Method Article

Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników

DOI:

10.3791/70085

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, Peking University School of Basic Medical Sciences, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, 2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego podejścia do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy poprzez miejscowe nałożenie fluoroforowo oznaczonych dektranów o różnej wielkości cząsteczkowої na powierzchnię dziąseł in vivo, z późniejszym obrazowaniem ex vivo za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śluzowa bariera nabłonkowa dziąseł pełni kluczową rolę jako pierwsza linia obrony w odporności i homeostazie jamy ustnej. Całotliwość bariery nabłonkowej skutecznie zapobiega przenikaniu szkodliwych substancji z środowiska jamy ustnej, podczas gdy jej uszkodzenie jest ściśle związane z patogenezą chorób takich jak periodontitis i liszaj ropny śluzówki jamy ustnej. W tym miejscu, opisaliśmy metodę opartą na aplikacji topikalnej do oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy. Po pierwsze, mieszanina fluorescencyjnie oznaczonych dekstrań o różnych masach cząsteczkowych (40 lub 70 kDa) w 2% karboksymetylocelulozie sodowej została zastosowana topikalnie na powierzchnię dziąseł wargowym regionu trzonów zębów. Po 30-minutowej inkubacji szczęka była sekcjonowana i fiksowana w specjalnym uchwycie dla natychmiastowego obrazowania za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego. Takie podejście umożliwia wizualizację i ilościową ocenę różnych śledzików w warstwach nabłonka, zapewniając funkcjonalne odczyty integralności bariery nabłonkowej dziąseł, które mogą być stosowane w badaniach nad zapaleniem jamy ustnej, gojeniem ran i modelowaniu chorób.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera nabłonkowa dziąseł stanowi krytyczną obronną powierzchnię w jamie ustnej, zachowując integralność tkanki poprzez selektywne regulowanie transportu substancji, jednocześnie zapobiegając inwazji mikroorganizmów1. Składająca się z wielowarstwowego nabłonka łuszczącego się, połączonego zespołami szczelnych złączy, ta dynamiczna struktura precyzyjnie kontroluje przepuszczalność międzykomórkową, aby ograniczyć niewybiórcze przenikanie mikroorganizmów, makrocząsteczek i rozpuszczalników2. Wiele czynników może osłabić integralność bariery dziąsłowej. Jama ustna mieści drugą pod względem różnorodności społeczność mikrobiologiczną w ludzkim ciele, z ponad 700 gatunkami bakterii kolonizujących powierzchnie zębów, szczeliny dziąsłowe i błonę śluzową jamy ustnej3,4. Komórki nabłonkowe wyściełające tkanki dziąsłowe są stale narażone na to gęste środowisko mikrobiologiczne5.

Czynniki wirulencji wydzielane przez patogeny przyzębia (np. Porphyromonas gingivalis), w tym lipopolisacharydy, wykazują zdolność do zakłócania funkcji bariery nabłonkowej, wywołując w ten sposób reakcje zapalne w tkankach dziąseł i prowadząc do postępu patologicznego6,7. Mediatory zapalne i czynniki stresujące mechanicznie dalece nasilają dysfunkcję bariery, zwiększając podatność na choroby jamy ustnej8. Probiotyki jamy ustnej mogą pomóc zapobiegać chorobom przyzębia poprzez promowanie stabilności nabłonkowej bariery dziąsłowej. Niemniej jednak biologiczne interakcje między mikroorganizmami a komórkami nabłonka dziąsłowego w modulacjach funkcji bariery pozostają w dużej mierze niewyjaśnione9. Stąd rozwój niezawodnych metod oceny funkcji bariery nabłonkowej ma ogromne znaczenie.

Mikroskopia laserowa skanująca pojedynczy foton, znana z wysokiej rozdzielczości i uznanego systemu wykrywania, okazała się szczególnie przydatna do badania próbek tkankowych ex vivo10. Zaawansowane metody obrazowania znacznie poprawiają ocenę właściwości bariery dziąsłowej. Powierzchowny charakter tkanek dziąseł, z komórkami nabłonkowymi położonymi około 100 μm od powierzchni, sprawia, że są one idealnie przystosowane do takich podejść obrazowania. Nasze badania ustanowiły technikę oceny ex vivo wykorzystującą fluorescencyjnie oznakowane dekstrany o różnych masach cząsteczkowych jako śladowce przepuszczalności międzykomórkowej. W połączeniu z mikroskopia laserową skanującą pojedynczy foton, ta metoda umożliwia dokładne określenie funkcji bariery nabłonkowej dziąseł, zapewniając wgląd w mechanizmy choroby przyzębia i potencjalne interwencje terapeutyczne.

Protokół ustalony w niniejszym badaniu, łączący zlokalizowany dostarczanie śladowców w żelu z trójwymiarowym obrazowaniem ex vivo, jest specjalnie zoptymalizowany, aby sprostać wyjątkowym wyzwaniom związanym z oceną bariery nabłonkowej dziąseł. Po pierwsze, istniejące metody wstrzyknięć śladowców dożylnych (Tabela 1) nie są w stanie precyzyjnie ocenić przepuszczalności zlokalizowanych drobnych miejsc nabłonkowych dla czynników zewnętrznych11. Po drugie, tradycyjne metody histologiczne wymagają dekalcyfikacji i przekrojów, które niszczą strukturę tkanki i są pracochłonne oraz czasochłonne12,13,14. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół wykorzystuje wysoce klejący żel, aby osiągnąć skuteczne utrzymanie śladowców na złożonej powierzchni lokalnej. Co więcej, poprzez 3D obraz, zapewnia precyzyjne, nieniszczące określenie głębokości przenikania śladowca i jego rozkładu w nabłonku dziąsłowym, zachowując w ten sposób pełną przestrzenną architekturę tkanki. W konsekwencji, ta metoda jest szczególnie odpowiednia dla wysokiej rozdzielczości oceny czasoprzestrzennej funkcji bariery nabłonkowej dziąseł w złożonym i ograniczonym środowisku jamy ustnej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Badań na Zwierzętach, Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Pekińskiego i zgodne były z Przewodnikiem po Opiece nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (Publikacja NIH nr 85-23, zmieniona w 1996 r.). Podczas procesu eksperymentów na zwierzętach traktowano je ostrożnie, aby zminimalizować ich ból i dyskomfort.

Szczegóły każdego kroku pracy w ocenie in vivo przepuszczalności epitelium dziąseł myszy są opisane poniżej (Rysunek 1A). Tutaj przedstawiono przykład wykrywania funkcji bariery nabłonkowej zarówno w ligacyjnych, jak i Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)-indukowanych modelach periodontitis u myszy. Wszystkie personel otrzymały kompleksowe szkolenie w zakresie opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i techniki aseptycznej.

1. Obsługa zwierząt

  1. Przez cały okres badania, przetrzymuj zwierzęta w warunkach standardowych, wolnych od patogenów specyficznych (SPF), z cyklem 12 h światło/ciemność i zapewnij żywność i wodę ad libitum.
  2. Przygotowanie i podawanie znieczulenia oraz znaczników
    1. Utrzymuj sterylne warunki przez cały protokół i używaj narzędzi wyczyszczonych 75% alkoholem etylowym.
    2. Użyj samców myszy C57BL/6J w wieku dorosłym w grupie wiekowej 8-10 tygodni do eksperymentu. Podziel myszy na trzy grupy: grupę kontrolną (nieleczoną) i dwie grupy eksperymentalne (modele periodontitis u myszy indukowanego ligacją i P. gingivalis).
      UWAGA: Przy grupach, myszy o podobnej masie ciała i podobnym wieku tygodniowym powinny być wybierane, aby zmniejszyć wpływ wieku i wagi na przepuszczalność epitelium dziąsłowego. Modele periodontitis u myszy indukowane ligacją i P. gingivalis reprezentują powszechnie używane modele periodontitis u myszy. Szczegółowe protokoły modelowania, patrz w literaturze na temat modeli periodontitis u myszy indukowanego ligacją15 i P. gingivalis-indukowanego16.
    3. Wybierz znaczniki fluorescencyjne o nienachodzących się spektrach, takich jak znacznik FITC-dekstrany (40 kDa; FD40) i znacznik rodaminą B-dekstrany (70 kDa; RD70), aby zapewnić wyraźne wykrywanie sygnału za pomocą odpowiednich filtrów FITC i rodaminy.
    4. Rozcieńcz znaczniki. Aby przestrzegać tego protokołu, wymieszaj FD40 (1 g/L) i RD70 (1 g/L) w 2% żelu karboksymetylocelulozy i przechowuj w 4 °C.
    5. Dożylnie wstrzyknij 1,25% tribromoetanolu (200 mg/kg masy ciała, 15-17 μL/g masy ciała) w celu znieczulenia myszy lub znieczulaj zgodnie z zaleceniami wydanymi przez lokalną instytucję.
      UWAGA: Roztwory tribromoetanolu są światłoczułe. Tert-amyl alkohol jest palnym, lotnym i drażniącym rozpuszczalnikiem organicznym. Wszystkie procedury związane z przygotowaniem, obsługą i podawanie należy przeprowadzać w komorze chemicznej lub na ekstremalnie dobrze wentylowanym obszarze, ściśle z dala od wszelkich źródeł zapłonu. Personel musi nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym rękawice, gogle chemiczne i fartuch laboratoryjny. Usuwanie odpadów: Zużyty roztwór tribromoetanolu, tert-amyl alkohol i wszystkie zanieczyszczone materiały (np. strzykawki, końcówki pipet, rękawice) muszą być zebrane i usunięte jako odpady chemiczne niebezpieczne zgodnie z przepisami i protokołami ds. bezpieczeństwa i higieny pracy (EHS) Twojej instytucji oraz protokołami dotyczącymi palnych i toksycznych chemikaliów.
  3. Podczas znieczulenia utrzymuj temperaturę rdzenia ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C za pomocą podkładki grzewczej z regulacją zwrotną. Nałoż do oczu środek zmniejszający wysychanie rogówki.
  4. Utrzymaj otwartą jamę ustną za pomocą zacięcia i nanieś 5 μL do 50 μL mieszanki dwóch lub więcej znaczników przepuszczalności parakomórkowej o różnych masach cząsteczkowych na powierzchnię wargową dziąseł w rejonie zębów trzonowych (Rysunek 1B). Pozostaw na 30 minut. Jeśli zwierzę połknęło mieszankę, nałóż ją ponownie.
  5. Izolacja zębów i tkanek przyzębnych
    1. Po 30 minutach stosowania znaczników przepuszczalności, wyłącz myszy poprzez ścięcie szyjne. Ułóż myszy na kartonach, umieszczając je w pozycji leżącej na plecach i przyklej ich kończyny.
    2. Po fiksacji, otwórz jamę ustną, aby odizolować zęby szczękowe i tkanki przyzębne. Delikatnie usuń otaczające tkanki i dokładnie przepłucz próbkę PBS.
    3. Umieść zęby i tkanki przyzębne na szklanej szlamie, z ułożeniem glinki modelującej po obu stronach, aby ułatwić zamocowanie szkiełka pokrywającego nad próbką.

2. Konfiguracja mikroskopu jednofotonowego</

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie ze standaryzowanym protokołem, zamontuj zęby szczękowe i tkanki przyzębne (w tym dziąsło, więzadło przyzębne, kość zębodołową i cement) myszy na specjalnie wykonanym uchwycie (Rysunek 1C). Badanie mikroskopowe ujawniło zielone (FD40) i czerwone (FD70) sygnały fluorescencji w dziąśle, wykazując przenikanie znaczników przez barierę nabłonkową. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania pod lunetą obrazów, dane były gromadzone za pomocą oprogramowania. W grupie kontrolnej oba fluoresce...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek dziąseł pełni funkcję istotnej fizycznej bariery przed inwazją bakterii, podczas gdy mikroorganizmy jamy ustnej wykazują podwójną zdolność regulacyjną poprzez albo zakłócanie integralności bariery za pomocą czynników wirulencji albo promocję jej utrzymania. Te interakcje biologiczne ostatecznie decydują o homeostazie tkanki lub postępie choroby17,18. Budując na tej podstawie, opracowałeśmy innowacyjne podejście metodologiczne w celu dalszego zbadania tyc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sporów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało wsparte przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty 32030010, 31972908, 81991500, 81991502).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40 kDa FITC-labeled dextranSigma Aldrich78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextranSigma AldrichR9379
Blunt tissue separation nickelBejinghuabo CompanyNZW28
carboxymethylcelluloseMREDAM049898
Disposable sterile syringeZhiyu Company1 mL
ImageJ softwareNational Institutes of Health
MicrotubesAxygenMCT-150-C1.5 mL
NIS-Elements AR Image SoftwareNikon
Phosphate buffered saline 1xServicebioG4207-500
Single photon microscope Nikon A1 MP+Nikon
Tissue scissorsBejinghuabo CompanyM286-05

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Study on the protection of gingival epithelial barrier by interleukin-22 through regulating microbiota and E-cadherin expression. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 59 (7), 653-662 (2024).
  2. Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. J Dent Educ. 66 (4), 564-574 (2002).
  3. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  4. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).
  5. Meyle, J., Chapple, I. Molecular aspects of the pathogenesis of periodontitis. Periodontol 2000. 69 (1), 7-17 (2015).
  6. Oriuchi, M., et al. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide damages mucosal barrier to promote gastritis-associated carcinogenesis. Dig Dis Sci. 69 (1), 95-111 (2024).
  7. Takeuchi, H., Nakamura, E., Yamaga, S., Amano, A. Porphyromonas gingivalis infection induces lipopolysaccharide and peptidoglycan penetration through gingival epithelium. Front Oral Health. 3, 845002(2022).
  8. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  9. Chatterjee, A., Bhattacharya, H., Kandwal, A. Probiotics in periodontal health and disease. J Indian Soc Periodontol. 15 (1), 23-28 (2011).
  10. Shin, D., et al. Photon-efficient imaging with a single-photon camera. Nat Commun. 7, 12046(2016).
  11. Yang, X., et al. Targeting endothelial tight junctions to predict and protect thoracic aortic aneurysm and dissection. Eur Heart J. 44 (14), 1248-1261 (2023).
  12. Cai, Y., et al. Foxf1 maintains endothelial barrier function and prevents edema after lung injury. Sci Signal. 9 (424), ra40(2016).
  13. Hou, A., Mohamed Ali, S., Png, E., Hunziker, W., Tong, L. Transglutaminase-2 is critical for corneal epithelial barrier function via positive regulation of claudin-1. Ocul Surf. 28, 155-164 (2023).
  14. Kitsuki, T., et al. Enhanced junctional epithelial permeability in trpv4-deficient mice. J Periodontal Res. 55 (1), 51-60 (2020).
  15. Chen, W., et al. Porphyromonas gingivalis impairs oral epithelial barrier through targeting grhl2. J Dent Res. 98 (10), 1150-1158 (2019).
  16. Lemaitre, M., et al. Periodontal tissue regeneration using syngeneic adipose-derived stromal cells in a mouse model. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 656-665 (2017).
  17. Takahashi, N., et al. Gingival epithelial barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7 (3), e1651158(2019).
  18. Ye, P., Chapple, C. C., Kumar, R. K., Hunter, N. Expression patterns of E-cadherin, involucrin, and connexin gap junction proteins in the lining epithelia of inflamed gingiva. J Pathol. 192 (1), 58-66 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gingival Epithelial BarrierFluorescent TracersOral ImmunityBarrier IntegrityMouse GingivaSingle Photon MicroscopyDextran TracersOral InflammationWound HealingDisease Modeling

Related Articles