Protokół badania regulacji Honokiolu sygnalizacji transformującego czynnika wzrostu beta 1/SMAD w modelach fotostarzenia skóry indukowanych ultrafioletem A

Podsumowanie

Protokół ten bada, czy honokiol łagodzi fotostarzenie wywołane UVA w ludzkich fibroblastach dermalnych i skórze myszy poprzez aktywację szlaku TGF-β1/Smad oraz redukcję ekspresji MMP.

Streszczenie

Honokiol (HNK), kluczowy składnik pochodzący z Magnolia officinalis, ma potencjał leczenia chorób skóry. Obecnie wpływ i mechanizm działania HNK na fotouszkodzenia skóry wywołane przez ultrafiolet A (UVA) są niejasne. Model uszkodzeń fotostarzenia komórek HDF i bezwłosej skóry myszy został skonstruowany przez indukcję UVA. Wpływ HNK na żywotność normalnych komórek HDF oraz komórek HDF indukowanych przez UVA został zbadany za pomocą testu żywotności komórek. Poziomy SOD, GSH, CAT i MDA w komórkach HDF mierzono różnymi zestawami, a poziomy ROS za pomocą DCFH-DA i dihydroetydu. Barwienie SA-β-galaktozydazy i TUNEL wykazało starzenie i apoptozę w komórkach HDF, a cytometria przepływowa oceniała postęp cyklu komórkowego. Histopatologiczne uszkodzenia skóry oceniono za pomocą patologicznego barwienia. Ponadto do oceny poziomu białek związanych z szlakiem matrycowego (MMP) oraz szlaku TGF-β1/Smad wykorzystano immunofluorescencję i Western blot. Leczenie HNK (2,5-10 μM) nie miało negatywnego wpływu na prawidłową żywotność komórek HDF, ale osłabiło uszkodzenia komórek HDF wywołane przez UVA, zmniejszając stres oksydacyjny i apoptozę. UVA indukowało starzenie komórek HDF, indukowało zatrzymanie fazy S, obniżenie poziomu Ki67, obniżenie zawartości kolagenu oraz zwiększenie ekspresji MMP, podczas gdy HNK skutecznie tłumiło te nieprawidłowości wywołane przez UVA. Ponadto UVA powodowała głębsze zmarszczki, obniżała zawartość wody i kolagenu oraz zwiększała grubość nabłonka u skóry myszy, podczas gdy podskórne wstrzykiwanie HNK zmniejszało patologiczne uszkodzenia tkanki skóry oraz zwiększało zawartość wody i kolagenu. Ponadto HNK aktywował szlak TGF-β1/Smad, a inhibitor TGF-β1 SB431542 osłabił ochronny efekt HNK przed uszkodzeniami fotostarzeniami w komórkach HDF. Podsumowując, HNK ma potencjał, by być lekiem łagodzącym uszkodzenia związane ze starzeniem się w świetle poprzez zmniejszenie ekspresji MMP poprzez aktywację szlaku TGF-β1/Smad, hamując tym samym fotostarzenie wywołane przez UVA w komórkach HDF i skórze myszy.

Wprowadzenie

Proces starzenia się skóry jest złożony i dzieli się na dwie główne formy: naturalne starzenie się oraz foto-starzenie^{się 1}. Badania wskazują, że nawet 80% do 90% starzenia się skóry jest spowodowane czynnikami obcymi środowiska (np. promieniowaniem ultrafioletowym, zanieczyszczeniem powietrza), z czego najpoważniejsze skutki ma długotrwałe fotostarzenie wywołane promieniowaniem ultrafioletowym ^2,3. Promieniowanie ultrafioletowe dzieli się na UVC, UVB i UVA. Ponieważ UVC nie przenika warstwy ozonowej, obecne badania nad foto-starzeniem koncentrują się na UVA (320-400 nm) oraz UVB (280-320 nm)^4,5,6. W porównaniu z UVB, UVA ma mniej energii, ale jest bardziej przenikliwa, przechodzi przez naskórek i sięga głęboko w skórę, co jest ważną przyczyną^poważnego starzenia się skóry. Poprzednie badania wykazały, że uszkodzenia spowodowane napromieniowaniem UVB o promieniowaniu UVA o stężeniu 57 mJ/^cm2 na komórkach HaCaT są porównywalne⁸. Foto-starzenie się skóry powoduje zmiany w funkcji i strukturze skóry, które objawiają się wiskiem tkanek powierzchniowych, pogłębianiem zmarszczek, utratą kolagenu oraz widocznym gołym okiem szarym kolorem skóry; W ciężkich przypadkach mogą wystąpić różne łagodne, przednowotworowe zmiany i guzy ^9,10. Wraz ze wzrostem badań nad starzeniem się i przeciwstarzeniem, ryzyko zdrowotne związane z fotografowaniem stało się jednym z najważniejszych problemów zdrowotnych na świecie. Dlatego kluczowe jest badanie procesów patofizjologicznych leżących u podstaw uszkodzeń wywołanych przez UVA w wyniku fotostarzenia, z myślą o opracowaniu nowych opcji terapeutycznych w leczeniu.

Pozyskiwany z magnolii officinalis, tradycyjnego chińskiego zioła leczniczego, Honokiol (HNK) jest istotnym związkiem bioaktywnym o wzorze chemicznym C₁₈H₁₈O₂¹¹. HNK wykazuje różne właściwości farmakologiczne, a jego grupa fenolowa hydroksylowa jest bardzo podatna na utlenianie i ma silne działanie antyoksydacyjne oraz wolne rodniki¹². Ponadto HNK ma działanie farmakologiczne antybakteryjne, przeciwzapalne, przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe, przeciwdepresyjne, neuroochronne oraz przeciwwczesne niewydolność jajników⁽13,14,15,16. Doustny HNK został uznany za zasadniczo bezpieczny w badaniach na zwierzętach i badaniach klinicznych, a nie stwierdzono istotnych skutków niepożądanych 17,18,19. Najnowsze badania wykazały, że HNK zapobiega rakowi skóry wywołanemu UVB²⁰ oraz hamuje reakcję zapalną skóry wywołaną UVB i hipermetylację DNA, co sugeruje jego potencjalne zastosowanie w leczeniu schorzeń skóry. W porównaniu z szeroko stosowanymi środkami przeciwstarzeniowymi, w tym witaminą C i resweratrolem, HNK ma charakterystyczne i lepsze właściwości: jego lipofilowa struktura zapewnia lepszą przepuszczalność przezskórną niż hydrofilowa witamina^C22; a także wykazuje wyższą fotostabilność i biodostępność in vivo niż resweratrol²³. Te przedkliniczne odkrycia potwierdzają tezę, że HNK ma obiecujący potencjał translacyjny jako bezpieczny i skuteczny kandydat do produktów do pielęgnacji skóry oraz interwencji klinicznych przeciwko fotouszkodzeniom skóry wywołanemu promieniowaniem ultrafioletem. Jednak wpływ leczenia HNK na uszkodzenia spowodowane fotostarzeniem skóry spowodowane przez UVA nie został jeszcze zgłoszony.

Transformujący czynnik wzrostu-β1 (TGF-β1) to wielofunkcyjna cytokina kluczowa dla wzrostu i rozwoju komórek, naprawy i regeneracji tkanek oraz wzrostu i rozwoju komórek, tkanek i narządów^24,25. Wykazano, że TGF-β1 wysyła sygnały do komórki głównie za pośrednictwem członków rodziny białek Smad, co prowadzi do specyficznej regulacji transkrypcji genów docelowych w dalszej fazie. Gdy sygnalizacja TGF-β1 zostaje aktywowana, powoduje fosforylację Smad2 i Smad3^26,27. Najnowsze badania wykazały silny związek między szlakiem TGF-β1/Smad a włóknieniem skóry a foto-starzeniem^{się 28,29}. Zgłoszono, że ssakowy cel rapamycyny aktywuje szlak TGF-β1/Smad w tkankach skóry szczurów, co z kolei sprzyja syntezie ceramidów, które są ważne dla utrzymania wilgoci skóry i utrzymania bariery^{skórnej 30}. Warto zauważyć, że HNK modulował szlak TGF-β1/Smad w komórkach wątrobowych gwiaździstych, co z kolei złagodziło włóknienie wątroby³¹. W związku z tym opracowano modele komórkowe i mysie urazów fotostarzeniowych wywołanych UVA, z leczeniem 2,5–10 μM HNK w komórkach HDF oraz interwencją 5 mg/kg lub 10 mg/kg HNK u bezwłosych myszy, aby zbadać wpływ HNK na uszkodzenia związane z fotostarzeniem się i jego potencjalną rolę w modulacji szlaku TGF-β1/Smad. Celem tego badania było opracowanie nowych strategii terapeutycznych w zakresie fotouszkodzeń skóry wywołanych przez UVA.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z hodowlą komórek przeprowadzano zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa i w warunkach laboratoryjnych poziomu 2 (BSL-2). Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono po uzyskaniu zgody Komitetu Etyki Zwierząt 988. Szpitala Połączonych Sił Wsparcia Logistycznego Chińskiej Armii Ludowo-Wyzwoleńczej (numer zatwierdzenia: 2023-089).

Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzano w ścisłej zgodności z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Na koniec eksperymentu myszy zostały uśpione przez przedawkowanie pentobarbitalu sodu (100 mg/kg, iniekcja dootrzewnowna). Podjęto wszelkie wysiłki, aby zminimalizować cierpienie zwierząt podczas zakwaterowania, leczenia i pobierania próbek. Odczynniki, chemikalia, sprzęt i oprogramowanie używane w protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla i przetwarzanie komórek

1. Hodować ludzkie fibroblasty skórne (HDF) w pożywce fibroblastowej. Utrzymuj hodowle w temperaturze 37 °C w środowisku o nasyconej wilgotności z 5%_CO2.
2. Wymieniaj podłoże hodowlane co 3 dni i przepuszczaj HDF w proporcji 1:3 podczas łączenia się roślin.
3. Napromieniuj włókno wysokiej energii lampami UVA (spektrum emisyjne: 320-400 nm) przy dawce 5 J/^cm2.
4. Uzupełnij świeżym medium natychmiast po 30 minutach napromieniowania UVA. Powtarzaj napromieniowanie UVA raz dziennie przez 8 kolejnych dni,³².
5. Lecz HDF dawką 2,5, 5, 10, 20 lub 40 μM HNK przez 24 godziny lub 48 godzin w eksperymentach dawkowo-przesiewowych³³. Traktuj HDF 2,5, 5 lub 10 μM HNK przez 24 godziny, a następnie napromieniowanie UVA (5 J/cm²) w kolejnych eksperymentach.
6. Wystaw się HDF na 10 μM HNK przez 4 godziny, następnie inkubuj inhibitorem TGF-β1 o stężeniu 10 μM SB431542 przez 24 godziny, a na końcu napromieniuj UVA (5 J/cm²) w grupie HNK+SB431542.

2. Ocena żywotności komórek

1. Zaszczep HDF do 96-dołkowych płytek hodowli komórkowych o gęstości 1×^{10 4 komórek} /dołek.
2. Po różnych zabiegach należy do każdego odwiertu dodać 10 μL 10% w wodzie rozpuszczalnego w wodzie odczynnika z solą tetrazolową do końcowej objętości 100 μL na odwiert i inkubować komórki w temperaturze 37°C przez 1,5 godziny w ciemności.
3. Zmierz wartości OD450 komórek za pomocą czytnika mikropłyt.

3. Określenie poziomów dysmutazy nadtlenkowej (SOD), malondialdehydu (MDA), katalazy (CAT) i glutationu (GSH)

1. Przemyj HDF 1 mL wstępnie schłodzonego PBS (0,01 M, pH 7,4), dodaj 200 μL roztworu do przygotowania próbek SOD (z zestawu do testów SOD) do limfocytów na lodzie przez 15 minut.
2. Wiruj lizat w 8000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i pobieraj supernatant jako próbkę testową.
3. Użyj zestawu do testowania białka BCA (kwasu bicinchoninowego), aby określić stężenie białka w supernatancie, a próbkę dostosuj do 50 μg całkowitego białka w objętości 50 μL.
4. Wymieszaj próbkę białka o pojemności 50 μg z buforem SOD do końcowej objętości reakcji 200 μL, inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności, a następnie zmierz wartość OD450.
5. Weź ten sam nadnadatnik lizatu komórkowego, który był używany w testie SOD, zmierz poziomy CAT, GSH i MDA za pomocą odpowiednich zestawów testowych.

4. Pomiar poziomów ROS komórkowych

1. Lecz komórki HDF w różnych warunkach, dwukrotnie przepłucz PBS 500 μL i dobrze wymieszaj z 500 μL 10 μM reaktywnych źródeł tlenu fluorescencyjnych i inkubuj w 37 °C przez 20 minut z dala od światła.
2. Wiruj w 1000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby zebrać komórki, a następnie dwukrotnie przepłukuj 500 μL PBS.
3. Ponownie zawiesz komórki w pożywce hodowli 500 μL, a następnie analizuj barwienie za pomocą cytometrii przepływowej.
4. Rejestruj intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, a następnie obliczaj poziomy ROS na podstawie intensywności fluorescencji, która wyższa odpowiada silniejszej zielonej fluorescencji.

5. Barwienie β-galaktozydazy (SA-β-galaktozydaza) związane ze starzeniem

1. Siej HDF na płytkach hodowli komórek 6-dołkowy o gęstości 1×10^{6 komórek/} dołek i hoduj do przylegania. Po różnych zabiegach myj HDF raz z 2 mL PBS.
2. Dodaj 1 ml utrwalacza β-galaktozydazy do każdej jamki i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej z utrwalaczem przez 15 minut.
3. Przemyj komórki 3 razy 2 mL PBS, dodaj 1 ml roztworu roboczego do każdego dołku, a następnie inkubuj w temperaturze 37°C przez noc w ciemności.
4. Obserwuj i fotografuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego (komórki starzejące wyglądają na niebieskie).

6. Test cyklu komórkowego

1. Zasiewaj HDF do płytek 6-dołkowych przy 1×10^{6 komórek} /dołek; po różnych zabiegach płucz komórki dwukrotnie 2 mL PBS.
2. Wiruj w 1000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby zebrać komórki, dodaj 1 ml 70% etanolu (utrwalacz komórek) i delikatnie wymieszaj przez pipetowanie. Umieść stałe ogniwa w lodówce o temperaturze 4°C na 12 godzin.
3. Przygotuj 500 μL na próbkę roztworu barwienia komórkowego, mieszając jodek propidiu (PI, stężenie końcowe 50 μg/mL) i RNaseA (końcowe stężenie 200 μg/mL) w PBS. Wystaw komórki na 500 μL roztworu barwiącego, inkubuj w ciemności w temperaturze 37°C przez 30 minut.
4. Oceń intensywność fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej. Wykonaj analizę cyklu komórkowego za pomocą cytometru przepływowego.

7. Barcowanie TUNELU

1. Komórki włókna wysokiej węgla z różnych grup zabiegowych wystawiaj na 1 mL 4% paradehydu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
2. Dodaj do komórek 1 mL PBS zawierającego 0,3% Triton X-100 i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
3. Przemyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie dodaj roztwór TUNEL 500 μL kropelowo, aby równomiernie pokryć komórki. Inkubuj w temperaturze 37°C w ciemności przez 1,5 godziny.
4. Dodaj 200 μL roztworu barwienia DAPI, aby pokryć komórki, i inkubuj z dala od światła przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
5. Uszczelnij komórki medium mocującym sygnał fluorescencyjny, a następnie obserwuj i fotografuj je mikroskopem fluorescencyjnym (komórki TUNEL-pozytywne wykazują zieloną fluorescencję).

8. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Rozsiewaj komórki HDF z różnych grup zabiegowych do płytek z 12 dołkami. Gdy gęstość komórek osiągnie 50%-60%, poddaj komórki 1 mL 4% paraformaldehydu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
2. Dodaj 1 ml 5% prowincji surowicy bydłej (BSA) krople, aby zablokować powierzchnię komórki, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
3. Dodaj 500 μL przeciwciał pierwotnych Ki67 (1:300), kolagen I (1:100), metaloproteinazę macierzową (MMP)-1 (1:50) lub MMP-3 (1:100) kroplami i inkubuj w temperaturze 4°C przez noc.
4. Następnego dnia inkubuj komórki 500 μL przeciwciała wtórnego znakowanego izotiocyanianem fluoresceiny (FITC) (1:100) w temperaturze 37°C z dala od światła przez godzinę.
5. Dodaj 200 μL roztworu barwienia DAPI, aby pokryć komórki, inkubuj z dala od światła przez 10 minut, obserwuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i analizuje za pomocą oprogramowania do analizy obrazów (komórki z pozytywnym kolagenem I i MMP-1 wykazują czerwoną fluorescencję, komórki pozytywne Ki67 i MMP-3 wykazują zieloną fluorescencję).

9. ELISA

1. Dodaj 100 μL supernatantu hodowli komórek HDF do studni z płytkami zestawu MMP-1 lub MMP-3 ELISA i inkubuj w temperaturze 37°C przez 2 godziny.
2. Przemyj studnie 3 razy 200 μL PBS, następnie dodaj 100 μL odpowiadającego przeciwciała do każdego odwiertu i inkubuj w 37 °C w ciemności przez 1 godzinę.
3. Przepłucz studnie 3 razy 200 μL buforu do płukania (dostarczonego w zestawie), strząśnij nadmiar roztworu i inkubuj próbki 100 μL streptawidyny-HRP przez 30 minut w temperaturze 37°C w ciemności.
4. Po płukaniu PBS dodaj 100 μL podłoża A i B zgodnie z instrukcją zestawu i inkubuj w temperaturze 37°C w ciemności przez 10 minut.
5. Dodaj 50 μL roztworu zakończenia, dobrze wymieszaj, ocenij wartość OD₄₅₀ za pomocą czytnika mikropłyt i oblicz stężenie.

10. Konstrukcja modelu myszy z uszkodzeniami fotostarzenia

1. Trzymaj samice bezwłosych myszy SKH1 o jakości SPF (15-20 g, 4-5 tygodni) w temperaturze 22 °C i wilgotności 55%-60% oraz umożliwiają autonomiczny dostęp do jedzenia i wody. Dezynfekuj regularnie obiekty, w tym pojemniki na jedzenie, butelki na wodę i wylewy do picia.
2. Losowo przypisz myszy do grupy kontrolnej (n=6) oraz grupy modelowej (n=18). Myszy z grupy modelowej Irradiate z UVA przy 0,35 J/^cm2 przez 8 tygodni³⁴; Myszy grupy kontrolnej w tym samym środowisku bez promieniowania UVA.
3. Podziel myszy z grupy modelowej równo na 3 podgrupy (n=6 każda).
4. Podawaj podskórne zastrzyki HNK w dawce 5 mg/kg lub 10 mg/kg w objętości 100 μL dwa razy w tygodniu do dwóch podgrup podczas napromieniania UVA (rejestrowane jako grupa 5 mg/kg HNK i grupa 10 mg/kg HNK). Podawanie podskórnych zastrzyków 100 μL soli fizjologicznej dwa razy w tygodniu trzeciej podgrupie podczas napromieniowania UVA (zarejestrowane jako grupa UVA).
5. Oceń powstawanie zmarszczek na skórze i zawartość wody po udanym modelowaniu³⁵.
6. Uśpiewa myszy pentobarbitalem sodu (100 mg/kg) dootrzewkowo, a następnie zbiera tkanki skóry grzbietowej do dalszych eksperymentów.

11. Pomiar zawartości kolagenu I w skórze

1. Zbierz 50 mg tkanek skóry grzbietowej myszy, dokładnie je zmiel w ciekłym azocie i lizuj za pomocą 500 μL wcześniej schłodzonego bufora RIPA przez 30 minut na lodzie.
2. Wiruj lizatan w dawce 8000 × g przez 5 minut w 4 °C, pobierz supernatant i zmierz zawartość kolagenu za pomocą zestawu do testowania peptydów prokolagenu IC zgodnie z instrukcjami producenta.

12. Barwienie hematoksylyną i eozyną (HE)

1. Utrwalić tkanki skóry myszy w 10 mL 4% paradehydu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, suszyć w etanolu gradientowym (50%, 75%, 95%, 100%, każdy przez 5 minut), zanurzyć w parafinie i pokroić na plasterki o objętości 4 μm.
2. Piecz plasterki w 65°C przez 8 godzin, odparaffinuj w ksylenie dwa razy przez 10 minut każdy, a następnie nawilżaj w etanolu gradientowym w temperaturze pokojowej.
3. Barwić plasterki roztworem hematoksyliny przez 8 minut, przepłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 1 minutę, różnicować roztworem różnicującym przez 30 sekund i barwić eozyną przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
4. Susz zabarwione plastry w gradientowym etanolu, przezroczystym w ksylenie, zamykaj medium montażowym i obserwuj pod mikroskopem (jądro komórki wygląda na niebiesko-fioletowe, podczas gdy cytoplazma, włókna kolagenowe i erytrocyty różowe w różowym stopniu).

13. Barwienie Massona

1. Barwij parafinowe fragmenty tkanek skóry myszy za pomocą zestawu do barwienia trichromowego Masson³⁶. Odparaffiniuj fragmenty parafiny w ksylenie dwa razy przez 10 minut każda, dodaj roztwór barwienia żelaza Heoksylyny Weigerta i barw przez 10 minut.
2. Różnicuj roztworem różnicowania etanolu kwasowego przez 30 sekund, płukaj bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, a następnie barw roztworem barwiącym Ponceau-fuchsin kroplą przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wykonaj odwrotne niebieskie roztwory Masson's blue, a następnie spłukuj wodą destylowaną przez 1 minutę.
3. Przygotuj słaby roztwór kwasowy w stosunku wody destylowanej: słaby roztwór kwasowy (dostępny w zestawie) = 2:1; Dodaj 1 mL słabego roztworu kwaśnego kroplami i myj przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.
4. Wylej nadmiar płynu, dodaj 1 ml roztworu kwasu fosfolibdykowego kroplami i traktuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Dodaj 1 ml słabego roztworu kwaśnego krople, a następnie myj przez 30 sekund.
5. Wylej nadmiar płynu, dodaj 1 ml roztworu do barwienia anilinowego, krople i bejcuj przez 1 minutę. Dodaj 1 ml słabego roztworu kwaśnego kroplami i myj przez 30 sekund.
6. Szybko odsusz w 95% etanolu przez 2 sekundy. Susz w absolutnym etanolu dwa razy, po 10 sekund za każdym razem.
7. Po wyschnięciu oczyszcz fragmenty ksylenem i zamontuj z neutralną gumą. Obserwuj pod mikroskopem rozkład włókien kolagenowych w każdej grupie (włókna kolagenowe wydają się niebieskie, włókna mięśniowe, cytoplazma i erytrocyty są jaskrawoczerwone, a jądra komórkowe wyraźnie niebiesko-czarne).

14. Pomiar poziomów ROS tkanki skóry

1. Weź zamrożone fragmenty tkanki skóry myszy (przygotowane w ciągu 1 godziny od wycięcia), rozprowadz 1 ml roztworu czyszczącego kroplami na całą powierzchnię sekcji i pozostaw w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Strząśnij roztwór płuczący, a następnie dodaj 1 mL 10 μM reaktywnego tlenu sondą kroplą, aby równomiernie pokryć przekroje; Inkubuj w temperaturze 37 °C z dala od światła przez 30 minut.
3. Przepłukać przekroje dwukrotnie PBS, dodać pokrywy i obserwować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (obszary ROS wykazują czerwoną fluorescencję; im niższy poziom ROS, tym słabszy czerwony sygnał fluorescencji).

15. Testowanie wskaźników biochemicznych

1. Zbieraj surowicę myszy i przygotowuj odczynniki wykrywające zgodnie z instrukcjami odpowiednich zestawów testowych.
2. Zmierz aktywność transaminazy asparagianowej (AST) i transaminazy alaninowej (ALT) w surowicy mysi za pomocą odpowiednich zestawów.
3. Określ poziomy azotu mocznika we krwi (BUN) i kreatyniny (CRE) w surowicy mysi, korzystając z odpowiednich zestawów.

16. Western blot

1. Pobierz 50 mg tkanek lub 1×10^{6 komórek} , lizuj próbki na lodzie przez 30 minut za pomocą 200 μL buforu lizy RIPA, aby uzyskać białka.
2. Wiruj w 8000 × g przez 5 minut w 4 °C i zbieraj supernatant. Oceń zawartość białek w komórkach i tkankach za pomocą zestawu do testowania stężenia białek BCA.
3. Wykonaj elektroforezę białek próbek na żelu 12% SDS-PAGE oraz przenieś rozdzielone białka do błon PVDF w temperaturze 4 °C.
4. Blokuj membrany PVDF z 5% BSA przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Płukaj błony TBST (zawiera 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl i 0,1% Tween-20) trzykrotnie, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4°C z pierwotnymi przeciwciałami: P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:100), kolagen I (1:1000), Cyklina A2 (1:500), kinaza zależna od cykliny 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:100), Smad3 (1:1000), p-Smad2 (1:1000) lub p-Smad3 (1:1000).
5. Drugiego dnia myj błony 3 razy TBST, a następnie inkubuj z 1 mL koziego IgG antykróliczego (1:10000) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Równomiernie nałóż 500 μL odczynnika o zwiększonej chemiluminescencji (ECL) na błony, a następnie skanuj je za pomocą systemu obrazowania żelowego.
6. Wykonaj analizę wartości szarości za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Relatywny poziom wyrażenia wyrażamy jako stosunek jego wartości szarości do wartości GAPDH.

17. Analiza statystyczna

1. W testach in vitro na komórkach wszystkie eksperymenty są niezależnie powtarzane trzy razy (n=3, biologiczne replikacje).
2. W eksperymentach in vivo na zwierzętach uwzględnia się 6 myszy na grupę (n=6), co jest zgodne z zasadami 3R dotyczących dobrostanu zwierząt laboratoryjnych i etyki.
3. Wszystkie wyniki wyrażane są jako średnia ± odchylenie standardowe. Wykonuj analizę statystyczną za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Normalność danych została przetestowana za pomocą testu Shapiro-Wilka.
4. Dla danych rozproszonych o normalnym rozkładzie użyj jednokierunkowej ANOVA do porównania wielogrupowego, a następnie testu post-hoc Tukeya do porównań parowych między grupami. Dla danych o rozkładzie nienormalnym zastosuj nieparametryczny test Kruskala-Wallisa. P< 0,05 wskazuje na istotną różnicę.
5. Generuj wykresy za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów.

Wyniki

HNK łagodzi uszkodzenia wywołane stresem oksydacyjnym w komórkach HDF spowodowane przez UVA
Wpływ różnych stężeń HNK podczas traktowania przez 24 h lub 48 h na żywotność komórek HDF zbadano za pomocą testu żywotności komórek w celu wyłonienia odpowiedniego stężenia i czasu ekspozycji. Wyniki wykazały, że stężenia 2,5, 5 i 10 µM HNK nie wpłynęły znacząco na żywotność prawidłowych komórek HDF po 24 h lub 48 h traktowania, co dowodzi, że HNK jest nietoksyczny dla prawidłowych komórek w tych dawkach. Co ...

Dyskusja

Światło ultrafioletowe jest jednym z czynników środowiskowych, które szkodzą komórkom i organizmom. Wcześniejsze badania wykazały, że promieniowanie UVA, ze względu na swoją wysoką zdolność przenikania, jest głównym rodzajem światła ultrafioletowego docierającym do powierzchni Ziemi³⁸. Fibroblasty są istotnymi komórkami funkcjonalnymi skóry właściwej, a ich starzenie się może bezpośrednio lub pośrednio prowadzić do starzenia się skóry³⁹. Model uszkodzeń fotostarzeniowych in...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do analizy aktywności ALT	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	P2711M	Zestaw do wykrywania aktywności transaminazy alaninowej
Zestaw do testowania Amplex Red CRE	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	S0291S	Zestaw do wykrywania kreatyniny
Medium montażowe AntiFade	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	P0126	Medium montażowe do zachowania sygnału fluorescencyjnego
Zestaw do analizy aktywności AST	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	P2715S	Zestaw do wykrywania aktywności transaminazy asparagianowej
Zestaw do testowania białka BCA	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	P0012	Zestaw do określania stężenia białka
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	V900933	Czynnik blokujący wiązanie niespecyficzne
Zestaw do testowania BUN	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	S0574S	Zestaw do wykrywania azotu z mocznika we krwi
Zestaw do testowania CAT	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	S0051	Zestaw do wykrywania aktywności katalazy
Odczynnik CCK-8	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	96992	Roztwór do testu żywotności komórek, który jest rozpuszczalną w wodzie solą tetrazolową
Przeciwciało CDK2	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-79024	Przeciwciało główne do wykrywania CDK2
Chemiluminescencyjny środek ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-K1005	Ulepszony odczynnik wykrywający chemiluminescencję
Przeciwciało I	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-26204	Główne przeciwciało do wykrywania kolagenu I
Przeciwciało cykliny A2	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-34682	Główne przeciwciało do wykrywania cykliny A2
Roztwór barwienia DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9542	Barwnik do barwienia jądrowego
Fluorescencyjna sonda DCFH-DA	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-D0940	Reaktywna sonda fluorescencyjna z gatunkami tlenu
Rozwiązanie różniczkowania	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	C0161	Odczynnik do etapu różnicowania hematoksyliny
Sonda dihydroetydowa	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	S0063	Sonda reaktywnych składników tlenu
Medium hodowlane fibroblastów	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, Chiny	SNPM-H342	Kompletne podłoże hodowlane do wzrostu fibroblastów
IgG antykrólikowy z oznaczeniem FITC	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F-2765	Przeciwciało wtórne znakowane izotiocyanianem fluoresceiny (FITC)
Cytometria przepływowa	BD nauki biologiczne, San Jose, CA, USA	BD FACSCaliburTM	Cytometr przepływowy
Oprogramowanie FlowJo	BD nauki biologiczne, San Jose, CA, USA	v10.8	Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej
Mikroskop fluorescencyjny	Leica, Heidelberg, Niemcy	DM IL PROWADZIŁ	Mikroskop do obrazowania fluorescencyjnego
Przeciwciało GAPDH	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-987	Przeciwciało kontroli wewnętrznej do normalizacji białek
System obrazowania żelowego	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	iBright CL1500	System obrazowania do wykrywania białek
kozy antykrólikowe IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	31460	Przeciwciało wtórne do immunodetekcji
Oprogramowanie Graphpad Prism 9.0	Oprogramowanie GraphPad, San Diego, CA, USA	Prism 9.0	Oprogramowanie do grafowania
Zestaw do testowania GSH	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	S0053	Zestaw do wykrywania zawartości glutationu
Zestaw do bejcowania HE	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	C0105S	Zestaw do barwienia histologicznego do analizy morfologii tkanek
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N0003	Honokiol, związek bioaktywny
Ludzkie fibroblasty skórne	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, Chiny	SNP-H342	Pierwotne komórki fibroblastu skóry u człowieka
Oprogramowanie IBM SPSS Statistics 26.0	IBM Corporation, Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statystyki 26.0	Oprogramowanie do analizy statystycznej
Oprogramowanie ImageJ	Wayne Rasband, Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego, USA	Wersja 1.54h	Oprogramowanie do analizy obrazów
Przeciwciało Ki67	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14520	Główne przeciwciało do wykrywania markerów proliferacji komórek
Mikroskop świetlny	Leica, Heidelberg, Niemcy	DM3000	Mikroskop optyczny do obrazowania w jasnym polu
Zestaw do barwienia trichrom Masson	Solarbio, Pekin, Chiny	G1340	Zestaw do barwienia kolagenu i tkanki łącznej
Zestaw do testowania MDA	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	S0131S	Zestaw do wykrywania poziomu malondialdehydu (marker peroksydacji lipidów)
Czytnik mikropłyt	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	1410101	Urządzenie do pomiaru absorpcji do testów komórkowych
Przeciwciało MMP-1	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-27210	Główne przeciwciało do wykrywania metaloproteinazy-1 w macierzu
Zestaw MMP-1 ELISA	Biotechnologia powiązana z enzymami, Szanghaj, Chiny	ml038199	ilościowe wykrywanie MMP-1 w próbkach biologicznych
Przeciwciało MMP-3	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab52915	Główne przeciwciało do wykrywania metaloproteinazy-3 w macierzu
Zestaw MMP-3 ELISA	Biotechnologia powiązana z enzymami, Szanghaj, Chiny	ml105322	ilościowe wykrywanie MMP-3 w próbkach biologicznych
Guma neutralna	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	C0173	Medium montażowe
Przeciwciało P16	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-20379	Główne przeciwciało do wykrywania białka p16
Przeciwciało P21	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14949	Główne przeciwciało do wykrywania białka p21
Przeciwciało P53	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab131442	Główne przeciwciało do wykrywania białka p53
Paraformaldehyd	Solarbio, Pekin, Chiny	P1110	Odczynnik do utrwalania komórek i tkanek
PI	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	ST512	jodek propidiu do barwienia DNA w analizie cyklu komórkowego
Zestaw do testowania peptydów prokolagenu I C	TAKARA, Tokio, Japonia	MK101	Zestaw do wykrywania syntezy kolagenu
Przeciwciało p-Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-244G	Główne przeciwciało do wykrywania fosforylowanego Smad2
Przeciwciało p-Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-246G	Główne przeciwciało do wykrywania fosforylowanego Smad3
Membrany PVDF	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	88520	Błona transferowa białek do western blottingu
Bufor lizy RIPA	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	P0013B	Bufor do ekstrakcji białek dla lizatów komórkowych i tkankowych
RNaseA	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	ST579	rybonukleaza do usuwania RNA podczas barwienia DNA
Zestaw do barwienia SA-β-galaktozydazy	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	C0602	Zestaw do wykrywania starzenia komórkowego
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-10431	TGF i beta; 1 Inhibitor szlaku sygnalizacyjnego
Żele SDS-PAGE	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	WG1403BX10	Żele poliakrylamidowe do elektroforezy białek
Bezwłose myszy SKH1	Vitalriver, Pekin, Chiny		Model zwierzęcy do badań foto-starzenia skóry
Przeciwciało Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1300	Główne przeciwciało do wykrywania Smad2
Przeciwciało Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1500	główne przeciwciało do wykrywania Smad3
Zestaw do testowania SOD	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	S0101S	Zestaw do wykrywania aktywności dysmutazy nadtlenkowej
TGF i beta; 1 przeciwciało	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab215715	pierwotne przeciwciało dla TGF i beta; 1 Wykrywanie
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-100	Niejonowy detergent do przepuszczania błon komórkowych
Rozwiązanie testu TUNEL	Beyotime Biotechnology, Szanghaj, Chiny	C1086	Odczynnik wykrywający apoptozę w przypadku fragmentacji DNA
Ksylen	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	247642	Rozpuszczalnik organiczny do deparafinizacji tkanek