Artykuł metodologiczny

Kolorymetryczna ocena aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa

671 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70104

⸱

10 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Experimental Toxicology and Ecology, BASF SE, 2Pharmacy, Pharmacology and Toxicology, Free University of Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R)

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje metodę kolorymetryczną umożliwiającą wiarygodną ocenę wpływu chemikaliów na aktywność dejodynazy 1 (DIO1) w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandell-Kolthoffa. Zawiera ona z góry określone kryteria akceptacji oraz statystyczne wskaźniki wydajności oraz wspiera dalsze działania na rzecz włączenia wytycznych testowych OECD.

Streszczenie

Metoda ta umożliwia identyfikację substancji testowych hamujących aktywność DIO1 i tym samym mogą zakłócać homeostazę hormonów tarczycy. Przedstawiony protokół opisuje nieradioaktywną, kolorymetryczną metodę oceny wpływu substancji testowych na aktywność enzymatyczną dejodynazy 1 (DIO1) w ludzkich mikrosomach wątroby. Test opiera się na reakcji Sandella-Kolthoffa (SK), która ilościowo określa jodek uwalniany podczas dejodynacji odwróconej trijodotyroniny (rT3) do dijodotyroniny (T2). Żółty cer (IV) redukuje się do bezbarwnego ceru (III) w obecności jodku, co pozwala na wykrywanie fotometryczne na 415 nm. W tym standaryzowanym układzie stężenie cerium (IV) jest ustawione na 40 mM, aby poprawić stabilność sygnału i odporność w opisanych warunkach. Aby zapewnić wiarygodność i powtarzalność testu, uwzględniono kompleksowy zestaw kontrolny: 6-propyl-2-tiouracyl (pozycja referencyjna), aurotioglukozę (kontrola dodatnia), sól sodową 1-tio-β-D-glukozy (kontrola ujemna) oraz 1% dimetylosulfoxid (kontrola rozpuszczalnika). Protokół obejmuje badanie pomiaru zakresu w celu określenia odpowiednich stężeń testowych, standaryzację aktywności uwalniania jodku specyficzną dla mikrosomów oraz strukturalne testy interferencyjne chemiczne w przypadku braku mikrosomów, z opcjonalną oceną kontrolną bez ditiotreitolu (DTT) w celu identyfikacji artefaktów zależnych od DTT. Test DIO1-SK nadaje się do badań przesiewowych o średniej i wysokiej przepustowości oraz toksykologii mechanistycznej. Jego odporność, skalowalność i zastosowanie w ludzkich mikrosomach czynią go cennym narzędziem do badania zaburzeń w funkcjonowaniu hormonalnym. Protokół ten wspiera działania regulacyjne w zakresie walidacji.

Wprowadzenie

Zaburzenia hormonalne (ED) to substancje chemiczne zakłócające regulację hormonalną i w konsekwencji powodujące niepożądane skutki u ludzi 1,2. Dejodynazy (DIO) to enzymy związane z błoną, z selenocysteiną jako kluczową resztą w ich aktywnych miejscach. Ta rodzina enzymów obejmuje trzy odrębne izoformy (DIO1, DIO2 i DIO3), które łącznie modulują stężenia krążącego hormonu tarczycy (TH) i regulują ich dostępność tkankowo w komórkach3. Tyroksyna (T4), która pełni rolę prohormonu, oraz trijodotyronina (T3), forma aktywna, odgrywają kluczową rolę w regulacji wydatku energii, wzrostu, procesów rozwojowych i termoregulacji organizmu4. Izoformy DIO różnią się cechami specyficzności miejsc dejodawacji, właściwościami kinetycznymi oraz preferencjami podłoża3. DIO1 jest główną izoformą dejodynazy w dorosłej wątrobie i wykazuje silne powinowactwo substratowe do odwróconej trijodotyroniny (rT3) oraz siarczanowych jodotyronin, podczas gdy DIO2 preferencyjnie wykorzystuje T4 i rT3, a DIO3 działa głównie na T4 i T3. Wykorzystanie ludzkich mikrosomów wątroby i rT3 jako podłoża pozwala na selektywne wykrywanie aktywności DIO1, minimalizując interferencje ze strony innych izoform. Chociaż dokładne konsekwencje hamowania DIO1 wywołanego przez substancje nie zostały w pełni wyjaśnione, dowody z mutacji genów u ludzi wpływających na DIO1 wyraźnie pokazują, że DIO1 może zakłócać układ hormonów tarczycy5. W związku z tym istnieje krytyczna potrzeba solidnych i powtarzalnych metod badania hamowania DIO1.

Celem przedstawionej metody jest ilościowe określenie aktywności DIO1 in vitro za pomocą nieradioaktywnego, kolorymetrycznego podejścia opartego na reakcji Sandella-Kolthoffa (SK). DIO1 katalizuje przekształcenie odwróconego rT3 w T2, proces prowadzący do uwalniania jonów jodkowych. Reakcja SK umożliwia czułe wykrywanie uwolnionego jodku, umożliwiając określenie aktywności uwalniającej jodek (IRA) jako bezpośredniego pomiaru aktywności DIO1. Test ten umożliwia wykrywanie hamujących efektów substancji testowych na DIO1, wspierając toksykologię mechanistyczną, badania przesiewowe lub podejmowanie decyzji regulacyjnych. Jest szczególnie istotny do badania hamowania DIO1 jako molekularnego zdarzenia inicjującego niepożądane szlaki prowadzące do zaburzenia tarczycy, zgodnie z międzynarodowymi badaniami walidacyjnymi, takimi jak te koordynowane przez EURL ECVAM 6,7. Metoda została pierwotnie opracowana w 2012 roku 8,9 i dodatkowo zoptymalizowanaw 6,7 w odpowiedzi na rosnące zapotrzebowanie na solidne, powtarzalne i skalowalne testy in vitro, które można integrować z bateriami testowymi do badań przesiewowych endokrynnych, zwłaszcza w kontekście metabolizmu hormonów tarczycy. Niedawno opublikowano zastosowanie analogowych konfiguracji SK dla średnio-10 do przesiewania wysokoprzepustowego11, co pokazuje szeroką przydatność podejścia opartego na SK.

Chociaż test DIO1-SK pośrednio mierzy aktywność DIO1 poprzez ilościowe określenie produktów IRA zamiast TH, oferuje kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami. W przeciwieństwie do metod opartych na radioznakowanych substratach12 lub ilościowości wyczerpanych lub uformowanych hormonów tarczycy13 opartej na spektrometrii masowej, reakcja SK zapewnia prosty, skalowalny i opłacalny odczyt poprzez pomiar uwalniania jojku na 415 nm14. Chociaż metody LC-MS/MS z ekstrakcją fazową (SPE-LC-MS/MS) oferują wysoką specyficzność i czułość do ilościowego określania rT3 i T2, wymagają one kosztownego sprzętu i są mniej odpowiednie do przesiewania o wyższej przepustowości. Dla porównania, test DIO1-SK może być stosowany w standardowych warunkach laboratoryjnych i został wstępnie zatwierdzony do stosowania z ludzkimi mikrosomami wątroby, wykazując wysoką powtarzalność i predykcyjność 6,7. W badaniu porównawczym wyniki reakcji SK, a konkretnie uwalniania jodku, zostały bezpośrednio porównane z ilościową ilościową ilością metabolitów hormonów tarczycy (rT3 i T2) za pomocą SPE-LC-MS/MS 15. Wyniki wykazały silną zgodność między tymi dwoma podejściami w zakresie różnych substancji testowych i mocy hamowania. Dla wszystkich badanych substancji zmiany aktywności uwalniania jojku (IRA) mierzone reakcją SK były ściśle odzwierciedlane ze zmianami poziomów rT3 i T2 określanymi spektrometrią mas. To dodatkowo potwierdzało ważność odczytu SK jako zastępstwa dla aktywności DIO1. Te analizy porównawcze potwierdzają, że test SK stanowi solidną i wiarygodną alternatywę dla bardziej złożonych technik analitycznych, a uwalnianie jodeku można z pewnością mierzyć w celu oceny inhibicji DIO1 in vitro.

Jednak metoda SK ma pewne ograniczenia, które należy rozważyć: jest podatna na interferencje substancji zawierających wolny jodek jako zanieczyszczenie, uwalniające jodek nieenzymatycznie lub reagujące z komponentami testowymi, takimi jak ditiotreitol (DTT). DTT jest uwzględniane jako kofaktor redukujący, aby utrzymać katalityczną kompetencję dejodynazy poprzez wspieranie regeneracji selenocysteiny w miejscu aktywnym w stanie zredukowanym podczas wymiany. Ponieważ DTT jest silnym reduktorem, niektóre substancje testowe (lub zanieczyszczenia) mogą ulegać reakcjom redoks, które wpływają na odczyt kolorymetryczny i w niektórych przypadkach prowadzą do artefaktów testowych zależnych od DTT niezwiązanych z enzymatycznym uwalnianiem jodku. Takie interferencje mogą prowadzić do fałszywie ujemnych wyników dla hamowania DIO1, ponieważ zmierzony jodek może nie pochodzić z enzymatycznej konwersji rT3. Tak więc, choć test SK nadaje się do rutynowych badań przesiewowych i większości substancji testowych, LC-MS/MS może być używany do potwierdzenia w razie podejrzenia interferencji testu lub do substancji o złożonych właściwościach chemicznych.

Test DIO1-SK jest obecnie przygotowywany do włączenia jako wytyczne testowe OECD w międzynarodowym projekcie PEPPER (Public-private platform for the validation of endocrine disruptors characterization methods), który podkreśla jego rosnące znaczenie dla zastosowań regulacyjnych oraz międzynarodowej harmonizacji strategii testowania disruptorów endokrynnych. Test może być zintegrowany z kompleksowymi bateriami testowymi in vitro, wspierając zarówno ocenę bezpieczeństwa chemicznego, jak i badania mechanistyczne dotyczące zakłóceń hormonalnych16. W połączeniu z testami dotyczącymi dodatkowych kluczowych zdarzeń na szlaku niepożądanych skutków tarczycy, przyczynia się do pełniejszego zrozumienia mechanizmów zaburzeń hormonów tarczycy.

Ponadto skalowalność protokołu i wysoka powtarzalność sprawiają, że jest on dobrze przystosowany do przesiewania średniego i wysokoprzepustowego. Jest to niezbędne do oceny dużej liczby substancji podczas opracowywania leków oraz w środowisku akademickim, co niedawno wykazało11. Badacze zainteresowani inhibicją DIO1, czy to w badaniach przesiewowych, toksykologii mechanistycznej, czy podejmowaniu decyzji regulacyjnych, skorzystają na solidnym, dostępnym i wszechstronnym badaniu. Walidacja tej metody uczyni ją standardowym narzędziem badań nad zaburzeniami układu hormonalnego tarczycy oraz oceny bezpieczeństwa chemicznego.

Protokół

UWAGA: Przed przeprowadzeniem głównego testu konieczne jest przeprowadzenie serii kroków przygotowawczych, aby zapewnić dokładność, powtarzalność i ważność testu DIO1-SK. Te działania wstępne obejmują odlewanie płytek filtrujących wypełnione żywicą jonowymi, które są kluczowe dla skutecznego rozdzielania i minimalizowania zakłóceń tła w reakcji SK. Reakcja Sandella-Kolthoffa jest regularnie standaryzowana za pomocą standardowych krzywych jodkowych do monitorowania zmian systematycznych i utrzymania jakości testu. Aktywność ludzkich mikrosomów wątroby jest mierzona, aby określić specyficzną dla partii zdolność uwalniania jodku, zapewniając spójną wydajność enzymatyczną we wszystkich eksperymentach. Razem te kroki stanowią solidną podstawę do dalszej głównej pracy nad testami i analizą danych, wspierając generowanie powtarzalnych i interpretowalnych wyników.

1. Prace przedtestowe

  1. Przygotowanie buforów i odczynników
    1. Przygotuj wszystkie bufory i roztwory zapasowe z wyprzedzeniem, zgodnie z Tabelą 1. Przechowuj aliquoty zgodnie z zaleceniami, aby zapewnić stabilność i powtarzalność.
    2. W dniu testu przygotuj świeżą mieszankę podłoża do każdej płytki z 96 dołkami. Dla jednej płyty z 96 dołami połącz 5,75 mL buforu HEPES/EDTA (50 mM HEPES, 2,16 mM EDTA, pH 7,0), 0,5 mL rozmrożonego 1 M DTT oraz 10 μL 6 mM rT3 (rozpuszczonego w DMSO). Wymieszaj delikatnie i trzymaj podłoże na lodzie aż do użycia.
  2. Przygotowanie odniesienia
    1. Przygotuj świeżo w dniu przeprowadzenia testu roztwór zapasowy 10-1 M referencyjnego 6-PTU w odpowiednim rozpuszczalniku (np. DMSO).
    2. Przygotuj rozcieńczenie 1:10 tego zapasu w diH2O (RI-C8), aby uzyskać stężenie DMSO na poziomie 10% i przygotuj serię rozcieńczeń z tego zapasu w 10% DMSO w diH20, jak opisano w Tabeli 2.
  3. Przygotowanie kontroli dodatniej
    1. Przygotuj roztwór zapasowy 10-2 M arotioglukozy z dodatnim kontrolowaniem w odpowiednim rozpuszczalniku (np. DMSO) i przechowuj go do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.
    2. W dniu badania rozcieńcz zapas do 10-3 M w diH20, aby uzyskać stężenie DMSO na poziomie 10% DMSO.
  4. Przygotowanie kontroli negatywnej
    1. Przygotuj 10-2 M zapasowy roztwór soli sodowej o stężeniu ujemnej kontroli 1-Thio-β-D-glukozy w dniu przeprowadzenia testu.
    2. W dniu badania rozcieńcz zapas do 10-3 M w diH20, aby uzyskać stężenie DMSO na poziomie 10% DMSO.
      UWAGA: Zawsze stosuj odpowiednie środki ostrożności, zwłaszcza przy obsłudze niebezpiecznych chemikaliów, takich jak arsenit sodu i kwas siarkowy. Wszystkie odczynniki powinny być przygotowywane z wodą dejonizowaną i przechowywane zgodnie z zaleceniami producenta. Mieszanka podłoża, po przygotowaniu, oraz rozmrożony aliquot DTT są przeznaczone do jednorazowego użytku w dniu badania i nie powinny być ponownie zamrażane.
  5. Odlewanie żywicy jonowowymiennej
    1. Do przygotowania używaj odpowiedniego, prostokątnego przezroczystego pojemnika.
    2. Dodaj około 250 g (lub pożądaną ilość) żywicy jonowej do dużego pojemnika i przepłucz. Płucz przez dodanie 10% kwasu octowego; Pozwól żywicowemu zawieszeniu odpocząć przez 10 minut.
    3. Po 10 minutach ustabilizowania się zawieszenia lekko przechyl i wdech supernatant. Pierz co najmniej 5 razy łącznie lub aż przestanie przeciekać kolor do rozpuszczalnika.
    4. Po ostatnim kroku mycia dodaj 10% kwasu octowego, aby stanowił około 50% całkowitej objętości.
    5. Przechyl pojemnik tak, aby żywica przesuwała się na bok i ustabilizuj pojemnik w pozycji pochylonej. Czekam na ~10 minut, aż fazy się rozdzielą.
    6. Umieść płytę filtracyjną z 96 dołkami na płytę o głębokości 96 dołków i dodaj 100 μL kwasu octowego o 10% do każdej studni płyty filtracyjnej z 96 dołkami.
    7. Rozciąłem końcówki używane do odlewania żywicy na wysokości ~1 cm, aby poszerzyć otwór na końcu, i wlej 300 μL żywicy jonowowymiennej do każdej studni płyty filtracyjnej z 96 dołkami.
      UWAGA: Końcówki używane w naszej pracy mają maksymalną objętość 1 200 μL i mogą być podłączane do pipetek wielokanałowych.
    8. Płucz kwas octowy, wirując w 96-głębokiej płycie studni i 100–200 × g w wirówce z rotorem wysuwanym na mikropłytki miareczkowe przez 1 minutę. Sprawdź, czy żywica jest równomiernie rozłożona na płytce.
    9. Zamknąć płytkę nieprzepuszczalną folią plastikową i przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 6 miesięcy.
      UWAGA: Wiadomo, że składniki żywicy jonizeninowej wpływają na reakcję SK, jeśli nie zostaną prawidłowo wypłukane. Usunięty supernatant można bezpośrednio wykorzystać w reakcji SK (użyć 50 μL próbki supernatantu, dodać 50 μL ceru i na końcu 50 μL roztworu arsenitu) i porównać go z próbką kwasu octowego 10% (kontrola blank), aby zapewnić całkowite wypłukanie składników.
  6. Standaryzacja reakcji Sandella-Kolthoffa
    1. Przygotować rozcieńczenia jodku z odpowiedniego źródła jodku (np. roztwór standardowy jodku) z zalecanymi stężeniami 1 500, 1 000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 i 1 nM, używając odpowiedniego standardu jodku w diH2O.
    2. Dodaj 50 μL czystej diH2O jako środek kontrolny oraz 50 μL przygotowanych rozcieńczeń jodków do płytki 96-dołkowej w potrójnym egzemplarze, jak opisano na układzie na Rysunku 1.
    3. Dodaj 50 μL roztworu cerium 40 mM do wszystkich studni i rozpocznij reakcję, dodając 50 μL roztworu arsenitu 25 mM do wszystkich studni.
    4. Jak najszybciej po dodaniu roztworu arsenitu zmierz absorpcję za pomocą czytnika płyt przy 415 nm (±2 nm), rejestrując gęstość optyczną (OD) co minutę przez 21 minut, a także rejestrując początkowy OD.
    5. Oceń wyniki opisane w sekcji 4.
      UWAGA: Zazwyczaj tło ΔOD21 min > 0,3 w czystej kontroli diH2O wymaga uwagi i dalszego zbadania przyczyn podstawowych (np. zanieczyszczenie w partii A lub Ce, niska jakość wody).
  7. Ocena aktywności mikrosome'ów
    1. Przygotuj najwyższe stężenie (RI-C8) w pozycji referencyjnej (6-PTU), zgodnie z krokiem 1.2.
    2. Przygotuj sześć rozcieńczeń mikrosomów opisanych w Tabeli 3 oraz mieszankę substratu opisaną w Tabeli 1.
    3. Dodaj 10 μL rozcieńczenia rozpuszczalnika 10% (v/v) w diH2O (np. 10% DMSO w diH2O) oraz 10 μL 10-2 M 6-PTU (RI-C8) do płyty z 96 dołkami w potrójnym wyliczeniu, jak opisano na układzie płyt na Rysunku 2.
    4. Dodaj 40 μL rozcieńczeń mikrosomów w diH2O (co daje 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,68 i 0 μg białka mikrosomalnego na dołek) do płytki z 96 dołkami, jak pokazano na układzie płytek.
      UWAGA: Dostawcy zazwyczaj dostarczają stężenie białka mikrosomalnego. Jeśli nie, można zastosować standardowe metody ilościowania białek, choć nie zastosowaliśmy ich w tym badaniu.
    5. Dodaj 50 μL świeżo przygotowanej mieszanki podłoża do każdego dołka i uszczelnij płytę nieprzepuszczalną folią plastikową.
    6. Umieść płytkę z 96 dołkami na shakerze w inkubatorze (37 °C przy 850 obr./min) i inkubuj przez 2 godziny.
    7. Po upływie czasu inkubacji należy umieścić płytkę na lodzie, aby zatrzymać reakcję.
    8. Przeprowadź wymianę jonową analogiczną do kroku 2.2.
    9. Przenieś odpowiednie ilości próbki z głębokiego odwiertu uzyskanego w etapie wymiany jonowej na świeżą płytę 96-dołkową, aby zmierzyć rozcieńczenia nierozcieńczone (50 μL próbki), 1:2 (25 μL próbki + 25 μL 10% kwasu octowego) oraz 1:4 (12,5 μL próbki + 37,5 μL 10% kwasu octowego), Układ tablicy pozostaje niezmieniony.
    10. Oceń wyniki opisane w sekcji 4 i określ czynnik rozcieńczający dla próbek w 10% kwasie octowym oraz stężenie białka w mikrosomalach, które nadal prowadzi do najwyższych możliwych wartości ΔOD21 min -BG w reakcji Sandella-Kolthoffa, nie osiągając jednak plateau nasycenia.
      UWAGA: Zazwyczaj uwalnianie jodeku w wysokości21 minut > 0,5 jest łatwo osiągalne przy rozcieńczeniach 1:4 lub 1:2 kwasu octowego 20 μg białka mikrosomalnego na próbkę dołku i zwykle wynosi około1 δod 21 minut . Wyższe stężenia białek mikrosomalnych nie są zalecane, ponieważ zwiększają tło i niespecyficzne wiązanie podczas badania. Zaleca się powtórzenie pomiaru serii rozcieńczeń 6-PTU z użyciem określonego stężenia mikrosomów i współczynnika rozcieńczania w celu potwierdzenia wyniku.
  8. Ocena rozpuszczalności zadań testowych
    1. Rozpuszczać badany element w stężeniu 100 mM lub 200 mg/mL w odpowiednim rozpuszczalniku (np. DMSO) w temperaturze pokojowej. Wymieszaj lub wymieszaj wir i sprawdź rozpuszczanie wzrokami (mikroskop).
    2. Jeśli nie rozpuszcza, sokonikuj przez maksymalnie 5 minut i sprawdź ponownie. Jeśli nadal nie rozpuszcza, podgrzej temperaturę 37 °C przez maksymalnie 60 minut i sprawdź ponownie.
    3. Jeśli jest nierozpuszczalny, rozcieńcz go dalej lub przygotuj nowy wywar o niższym stężeniu i powtórz procedurę. Jeśli DMSO nie jest odpowiednie, spróbuj wody lub etanolu jako alternatywnych rozpuszczalników.
    4. Po rozpuszczeniu przygotuj rozcieńczenie 1:10 w diH2O(10% rozpuszczalnika) i powtórz ocenę (mieszanie, sonikowanie, podgrzewanie w razie potrzeby).
    5. Aby zasymulować warunki testowe, przygotuj rozcieńczenie 1% w buforze testowym i powtórz test rozpuszczalności.
  9. Przygotowanie i wyznaczanie odległości do testu
    1. Przygotuj roztwór materiału testowego w najwyższym stężeniu rozpuszczalnym w odpowiednim rozpuszczalniku (najlepiej DMSO), zgodnie z oceną rozpuszczalności w kroku 1.8.
    2. Do testu pomiarowego przygotuj osiem rozcieńczeń testowych w kolejnych 1:10 (v/v) rozcieńczeń z użyciem roztworu zapasowego i 10% DMSO w diH20.
    3. Przeprowadzić badanie zakresu, aby oszacować profil hamowania testu, wykonując kroki opisane w sekcji 2. Jeśli zadanie testowe wykazuje hamowanie ≥25% przy dowolnym stężeniu, dostosuj zakres stężenia dla końcowych testów tak, aby uwzględniał co najmniej trzy stężenia w zakresie hamowania liniowego oraz dwa poniżej 10% IRA, jeśli to dotyczy.
    4. Jeśli test wykazuje hamowanie <25% we wszystkich testowanych stężeniach, ponownie użyj tej samej serii rozcieńczeń do końcowych testów. W takim przypadku test pomiarowy może być uznany za jeden z trzech wymaganych niezależnych testów.
      UWAGA: Przeprowadź co najmniej dwa, najlepiej trzy, niezależne eksperymenty dla każdego testu, aby zapewnić powtarzalność i wiarygodność wyników. Jeśli wybierze się inne rozcieńczenie, aby lepiej pokryć zakres aktywności, dopuszczalne jest odchylenie od stosunku rozcieńczeń 1:10. Próg 25% w tej strategii testowej (patrz kroki 1.9.3 i 1.9.4) odróżnia efekty testów od kontrolnych negatywnych, uwzględniając zmienność aktywności bazowej i zapewniając dodatkowy margines bezpieczeństwa. Ten próg zapewnia wiarygodną klasyfikację profili hamujących.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Układ płyt dla prawidłowej krzywej jodekowej. Ten rysunek przedstawia układ płyt 96-dołkowy używany do generowania krzywej standardowej jodkowej. Studnie zawierają seryjne rozcieńczenia jodku w zakresie od 1 nM do 1 500 nM, a także sterowanie tylko diH2O. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Układ płytek do mikrosomalnej titracji białek i testowanie pozycji referencyjnych. Na tym rysunku przedstawiono układ płytek 96-dołkowy do miareczkowania białek mikrosomalnych oraz testów inhibitorów referencyjnych (6-PTU). Rzędy zawierają coraz więcej białka mikrosomalnego na dołek, zarówno z 6-PTU, jak i bez. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wykonanie testu DIO1–SK

  1. Inkubacja mikrosomów z przedmiotem testowym
    1. Przygotuj element referencyjny opisany w kroku 1.2, a także kontrolę pozytywną i negatywną, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4. Przygotuj testy z odpowiednimi stężeniami, zgodnie z protokołem opisanym w krokach 1.8 i 1.9.
    2. Przygotuj mieszankę substratu zgodnie z Tabelą 1 i przygotuj zawiesinę mikrosomów w określonym stężeniu białka zgodnie z krokiem 1.7, rozcieńczając starannie rozmrożony, alicytowany roztwór mikrosomów w diH2O. Utrzymuj zawiesinę mikrosomów na lodzie do czasu inkubacji.
    3. Zgodnie z układem płyt pokazanym na Rysunku 3 i 4 (jeśli oceniane są jednocześnie więcej niż dwa testy), dodaj 10 μL stężeń w odsłonach referencyjnych, kontrolę pozytywną i ujemną, kontrolę rozpuszczalników (10% (v/v) rozpuszczalnika w diH2O) oraz stężenia testowych do odwiertów.
    4. Dodaj 40 μL mikrosomowej zawiesiny do wszystkich studni. Dodaj 50 μL świeżo przygotowanej mieszanki podłoża do próbek.
    5. Zamknąć płytkę nieprzepuszczalną folią plastikową i umieścić ją na shakerze w inkubatorze (37 °C przy 850 obr./min) na 2 godziny; Po inkubacji umieść płytkę na lodzie, aby zatrzymać reakcję.
    6. Po inkubacji umieść talerz na lodzie, aby zatrzymać reakcję.
      UWAGA: Płyta może być przechowywana na lodzie do czasu pomiaru, aby zachować integralność próbki. Pierwsza płytka testowa zawiera osiem stężeń pozycji referencyjnej, podczas gdy każda dodatkowa płytka tego samego dnia zawiera tylko najwyższe stężenie elementu referencyjnego, pozostawiając więcej miejsca na dodatkowe testy w razie potrzeby.
  2. Separacja za pomocą płyt filtracyjnych wypełnionych żywicą jonowymienną z 96 dołkami
    1. Na płytę o głębokości 96 studni połóż przygotowaną płytę filtracyjną wypełnioną żywicą jonowymienną, jak przygotowaną w kroku 1.5, i dodaj 150 μL 10% kwasu octowego do każdej studni wypełnionej żywicą jonowowymienną na 96 dołek, aby zwilżyć żywicę w kolumnach.
    2. Opuszczaj kwas octowy, wirując na stosowanej 96-głębokiej płycie studni z 100–200 × g w wirówce z wirowakiem wysuwanym na płytki mikromiarek przez 1 minutę.
    3. Zastąpić używaną płytę o głębokości 96 otworów nową płytą o głębokości 96 otworów.
    4. Od etapu 2.1.6 do każdego dołku inkubowanej płyty 96-dołkowej należy dodać 133 μL kwasu octowego o stężeniu 10% i krótko potrząsnąć płytką, aby wymieszać roztwory.
    5. Przenieś 175 μL próbek przygotowanych w poprzednim etapie na płytę filtracyjną wypełnioną żywicą jonową z 96 dołkami, zachowując początkowy układ płyt.
    6. Przepuszczaj próbki przez żywicę i do płytki o głębokości 96 otworów przez wirowanie (100–200 × g) w wirówce z rotorem wysuwanym na mikropłytki miareczkowe przez 1 minutę. Usuń płytkę filtra wypełnioną żywicą jonową, wypełnioną 96 dołkami.
      UWAGA: Płyta z 96 głębokościami z próbkami może być uszczelniona nieprzepuszczalną folią plastikową i przechowywana w temperaturze 4 °C przez co najmniej 3 miesiące. Pozwala to na dodatkowe pomiary w przypadku błędów ręcznych/technicznych lub zmian współczynnika rozcieńczenia w reakcji lub pomiarze Sandella-Kolthoffa w kolejnych dniach.
  3. Reakcja Sandell-Kolthoff
    1. W zależności od ustalonego współczynnika rozcieńczenia próbek w 10% kwasie octowym dla użytej partii mikrosomów (patrz krok 1.7), należy dodać 50 μL nierozcieńczonej lub odpowiednio rozcieńczonej próbki do nowej płyty 96-dołkowej.
    2. Dodaj 50 μL roztworu cerowego 40 mM (przygotowanego zgodnie z Tabelą 1) do wszystkich dołków i rozpocznij reakcję, dodając 50 μL roztworu arsenitu 25 mM (przygotowanego zgodnie z Tabelą 1) do wszystkich dołków.
    3. Jak najszybciej po dodaniu roztworu arsenitu zmierz absorpcję za pomocą czytnika płyt przy 415 nm (±2 nm), rejestrując gęstość optyczną (OD) co minutę przez 21 minut, a także rejestrując początkową przedawkowość.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Układ płyty do równoległego testowania dwóch testów. Układ płyty 96-dołkowy do testowania dwóch testów w potrójnych egzemplarzach w różnych stężeniach, wraz z replikami negatywnych, pozytywnych, kontroli rozpuszczalników oraz elementów referencyjnych. Użyty jako pierwsza płytka do testowania tego dnia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Układ płyty do równoległego testowania trzech testów. Układ płytek 96-dołkowych do testowania trzech testów w potrójnych egzemplarzach w różnych stężeniach, z replikacjami testów ujemnych, pozytywnych i rozpuszczalnikowych. Przedmiot referencyjny jest uwzględniany tylko w najwyższym stężeniu, ponieważ jest w pełni testowany na pierwszej tablicy (patrz Rysunek 3). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Testowanie interferencji (± mikrosomów i ± DTT)

  1. Przygotuj najwyższe stężenie (RI C8) przedmiotu referencyjnego (6 PTU), zgodnie z krokiem 1.2, oraz przygotuj roztwór i rozcieńczenia zapasów testowych (z uwzględnieniem najwyższego stężenia testowego).
  2. Przygotuj zawiesinę mikrosomów w określonym stężeniu na dołek (patrz krok 1.7) poprzez starannie rozcieńczenie rozmrożonych, alicytatowanych mikrosomów w diH20. Trzymaj zawiesinę mikrosomów na lodzie do użycia.
  3. Przygotuj dwie mieszanki podłoża: standardową mieszankę z DTT opisaną w Tabeli 1 oraz identyczną mieszankę bez DTT (pomijając tylko DTT).
  4. Podawaj do wyznaczonych dołków płyty 96-dołkowej zgodnie z Rysunkiem 5: 10 μL RI C8, 10 μL 10% (v/v) DMSO w diH2O (kontrola rozpuszczalnika) oraz 10 μL każdego rozcieńczenia testowego.
  5. Dodaj 40 μL zawiesiny mikrosomów do studni oznaczonych jako "z mikrosomami" oraz 40 μL diH2O do studni oznaczonych jako "bez mikrosomów", zgodnie z rysunkiem 5.
  6. Na lodzie dodaj 50 μL mieszanki podłoża z DTT do studni oznaczonych jako "z DTT" oraz 50 μL mieszanki podłoża bez DTT do studni oznaczonych jako "bez DTT" (Rysunek 5).
  7. Zamknąć płytkę nieprzepuszczalną folią plastikową i inkubować na shakerze w inkubatorze (37 °C, 850 obr./min) przez 2 godziny.
  8. Po inkubacji umieść płytkę na lodzie, aby zatrzymać reakcję.
  9. Wykonaj rozdzielenie jonów i ilościowe określenie jodku za pomocą reakcji SK, jak opisano w krokach 2.2 i 2.3, oraz oceniaj wyniki zgodnie z Sekcją 4.
    UWAGA: Ten zestaw z jedną płytą (rysunek 5) testuje najwyższe stężenie przedmiotów testowych równolegle z mikrosomami w porównaniu z bezmikrosomami oraz bez DTT, aby odróżnić aktywność enzymatyczną DIO1 od artefaktów testowych. Wzrost IRA ≥20% w studniach bez mikrosomów wskazuje na interferencję SK (uwalnianie/odczyt jodku niezależny od DIO1), a substancja ta jest klasyfikowana jako "nieprzydatna w teście DIO1 SK" i wykluczona z analizy. Różnice między warunkami DTT a bez DTT pomagają zidentyfikować uwalnianie jodku zależne od DTT jako dodatkowy mechanizm interferencyjne.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Układ płyty do testów interferencji. Ten rysunek przedstawia układ płyt 96-dołkowych do testów interferencyjnych, gdzie testy testowe, element odniesienia i kontrola rozpuszczalnika są testowane zarówno z mikrosomami, jak i bez nich w obecności DTT, jak i bez mikrosomów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Analiza danych

  1. Ocena aktywności DIO1
    1. Określ wartości ΔOD21 minut, odejmując wartości 21 minut wszystkich próbek od początkowo zmierzonych (0 min):
      figure-protocol-6
    2. Określ wartości ΔOD-BG, odejmując średnią wartości ΔOD21 minut z hamowanych 10 3 M 6-PTU (RI) od wartości ΔOD21 minut wszystkich próbek:
      figure-protocol-7
    3. Normalizuj wartości testowanego elementu do odpowiednich wartości kontroli rozpuszczalnika, dzieląc wartości ΔOD21min-BG TI w badanym (TI) średnią wartościΔOD 21min -BG SC odpowiedniego rozpuszczalnika (SC), generując wartości aktywności uwalniającej jodek (IRA) w %.
      figure-protocol-8
    4. Należy narysować wartości IRA różnych stężeń testowych w oprogramowaniu statystycznym, z wartościami IRA na osi y (liniowo), a stężeniami testowych na osi x (logarytmicznie).
    5. Użyj algorytmu dopasowania krzywej, aby zwizualizować zależność koncentracji-odpowiedzi (np. "[Inhibitor] versus odpowiedź – zmienny nachylenie (cztery parametry)" w wybranym oprogramowaniu statystycznym. "Top" oznacza maksymalną odpowiedź, "Bottom" najniższą odpowiedź, a "HillSlope" opisuje stromość krzywej:
      figure-protocol-9
    6. Określ IC50 elementu referencyjnego, a jeśli dotyczy, także testowego.
    7. Oblicz współczynnik wariancji (CV) oszacowania log IC50 dla pozycji referencyjnej w %:
      figure-protocol-10
    8. Oblicz IRA kontroli ujemnej znormalizowanej do kontroli rozpuszczalnika w %:
      figure-protocol-11
    9. Oblicz IRA dodatniej kontroli znormalizowanej do kontroli rozpuszczalnika w %:
      figure-protocol-12
    10. Oblicz czynnik z':
      figure-protocol-13
    11. Aby sprawdzić wiarygodność eksperymentu, porównaj obliczone wartości z kryteriami akceptacji w Tabeli 4.
      UWAGA: Należy spełnić wszystkie kryteria, aby uzyskać ważny test testowy.
    12. Klasyfikuj testy jako pełne inhibitory, częściowe inhibitory lub nieinhibitory na podstawie ich maksymalnej inhibicji i wartości IC50 , jak podsumowano w Tabeli 5.

Wyniki

Rysunek 6 przedstawia przegląd przepływu pracy DIO1-SK oraz kluczowe kroki standaryzacyjne niezbędne do skutecznego wdrożenia metody w laboratorium. Workflow (Rysunek 6A) podsumowuje kolejne fazy testu, w tym użycie ludzkich mikrosomów wątroby, inkubację z testami i kontrolami, ekstrakcję jodku za pomocą separacji wymiany jonowej oraz kolorymetryczną ilościową ilościową metodą reakcji Sandell–Kolthoff (SK). Rysunek 6B podkreśla strategię standaryzacji, która stanowi solidne wyniki i wiarygodne wyniki, w tym (i) standaryzację reakcji SK, (ii) testy aktywności mikrosomów specyficzne dla partii, (iii) ocenę rozpuszczalności i testy interferencyjne, (iv) badanie zakresu oraz (v) dostosowanie stężeń w testach na podstawie pierwszego prawidłowego testu.

Kluczowym elementem tej strategii jest specyficzne dla partii testy aktywności mikrosomowej, ponieważ partie mikrosomów ludzkich wątroby mogą się znacznie różnić w aktywności dejodykacji rT3, co wymaga ustalenia odpowiedniego stężenia enzymu dla każdej nowej partii przed rutynowym testowaniem substancji.

Ta strategia testowania etapowego jest kluczowa dla wdrożenia: dopiero po zweryfikowaniu wyników testu bazowego (kontrola, zachowanie reakcji SK i aktywność mikrosomów) oraz standaryzacji warunków testu można oczekiwać, że testy substancji dadzą prawidłowe, interpretowalne profile hamowania.

figure-results-1
Rysunek 6: Etapy pracy i standaryzacji testu DIO1 SK. (A) Workflow ilustruje zastosowanie ludzkich mikrosomów wątrobowych, ustawienie płytki 96-dołkowej, inkubację z elementami testowymi i kontrolą, ekstrakcję jodkową oraz ilościową ilościową metodę kolorymetryczną za pomocą reakcji SK. Każdy krok jest przedstawiony kolejno, aby podkreślić główne etapy testu. (B) Etapy standaryzacji obejmują standaryzację reakcji Sandell-Kolthoffa, testy aktywności mikrosomów specyficzne dla partii, ocenę rozpuszczalności i testy interferencyjne, badanie zakresu oraz dostosowanie stężeń testowych na podstawie pierwszego prawidłowego testu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Opierając się na ramach pracy i standaryzacji pokazanych na Rysunku 6, Rysunek 7 pokazuje, jak laboratoria określają odpowiednie stężenie białka mikrosomalnego (oraz rozcieńczenie po wymianie jonów), aby osiągnąć wystarczający zakres dynamiczny, jednocześnie utrzymując odpowiedź hamującą sigmoidalną dla referencyjnego inhibitora. Na Rysunku 7A poziom ΔOD21min-BG rośnie wraz ze wzrostem białka mikrosomalnego i zależy od rozcieńczenia po wymianie jonów (nierozcieńczone, 1:2, 1:4). Rozcieńczenie, które daje najwyższy ΔOD21min-BG przy zachowaniu odpowiedzi sigmoidalnej, jest wybierane do kolejnych eksperymentów (przykład: rozcieńczenie 1:2). Na Rysunku 7B porównano krzywe hamowania 6-PTU w różnych ilościach białek mikrosomalnych, aby zidentyfikować najniższe stężenie białka, które nadal daje krzywą sigmoidalną (przykład: 5 μg białka/studnię), co równoważy wrażliwość z tłem.

Co ważne, ten etap optymalizacji musi być przeprowadzony przez każde laboratorium podczas wdrażania metody, ponieważ wymagane stężenie białka zależy od aktywności użytej partii mikrosomów, co wymaga specyficznej dla partii standaryzacji stężenia enzymu.

figure-results-2
Rysunek 7: Aktywność i hamowanie mikrosomów przez 6-PTU. (A) Wykres pokazuje wzrost aktywności jako sygnał Sandell-Kolthoffa skorygowany tłem (BG) (ΔOD21 min n- BG) przy rosnącej ilości białka mikrosomowego na dołek (log10[μg białko/dołek]), testowany przy rozcieńczonych rozcieńczeniach, 1:2 i 1:4. Najwyższe rozcieńczenie o najwyższej wartości ΔOD21 min– BG oraz o kształcie sigmoidalnym zostanie użyte w przyszłych eksperymentach. W tym przypadku jest to rozcieńczenie 1:2. (B) Krzywa stężenia–odpowiedź referencyjnego inhibitora 6-propyl-2-tioracylu (6-PTU) wykazująca aktywność uwalniania jodku (IRA w %) na wykresie w porównaniu z log10[stężenie (M)] przy różnych ładunkach białkowych mikrosomalnych (5, 7,5 i 10 μg białka/dołek). Wartości IRA są znormalizowane do kontroli rozpuszczalnika. Punkty danych obu wykresów reprezentują średnią ± SD trzech technicznych replikatów (dołków) na każdy stan z jednego reprezentatywnego testu aktywności mikrosomów. Krzywe były dopasowywane przez regresję nieliniową z wykorzystaniem czteroparametrowego modelu logistycznego ("zmiennego nachylenia") (inhibitor kontra reakcja). Najmniejsze stężenie białka o krzywej egicznej będzie używane w przyszłych eksperymentach; w tym przypadku 5 μg na studnię. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Po zakończeniu etapów przepływu pracy i standaryzacji (Rysunek 6) oraz ustaleniu odpowiedniego stężenia białka mikrosomalnego dla wybranej partii mikrosomów (Rysunek 7), podstawowe parametry testu są gotowe, aby rozpocząć rutynowe testy substancji. Na tym etapie elementy testowe mogą być oceniane równolegle z zestawem kontroli płyt (element referencyjny, kontrola rozpuszczalnika oraz kontrola dodatnia/ujemna) w formacie płyty standaryzacyjnej, co umożliwia solidną normalizację i spójną interpretację profili hamujących.

Rysunek 8 pokazuje dyskryminację w testach na podstawie zachowań koncentracji i reakcji w aktywności uwalniającej jodek (IRA). Referencyjny inhibitor 6-PTU (rysunek 8A) wykazuje zależny od stężenia spadek IRA, dostarczając oczekiwany profil hamowania sigmoidalnego, zgodnie z oczekiwaniami przy weryfikacji wydajności testu. Kwas taninowy (Rysunek 8B) wykazuje profil hamujący porównywalny do inhibitora referencyjnego (maksymalna inhibicja > 90%) w podanych warunkach. Trzy najwyższe stężenia substancji testowej wykazywały ujemne wartości IRA. Wartości IRA <0% nie odzwierciedlają biologicznie istotnego "ujemnego uwalniania jodku", lecz wynikają z procedury obliczeniowej (odejmowanie tła i normalizacja do kontroli rozpuszczalnika), która może propagować niewielkie wahania w kontroli rozpuszczalnika do ujemnych wartości znormalizowanych. W związku z tym wartości IRA poniżej 0% są traktowane jako równoważne 0% (punkt wyjściowy) do interpretacji wyników. Ftalat dibutylony (Rysunek 8C) nie wykazuje hamowania (maks. hamowanie poniżej 25%) w całym badanych zakresie stężeń, co oznacza profil niehamujący. Razem te profile pokazują, że test może odróżnić zachowania hamujące od niehamujących w warunkach standaryzowanych. System testowy może również zidentyfikować częściowe inhibitory, które wykazują maksymalny poziom hamowania między 25% a 90% (dane nie są pokazane). Dalsze szczegóły dotyczące kategoryzacji tych elementów można znaleźć w Tabeli 5.

figure-results-3
Rysunek 8: Zachowanie dawka-odpowiedź w testie DIO1–SK odróżnia inhibitory od nieinhibitorów. Krzywe dawka–odpowiedź pokazują aktywność uwalniającą jodek (IRA w %) na wykresie względem stężenia log10 (M) dla (A) inhibitora referencyjnego 6-PTU, (B) inhibitora reprezentatywnego (kwas taninowy) oraz (C) reprezentatywnego nieinhibitora (ftalat dibutylu). Wartości IRA zostały obliczone po odejmowaniu tła i znormalizowane do kontroli rozpuszczalnika. Symbole reprezentują średnią ± SD (n = 3) z jednego niezależnego eksperymentu, każdy przeprowadzony z trzema technicznymi replikacjami (studniami) na stężenie. Krzywe były dopasowywane przez regresję nieliniową z wykorzystaniem czteroparametrowego modelu logistycznego ("zmiennego nachylenia") (inhibitor kontra reakcja). Wartości IRA poniżej 0% są uważane za równoważne 0% (poziom wyjściowy) do interpretacji wyników. Dane te pokazują, że test daje sigmoidalny profil hamowania dla referencyjnego inhibitora i może potwierdzić, czy krzywa stężenia-odpowiedź jest hamująca, czy niehamująca w warunkach standaryzowanych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

W prawidłowym testie kontrola rozpuszczalnika (SC) wykazuje wyraźne rozdzielenie sygnału ΔOD21 minut od w pełni zahamowanego warunku odniesienia (6-PTU, RI-C8). W przykładowym zbiorze danych (10 niezależnych przebiegów) każda płyta zawierała n = 9 technicznych replikacji dla SC oraz w pełni zahamowanej referencji (6-PTU na 10−3 M). Na wszystkich płytkach wartości SC ΔOD21 minut od płytki-średnia mieściły się od 1,383 do 1,819 (średnia ± SD: 1,565 ± 0,114), podczas gdy średnia ΔOD21-minutowa dla zahamowanego stanu 6-PTU mieściła się od 0,258 do 0,771 (średnia ± SD: 0,473 ± 0,087). Obliczenie ΔOD w tym teście opiera się na różnicy między OD0min a OD21 min, a ważność testu jest zwykle wspierana przez próg czynnika z′ >0,5.

W 10 niezależnych testach 6-PTU wygenerowało sigmoidalną krzywą stężenia-odpowiedzi z wartościami IC50 w zakresie od 1,20E-06 M do 5,02E-06 M (średnia ± SD: 2,74E-06 M ± 1,13E-06 M). Kryteria akceptacji wartości IC50 w zakresie referencyjnym od 1,00E-06 do 1,00E-05 opierają się na danych z wcześniejszych badań walidacyjnych. Jednak wartości IC50 są istotnie zależne od konkretnej partii mikrosomów i mogą wykazywać znaczną zmienność. Niemniej jednak oczekuje się, że te różnice pozostaną w tym samym rzędzie wielkości.

Jakość testu można podsumować za pomocą czynnika z′, który odzwierciedla zarówno okno sygnałowe, jak i zmienność parametrów. W opisanym zbiorze danych sześć krzywych odniesienia było powiązanych z czynnikami z′ w zakresie od 0,544 do 0,774 (średnia ± SD: 0,658 ± 0,062), co jest zgodne z powszechnie stosowanym celem akceptacji z′ > 0,5.

W praktyce nieoptymalne przebiegi można zidentyfikować na podstawie odchyleń w tle testu i/lub niespełnienia wcześniej określonych kryteriów akceptacji. Na przykład wysokie tło w reakcji Sandella-Kolthoffa wskazuje się, gdy czysta pusta diH₂O wykazuje ΔOD > 0,3, co wymaga zbadania (np. zanieczyszczenie reagentami lub problemy z jakością wody). Takie podwyższenia tła mogą zmniejszyć zakres dynamiczny testu i podnieść zmienność kontroli, co przyczynia się do niespełnionych kryteriów akceptacji, w tym czynnika z′ poniżej 0,5. Studnie wykazujące oczywiste artefakty techniczne (np. opady lub nieprawidłowe przebarwienia) są wykluczane z oceny. Wyłączone są również wartości odstające, wyznaczone za pomocą testów odstających na wykresie pudełkowym. Jeśli kryteria akceptacji nie zostaną spełnione po usunięciu wartości odstającej, test jest uznawany za nieważny i musi być powtórzony.

Odczynnik/BuforInformacje o przygotowaniu
Roztwór kwaśnego cerium amonowego (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0,5 M H2SO4) (250 mL)Dodaj 6,32 g (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O oraz 125 mL diH2O do kolby objętościowej o pojemności 250 mL. Dodaj 125 mL 1 M H2SO4, aby uzyskać końcową objętość 250 mL. Przechowuj w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
DTT (Aliquots of 1 M)Aliquot przygotowany lub podany 1 M roztworu DTT w H2O jako 0,5 mL aliquotów w rurkach mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i przechowywany w -20°C do 6 miesięcy.
HEPES (50 mM) / EDTA (2,16 mM) bufor (pH 7,0)Używając kolby objętościowej o pojemności 250 mL, dodaj 12,5 mL 1 M roztworu HEPES, 201 mg etylendiaminetetraoctowego kwasu octowego (EDTA) i napełnij do 250 mL diH2O. Przechowuj w temperaturze 4°C do 3 miesięcy.
Roztwór rT3 ("probówki mieszanki podłoża")Rozpuszczaj rT3 w DMSO do końcowego stężenia 6 mM, aliquotuj je w porcjach po 10 μL w probówkach wirówek 15 mL i przechowywaj w temperaturze -20°C do 6 miesięcy.
Roztwór arsenitu sodu (25 mM NaAsO2, 0,8 M NaCl, 0,5 M H2SO4) (250 ml)Do kolby objętościowej o pojemności 250 mL należy dodać 0,81 g NaAsO2, 11,7 g NaCl i 125 mL diH2O. Dodaj 125 mL 1 M H2SO4, aby uzyskać końcową objętość 250 mL. Przechowuj w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.

Tabela 1: Przygotowanie buforów i odczynników. Ta tabela przedstawia etapy przygotowania i instrukcje przechowywania wszystkich buforów i roztworów zapasowych używanych w badaniu DIO1 SK, w tym buforu HEPES/EDTA, roztworu DTT, rT3, roztworu kwaśnego amonu cerium oraz roztworu arsenitu sodu.

Nazwa rozcieńczenia elementu referencyjnegoStężenie rozcieńczenia przedmiotu referencyjnego [M]10% DMSO [μL]Pozycja referencyjnaKońcowe stężenie elementu referencyjnego w testie [M]
RI-C81.00E-0245050 μL roztworu referencyjnego towaru 10-1 M1.00E-03
RI-C71.00E-0345050 μL RI-C81.00E-04
RI-C61.00E-0445050 μL RI-C71.00E-05
RI-C53.16E-05342158 μL RI-C63.16E-06
RI-C41.00E-0545050 μL RI-C61.00E-06
RI-C33.16E-0645050 μL RI-C53.16E-07
RI-C21.00E-0645050 μL RI-C41.00E-07
RI-C11.00E-0745050 μL RI-C21.00E-08

Tabela 2: Przygotowanie rozcieńczeń elementów referencyjnych. Ta tabela podsumowuje przygotowanie seryjnych rozcieńczeń dla pozycji referencyjnej (6-PTU), w tym stężenia, objętości DMSO oraz końcowe stężenia użyte w teście.

Mikrosome na dołek [μg]diH2O [μL]Rozcieńczenie mikrosomów [μL]Końcowe stężenie enzymu w teście [μg/mL]
2078020 μL roztworu zapasowego mikrosomu 20 mg/mL200
10400400 μL mikrosomu 20 μg na rozcieńczenie dołka100
5400400 μL mikrosomu 10 μg na rozcieńczenie dołka50
2.5400400 μL mikrosomu 5 μg na rozcieńczenie dołka25
1.25400400 μL mikrosomu 2,5 μg na rozcieńczenie dołka12.5
0.68400400 μL mikrosomu 1,25 μg na rozcieńczenie dołka6.8

Tabela 3: Przygotowanie rozcieńczeń mikrosomów. Ta tabela przedstawia schemat rozcieńczania białka mikrosomalnego na dołek, w tym wymagane objętości roztworu diH₂O i mikrosomowego zapasu, aby uzyskać końcowe stężenia białek mikrosomalnych do testu.

Kryteria akceptacjiSugerowana wartość progowa
Numeryczne
IC50 pozycji referencyjnej [M]1*10-05 - 1*10-06
CV log IC50 szacunkowa pozycja referencyjna [%]< 3
Negatywna kontrola IRA [%]80 - 120
Dodatnia kontrola IRA [%]< 20
Czynnik z'-> 0.5
Binarność
Kształt elementu referencyjnego (sigmoidalny?)Tak
Końcowa krzywa stężenia-odpowiedź elementu referencyjnego składa się z minimum sześciu stężeń z trzech replikatówTak
Końcowa krzywa stężenia-odpowiedź testowanego produktu składa się z minimum sześciu stężeń z trzech replikatówTak

Tabela 4: Kryteria akceptacji do testu DIO1 SK. Ta tabela przedstawia kryteria akceptacji dla ważności testu, takie jak zakres IC₅₀, współczynnik zmienności, wartości IRA dla kontroli, czynnik z'-oraz wymagania dla krzywych stężenia-odpowiedzi. Okna akceptacji zostały wyprowadzone z wcześniej zgłoszonych badań walidacyjnych DIO1-SK6, w tym oceny powtarzalności opartej na pięciu niezależnych testach, które wpłynęły na referencyjne okno IC₅₀. W przykładowym zbiorze danych składającym się z 10 niezależnych przebiegów, wydajność czynnika z′ wahała się od 0,544 do 0,774 (średnia ± SD: 0,658 ± 0,062), co wspiera próg akceptacji z′ użyty tutaj.

Kategoria (według skuteczności)Podkategoria (według mocy)Aktywność hamującaPróg
Kategoria 1: pełny inhibitorO: Silny pełny inhibitorCałkowicie hamuje aktywność DIO1 w stężeniu porównywalnym z elementem referencyjnym 6-PTUMaksymalna hamowanie większe 90% oraz IC50 na lub poniżej górnego zakresu IC50 6-PTU
B: Słaby pełny inhibitorCałkowicie hamuje aktywność DIO1 w wyższych stężeniach niż referencyjny element 6-PTUMaksymalna hamowanie większe o 90% oraz IC50 powyżej górnego zakresu IC50 6-PTU
Kategoria 2: częściowy inhibitor-Brak pełnej inhibicji, ale większa niż ujemna i kontrola rozpuszczalnikaMaksymalna hamowanie między 25% a 90%
Kategoria 3: nie inhibitor-Nie hamuje DIO1 (tak samo jak ujemna i rozpuszczalnikowa kontrola)Maksymalne hamowanie poniżej 25%

Tabela 5: Klasyfikacja zadań testowych na podstawie mocy i skuteczności hamowania DIO1. Zadania testowe dzieli się na trzy grupy skuteczności (pełne, częściowe lub nieinhibitorowe) na podstawie maksymalnej inhibicji aktywności DIO1. Pełne inhibitory są dodatkowo podkategorizowane według potencji, w zależności od ich IC₅₀ względem referencyjnego elementu 6-PTU.

Dyskusja

Test DIO1-SK stanowi nieradioaktywną, opłacalną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnych metod oceny aktywności DIO1, takich jak testy znakowane radioaktywnie czy spektrometria mas. Jego wstępna weryfikacja dla ludzkich mikrosomów wątroby oraz silna zgodność z pomiarami SPE-LC-MS/MS poziomu hormonów tarczycy potwierdzają jego wiarygodność i znaczenie regulacyjne, co odzwierciedla włączenie do planu pracy OECD dotyczącego wytycznych testowych. Prostota reakcji Sandella-Kolthoffa (SK) sprawia, że test jest dostępny dla laboratoriów bez zaawansowanego wyposażenia.

W niniejszym protokole określono kilka praktycznych aspektów bardziej szczegółowo niż wcześniej opublikowane procedury DIO1-SK, aby dodatkowo wspierać odporność i powtarzalność w rutynowym formacie 96-dołkow. Te wyjaśnienia koncentrują się na uzasadnieniu koncepcji kontroli (rozpuszczalnik, kontrola ujemna i dodatnia), decyzji o użyciu świeżo przygotowanych płyt żywicy jonowowymiennej zamiast ponownego użycia wcześniej odlanych płyt oraz warunkach reakcji SK, które poprawiają wytrzymałość obsługi podczas pomiarów wielodołowych płytek, przy jednoczesnym zachowaniu biologicznej interpretacji zgodnej z wcześniejszymi pracami standaryzacyjnymi 6,7.

Pomimo swoich mocnych stron, należy podjąć kilka kluczowych kroków, aby dokładnie określić ilość jodku uwalnianego podczas konwersji rT3 do T2 za pośrednictwem DIO1. Osiąga się to dzięki reakcji Sandella-Kolthoffa, która wymaga precyzyjnego wyczucia czasu i konsekwentnego manipulowania z odczynnikami, aby zapewnić powtarzalność. Reakcja SK to szybki proces kataliczny, w którym jodek przyspiesza redukcję żółtego ceru (IV) do bezbarwnego cerium (III) przez arsenit; Szybkość zmiany koloru jest bezpośrednio proporcjonalna do stężenia jodku. Ponieważ reakcja przebiega szybko po dodaniu roztworu arsenu, niezbędne jest, aby pomiar został rozpoczęty bez zwłoki. W formacie płyty 96-dołowej powolne lub nieregularne dodawanie roztworu arsenu może wprowadzać znaczną zmienność między odwiertami. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie pipety wielokanałowej lub automatycznego dozownika, aby zapewnić równomierne i szybkie dodawanie odczynników we wszystkich dołkach.

Aby zmaksymalizować porównywalność między dołkami i między płytkami, kolejność dodawania odczynników w reakcji SK powinna być zgodna z opisanym procesem: cer jest obecny jako podłoże chromogeniczne, a reakcja jest inicjowana przez dodatek arsenitu, który definiuje czas rozpoczęcia i dlatego wymaga szybkiego, zsynchronizowanego dozowania. Kolejność dodawania alternatywnych odczynników nie była oceniana w tym układzie; dlatego zmiana kolejności nie jest zalecana podczas odtwarzania protokołu. Ponadto stężenie cerium może wpływać na praktyczne parametry odczytu SK (np. okno sygnału i odporność). Podczas gdy 25 mM ceru zostało zdefiniowane jako zwalidowany warunek standardowy podczas wcześniejszej standaryzacji testów, wyższe stężenia, takie jak 40 mM, wykazano, że wydłużają okno sygnału i czynnik z′ bez wpływu na wartości IC50 czy interpretację biologiczną, jak opisano już w poprzednich badaniach6. W tym protokole stosuje się cerium 40 mM, aby zapewnić pełną i szybką kompleksację jodku w warunkach testu oraz poprawić odporność i stabilność sygnału podczas rutynowych pomiarów płytowych. Kryteria akceptacji (np. czynnik z′, wartości IC50 referencyjnego inhibitora) opierają się na historycznych wynikach obserwowanych w wcześniejszych badaniach walidacyjnych i mają służyć jako rutynowa kontrola wydajności testu.

Zastosowanie ludzkich mikrosomów wątroby wprowadza zmienność biologiczną, co sprawia, że standaryzacja aktywności uwalniania jodku specyficznego dla mikrosomów jest niezbędna. Staranne przygotowanie płyt filtracyjnych wypełnionych żywicą jonowowymienną jest konieczne, aby uniknąć nierównomiernego rozłożenia żywicy na całej płycie filtracyjnej oraz zapewnić całkowite oddzielenie jodku od potencjalnie interferujących substancji. W odniesieniu do przepływu pracy z żywicą, wybrano świeżo odlewane płyty filtracyjne wypełnione żywicą jonową, aby zminimalizować potencjalne ryzyko dodatkowej zmienności wynikającej z nasycenia żywicą, przenoszenia jodku lub białka oraz potencjalnej utraty efektywności wiązania przy ponownym użyciu. Ponowne wykorzystanie żywicy i płyt filtrujących jest technicznie wykonalne, jednak może wiązać się z pewnymi ryzykami, które nie zostały systematycznie ocenione w tym badaniu. Może to powodować dryf między partiami, jeśli zdolność wiązania żywicy zostanie zmniejszona lub jeśli pozostałości składników matrycy pozostają w warstwie żywicy po wcześniejszych przebiegach. Dla laboratoriów rozważających recykling pragmatyczną rekomendacją jest weryfikacja wydajności żywicy po ponownym użyciu (np. poprzez monitorowanie zachowania tła i standardowych krzywych oraz zapewnienie spójnego wychwytywania jodku) oraz zaprzestanie ponownego użycia, jeśli zaobserwowane jest zwiększone tło, zmniejszony zakres dynamiczny lub nieregularne rozdzielenie. Zaleca się stosowanie płyt filtracyjnych wypełnionych żywicą do jednorazowego użytku, ponieważ protokół ten został opracowany specjalnie na podstawie tej metodologii.

Dodatkowo, rozpuszczalność każdego testowanego elementu musi być określona w odpowiednim nośniku, ponieważ maksymalne stężenie testowane jest ograniczone rozpuszczalnością (zazwyczaj do 1 mM przy 1% DMSO). Ponieważ wszystkie związki testowe są stosowane w DMSO jako rozpuszczalnik, kontrola rozpuszczalnika definiuje bazową aktywność DIO1 w warunkach istotnych dla testu i stanowi najbardziej odpowiednie warunki odniesienia do normalizacji i porównania. Natomiast sól sodowa 1-tio-β-D-glukozy została uwzględniona jako kontrolę ujemną, ponieważ jest strukturalnie podobna do dodatniej kontroli aurogioglukozy (ATG), ale chemicznie obojętna względem dejodynacji jodotyroniny i nie zakłóca mikrosomalnych systemów redoksowych ani aktywności katalitycznej DIO1. Jego obecność pomaga odróżnić prawdziwie specyficzne dla DIO1 efekty od niespecyficznych związanych z dodawaniem, przetwarzaniem lub interakcjami macierzy testowych. Kontrola bez leczenia/bez pojazdu nie była podstawowym warunkiem odniesienia, ponieważ nie odzwierciedlała rzeczywistego środowiska testowego, w którym DMSO występuje we wszystkich studniach objętych związkiem chemicznym; dlatego kontrola rozpuszczalnika jest odpowiednim punktem odniesienia do interpretacji testu.

Rozwiązywanie problemów koncentruje się na identyfikacji zakłóceń w reakcji SK. Substancje zawierające jod, chelatujące lub silnie utleniające mogą sztucznie wpływać na odczyt kolorymetryczny 14,17,18. Aby temu zaradzić, protokół obejmuje testy interferencyjne bez mikrosomów. Ponadto stosowanie ditiotreitolu (DTT) jako kofaktora może również prowadzić do uwalniania jodku nieenzymatycznego z niektórych substancji testowych. W takich przypadkach zaleca się metody ortogonalne, takie jak SPE-LC-MS/MS, aby potwierdzić hamowanie DIO1. Niespecyficzne interferencje poprzez ogólne efekty denaturacji (np. surfaktanty) mogą generować fałszywie pozytywne wyniki, dlatego ogólna strategia identyfikacji częstych atakujących czynniki, wykorzystując narzędzia in silico lub zintegrowane podejścia testowe, może być cenna.

Test ma kilka ograniczeń. Jest podatny na interferencję ze strony substancji testowych, które reagują z komponentami testu lub uwalniają jodek niezależnie od aktywności DIO1. Test nie rozróżnia specyficznej inhibicji DIO1 od niespecyficznej interferencji z funkcją enzymu lub integralnością strukturalną. Aby poprawić swoistość, równolegle można analizować hamowanie dodatkowych enzymów mikrosomalnych, a porównanie sił hamujących w różnych testach enzymatycznych może dostarczyć dodatkowych dowodów.

Kolejną strategią identyfikacji możliwych artefaktów jest włączenie testów integralności lub żywotności, jak często wykonywane w testach in vitro na komórkach, aby określić maksymalne stężenie testowe. Chociaż bezpośredni test integralności nie istnieje dla testu DIO1-SK, jego zastosowanie w baterii testów in vitro umożliwia integrację danych o cytotoksyczności z innych testów komórkowych w celu doboru stężenia. Jeśli takie informacje z testu krzyżowego nie są dostępne, górne stężenie w teście DIO1-SK jest ograniczone rozpuszczalnością, która może nie odzwierciedlać istotnych ekspozycji in vivo. Jednak podejścia toksykokinetyczne mogą być stosowane do lepszego określenia i interpretacji stężeń in vitro testowych.

Test DIO1-SK jest szczególnie cenny w badaniach toksykologicznych oraz mechanistycznych badaniach zaburzeń hormonalnych. Dotyczy kluczowego zdarzenia w homeostazie hormonów tarczycy i może być zintegrowany z bateriami testów in vitro. Jego odporność, powtarzalność i zdolność adaptacji do różnych warunków laboratoryjnych i potrzeb przepustowych czynią go cennym narzędziem do oceny bezpieczeństwa chemicznego i walidacji regulacyjnej. Test ten dostarcza solidnego pomiaru in vitro hamowania DIO1 w warunkach standaryzowanych i wspiera klasyfikację substancji testowych względem dobrze scharakteryzowanego inhibitora referencyjnego (6-PTU). Jednak dane in vivo dotyczące hamowania DIO1 są skąpe, dlatego bezpośrednia korelacja między wynikami hamowania DIO1 in vitro a efektami in vivo nie jest obecnie stosowalna do szacowania predykcyjności in vivo. W związku z tym wyniki testów należy interpretować jako mechanistyczne dowody zakłóceń z jednym kluczowym zdarzeniem w metabolizmie hormonów tarczycy i integrować z dodatkowymi liniami dowodowymi (np. innymi testami MoA tarczycy oraz pomiarami ortogonalnymi tam, gdzie jest to potrzebne). Co istotne, test DIO1–SK był oceniany w wielu badaniach zorientowanych na walidację (optymalizacja/standaryzacja, ocena predykcyjności oraz analiza odporności/dokładności)6,7,15, a wraz z postępem metody w kierunku wdrożenia OECD, niniejszy artykuł dostarcza poziom szczegółów proceduralnych, krok po kroku, mających na celu ułatwienie transferu i spójnego wdrażania w kolejnych laboratoriach.

Oświadczenia

Autorzy K.S., N.H, D.F.-W. oraz R.L. są pracownikami BASF SE, firmy chemicznej, która w przyszłości może wykorzystać test DIO1 do opracowywania i rejestracji produktów komercyjnych.

Podziękowania

Autorzy chcą podziękować dr. Andreasowi Weberowi za jego pracę podczas początkowego opracowania testu DIO1-SK.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-Tio-β-D-glukoza sól sodowaSigma-AldrichT6375-1GCAS 10593-29-0
3,3',5'-trijodotyronina (rT3)  Santa Cruz BiotechnologySC-209692CAS 5817-39-0
6-propyl-2-tiouracyl (6PTU)SupelcoP3755-10GCAS 51-52-5
Kwas octowyThermo Fisher9526-33CAS 64-19-7
Bilans analitycznyNANAzdolny do dokładnej wagi do 30 g przy czytelności 0,1 mg
Tlenek sodu arsenu (NaAsO2)Thermo Fisher041533.APCAS 7784-46-5
Płytki do testowania (format 96 dołków)MerckZ707902-108EAnp. płytki do hodowli tkankowych, płytki 96-dołkowe, płaskie dno, polistyren, 0,34 cm2, sterylne, 108/cs, TPP
Aurotioglukoza (ATG)Sigma-AldrichA0606-5MGCAS 12192-57-3
Rurki wirówkowe 15 i 50  mLMerckZ707724-800EA, Z707716-320EAnp. rurki wirówek TPP, objętość 15 i 50 mL, polipropylen i nbsp;
Wirówka z wirnikem wychylanym na płytki mikromiareczkoweNANAPowinna być wystarczająco wysoko, by zmieścić płytę o głębokości 96 studni i 96-dołkową płytkę filtra na górze (co najmniej około 6 cm wysokości)
Siarczan amonu cerium (IV) (Ce(NH4)4(SO4)4)Sigma-Aldrich22269-100G-FCAS 10378-47-9
Inkubator CO2NANAzdolny do utrzymania temperatury 37 stopni i g; C, 5% CO2 i ≥ 90% wilgotności
Płytki głębokich odwiertów (format 96 otworów)Supelco575653-Unp. płytka zbiorcza studni SPE 96 – głęboka kwadratowa studnia, objętość studni 2 mL, polipropylen
Dimetylsulfotlenek (DMSO)AppliChemA3672,0250CAS 67-68-5
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779-1GCAS 3483-12-3
Kwas etylendiaminetetraoctowy (EDTA) i nbsp;Sigma-AldrichAPO456787707-500GCAS 6381-92-6
Płytki filtracyjne (format 96-dołkowy)MerckWHA77002810np. mikropłytki, 96-dołki, przezroczysty polistyren, 800 & mikro; L, Wiązanie DNA, Whatman
Uszczelniacze płytowe szczelneThermo Fisher232698np. taśma uszczelniająca, poliester, sterylna, taśma uszczelniająca, poliester, sterylna, Nunc
HEPESPan BiotechP05-01100CAS 7365-45-9
Ludzkie mikrosomy wątrobyBiovitX008070np. INVITROCYP 150-dawcy zebrane ludzkie mikrosomy wątroby
Jodek (standard układów scalonych)Supelco41271-100MLnp. standard jodku dla IC, 1000 mg/L w wodzie, Sigma-Aldrich
Żywica jonowa podobna do Dowex 50WX2Roth334.4CAS 12612-37-2; Siatka 100-200
Rurki mikrowirówkowe 1,5  mLMerckEP0030120086-1PAKnp. Eppendorf® Safe-Lock mikrowirówki, objętość 1,5 mL, naturalne
Dozownik wielokanałowy zdolny do dostarczania od 50 do 300 nbsp; &mikro; L na krokNANANA
Pipeta wielokanałowa zdolna dostarczyć od 10 do 100 nbsp; &mikro; L na krokNANANA
pH z elektrodami i buforami kalibracyjnymiNANAzdolny do odczytu +/- 0,1 jednostek pH
Fotometr do pomiaru absorpcjiTecan Trading AGNAnp. Sunrise Absorbance Reader, INSTSUN-3
Pipety zdolne do dostarczania od 1 do 10 nbsp; &mikro; LNANANA
Pipety zdolne do dostarczania od 10 do 100 nbsp; &mikro; LNANANA
Pipety zdolne do dostarczania od 100 do 1000 nbsp; &mikro; L NANANA
Pipety dla większych objętościNANApipety serologiczne, np. 10, 25, 50 mL
Potrząsacz płytThermo FisherNAnp. mikropłytka mikromiareczkowa Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER, sterowana bezpośrednio
Pipeta powtarzającaNANANA
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS9888-25GCAS: 7647-14-5, np. chlorek sodu, odczynnik ACS itd; 99.0 %
Oprogramowanie statystyczneNANAZdolny do wykonywania analizy regresji odzwierciedlającej charakterystyki testu oraz obliczania stężeń hamujących, np. GraphPad Prims 8, GraphPad
Kwas siarkowy (H2SO4) Supelco1007311000CAS 7664-93-9
Kolba objętościowaNANAcertyfikowane z określoną objętością

Bibliografia

  1. Kabir, E. R., Rahman, M. S., Rahman, I. A review on endocrine disruptors and their possible impacts on human health. Environ Toxicol Pharmacol. 40 (1), 241-258 (2015).
  2. Yue, B., et al. Human exposure to a mixture of endocrine disruptors and serum levels of thyroid hormones: a cross-sectional study. J Environ Sci. 125, 641-649 (2023).
  3. Köhrle, J. The deiodinase family: selenoenzymes regulating thyroid hormone availability and action. Cell Mol Life Sci. 57 (13), 1853-1863 (2000).
  4. Zhang, J., Lazar, M. A. The mechanism of action of thyroid hormones. Annu Rev Physiol. 62 (1), 439-466 (2000).
  5. França, M. M., et al. Human type 1 iodothyronine deiodinase (DIO1) mutations cause abnormal thyroid hormone metabolism. Thyroid. 31 (2), 202-207 (2020).
  6. Weber, A. G., et al. Assessment of the predictivity of the DIO1-SK assay to investigate DIO1 inhibition in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 9 (2), 44-59 (2023).
  7. Weber, A. G., et al. A new approach method to study thyroid hormone disruption: optimization and standardization of an assay to assess the inhibition of DIO1 enzyme in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 8 (3), 67-82 (2022).
  8. Renko, K., Hoefig, C. S., Hiller, F., Schomburg, L., Köhrle, J. Identification of iopanoic acid as substrate of type 1 deiodinase by a novel nonradioactive iodide-release assay. Endocrinology. 153 (5), 2506-2513 (2012).
  9. Renko, K., et al. An improved nonradioactive screening method identifies genistein and xanthohumol as potent inhibitors of iodothyronine deiodinases. Thyroid. 25 (8), 962-968 (2015).
  10. Olker, J. H., et al. Screening the ToxCast phase 1, phase 2, and e1k chemical libraries for inhibitors of iodothyronine deiodinases. Toxicol Sci. 168 (2), 430-442 (2019).
  11. Sane, R., et al. Identification and characterization of highly potent and isoenzyme-selective inhibitors of deiodinase type I via a nonradioactive high-throughput screening method. Thyroid. 35 (5), 576-589 (2025).
  12. Visser, T. J., Van Overmeeren, E. Binding of radioiodinated propylthiouracil to rat liver microsomal fractions: stimulation by substrates for iodothyronine 5′-deiodinase. Biochem J. 183 (1), 167-169 (1979).
  13. Hindrichs, C., et al. A novel and fast online SPE-LC-MS/MS method to quantify thyroid hormone metabolites in rat plasma. Chem Res Toxicol. 37 (1), 33-41 (2024).
  14. Kolthoff, I. M., Sandell, E. B., Lingane, J. J. A modified persulfate-arsenite method for manganese. Anal Chem. 8 (1), 73-73 (1936).
  15. Stefanidis, K., et al. Assessment of the robustness and accuracy of the deiodinase 1 Sandell–Kolthoff assay: a comparative analysis. Appl Vitro Toxicol. 10 (4), 80-90 (2024).
  16. Satya, S., et al. Guidance document on standardised test guidelines for evaluating chemicals for endocrine disruption. OECD Environ Health Saf Publ. 150, (2012).
  17. Joseph, O., Eberle, M., Lieberman, M. Metabolites in urine that interfere with the Sandell–Kolthoff assay for urinary iodine. Biol Trace Elem Res. 202 (2), 466-472 (2024).
  18. May, W., Wu, D., Eastman, C., Bourdoux, P., Maberly, G. Evaluation of automated urinary iodine methods: problems of interfering substances identified. Clin Chem. 36 (6), 865-869 (1990).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza kolorymetrycznauwalnianie jodkuhomeostaza hormon w tarczycytoksykologia mechanistycznaprzesiewowe badanie inhibicji enzym wczytnik p ytekywica jonowymienna
Kolorymetryczna ocena aktywności dejodynazy 1 w ludzkich mikrosomach wątroby za pomocą reakcji Sandella-Kolthoffa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.