Izolacja i hodowla białych i brązowych preadipocytów z embrionów myszy

Podsumowanie

Przedstawiamy nowatorskie, solidne i powtarzalne podejście do izolowania i hodowli białych i brązowych preadipocytów z embrionów myszy, ustanawiając potężną strategię in vitro do analizy komórkowych i molekularnych mechanizmów regulujących zaangażowanie i różnicowanie linii adipocytów oraz dostarczając ramy do badania wpływu rozwoju tkanki tłuszczowej.

Streszczenie

Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w homeostazie metabolicznej, a jej właściwości kształtują się podczas rozwoju embrionalnego poprzez różnicowanie adipocytów. Preadipocyty embrionalne stanowią zatem istotny model do badania wczesnych zdarzeń w formowaniu tkanki tłuszczowej i specyfikacji linii rodowej. Artykuł ten opisuje powtarzalny protokół izolacji i in vitro różnicowania białych i brązowych preadipocytów izolowanych z zarodków myszy w dniu embrionalnym 15.5 (E15.5), etapie rozwojowym, w którym zaczynają się tworzyć depoy tłuszczowe. Metoda ta dostarcza szczegółowych wskazówek dotyczących mikrosekcji tkanek, trawienia enzymatycznego, hodowli pierwotnej oraz warunków różnicowania specyficznych dla linii liniowej, które wspierają żywotność komórek i dojrzewanie adipogenne. Reprezentatywne wyniki obejmują nagromadzenie kropelek lipidowych oraz ekspresję markerów powiązanych z linią rodową, potwierdzając skuteczną różnicację w określonych warunkach hodowlanych. Dzięki temu podejściu preadipocyty embrionalne mogą być kierowane na los białych lub brązowych adipocytów, co umożliwia porównawczą analizę czasu rozwoju, cech linii i profili ekspresji genów. Protokół ten stanowi praktyczne i rozwojowo istotne narzędzie do badania tworzenia tkanki tłuszczowej oraz mechanizmów programowania okołoporodowego w kontrolowanych, eksperymentalnych warunkach.

Wprowadzenie

Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy całego ciała poprzez regulację magazynowania energii, sygnalizacji endokrynologicznej oraz adaptacyjnej termogenezy, jednocześnie intensywnie oddziałując zarówno z lokalnymi, jak i odległymi narządami ^1,2,3. Można wyróżnić dwa główne typy tkanki tłuszczowej: białą tkankę tłuszczową (WAT) oraz brązową tkankę tłuszczową (BAT), które różnią się wyraźnie pod względem linii komórkowej, funkcji fizjologicznej, rozkładu anatomicznego i aktywności metabolycznej⁴.

WAT stanowi główny rezerwuar energii organizmu. Białe adipocyty są wysoce wyspecjalizowane w magazynowaniu lipidów i charakteryzują się obecnością pojedynczej dużej kropli lipidowej (LD), która zajmuje większość przestrzeni cytoplazmatycznej⁵. Natomiast BAT specjalizuje się w termogenezie niedrżącej. Brązowe adipocyty zawierają wiele małych LD i wykazują wysoką gęstość mitochondriów ^3,6. Termogenna zdolność BAT opiera się na Uncoupling Protein 1 (UCP1), białku błony mitochondrialnej wewnętrznej, które ułatwia wyciek protonów przez błonę⁷. Oddzielając fosforylację oksydacyjną od syntezy ATP, UCP1 rozprasza gradient protonowy w postaci ciepła, przyczyniając się tym samym do utrzymania temperatury ciała⁸. Biorąc pod uwagę ich różnorodne role, WAT i BAT wzbudziły duże zainteresowanie nie tylko jako kluczowe regulatory i potencjalne cele terapeutyczne w chorobach metabolicznych, ale także w biologii rozwojowej i ewolucyjnej, immunologii oraz starzeniu, ze względu na ich złożone i dalekosiężne interakcje systemowe ^9,10. Rosnące dowody wskazują również, że programowanie metaboliczne płodu jest ściśle związane z rozwojem tkanki tłuszczowej, ponieważ zaburzenia w środowisku wewnątrzmacicznym mogą wpływać na liczbę, rozkład i funkcjonowanie adipocytów, co predysponuje osoby do otyłości i chorób metabolicznych w późniejszym życiu¹¹.

Aby zbadać biologię tkanki tłuszczowej, dostępność dojrzałych adipocytów jest niezbędna. Systemy hodowli in vitro zapewniają kontrolowane środowisko, które pozwala ocenić konkretne czynniki wpływające na adipogenezę i funkcję adipocytów. Ustalono kilka protokołów dotyczących izolacji i różnicowania adipocytów od dorosłych myszy lub noworodków 12,13,14,15. Jednak te progenitory adipocytów mogą różnić się od pierwotnych populacji komórek, które podczas rozwoju tworzą tkanki tłuszczowe. U myszy depoty BAT są pierwszymi rozwijającymi się podczas embriogenezy, zapewniając noworodkom niedrżącą zdolność termogeniczną, kluczową dla adaptacji do zimna po porodzie. Złoża brązowych adipocytów można wykryć w okolicy międzyłopatkowej już w dniu embrionalnym 14.5 (E14.5)¹⁶. LD zaczynają się formować w wieku E15,5, a ekspresja UCP1 rozpoczyna się około E16,5. W zarodku myszy preadipocyty pachwinowego WAT (iWAT) są już obecne na tym etapie¹⁶.

Opisany protokół koncentruje się na preadipocytach izolowanych w E15.5. Etap ten odpowiada okresowi embrionalnemu, podczas którego komórki progenitorowe inicjują różnicowanie in vivo¹⁶, reprezentując tym samym główne progenitory, które dają początek WAT i BAT. Natomiast progenitory adipogenne wyizolowane w dorosłym lub noworodkowym stadium mogły już być pod wpływem czynników środowiskowych i wykazywać bardziej ograniczoną plastyczność. Dlatego stosowanie progenitorów embrionalnych w E15.5 zwiększa zdolność wiernego podsumowania programu adipogenicznego in vivo , ponieważ komórki te zachowują wysoki stopień plastyczności rozwojowej i są bardziej skłonne do podążania za trajektoriami fizjologicznych różnicowania. To podejście jest szczególnie interesujące dla zagadnień z biologii rozwojowej, zwłaszcza do badania wpływu czynników środowiskowych na różnicowanie preadipocytów w okresie okołoporodowym, stanowiąc cenny model do badania, jak ekspozycja we wczesnym życiu może kształtować rozwój tkanki tłuszczowej oraz długoterminowe wyniki metaboliczne. Jednak użytkownicy powinni zachować ostrożność w tej specyficzności etapu: metoda jest zoptymalizowana pod kątem zarodków E15.5, a odchylenia w wieku embrionalnym lub precyzji sekcji mogą wpływać na wydajność lub żywotność komórek. Dodatkowo technika mikrosekcji wymaga praktyki, aby uniknąć skażenia tkankami nietłuszczowymi, zwłaszcza biorąc pod uwagę niewielkie rozmiary magazynów embrionalnych. Protokół ten podsumowuje wszystkie kroki i procedury izolacji, hodowli, amplifikacji i różnicowania embrionalnych preadipocytów w dojrzałe brązowe i białe adipocyty.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były wykonywane zgodnie z lokalnymi przepisami oraz zgodnie z wytycznymi określonymi w Dyrektywie Rady Unii Europejskiej z dnia 22 września 2010 r. (2010/63/UE) (APAFIS#2617-2015110517317420).

Wszystkie odpady biologiczne i roztwory enzymatyczne muszą być traktowane i utylizowane zgodnie z wytycznymi i przepisami instytucjonalnymi dotyczącymi biobezpieczeństwa dla materiałów biologicznie niebezpiecznych. Konkretnie:
- Odpady biologiczne: zbierane w zatwierdzonych pojemnikach na zagrożenia biologiczne i utylizowane za pomocą autoklawu lub zgodnie z zaleceniami biura ds. bezpieczeństwa biologicznego instytucji.
- Roztwory enzymatyczne: dezaktywować pozostałą aktywność enzymatyczną przez dodanie 10% wybielacza przez 30 minut i utylizować jako odpady chemiczne zgodnie z lokalnymi przepisami.
- Skażone materiały zużywalne (końcówki pipet, rurki itp.): umieść w workach biologicznych i autoklawie przed utylizacją.
- Odczynniki utrwalające: utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne w wyznaczonych pojemnikach.

Zawsze noszę odpowiednie środki ochrony osobistej podczas obsługi odpadów.

1. Pobieranie zarodków myszy

1. Uśpienie ciężarnych myszy (C57Bl/6J) zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych.
2. Dezynfekuj okolice brzucha u ciężarnych myszy 70% etanolem i wykonaj nacięcie środkowe, aby odsłonić macicę.
3. Naciń jamę brzuszną, aby usunąć worek żółtkowy zawierający zarodki w E15.5 i umieść je w agarozowym pudełku zawierającym zimną (4 °C) 1x PBS.
4. Usuń zewnętrzną błonę każdego worka żółtkowego i łożyska oraz przetnij pępowinę zarodków.
5. Umieść zarodki w nowym pudełku z agarozą zawierającym zimny 1x PBS.
   UWAGA: Chociaż struktury ośrodkowego układu nerwowego, które leżą u podstaw świadomego odczuwania bólu, nie są w pełni rozwinięte na tym etapie ciążowym, nocyceptory obwodowe zaczynają się formować między E13 a E15. Zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej opieki nad zwierzętami, aby zminimalizować potencjalne reakcje nocyceptywne, zalecamy jednak, aby zarodki zostały uśpione przez dekapitację przed jakąkolwiek eksperymentalną manipulacją.

2. Rozwarstwienie tkanek tłuszczowych embrionalnych (Rysunek 1)

1. Rozwarstwienie BAT międzyłopatkowego (Rysunek 1A)
   1. Wytnij prostokąt z płytki 5% agarozy i umieść w niej zarodek, aby go unieruchomić. Napełnij talerz zimnym 1x PBS. Umieść pudełko z agarozą z zarodkiem pod mikroskopem obuocznym.
   2. Usuń skórę z tyłu zarodka.
   3. Rozciąć nietoperza międzyłopatkowego za pomocą drobnych kleszczy i mikronożyczek.
   4. Ostrożnie oddziel BAT od otaczającej tkanki (tkanki łącznej i mięśnia) za pomocą mikronożyc, aby uzyskać próbkę BAT o wymiarach około 4–6 mm x 2–3 mm.
   5. Włóż BAT do probówki o pojemności 2 mL zawierającej 1 mL zimnej (4 °C) mieszanki Dulbecco Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) z 100 U/mL penicyliny/streptomycyny (P/S).
2. Rozbiórka iWAT (Rysunek 1B)
   1. Połóż zarodek na boku (z jednej strony, potem z drugiej) na płytkę agarozową.
   2. Rozciągnij iWAT za pomocą cienkich kleszczy i mikronożyczek.
   3. Ostrożnie oddziel iWAT od otaczającej tkanki (tkanki łącznej i skóry), aż uzyskasz dwa magazyny o wymiarach około 2–4 mm x 0,5–0,8 mm.
   4. Umieść dwie próbki WAT w probówce o pojemności 2 mL zawierającej 1 ml zimnej DMEM/F-12 glutaminy z 100 U/mL penicyliny/streptomycyny (P/S).
      UWAGA: Wszystkie sekcje muszą być wykonywane pod mikroskopem binokularnym w jak najbardziej sterylnym środowisku, przy użyciu narzędzi wcześniej zdezynfekowanych.

3. Trawienie tkanek tłuszczowych

1. Usuń DMEM/F12 pipetą i dodaj do rurek 200 μL glutaminy DMEM/F12 z 100 U/mL P/S, 0,2% albuminy surowicy bydłej (BSA), 0,5 U kolagenazy D oraz 0,5 U Dispaze II.
2. Przetnij tkanki mikronożyczkami w rurkach, aby jak najbardziej zmniejszyć fragmenty tkanek i wspomóc proces trawienia pipetując w górę i w dół 10 razy.
   UWAGA: W pełni strawione próbki powinny wyglądać jako mętna zawiesina bez widocznych grudek tkanek.
3. Inkubuj w temperaturze 37 °C (w kąpieli wodnej) przez 15 minut.
4. Zatrzymaj reakcję, dodając 600 μL zimnego DMEM/F-12 glutaminy z 100 U/mL P/S, 20% surowicy płodowej bydła (FBS). Równomiernie zawiesz, pipetując w górę i w dół 10 razy.

4. Hodowla komórek pierwotnych

UWAGA: Od tego etapu wszystkie procedury muszą być wykonywane w surowych warunkach sterylnych w Szafie Bezpieczeństwa Biologicznego (BSC), aby zapobiec skażeniu. Noś sterylne rękawiczki, fartuch laboratoryjny i gogle ochronne, aby zachować sterylność i chronić przed potencjalnymi zagrożeniami. Używaj sterylnych jednorazowych szkół sztucznych, techniki aseptycznej i upewnij się, że wszystkie odczynniki i media są sterylne. Unikaj kontaktu z powierzchniami niesterylnymi, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

1. Nakładaj komórki na szkiełka studni i inkubuj je w standardowych warunkach (37 °C, 5%_CO2) przez 1 godzinę; dla płyt 8-dołkowych należy podać 200 μL/dołek. Po inkubacji potwierdzić, że komórki się przylegały, delikatnie poruszając płytką podczas obserwacji pod mikroskopem.
   UWAGA: Na tym etapie różne próbki BAT lub WAT można zebrać w jedną probówkę, aby uzyskać ujednolicone kultury w różnych dołach (np. aby przetestować wpływ zabiegu na podobne hodowle).
2. Zamień podłoże na podgrzaną (37 °C) glutaminę DMEM/F-12 z 100 U/mL P/S, 10% FBS i inkubuj komórki przez noc w 37 °C, 5%_CO2.
   UWAGA: Zmieniając medium, usuwane są martwe/nieprzyczepione komórki oraz fragmenty tkanek, których nie dało się rozłożyć, pozostawiając jedynie przymocowane komórki.
3. Leczenie różnicowania (72 h)
   1. Dla różnicowania brązowych adipocytów należy zmienić podłoże za pomocą podgrzanej (37 °C) glutaminy dmem/f-12 z 100 U/mL P/S, 10% FBS, 125 nM indometacyny, 0,5 mM 3-izobutyl-1-metyloksantyny (IBMX), 1 nM trijodotyroniny (T3), 1 μM rozyglitazonu, 1 μM deksametazonu oraz insuliny 850 nM i inkubować w temperaturze 37 °C, 5%_CO2 przez 72 godziny.
   2. W przypadku różnicowania białych adipocytów należy zmienić podłoże za pomocą podgrzewanej DMEM/F-12 glutaminy z 100 U/mL P/S, 10% FBS, 0,5 mM IBMX, 1 μM deksametazonu i insuliną 850 nM, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C, 5%_CO2 przez 72 godziny.
4. Leczenie podtrzymujące (co 48 godzin)
   1. Zmień podłoże za pomocą podgrzanej (37 °C) GLUTAMINY DMEM/F-12 o stężeniu 100 U/mL P/S, 10 % FBS, 1 nM T3, 1 μM rozyglitazonu i insulinie 850 nM. Odnawiaj medium co 48 godzin.
      UWAGA: Wszystkie wymienione stężenia odnoszą się do końcowych stężeń roboczych odczynników. Dostosuj końcowe objętości mediów różnicujących i utrzymania w zależności od liczby studni do obróbki, używając 200 μL na odwiert jako standardową objętość dla płyt 8-dołowych.

5. Utrwalanie i immunobarwienie (Rysunek 2A)

1. Aspiruj medium i myj komórki zimnym 1x PBS.
2. Utrwal komórki przez 10 minut zimnym 4% formaldehydem w 1x PBS.
3. Myj komórki 1x PBS przez 3 x 5 minut.
4. Przepuszczaj komórki 0,1% trytonu w 1x PBS przez 10 minut.
5. Myj komórki 1x PBS przez 3 x 5 minut.
6. Blokuj nieokreślone miejsca za pomocą 5% normalnej surowicy osła (NDS) w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
   UWAGA: Wybór gatunku surowicy blokującej zależy od gatunku, w którym powstają przeciwciała wtórne.
7. Inkubuj pierwotne przeciwciała rozcieńczone w 5% NDS w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Nie dodawaj przeciwciał pierwotnych do jednego z dołków — będzie to działać jako kontrola negatywna.
8. Przemyj komórki 1x PBS przez 2 x 5 minut.
9. Myj komórki 5% NDS w 1x PBS przez 5 minut.
10. Inkubuj z przeciwciałami wtórnymi, DAPI i Bodipy przez 1 godzinę w RT, przykryte w celu ochrony przed światłem.
11. Przemyj studnie 1x PBS przez 3 x 5 minut.
12. Utrzymuj komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu wykonania zdjęć.

6. Kriokonserwacja preadipocytów

UWAGA: Możliwe jest zatrzymanie hodowli i zamrozenie komórek przed lub po procesie różnicowania, aby je przechowywać i ponownie wykorzystać do kolejnych hodowli komórkowych.

1. Przygotuj medium zamrażające: 50% FBS, 40% DMEM/F-12 glutaminy z 100 U/mL P/S, 10% dimetylsulfotlenek (DMSO).
   UWAGA: DMSO to niebezpieczny związek chemiczny. Jest drażniącą substancją dla skóry i oczu, może ułatwić wchłanianie innych toksycznych substancji przez skórę i może powodować szkody w przypadku wdychania lub spożycia. Zawsze zajmij się DMSO wewnątrz BSC, aby zminimalizować narażenie i zanieczyszczenie. Noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE) (sterylne rękawice, fartuch laboratoryjny oraz gogle ochronne, aby zapobiec kontaktowi). Unikaj kontaktu ze skórą. W przypadku kontaktu natychmiast umyj wodą. Przechowuj DMSO w szczelnie zamkniętym pojemniku w BSC, gdy nie jest używane, i zapewnij prawidłową utylizację zgodnie z protokołami bezpieczeństwa laboratoryjnego.
2. Przemyj komórki podgrzaną (37 °C) 1x PBS.
3. Dodaj podgrzaną (37 °C) trypsynę 0,05% w celu chemicznego odłączenia komórek i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5%_CO2. Sprawdź wizualnie pod mikroskopem odłączenie komórek.
4. Zatrzymaj reakcję, dodając 3x większą objętość podgrzanej (37 °C) DMEM/F-12 glutaminy z 100 U/mL P/S, 10% FBS. Równomiernie zawiesz.
5. Wirówka 7 minut przy RT, 300 × g i odrzuć supernatant.
6. Ponownie zawiesij komórki w 10 mL medium zamrażającego. Wirówka 7 minut przy RT, 300 × g i odrzuć supernatant, pozostawiając około 3 mL.
   UWAGA: Po liczeniu zmierz dokładną objętość, aby obliczyć całkowitą liczbę komórek.
7. Rozcieńcz niewielką objętość 1:2 Trypan Blue i licz żywe komórki za pomocą komory Neubauera.
8. Dostosuj objętość za pomocą medium zamrażającego, aby uzyskać 5 × 10⁴ – 1 × 10⁵ komórek/fiolkę (ostateczna objętość: 1 mL/fiolka).
9. Przelej fiolki do pojemnika do zamrażania (tempo chłodzenia: -1 °C/min) i przechowuj w temperaturze -80 °C przez noc.
10. Przenieś do ciekłego azotu do długoterminowego przechowywania.
    UWAGA: Protokół ten pozwala na żywotność powyżej 90% po rozmrożeniu.
11. Rozmrażaj komórki w razie potrzeby, szybko rozmrażając fiolkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
12. Przelej zawartość fiolki do 4 mL podgrzanej (37 °C) GLUTAMINY DMEM/F-12 z 100 U/mL P/S, 10% FBS. Równomiernie zawiesz się, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5%_CO2.
13. Wymień medium na świeżą DMEM/F-12 glutaminę z 100 U/mL P/S, 10% FBS i odnawiaj co 48 godzin.
    UWAGA: Zmiana podłoża jest kluczowa, aby usunąć pozostałości DMSO, ponieważ długotrwała ekspozycja może zaszkodzić żywotności, różnicowaniu i funkcjonowaniu komórek. Zapewnij całkowitą wymianę medium, aby uniknąć efektów cytotoksycznych.
14. Kontynuuj eksperymenty lub komórki przechodzące, gdy osiągną 80% konfluencji.

Wyniki

Jak pokazano na Rysunku 1, nienaruszone magazyny BAT i iWAT mogą być efektywnie izolowane z zarodków w E15.5. Chociaż BAT jest łatwo wykrywalny w embrionach E15.5, wykrywanie iWAT może wymagać szkolenia. W obu przypadkach niezbędne jest mikrorozcinanie całej otaczającej tkanki po grubym rozwarstwieniu, aby uniknąć hodowli innych typów komórek.

Początkowe etapy trawienia i hodowli białych i brązowych preadipocytów są identyczne (Rysunek

Dyskusja

Hodowla preadipocytów była szczegółowo opisywana w różnych kontekstach eksperymentalnych. Jednak istniejące protokoły opierają się głównie na tkankach dorosłych lub fibroblastach embrionalnych, a obecnie nie istnieją ustandaryzowane metody izolowania i hodowli embrionalnych preadipocytów bezpośrednio z rozwijających się tkanek tłuszczowych. Badanie tych komórek jest szczególnie ważne, ponieważ reprezentują one autentyczne populacje preadipocytów zamieszkujących ich rodzime zarodkowe mikrośrodowisko. Takie analizy są kluc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3,5,3'-trijodottyronina	Sigma	709719	T3
3-izobutyl-1-metyloksantyna	Sigma	I7018	IBMX
Agarose	Sigma	A0169
Alkohol	VWR	1.59010.0500
Przeciwciało przeciw UCP1	Abcam	AB10983
Mikroskop binokularny	Leica	MZ9.5
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Thermo Scientific	51022482	BSC, szafka bezpieczeństwa HeraSafe KS klasy II
Bodipy	Invitrogen	D3922	Wzbudzenie/Emisja 493/504 nm
Albumina surowicy bydła	Euromedex	04-100-812-C	BSA
Wirówka	Eppendorf	5430 R
Zaciski	FST (Niemiecki Stainless)
Kolagenaza D	Sigma	11088882001
Kriotuby	Sarstedt	72.379
Płytki hodowlane (8-studniowe)	Ibidi	80826
Płytki hodowlane (12 studni)	Corning Costar	CLS3513	Płyta polistyrenowa, płaskie dno, sterylne
Deksametazon	Sigma	D2915
Dispase II	Sigma	4942078001
DMEM/F12	Gibco	31331	Dodana glutamina
DMSO	Sigma	D2438
Przeciwciało przeciwkrólikowe dla osła	Invitrogen	A32795	Alexa Fluo Plus 647
Eppendorfs 1,5 mL	Eppendorf	15625367
FBS	Gibco	A5256701
Formaldehyd 37 %	Thermo Scientific	119690010
Pojemnik zamrażający	Thermo Scientific	5100-0001
Hoechst	Invitrogen	H3570
Inkubator	Thermo Scientific	50116048	Inkubator CO2 Heracell 150i
Indometacyna	Sigma	I7378
Insulina	Sigma	I9278
mikroskop odwrócony wyposażony w mikroskop 10&; Oświetlenie obiektywne i halogenowe	Carl Zeiss Axio Vert.A1
Myszy C57BL/6J	Rzeka Charles
Mikronożyce	FST (Niemiecki Stainless)
NDS	Sigma	D9663
Komora Neubauera	Thermo Scientific	10195580
PBS 10x	Gibco	14200
PBS 1x	Gibco	14190
Penicylina/Streptomicyna	Gibco	15140-122
Szalki Petriego	Sarstedt	83.3902
płytki qPCR	Thermo Scientific	AB-0600
sonda qPCR dla Fabp4	Thermo Scientific	4331182	Testy TaqMan, Mm00445878_m1
sonda qPCR dla Pparg	Thermo Scientific	4331182	Testy TaqMan, Mm00440940_m1
sonda qPCR dla Ucp-1	Thermo Scientific	4331182	Testy TaqMan, Mm01244861_m1
Zestaw do transkrypcji odwrotnej	Thermo Scientific	4368813	Zestaw cDNA o dużej pojemności
Zestaw do ekstrakcji RNA	Omega Bio-Tek	R6934-02	E.Z.N.A. Zestaw Total RNA II
Rosiglitazon	Sigma	R2408
Triton X-100	Thermo Scientific	A16046
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Gibco	25300054
Kąpiel wodna	Grant	SAP12	Pojemność 12 L