbkach kału, ale nie jest przeznaczona do zastosowań wymagających wykrywania zależnego od derywatyzacji, ultraśladowej ilościowej oceny poza wrażliwością GC lub oceny systemowych stężeń SCFA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Komisja Stała ds. Zwierząt w Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, USA, zatwierdziła poprzedni protokół dotyczący zwierząt, który został zaprojektowany w celu zminimalizowania liczby użytych zwierząt. Protokół ten przestrzega wytycznych i regulacji National Institutes of Health. Niniejszy rękopis został sporządzony zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1, a wymagane materiały są wymienione w Tabeli Materiałów.
Rysunek 1: Schemat protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.
1. Pobieranie i przygotowanie próbek kału
- Zbierz świeże próbki kału (ok. 30 mg) w osobnych 1,5 mL probówkach mikrowirówkowych. Zarejestruj dokładną masę kału dla każdej próbki, aby umożliwić dokładną normalizację stężeń SCFA.
UWAGA: Upewnij się, że pobieranie obejmuje czyste probówki, rękawiczki i szczypce dla każdej próbki. Całe szkło i instrumenty muszą być przed użyciem autoklawowane. Ten protokół został zweryfikowany dla mas kału w wysokości około 20–50 mg na próbkę, przy czym jako reprezentatywną masę wejściową stosuje się ~30 mg. Objętości ekstrakcji są utrzymywane na stałym poziomie w tym zakresie. - Umieść i oznaczyć wymagany liczby probówek wirówkowych odpowiadających próbkom.
- Przygotuj rozcieńczoną kwas solny (0,5 M; pH 1–2), powoli dodając stężony HCl (12 M, klasy ACS) do ultraczystej wody.
UWAGA: HCl jest żrący; może powodować poważne oparzenia skóry, oczu i dróg oddechowych. Niebezpieczne przy wdychaniu. - Roztapiaj próbki w temperaturze pokojowej przez 30–45 min, lub aż całkowicie się rozmrozią.
2. Homogenizacja i zakwaszenie próbek
- Dodaj 255 μL 0,5 M roztworu HCl do każdej probówki wirówkowej.
- Weź nową probówkę i napełnij ją 70% etanolem do czyszczenia szczypiec. Wyczyść szczypce, zanurzając je w etanolu, a następnie osuszując na czystym ręczniku papierowym.
UWAGA: Etanolol jest łatwopalny i może podrażniać skórę i oczy; wdychanie par może powodować zawroty głowy. - Ustaw kąpiel etanową dla tłuczka, umieszczając tłuczki w pojemniku i wypełniając pojemnik 70% etanolem, aż wszystkie tłuczki będą całkowicie zanurzone.
- Pobierz odpowiednią próbkę z pudełka z próbkami. Zdejmij pokrywkę z probówki i usuń jedną próbkę (~ 30 mg) kału.
- Umieść próbki kału do odpowiednich probówek wirówkowych.
- Gdy wszystkie próbki zostaną umieszczone we właściwych probówkach wirówkowych, usuń tłuczek z kąpieli etanolu. Osusz tłuczek na czystym ręczniku papierowym.
UWAGA: Użyj nowego tłuczka dla każdej próbki. - Użyj tłuczków, aby odpowiednio rozdrobić i rozpuścić próbki kału, patrz Rysunek 2. Zmiel próbkę kału, aż uzyskany zostanie wizualnie jednorodny zawiesina, bez widocznych stałych fragmentów.
Rysunek 2: Zmiel próbki kału za pomocą tłuczka. Świeżo zebrany kał jest mielony, aby uzyskać jednolitą konsystencję do analizy SCFA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.
- Umieść użyte tłuczki w pustym pudełku, aby później je umyć.
- Wiruj próbki za pomocą mieszadła wirującego typu impulsowego z maksymalną prędkością przez 10 s, z ciasno zamkniętymi probówkami.
UWAGA: Upewnij się, że probówki wirówkowe są ciasno zakryte, aby uniknąć rozlania mieszanki.
3. Ekstrakcja SCFA i separacja faz
- Wiruj próbki z prędkością 16 000 × g przez 10 min w 4 °C, upewniając się odpowiedniego zrównoważenia wirówki.
- Po uruchomieniu wirówki oznaczyć nowe probówki wirówkowe odpowiadające próbkom. Usuń próbki z wirówki po zakończeniu wirowania.
- Ustaw pipetę 200 μL na 120 μL. Ostrożnie pobierz 120 μL wodnego nadstanu po wirowaniu, unikając zakłócenia osiadłego dna. Przenieś nadstan do nowo oznaczonych probówek wirówkowych i wyrzuć osad.
- Dodaj równą ilość
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Powyższy protokół wynikł w wyekstrahowanych alikwotach SCFA o objętości 120 μL odpowiadającej liczbie próbek kału, z których zostały wyprowadzenie. Pomyślne wykonanie protokołu ekstrakcji jest wskazane przez obecność wyraźnie rozdzielonych szczytów SCFA w charakterystycznych czasach retencji z intensywnością sygnału powyżej poziomu szumów tła. Przy wykonaniu, jak opisano, protokół daje profile SCFA z kału nadające się do porównania ilościowego w dalszej kolejności pomiędzy próbkami. Zmierzyliśmy osiem SCFA: kwas octowy, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten protokół zawiera kilka kluczowych kroków, które zapewniają wydajne i powtarzalne ekstrakcję KOK z małych objętościowych próbek kału myszy. Protokół wykorzystuje dwuetapowy system ekstrakcji kwasowo-rozpuszczalnikowej z użyciem określonych objętości rozcieńczonego kwasu solnego i octanu etylu, który jest dostosowany do właściwości fizykochemicznych KOK jako niskocząsteczkowych, słabych kwasów organicznych. Zakwaszenie przesuwa KOK w ich protonowaną formę, zmniejszając oddziaływania jonowe z matrycą kału i ułatwiając i...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sporów interesu do zadeklarowania.
Podziękowania
Z poważaniem przyjmujemy wsparcie finansowe dla tego badania udzielone przez Narodowe Instytuty Zdrowia poprzez R21AG065606 i R21AG08176 przyznane Yiying Zhang, a także wsparcie z Borten Family Foundation i darowizny rodziny Tang dla Yiying Zhang.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Centrifuge | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| Centrifuge vials | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microtube Rack | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Ethyl acetate | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99.5% |
| Green pestles | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Certified (10 N, stock solution); diluted to 0.5 M for use |
| 1000 μL pipette | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 μL pipette tips | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | Molecular Biology Grade, 70% solution |
| 200 μL pipette | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 μL pipette tips | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Tweezers | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vortex | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
Bibliografia
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Zhang, Y., et al. Transmission of Alzheimer's disease-associated microbiota dysbiosis and its impact on cognitive function: evidence from mice and patients. Mol Psychiatry. 28 (10), 4421-4437 (2023).
- Sun, Y., et al. PYY-mediated appetite control and obesity alleviation through short-chain fatty acid-driven gut-brain axis modulation by Lacticaseibacillus rhamnosus HF01 isolated from Qula. J Dairy Sci. 108 (8), 7960-7978 (2025).
- He, J., et al. Short-chain fatty acids and their association with signalling pathways in inflammation, glucose and lipid metabolism. Int J Mol Sci. 21 (17), 6356(2020).
- Fock, E., Parnova, R. Mechanisms of blood-brain barrier protection by microbiota-derived short-chain fatty acids. Cells. 12 (4), 657(2023).
- Kachoueiyan, F., et al. Butyrate: a key mediator of gut-brain communication in Alzheimer's disease. Metab Brain Dis. 40 (5), 189(2025).
- Kim, K. S., Lee, Y., Chae, W., Cho, J. Y. An improved method to quantify short-chain fatty acids in biological samples using gas chromatography-mass spectrometry. Metabolites. 12 (6), 525(2022).
- Ueyama, J., et al. Freeze-drying enables homogeneous and stable sample preparation for determination of fecal short-chain fatty acids. Anal Biochem. 589, 113508(2020).
- Papanicolas, L. E., et al. Bacterial viability in faecal transplants: which bacteria survive. EBioMedicine. 41, 509-516 (2019).
- Yao, L., et al. Quantitative analysis of short-chain fatty acids in human plasma and serum by GC-MS. Anal Bioanal Chem. 414 (15), 4391-4399 (2022).
- Zhang, C., Liu, A., Zhang, T., Li, Y., Zhao, H. Gas chromatography detection protocol of short-chain fatty acids in mice feces. Bio Protoc. 10 (13), e3672(2020).
- Zha, X., et al. Microbiota-derived lysophosphatidylcholine alleviates Alzheimer's disease pathology via suppressing ferroptosis. Cell Metab. 37 (1), 169-186.e9 (2025).
- Li, L. J., et al. Neuronal double-stranded DNA accumulation induced by DNase II deficiency drives tau phosphorylation and neurodegeneration. Transl Neurodegener. 13 (1), 39(2024).
- Zhou, H., et al. Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice. Cell. 181 (3), 590-603.e16 (2020).
- Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography. Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
