Artykuł metodologiczny

Izolacja i identyfikacja pierwotnych komórek maziowych podobnych do fibroblastów u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

DOI:

10.3791/70116

⸱

24 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę izolowania i identyfikacji synowiocytów o wysokiej czystości pierwotnych fibroblastopodobnych (FLS) z tkanki maziowej pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów w celu wiarygodnego modelowania chorób i badań przesiewowych leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) to przewlekła autoimmunologiczna choroba zapalna, charakteryzująca się hiperplazją maziową oraz postępującym niszczeniem stawów jako główną cechą patologiczną. Synowiocyty przypominające fibroblasty (FLS) są uznawane za kluczowe składniki komórkowe patogenezy RZS, charakteryzujące się agresywnym, guzowatym zachowaniem, które pośredniczy w niszczeniu chrząstki i kości. Izolacja i oczyszczanie reumatoidalnego zapalenia stawów Fibropodobne synowiocyty (RA-FLS) są kluczowym narzędziem do badania mechanizmów choroby i oceny potencjalnych leków terapeutycznych. Przedstawiamy tutaj kompleksowy protokół izolacji, kultywacji i funkcjonalnej walidacji pierwotnego ludzkiego RA-FLS z usuniętych próbek tkanek maziowych pobranych podczas operacji wymiany stawu kolanowego u pacjentów z RZS. Metoda ta wykorzystuje świeżą tkankę maziową i stosuje sekwencyjny proces trawienia enzymatycznego z trypsyną i kolagenazą typu II, aby zmaksymalizować izolację RA-FLS z matrycy tkankowej. Na koniec identyfikacja komórek odbywa się za pomocą immunofluorescencji i cytometrii przepływowej Vimentin, uzupełnionej o funkcjonalną ocenę proliferacji indukowanej przez TNF-α. Protokół ten umożliwia pozyskiwanie hodowli RA-FLS o wysokiej czystości o określonych cechach fenotypowych i reakcji zapalnej, dostarczając naukowcom wiarygodną metodę uzyskiwania krótkoterminowych, hodowlowanych, pochodzących od pacjentów RA-FLS odpowiednich do badań lekowych, badań mechanistycznych i zastosowań inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) to przewlekła autoimmunologiczna choroba zapalna charakteryzująca się symetrycznym poliartretwem stawów obwodowych, z szacowaną globalną częstością występowania na poziomie 0,5%-1% oraz potencjałem wywoływania różnych powikłań układowych i pozastawowych 1,2,3,4,5. Podstawową cechą patologiczną RZS jest przewlekłe zapalenie błony przymazowej wywołane odpowiedziami autoimmunologicznymi, które dodatkowo prowadzi do powstawania inwazyjnej tkanki pannusa erozyjnej chrząstki stawowej i kości podchrząstki. Spośród nich zapalenie błony przytomnej stanowi najwcześniejszą i najważniejszą cechę patologiczną RZS. Synowiocyty podobne do fibroblastów (FLS), będące dominującymi komórkami osiadłymi w błonie maziowej, odgrywają kluczową rolę w koordynacji zarówno zapalenia błony maziowej, jak i niszczenia kości 8,9. Podczas odpowiedzi zapalnej maziowej w RZS, reumatoidalne zapalenie stawów Fibroblastowopodobne synowiocyty (RA-FLS) tracą swój normalny "regulatorny" fenotyp i zamiast tego wykazują profil "prozapalny"10. Ta zmiana prowadzi do masowej produkcji cytokin zapalnych, które mogą aktywować powiązane szlaki metaboliczne energii, prowadząc do zwiększonej proliferacji komórek i dalszego wzmacniania kaskady zapalnej mazii 11,12,13. Jednocześnie RA-FLS oddziałują z innymi komórkami odpornościowymi (takimi jak makrofagi, limfocyty T i limfocyty B), utrzymując utrzymujący się przewlekły stan zapalny14,15. Ponadto RA-FLS wykazują cechy nowotworowe, w tym zwiększoną zdolność migracyjną, inwazyjną, niekontrolowaną proliferację oraz odporność na apoptozę, i aktywnie uczestniczą w procesach erozji chrząstki i kości16.

W ostatnich latach FLS jest szeroko wykorzystywany jako modele in vitro do badania chorób zapalnych stawów, takich jak RZS, co jest częściowo wynikiem ograniczeń obecnych farmakoterapii pierwszego wyboru 17,18,19. Są wykorzystywane w hodowlach 2D, modelach 3D oraz systemach organ-na-chipie do badania mechanizmów chorób, walidacji celów terapeutycznych oraz przeprowadzania badań przesiewowychleków 20,21,22,23. Ponadto RAFLS stanowią podstawę zaawansowanych zastosowań, w tym organoidów przymaziowych pochodzących od pacjentów do przewidywania odpowiedzi DMARD; edycja genetyczna za pomocą CRISPR/Cas9 w celu badania funkcji genów w progresji RZ; oraz jako źródło komórek do inżynierii funkcjonalnych przeszczepów tkanek mazialnych 24,25,26.

Uzyskanie krótkotrwałych hodowli RA-FLS z tkanki maziowej pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów stanowi pierwszy krok wielu eksperymentów. W porównaniu z liniami komórkowymi FLS, krótkoterminowe, hodowane przez pacjentów RA-FLS zachowują heterogeniczność między pacjentami oraz specyficzne dla choroby, umożliwiając bardziej autentyczną reprezentację czynników transkrypcyjnych związanych z chorobą oraz różnic regulacyjnych szlaków. W konsekwencji wydajność komórek, tempo wzrostu i funkcjonalność mogą być zależne od czynników specyficznych dla pacjenta, takich jak wiek, czas trwania choroby, historia leczenia i aktywność choroby, co prowadzi do pewnego stopnia zmienności między grupami. Dlatego badacze powinni ocenić kliniczne tło tkankowe przed użyciem i prowadzić eksperymenty we wczesnych fazach (P3-P7), aby utrzymać stabilność fenotypową komórek.

Niniejsze badanie opisuje uproszczony protokół ekstrakcji i identyfikacji RA-FLS z tkanki maziowej kolana. Metoda wykorzystuje sekwencyjne trawienie enzymatyczne (trypsyna, a następnie kolagenaza typu II) połączone z delikatną dysocjacją mechaniczną. Dowody sugerują, że takie zoptymalizowane, wieloetapowe strategie enzymatyczne zazwyczaj przewyższają leczenie pojedynczym enzymem lub niesekwencyjne mieszane enzymy, co może zaburzać żywotność komórek i fenotyp 27,28,29,30. Dla porównania, przedstawiony protokół umożliwia bardziej efektywną i delikatną izolację wysokożywotnych, wysokiej czystości RA-FLS, minimalizując uszkodzenia komórek i utratę fenotypową, aby zapewnić odpowiedniość do dalszych testów funkcjonalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zebrało tkankę maziową od pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów poddawanych operacji wymiany stawów w China-Japan Friendship Hospital. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę przed operacją. Zebrane informacje i próbki biologiczne zostały obsłużone z surowymi środkami mającymi na celu zapewnienie prywatności pacjentów i bezpieczeństwa danych. Pozostałe próbki tkanki maziowej zostały utylizowane zgodnie z przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Wykorzystanie tkanki maziowej stawu kolanowego u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów w tym badaniu zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Szpitala Przyjaźni China-Japan (nr zatwierdzenia: 2025-KY-223). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Pozyskanie i przygotowanie tkanki maziowej

UWAGA: Umieść tkankę maziową pobraną podczas operacji w sterylnym pojemniku wypełnionym roztworem soli fizjologicznej 0,9% lub PBS, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas transferu z sali operacyjnej do szafki bioasekuracyjnej. Stosuj zanurzenie w etanolu, a następnie mycie roztworem penicyliny i streptomycyny jako kluczowe kroki zapobiegające zakażeniu bakteryjnym lub grzybiczym, zapewniając sukces kolejnych eksperymentów.

  1. Zanurz świeżą tkankę maziową w 50 mL wirówce zawierającej PBS i przelej ją do szafki do zabezpieczenia biologicznego.
  2. Przenieś tkankę maziową do szalki Petriego zawierającej 75% etanolu i zanurz ją na 30 sekund w celu dezynfekcji.
  3. Usuń tkankę tłuszczową i kostną z tkanki maziowej za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, a następnie przenieś pozostałą tkankę do nowej poduszki hodowlowej.
  4. Pobraną tkankę maziową przemyj 3 razy PBS zawierającą 10% penicyliny/streptomycyny.

2. Trawienie tkanki maziowej

UWAGA: Użyj trypsyny do zakłócenia styków komórkowych oraz macierzy zewnątrzkomórkowej w tkance maziowej w celu dalszej izolacji. Stosuj kolagenazę typu II do selektywnej degradacji struktury macierzy zewnątrzkomórkowej, ułatwiając dysocjację komórek od matrycy. Przed użyciem sterylizuj wszystkie chirurgiczne nożyczki, kleszcze i filtry komórkowe niezbędne do rozwarstwiania tkanki maziowej poprzez autoklawowanie. Po trawieniu fragmenty tkanek powinny wyglądać na poluzowane, z postrzępionymi krawędziami, a medium może stać się lekko mętne. Niestrawiona tkanka pozostanie zwarta i nieprzezroczysta.

  1. Tkanie tkanek posiekaj nożyczkami na fragmenty o wysokości 1 mm × 1 mm.
  2. Dodaj 0,25% trypsyny do tkanki i traw w temperaturze 37 °C w shakerze o stałej temperaturze (100-150 obr./min) lub w inkubatorze komórkowym przez 30 minut.
  3. Przygotuj 10% roztwór surowicy bydła płodu (FBS) z użyciem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
  4. Przenieś tkankę do probówek do wirówek o pojemności 15 mL lub 50 mL w zależności od ilości tkanki, a następnie zneutralizuj i strawić ją PBS zawierającym 10% surowicy płodowej bydła (FBS).
  5. Wirówka (4 °C, 500 × g, 5 min), następnie odrzuć supernatant i zatrzymać granulat.
  6. Ponownie zawiesić granulkę w PBS.
  7. Wirówka (4 °C, 500 × g, 5 min), następnie odrzuć supernatant i zatrzymać granulat.
  8. Dodaj 100 mg kolagenazy typu II do 50 ml pożywki DMEM, aby przygotować roztwór kolagenazy typu II o stężeniu 2 mg/mL.
  9. Przefiltruj przygotowany roztwór kolagenazy typu II przez membranę o pojemności 0,22 μm do sterylizacji.
  10. Dodaj 2 mg/mL kolagenazy typu II i traw w shakerze o stałej temperaturze 37 °C (przy 100-150 obr./min) lub inkubatorze komórkowym przez 4 godziny.

3. Izolacja i hodowla synowiocytów fibroblastopodobnych

UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórek wykonuj na szafce bioasekuracyjnej w warunkach sterylnych i zakładaj sterylne rękawiczki, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

  1. Przygotować kompletne podłoże DMEM, uzupełniając podstawowe pożywkę DMEM o 10% surowicy bydlęcej płodu, 100 U/mL penicyliny oraz 100 μg/mL streptomycyny.
  2. Umieść sitko o średnicy 100 metek na sterylnej misce Petriego i wylej na nie strawioną tkankę maziową oraz płyn.
  3. Przenieś sitko komórkowe z resztkami tkanki do innej sterylnej szalki Petriego.
  4. Zmielić pozostałe tkanki na sicie za pomocą końcówki 20 mL sterylnego pręta tłokowego strzykawki, aż pozostaną tylko białe, włókniste resztki i nie będzie można wyciągnąć dalszej zawiesiny komórkowej.
  5. Przepłucz sitko odpowiednią ilością kompletnego medium DMEM.
  6. Zbierz wszystkie filtraty, zawiruj (4 °C, 500 × g, 5 minut) i wyrzuć supernatant.
  7. Ponownie zawiesz granulek w PBS, wirówce (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzuć supernatant.
  8. Ponownie zawiesić komórki w pełnym nośniku DMEM.
  9. Wykonaj liczenie komórek i przenieś je do kolby hodowlowej.
  10. Inkubuj kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂).
  11. Wymień medium po 48 godzinach.
  12. Trawić komórki trypsyną i przepuszczać je w stosunku 1:3, gdy osiągną pełne zbicie.

4. Identyfikacja RA-FLS za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego vimentyną

UWAGA: Podgrzej roztwór PBS używany do mycia komórek w kąpieli wodnej ustawionej na 37 °C. Wszystkie objętości odczynników określone w tej sekcji są standaryzowane dla formatu płytek 48-dołkowych. Objętości powinny być skalowane proporcjonalnie do obszaru wzrostu przy użyciu talerzy w innym formacie.

  1. Trawić komórki trypsyną, ponownie zawiesijować pobrane komórki i rozcieńczać do 1 × 104 komórek/ L, używając kompletnego medium DMEM.
  2. Nasiać RA-FLS do płyty 48-dołkowej o pojemności 200 μL na odwiert.
  3. Umieść w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂) i inkubuj przez 24 godziny.
  4. Usuń podłoże i przemyj komórki trzykrotnie podgrzanym PBS.
  5. Dodaj 4% paradehydu, aby utrwalić komórki przez 10 minut, wyrzuć utrwalacz i przemyć trzy razy PBS.
  6. Przygotuj 150 μL roztworu 0,1% Triton X-100 w PBS na odwiert. Upewnij się, że przed użyciem wymieszaj pełne mieszanie poprzez wirowanie lub delikatną inwersję.
  7. Do dołków dodaj 0,1% roztworu Triton X-100 i inkubuj przez 10 minut, aby przeniknąć komórki.
  8. Usuń 0,1% roztwór Triton X-100 i przepłucz trzy razy PBS.
  9. Dodaj 150 μL bezzwierzęcego roztworu blokującego na dołek, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  10. Usuń roztwór blokujący. Do każdego dołku dodaj 150 μL pierwotnego roztworu przeciwciał vimentynowych (rozcieńczonych 1:200 w rozcieńczalniku przeciwciał).
  11. Inkubować z pierwotnym przeciwciałem w temperaturze 4 °C przez noc.
  12. Usuń pierwotne przeciwciało i przemyj komórki pięć razy PBS.
  13. Dodaj 150 μL przeciwciała przeciwkróliczego IgG sprzężonego z Alexa Fluor 488 (rozcieńczonego w 1:50 w rozcieńczalniku uniwersalnym) na dołek i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę chronioną przed światłem.
  14. Usuń przeciwciało wtórne i przemyj komórki trzykrotnie PBS.
  15. Dodaj jedną kroplę medium antyfade zawierającego DAPI na każdy dołek i susz przez 10 minut w ciemności.
  16. Obserwuj i rejestruj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w 20× obiektywne i odpowiednie zestawy filtrów dla DAPI oraz FITC/GFP.
    UWAGA: Przemyj komórki PBS, całkowicie wypełniając dołki PBS, inkubując przez 5 minut, a następnie usuwając PBS. Ten proces stanowi jeden cykl prania.

5. Ilościowo określić RA-FLS i ocenić czystość za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Stosuj Vimentin i CD90 jako pozytywne markery do identyfikacji RA-FLS, jednocześnie stosując CD68, CD14 i CD11b jako negatywne kontrole, aby wykluczyć zanieczyszczenie komórek odpornościowych. Vimentyna pełni funkcję wewnątrzkomórkowego białka włókna pośredniego, głównie lokalizowanego w cytoplazmie RA-FLS. CD90 pełni funkcję krytycznego markera powierzchniowego o wysokiej ekspresji na RA-FLS, umożliwiając odróżnienie ich od komórek odpornościowych. Chociaż CD68, CD14 i CD11b są specyficznie eksprymowane w makrofagach, monocytach i komórkach szpikowych, są wykorzystywane jako ujemne markery, aby wykluczyć zanieczyszczenie komórkami odpornościowymi. Przypisuj fluorochromy markerom powierzchni komórkowej na podstawie ich specyficzności wiązania i upewnij się, że kanały fluorescencyjne się nie nakładają. Na przykład w tym eksperymencie CD90 i CD68 mają ten sam fluorochrom; dlatego nie należy ich dodawać do tej samej rurki wirówki. Przed inkubacją z przeciwciałem wimentynowym dodaj środki utrwalające i permeabilizujące, aby rozbić błonę komórkową. Jeśli cytometr przepływowy ma wystarczającą liczbę kanałów fluorescencjowych, markery takie jak CD90 i CD68 mogą być przypisane do różnych kanałów do wielokolorowej analizy jednoczesnej, co dodatkowo poprawia efektywność detekcji i zawartość informacji.

  1. Digestuj trzecią generację RA-FLS za pomocą trypsyny wolnej od EDTA.
  2. Zakończ trawienie kompletnym medium DMEM, wirówka (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzuć supernatant.
  3. Ponownie zawiesij pellet w PBS, przeprowadź liczenie komórek i dostosuj stężenie komórek do 1 × 10⁶ komórek/mL za pomocą PBS.
  4. Rozprowadź ogniwa w trzech rurkach wirówkowych, dodając do każdej 200 μL zawiesiny ogniwowej.
  5. Dodaj przeciwciało CD11b (rozcieńczone w 1:100 w uniwersalnym rozcieńczalniku przeciwciał) w końcowej objętości 100 μL do probówki 1. Wir do mieszania.
    1. Po 15 minutach inkubacji dodaj 1 ml środka do utrwalania/permeabilizacji do rurki 1, wir do wymieszania i inkubuj przez 30 minut chroniony przed światłem.
    2. Do probówki 1 dodaj 1 ml buforu wiązania/permeabilizacji, aby zakończyć permeabilizację, wir wymieszać, wirować (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzucić supernatant.
    3. Przygotuj 100 μL koktajlu wimentyny i przeciwciał CD68 (każde rozcieńczone w 1:100 w uniwersalnym rozcieńczalniku przeciwciał), dodaj do probówki 1, wymieszaj wir i inkubuj w ochronie światła przez 30 minut.
    4. Dodaj 1 mL buforu wiązającego/permeabilizacyjnego do probówki 1, wymieszaj wir, wiruj (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzuć supernatant.
    5. Dodaj 100 μL przeciwciała przeciw króliczym IgG sprzężonego z Alexa Fluor 488 (rozcieńczonego 1:50 w rozcieńczalniku uniwersalnym) do probówki 1. Wir do mieszania i inkubacji chronionej przed światłem przez 30 minut.
    6. Dodaj 1 ml buforu do rurki 1, wymieszaj wir, wiruj (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzuć supernatant.
    7. Dodaj 300 μL buforu do Rurki 1 i zmieszaj wir do próbki ładowającej.
  6. Dodaj do probówki 2 przeciwciała CD90 i CD14 (każde rozcieńczone w 1:100 w uniwersalnym rozcieńczalniku przeciwciał) do probówki 2 do końcowej objętości 100 μL. Porzuć probówkę 3 bez przeciwciał jako kontrolę negatywną.
    1. Po 15 minutach inkubacji należy dodać 1 ml PBS do probówek 2 i 3.
    2. Probówki wirówek 2 i 3 (4 °C, 500 × g, 5 min) odrzucają supernatant, dodają 300 μL buforu i mieszają wiry do próbki ładowanej.
  7. Wykonaj pozyskiwanie przygotowanych próbek cytometrią przepływową.
  8. Analizuj dane cytometrii przepływowej i wykonuj statystyki przy użyciu kompatybilnego oprogramowania.

6. Pomiar proliferacji RA-FLS indukowanej TNF-α za pomocą testu MTS

  1. Digestuj trzecią generację RA-FLS za pomocą trypsyny wolnej od EDTA.
  2. Zakończ trawienie kompletnym medium DMEM, wirówka (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzuć supernatant.
  3. Ponownie zawiesić pellet w pełnym nośniku DMEM, przeprowadzić liczenie komórek i rozcieńczyć do 1 × 10⁵ komórek/L.
  4. Nasiać ponownie zawiesowane komórki do płyty z 96 dołkami o pojemności 100 μL na dołek.
  5. Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórek aż do wystąpienia adhezji komórkowej, następnie dziel się na grupy kontrolne i interwencyjne.
  6. Dodaj 10 ng/mL TNF-α do grupy interwencyjnej i równą objętość PBS do grupy kontrolnej pustej.
  7. Po 24 godzinach interwencji należy dodać 10 μL odczynnika MTS do każdego dołka i kontynuować inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  8. Po 1 godzinie inkubacji zmierz absorpcję (OD) na 490 nm za pomocą czytnika mikropłyt.
  9. Oblicz żywotność proliferacji komórek na podstawie wartości przedawkowania każdego dołka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z protokołu, skutecznie wyizolowaliśmy krótkotrwałe, hodowlane od pacjenta RA-FLS. Przedstawiono schemat proceduralnego przepływu pracy (Rysunek 1). Pod mikroskopią świetlną RA-FLS wykazywały dominujący fenotyp morfologiczny z komórkami wielokątnymi w kształcie wrzeciona i nieregularnymi. Komórki wykazywały rozległe rozprzestrzenianie się cytoplazmatyczne z wydłużonymi wyrostkami. Granice komórek wydawały się nieco niewyraźne w miejscach kontaktu lub nakładania się komórek. Więks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ustanawia powtarzalną metodę izolacji i krótkotrwałej hodowli RA-FLS od pacjentów z RZS, a jej skuteczność potwierdza wysoka żywotność komórek, charakterystyczny fenotyp, specyficzna ekspresja markerów oraz funkcjonalna reakcja na bodźce zapalne.

Kluczowe kroki i kwestie techniczne
Niezawodność tej metody zależy od kilku kluczowych kroków. Po pierwsze, świeża tkanka maziowa powinna być poddana trawieniu enzymatycznemu niezwłocznie w ciągu 4-6 godzin od pozysk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów w tej pracy i potwierdzają, że użycie Figdraw do generowania Rysunku 1 jest zgodne z warunkami licencyjnymi platformy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82074223 i 8207141673) oraz kluczowy projekt na poziomie rządu centralnego: ustanowienie zrównoważonego wykorzystania cennych zasobów medycyny chińskiej (nr 2060302).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IgG z Alexa Fluor 488-sprzężonym antykróliczymZhongshan Jingqiao BiotechnologyZF-0511
0,25% trypsyna-EDTA (1x)Gibco25200-072
4% paradehyduSolarbioP1110
Alexa Flour674 antyludzki CD68Biolegenda562111
Rozwiązanie blokujące bez zwierzątTechnologia sygnalizacji komórkowej15019
APC antyludzki CD90Biolegenda559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD Biosciences657925
BD LSRFortessaBD Biosciences647177
BV605 antyludzki CD11bbidegend563015
CellTiter 96 AQaueous One Solution Cell Proliferation Test (MTS)PromegaG358A
Kolagenaza IISolarbioC8150
Medium mocujące fluorescencyjne zawierające DAPIZhongshan Jingqiao BiotechnologyZLI-9556
Medium mocujące fluorescencyjne zawierające DAPIZhongshan Jingqiao BiotechnologyZLI-9556
Zmodyfikowane medium Dulbecco (DMEM), wysokoglukozoweHyCloneSH30022.01
Surowica krowiecka płodu – Superfine (FBS)Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.ZQ0500
FITC antyludzki CD14Biolegenda325604
PBS, 1&raz; (pH 7,4) Fosforanowa sól fizjologicznaServicebioG4202
Roztwór mieszanki penicyliny i streptomycyny (podwójne antybiotyki) 100 razy;Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.CSP006
Uniwersalny bufor blokujący białka i przeciwciała QuickBlockBeyotimeP0270-500ml
Rekombinowane ludzkie TNF-&alfa;Peprotech300-01A
Buffe barwienie czynnikiem transkrypcyjnymeBioscience00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
Roztwór trypsyny (bez EDTA)Beijing Labgic Technology Co., Ltd.BL526A

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Matteo, A., Bathon, J. M., Emery, P. Rheumatoid arthritis. Lancet. 402 (10416), 2019-2033 (2023).
  2. Uke, P., Maharaj, A., Adebajo, A. A review on the epidemiology of rheumatoid arthritis: An update and trends from current literature. Best Pract Res Clin Rheumatol. 39 (1), 9(2025).
  3. Wu, D., et al. Systemic complications of rheumatoid arthritis: Focus on pathogenesis and treatment. Front Immunol. 13, 13(2022).
  4. Chen, G., Yan, Z., Wang, Y., Tao, Q. Rheumatoid arthritis and fibromyalgia syndrome: A bibliometric and bioinformatics perspective on comorbidity research. J Multidiscip Healthc. 18, 6811-6827 (2025).
  5. Zhao, Y., Chen, G. Y., Fang, M. Research trends of rheumatoid arthritis and depression from 2019 to 2023: A bibliometric analysis. J Multidiscip Healthc. 17, 4465-4474 (2024).
  6. Komatsu, N., Takayanagi, H. Mechanisms of joint destruction in rheumatoid arthritis - immune cell-fibroblast-bone interactions. Nat Rev Rheumatol. 18 (7), 415-429 (2022).
  7. Zhang, Y. Y., Gao, Z. J., Chao, S. S., Lu, W. J., Zhang, P. P. Transdermal delivery of inflammatory factor-regulated drugs for rheumatoid arthritis. Drug Deliv. 29 (1), 1934-1950 (2022).
  8. Bottini, N., Firestein, G. S. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: Passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 9 (1), 24-33 (2013).
  9. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 4, 23(2018).
  10. Liu, Y., et al. Regulatory fibroblast-like synoviocytes cell membrane-coated nanoparticles: A novel targeted therapy for rheumatoid arthritis. Adv Sci. 10 (4), 15(2023).
  11. Li, C. L., et al. A transformable nanoplatform precisely positions fibroblast-like synoviocytes via FAP-α for improved rheumatoid arthritis therapy. Adv Healthc Mater. 15 (2), e03277(2026).
  12. Meng, Q. L., Wei, K., Shan, Y. E3 ubiquitin ligase gene BIRC3 modulates TNF-induced cell death pathways and promotes aberrant proliferation in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Front Immunol. 15, 10(2024).
  13. Chen, L., et al. AMPK signaling in osteoarthritis: From mechanisms to targeted therapeutics. Front Pharmacol. 16, 1681610(2025).
  14. Bakinowska, E., et al. The role of mesenchymal stromal cells in the treatment of rheumatoid arthritis. Cells. 13 (11), 17(2024).
  15. Filer, A. The fibroblast as a therapeutic target in rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 413-419 (2013).
  16. Promila, L., et al. Mitochondrial calcium uniporter regulates human fibroblast-like synoviocytes invasion via altering mitochondrial dynamics and dictates rheumatoid arthritis pathogenesis. Free Radic Biol Med. 234, 55-71 (2025).
  17. Wang, X. C., He, J. X., Zhang, Q., He, J., Wang, Q. W. Constructing a 3D co-culture in vitro synovial tissue model for rheumatoid arthritis research. Mater Today Bio. 31, 16(2025).
  18. Shi, R. Y., et al. Monocyte membrane-coated drug nanocrystals for enhanced targeted therapy of rheumatoid arthritis. J Control Release. 384, 14(2025).
  19. Smolen, J. S., et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2019 update. Ann Rheum Dis. 79 (6), 685-699 (2020).
  20. Chen, G. Y., et al. Mechanisms of total glucosides of paeony in alleviating methotrexate-induced liver injury. Drug Des Devel Ther. 19, 3407-3423 (2025).
  21. Philippon, E. M. L., et al. A novel 3D spheroid model of rheumatoid arthritis synovial tissue incorporating fibroblasts, endothelial cells, and macrophages. Front Immunol. 14, 11(2023).
  22. Lin, X., et al. Sesamol serves as a p53 stabilizer to relieve rheumatoid arthritis progression and inhibits the growth of synovial organoids. Phytomedicine. 121, 14(2023).
  23. Lee, M. S., Kim, S., Lee, J. H., Bae, Y. S., Lee, S. K. Synovium-on-a-chip reveals fibroblast-macrophage crosstalk underpinning joint homeostasis and evaluation of gout therapies. Adv Healthc Mater. 14 (18), 16(2025).
  24. Kim, D., et al. 3D in vitro synovial hyperplasia model on polycaprolactone-micropatterned nanofibrous microwells for screening disease-modifying anti-rheumatic drugs. Mater Today Bio. 26, 10(2024).
  25. Murakami, A., et al. Human CD4(+) T cells regulate peripheral immune responses in rheumatoid arthritis via insulin-like growth factor-like family member 2. Sci Immunol. 10 (110), eadr3838(2025).
  26. Yue, S., et al. Unveiling the therapeutic potential: Targeting fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Expert Rev Mol Med. 27, e18(2025).
  27. Clister, T., et al. Optimization of tissue digestion methods for characterization of photoaged skin by single-cell RNA sequencing reveals preferential enrichment of T cell subsets. Cells. 13 (3), (2024).
  28. Hu, Z., et al. Novel strategy for primary epithelial cell isolation: Combination of hyaluronidase and collagenase I. Cell Prolif. 56 (1), e13320(2023).
  29. Sueters, J., Schipperheijn, R., Huirne, J., Smit, T., Guler, Z. Reproducibility and consistency of isolation protocols for fibroblasts, smooth muscle cells, and epithelial cells from the human vagina. Cells. 14 (2), 76(2025).
  30. Jiang, D. X., et al. Primary isolation, culture, and phenotypic verification of rat knee articular chondrocytes. J Vis Exp. (225), e69509(2025).
  31. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Res Ther. 20 (1), 139(2018).
  32. Zhang, F., et al. Deconstruction of rheumatoid arthritis synovium defines inflammatory subtypes. Nature. 623 (7987), 616(2023).
  33. Li, P. F., et al. Comparative proteomic analysis of polarized human THP-1 and mouse RAW264.7 macrophages. Front Immunol. 12, 13(2021).
  34. Zhu, E. B., et al. Biomimetic cell stimulation with a graphene oxide antigen-presenting platform for developing T cell-based therapies. Nat Nanotechnol. 19 (12), 1914-1922 (2024).
  35. Sato, N., Bamford, R. N., Bryant, B. R., Tagaya, Y., Waldmann, T. A. Accessory cells precondition naive T cells and regulatory T cells for cytokine-mediated proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), 13(2023).
  36. Krishnaswamy, J. K., Alsén, S., Yrlid, U., Eisenbarth, S. C., Williams, A. Determination of T follicular helper cell fate by dendritic cells. Front Immunol. 9, 16(2018).
  37. Ndeupen, S., et al. Langerhans cells and cDC1s play redundant roles in mRNA-LNP-induced protective anti-influenza and anti-SARS-CoV-2 immune responses. PLoS Pathog. 18 (1), 18(2022).
  38. Walsh, M. C., et al. Osteoimmunology: Interplay between the immune system and bone metabolism. Annu Rev Immunol. 24, 33-63 (2006).
  39. Koenderman, L., Tesselaar, K., Vrisekoop, N. Human neutrophil kinetics: A call to revisit old evidence. Trends Immunol. 43 (11), 868-876 (2022).
  40. Montero, R. B., et al. bFGF-containing electrospun gelatin scaffolds with controlled nano-architectural features for directed angiogenesis. Acta Biomater. 8 (5), 1778-1791 (2012).
  41. Yang, C. Y., Yuan, W. W., Liao, G. X., Yu, Q. Q., Wang, L. G. Construction of bFGF/heparin and Fe3O4 nanoparticles functionalized scaffolds aiming at vascular repair and magnetic resonance imaging monitoring. Int J Biol Macromol. 286, 15(2025).
  42. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of induced-pluripotent stem cells using fibroblast-like synoviocytes isolated from joints of rheumatoid arthritis patients. J Vis Exp. (116), e54072(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

synowiocyty fibroblastopodobneizolacja kom rektkanka maziowatrawienie enzymatycznetrawienie kolagenazcytometria przep ywowaimmunofluorescencja wimentynystymulacja TNF alfa
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły