Artykuł przeglądowy

Metody wyjaśniania mechanizmów chorób w zaburzeniach neurorozwojowych

DOI:

10.3791/70127

⸱

6 lutego 2026

 , 
1Department of Neurology, University of Maryland School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opcje leczenia modyfikującego chorobę dla osób z zaburzeniami neurorozwojowymi są ograniczone i nie ma lekarstw. Aby temu przeciwdziałać, konieczne są wysiłki na celu zdefiniowanie mechanizmów chorób i nowych celów terapeutycznych. W tej recenzji przedstawiamy kilka technik, które wyznaczają kierunek w tych działaniach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia neurorozwojowe (NDD) dotykają 317 milionów dzieci i młodzieży na całym świecie. Chociaż NDD to zróżnicowana grupa zaburzeń wpływających na wiele narządów, epilepsja, zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD) i/lub niepełnosprawność intelektualna (ID) są częstymi objawami. Niestety, istnieje niewiele terapii modyfikujących chorobę i brak lekarstw na NDD. Ostatnio jednak edycja genów, testy komórkowe/molekularne oraz modele komórek macierzystych pojawiły się jako obiecujące techniki głębokiego zrozumienia przyczyn NDD, kategoryzowania wariantów genetycznych i precyzyjniejszego modelowania procesów chorób u ludzi. Dodatkowo kilka technik, zwłaszcza edycja genów, już odniosło sukces kliniczny. W tym przeglądzie szczegółowo przedstawiamy kilka nowych metod funkcjonalnej walidacji wariantów genetycznych, modele komórek macierzystych NDD oraz nowe metody edycji genów. Zrozumienie i stosowanie tych metod jest kluczowe dla odkrywania nowych mechanizmów chorób i celów terapeutycznych dla NDD, a także dla rozwoju podejść technicznych od pracy laboratoryjnej do kliniki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia neurorozwojowe (NDD) dotykają 317 milionów dzieci i młodzieży na całym świecie1. Do tych zaburzeń należą porażenie mózgowe, zespół łamliwego chromosomu X, zespół Angelmana oraz zespół stwardnienia guzy, między innymi. Chociaż NDD to zróżnicowana grupa zaburzeń wpływających na wiele układów narządowych, padaczka, zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD) i/lub niepełnosprawność intelektualna (ID) są częstymi skutkami2. Jedno z badań wykazało, że dzieci w Kenii z padaczką oraz zaburzeniami poznawczym, wzrokowymi, słuchowymi lub ruchowymi umierały 3 do 4 razy częściej niż dzieci z grupy1 bez NDD.

Zmiana paradygmatu w badaniu NDD nastąpiła wraz z ukończeniem Projektu Ludzkiego Genomu w 2003roku. Dalszy postęp osiągnięto poprzez zdefiniowanie poligenicznych wskaźników ryzyka za pomocą GWAS oraz charakterystykę "zaburzeń neurorozwojowych" przez DSM-5 w 2013 roku4. Chociaż istnieje znaczący postęp w zrozumieniu genetycznych przyczyn NDD, istnieje niewiele terapii celowanych dla konkretnych NDD i nie ma terapii modyfikujących przebieg choroby dla ASD i/lub ID z nimi związanych.

Edycja genów, elektrofizjologiczna oraz testy i metody komórkowe/molekularne opisane w tym przeglądzie znajdują się na czele badań nad NDD. Chociaż nie omówiliśmy wszystkich testów w pełni, te metody stanowią nowoczesne podejścia do identyfikacji terapii modyfikujących przebieg choroby. Jednym z przykładów są enzymy deubikwitylujące (DUB), które to grupa enzymów usuwających ubikwitynę z białek. Ponieważ mutacje w DUB są powiązane z NDD, celowanie w ich modyfikację może być potencjalną terapią dla NDD 5,6. Ponadto badane są szlaki na poziomie obwodów, takie jak te obejmujące podjednostkę receptora GABAA, oraz inne kanałopatie, aby zdefiniować mechanizmy choroby związane z padaczką, ASD i ID7. Inną istotną metodą, edycją genomu CRISPR/Cas (Rysunek 1), jest potężnym narzędziem służącym do bezpośredniej zmiany genomu w celu tworzenia nowych modeli eksperymentalnych, a ostatnio także leczenia rzadkich zaburzeń genetycznych 8,9,10. Zestaw narzędzi CRISPR stale się rozwija, a cztery podejścia, w tym CRISPRi (CRISPR Interference/Inhibition), CRISPRa (CRISPR Activation), prime editing oraz base editing, stały się znaczącymi badaniami i innowacjami klinicznymi. Na koniec, artykuł ten opisuje postępy w wykorzystaniu indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC). iPSC i ich pochodne komórkowe pozwoliły badaczom dokładniej modelować wiele NDD przy użyciu komórek pochodzących od pacjentów 9,11,12. Co ważne, rozwój organoidów z iPSC umożliwił badanie procesu rozwojowego leżącego u podstaw wielu NDD w sposób znacznie bardziej istotny dla chorób ludzkich niż modele gryzoni13,14.

Ta krótka recenzja szczegółowo opisuje i rozwija techniki przedstawione powyżej. Ponadto omawiane są także ostatnie badania wykorzystujące te techniki do uzyskania głębszego wglądu w NDD, luk w obecnej literaturze oraz przyszłych kierunków.

Przegląd i perspektywa

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowane pluripotentne komórki macierzyste i powiązane paradygmaty eksperymentalne

Indukowane pluripotentne komórki macierzyste stały się potężnym systemem modelowania NDD. Rzeczywiście, wiele procesów rozwojowych zachodzi w modelach iPSC podobnych do tych obserwowanych podczas rozwoju mózgu człowieka, które nie zachodzą podczas rozwoju mózgu gryzoni15. Dlatego badacze połączyli modele komórek macierzystych, w tym kultury 2D, organoidy i assembloidy, z innymi metodami eksperymentalnymi, aby lepiej zrozumieć mechanizmy choroby w NDD11, 13, 14, 16.

Ostatnio do modelowania kluczowej cechy neurogenezy zespołu Downa (DS) podczas rozwoju płodu użyto assembloidów16. Przy użyciu zarówno hiPSC DS, jak i izogenicznych euploidalnych hiPSC, wywołano neurogenezę, a następnie nastąpiła różnicacja do neuronów. Po 85 dniach zastosowano immunocytochemię i obrazowanie do obserwacji cyklu komórkowego. Zaobserwowali, że neuronalne komórki progenitorowe DS nie opuszczają cyklu komórkowego i nie są w stanie różnicować się w dojrzałe neurony, a także odkryli, że defekty cyklu komórkowego zmieniają fazę neurogenną, powodując zaburzenia neurogenezy w DS16.

Podczas gdy wiele modeli komórek macierzystych koncentrowało się na neuronach, inne typy komórek, w tym komórki glejowe, odgrywają ważną rolę w patologii NDD17. Niedawny raport skupił się na roli gliogenezy i astrocytów w zespole łamliwego chromosomu X (FXS). Za pomocą hiPSC komórki progenitorowe astrocytów zostały hodowane i zróżnicowane do astrocytów specyficznych dla przedniego mózgu, które nie posiadały delikatnego białka rybojądrowegoX 11. Zaobserwowali, że te astrocyty mają zaburzenia metabolizmu glikolitycznego i mitochondrialnego. Wcześniejsze badania tego samego zespołu wykazały również, że prawidłowa funkcja mitochondriów jest niezbędna do kontrolowania wyładowania potencjału czynnościowego u neuronów pochodzących od pacjentów z FXS11,18. Chociaż potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć mechanizm, przez jaki metabolizm astrocytów i wyładowywanie neuronów są zmieniane w FXS, badania te pokazują, że astrocyty mogą zarówno napędzać patologię chorób, jak i być celem terapeutycznym.

Edycja genomu

Francisco Mojica położył podwaliny pod edycję genomu, odkrywając CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), adaptacyjny układ odpornościowy dla prokariotów, na początku lat 90. Na tej podstawie Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier opracowały metodę o nazwie CRISPR/Cas9, która wykorzystuje CRISPR sprzężony z endonukleazą Cas9 do selektywnej izolacji i zmiany genów20. Niedługo po publikacji pierwszych badań nad edycją genów CRISPR/Cas9, badacze zaczęli manipulować systemem CRISPR/Cas, aby ujawnić nowe informacje genomowe lub edytować geny w unikalny sposób. Jedną z nowatorskich metod jest CRISPRi – sposób na wyciszenie interesującego genu 21,22. Stosując katalistycznie nieaktywną nukleazę Cas9 w połączeniu z RNA CR- i Tracr, dostęp polimerazy RNA do promotora jest blokowany, co wyłącza ekspresję genów dla konkretnego genu lub zestawu genów22,23. Badania CRISPRi zostały wykorzystane do identyfikacji kilku genów ryzyka NDD oraz identyfikacji zmian funkcjonalnych związanych z utratą funkcji w tych genach. Na przykład niedawny test CRISPRi w assembloidach pochodzących z iPSC przeanalizował 425 genów NDD pod kątem ich wpływu na rozwój interneuronów i wykazał, że utrata kilku genów kandydatów wpływa na strukturę siatkówki cytoszkieletowej i endoplazmatycznej24. Ponadto badanie CRISPRi wykazało, że utrata ADNP, genu ryzyka ASD, spowodowała zmiany w mikroglejowym przycinaniu synaps25. W ten sposób badania CRISPRi ujawniły kilka zbieżnych i odmiennych mechanizmów chorób w NDD.

Uzupełniając CRISPRi, CRISPRa jest narzędziem wykorzystywanym do zwiększania ekspresji genów. Technika ta łączy katalistycznie nieaktywny Cas9 z aktywatorami transkrypcyjnymi i jest celowana przez przewodnik RNA. CRISPRa została również wykorzystana do zrozumienia, jak aktywacja genów ryzyka ASD i NDD może zmieniać fenotypy chorób. Chociaż istnieje niewiele badań wykorzystujących CRISPRa do wykrywania fenotypów NDD, CRISPRa może mieć duży potencjał terapeutyczny. Na przykład niedawne badanie wykazało, że aktywacja ITGB3 (haplonieniewystarczalność związana z ASD) ratowała funkcje sieciowe i fenotypy ASD u gryzoni23. Rzeczywiście, wiele wariantów genu NDD powoduje choroby z powodu haploinsynowości, co rodzi możliwość, że CRISPRa może być użyty do zwiększenia ekspresji niedotkniętego allelu w sposób modyfikujący przebieg choroby.

Edycja baz i edycja prime to precyzyjne metody w ramach narzędzi CRISPR do edycji konkretnych nukleotydów w genomie. Oba rozszczepiają pojedynczą nić DNA, a nie podwójne pęknięcie (DSB) jak CRISPR/Cas910,26. Chociaż montaż bazowy jest bardziej szczegółowy niż standardowy montaż CRISPR/Cas9, jest mniej elastyczny, a więc mniej istotny pod względem translacyjnym niż montaż prime. Efektywność edycji bazowej polega na jej zdolności do korygowania mutacji punktowych poprzez zastąpienie cytozyny tyminą lub adeniną guaniną i odwrotnie10. Z tego powodu edycja baz jest ograniczona pod względem rodzajów mutacji, które może wywołać. Dlatego, choć przydatne, można wykonać tylko mutacje przejściowe, a nie wstawienia czy delecje10. Jednak edycja prime to bardzo elastyczna forma edycji genomu z wieloma możliwymi zastosowaniami. Edycja Prime wykorzystuje przewodnie RNA (pegRNA) oraz nikazę Cas9 sprzężoną z transkryptozawą odwrotną, co umożliwia wstawianie, delecje lub zmiany pojedynczych nukleotydów10. Niestety, ponieważ jest bardziej technicznie skomplikowana i może dokonywać większych zmian genów, edycja prime może być mniej efektywna niż edycja baz. Dlatego oba mogą być wykorzystywane jako narzędzia uzupełniające się i przydatne w edycji genomu w zaburzeniach neurorozwojowych. Edycja Prime została już wykorzystana do leczenia pacjenta z rzadkim zaburzeniem genetycznym27 i wykazała obiecujące efekty w ratowaniu fenotypów chorób w modelu gryzoni z naprzemienną hemiplegią dzieciństwa28.

Testy komórkowe i molekularne

NDD są wywoływane przez warianty genetyczne, które wpływają na funkcjonowanie komórek w różny sposób29, 30, 31. Głównym wyzwaniem dla osób badających NDD jest ustalenie, czy konkretny wariant pacjenta powoduje szkodliwą zmianę funkcjonalną w komórce. Dlatego istnieje ogromne zapotrzebowanie na testy, które szybko i dokładnie określą, czy dany wariant genetyczny jest chorobotwórczy lub łagodny. Obiecującym nowym testem jest test rozszczepienia ubiquitin32. Enzymy deubikwitylujące (DUB) to grupa enzymów, które usuwają ubikwitynę z białek, zapobiegając degradacji. DUB są zarówno potencjalnymi metodami leczenia, jak i przyczynami NDD. Do tej pory zidentyfikowano mutacje w 12 DUB jako przyczynowo powiązane z NDD, w tym zespół Hao-Fountain, zespół pseudo-TORCH, zespół mikrocefalii i naczyń naczyniowatych oraz inne5. Aby ustalić, czy konkretne warianty pacjentów powodują chorobę, testy rozszczepienia in vitro ubiquitin stały się złotym standardem pomiaru aktywności enzymatycznej DUB w celu funkcjonalnej weryfikacji mutacji. Metoda ta może być stosowana do oceny wpływu wariantów genów na DUB. Niedawne badanie skupiło się na DUB, który jest zmutowany w X-linked intellectual disability 105, DUB Ubiquitin Specific Protease 27 (USP27X). Badacze z powodzeniem zaprezentowali metodę ekspresji i oczyszczania rekombinowanego USP27X oraz test cięcia łańcucha ubiquityny in vitro. Takie podejście pozwala na określenie aktywności enzymatycznej regulującej odmianę białek w neuronach, co może być istotne dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zmienionego przycinania synaptycznego, krytycznych okresów neurorozwojowych oraz funkcji białek32. Co ciekawe, brakuje opublikowanych artykułów na temat DUB i ich roli w chorobach, dlatego pełny zakres zastosowania tego testu pozostaje nieprzetestowany i otwarty na dalsze badania.

Ponieważ wiele NDD jest również klasyfikowanych jako rzadkie zaburzenia, kliniczne genetyczne określenie wariantów często identyfikuje zmiany genów jako "warianty o nieznanym znaczeniu" (VUS) ze względu na brak wcześniej opublikowanych badań klinicznych lub funkcjonalnych dotyczących tych wariantów 7,33,34. Dlatego badania mające na celu szybkie określenie, czy VUS jest patogenny, są kluczowe dla ustalenia genetycznych przyczyn NDD. Przykładem są warianty receptorów GABAA. Warianty genetyczne receptora GABAA są główną przyczyną padaczki genetycznych i są związane z wieloma typami napadów oraz rozwojowymi encefalopatiami padaczkowymi 7,35. Niedawne badanie badało podjednostki receptora GABAA i próbowało ustalić, czy warianty wywołują zmiany funkcjonalne w komórce, stosując podejście wielomodalne. Do identyfikacji VUS i przewidywania patogennych zmian podjednostek γ2 GABAA zastosowano testy in silico. Następnie zdefiniowano molekularne konsekwencje wariantów, obejmujące markery strukturalne, fizykochemiczne i biofizyczne7. Każda z tych dziedzin została zdefiniowana za pomocą analizy literatury, modelowania in silico oraz elektrofizjologii patch-clamp. Po wybraniu regionu referencyjnego zastosowano piramidalne modelowanie neuronalne do testowania efektów hamowania pośredniczonego przez receptorGABA A. Zaobserwowano, że dwie mutacje podjednostek ß3 (ß3N110D i ß3T288N) oraz dwie mutacje podjednostek γ2 zaburzają hamowanie GABAergiczne7. Protokół ten pokazuje, że podejście wielomodalne często jest przydatne przy określaniu patogenności VUS. Chociaż nie jest to wysokoprzepustowe, to podejście może być również przydatne dla innych VU związanych z NDD, które nie mają specyficznego testu do funkcjonalnej weryfikacji wariantów (np. DUB) – szczególnie jeśli są one związane ze zmianami elektrofizjologicznymi.

Chociaż nie jest to nowatorskie podejście, elektrofizjologia patch-clamp pozostaje złotym standardem w zrozumieniu właściwości elektrycznych neuronów, a tym samym tego, jak zmiany genetyczne wpływają na podstawowe właściwości neuronów. Dla NDD istotne są kanałopatie36. Chociaż istnieje wiele typów kanałopatii, warianty SCN1A zostały dobrze zbadane i stanowią główną przyczynę zespołu Draveta – szczególnie niszczycielskiej encefalopatii rozwojowej36. Funkcjonalna walidacja wariantów SCN1A została osiągnięta przy użyciu kombinatorycznego podejścia automatycznego patch-clamp oraz symulacji in silico. Wykorzystując to podejście, badacze byli w stanie rozdzielić kilka VU i stworzyć korelacje genotyp-fenotyp na podstawie zmian funkcjonalnych neuronów37. W osobnym badaniu o podobnym podejściu zastosowano modele iPSC z automatyczną elektrofizjologią patch-clamp oraz modelami in silico do klasyfikacji wariantów genu w kanałach wapniowych typu T-38. Skupiając się na CACNA1G, genie kodującym Cav3.1 w różnych typach neuronów, CACNA1G został zmutowany, tworząc 18 wariantów Cav3.1, które następnie tymczasowo transfekowane w neurony. Następnie wykonywano automatyczne nagrania patch-clamp, a następnie ręczne patch-clamp i podejścia obliczeniowe. Zaobserwowali, że automatyczne i ręczne patch-clamp dają podobne rezultaty, a podejścia obliczeniowe pozwalają określić zmiany funkcjonalne wywołane przez konkretne warianty genetyczne38. Podczas gdy modele obliczeniowe zapewniają stosunkowo szybki sposób przewidywania funkcjonalnych konsekwencji wariantów genów, podejścia elektrofizjologiczne pozostają czasochłonne i wymagają wysoce wyspecjalizowanych umiejętności, które ograniczają użyteczność tych metod podczas próby weryfikacji dużej liczby wariantów.

Matryce wieloelektrodowe (MEA) służą do pomiaru aktywności elektrycznej wokół małych grup lub na dużych siećach komórek. Ta metoda różni się od elektrofizjologii patch-clamp tym, że koncentruje się na modelach wielokomórkowych, podczas gdy patch-clamp koncentruje się na jedynym kanale lub komórce39,40. Dzięki temu MEA mogą dostarczać wglądu w to, jak różne obszary mózgu ze sobą współdziałają, i mogą być wykorzystywane do badania chorób na skalę sieciową. Wiele badań wykorzystywało MEA do badania eksperymentalnych modeli padaczki i ASD14,39. Kluczową cechą MEA jest to, że potrafią określić sposoby, w jakie różne typy komórek neuronalnych oddziałują (np. neurony glutamatergiczne, interneurony GABAergiczne, progenitory i komórki glejowe)14. To sprawia, że MEA są doskonałym sposobem do badania zespołów mózgowych. Jedno z badań, przeprowadzone przez Pana i in., wykorzystało tę metodę do badania rozwoju sieci neuronalnych. Autorzy wykorzystali ludzkie pluripotentne komórki macierzyste (hPSC) z fibroblastów napletka14, które najpierw zostały oznaczone wirusowo, a następnie hodowane w celu uzyskania assembloidów. Następnie assembloidy zostały przyklejone do płyt MEA i zarejestrowano14. Co ważne, ponieważ assembloidy mogły być stabilizowane, rejestrowane i poddawane eksperymentom farmakologicznym przez około 50 dni, ten paradygmat mógł być wykorzystywany do analizy leków terapeutycznych w leczeniu padaczki związanej z NDD. Rzeczywiście, to podejście mogłoby być stosowane do testowania wszelkich NDD, w których znane są lub podejrzewane są zmiany właściwości sieciowych neuronów14.

Wnioski

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NDD mogą być niszczycielskimi zaburzeniami, mają niewiele ukierunkowanych terapii i brak lekarstwa. Rzeczywiście, większość terapii ma na celu łagodzenie objawów choroby (np. leki przeciwpadaczkowe w padaczce). Jednak najnowsze postępy technologiczne doprowadziły do powstania nowych technik edycji genów, testów i systemów modelowych, które pozwalają naukowcom badać przyczyny NDD (Rysunek 1). Niniejszy przegląd szczegółowo przedstawia niektóre z wiodących podejść w poszukiwaniu nowych metod leczenia NDD i powiązanych patologii. Techniki edycji genów pozwolą badaczom bezpośrednio ukierunkować mutacje, aby lepiej zrozumieć mechanizmy choroby i potencjalnie leczyć pacjentów precyzyjną terapią genową. Nowatorskie testy umożliwiają szybką funkcjonalną klasyfikację wariantów genetycznych, a modele komórek macierzystych pozwolą naukowcom zrozumieć wczesne mechanizmy rozwojowe napędzające NDD oraz przetestować nowe terapie. Techniki opisane w tym przeglądzie stanowią fundament, na którym można prowadzić przyszłe badania w celu głębszego zrozumienia mechanizmów NDD oraz opracowania nowych metod klinicznych ich leczenia. W miarę jak dziedzina się rozwija, przyszłe badania powinny integrować techniki takie jak badania prenatalne, terapie płodowe, obrazowanie o wysokiej zawartości oraz farmakogenomika z tymi opisanymi w tym przeglądzie.

figure-results-1
Rysunek 1: Podsumowanie kluczowych mocnych i słabych stron podejść technicznych.Metody opisane w artykule i przedstawione w kolekcjach metod towarzyszących są podsumowane. Szczegółowo opisano główne mocne i słabe strony każdej techniki. Kluczowy odnośnik dla każdej techniki znajduje się w kolumnie metody. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Środki zapewniła NIH NINDS RO1NS131223 PHI. Rysunek 1 został przygotowany przy użyciu BioRender.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global report on children with developmental disabilities. , https://www.unicef.org/media/145016/file/Global-report-on-children-with-developmental-disabilities-2023.pdf (2023).
  2. Martínez De Lagrán, M., Bascón-Cardozo, K., Dierssen, M. Neurodevelopmental disorders: 2024 update. Free Neuropathol. 20, (2024).
  3. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431, 931-945 (2004).
  4. Diagnostic and statistical manual of mental disorders. , 5th ed, American Psychiatric Association. (2013).
  5. Jolly, L. A., Kumar, R., Penzes, P., Piper, M., Gecz, J. The DUB club: Deubiquitinating enzymes and neurodevelopmental disorders. Biol Psychiatry. 92, 614-625 (2022).
  6. Clague, M. J., Urbé, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20, 338-352 (2019).
  7. Arslan, A., Öz, P. Identification and classification of position-specific GABAA receptor subunit missense variants for their role in hippocampal pyramidal neurons. J Vis Exp. , e67833(2025).
  8. Cabré-Romans, J. J., Cuella-Martin, R. CRISPR-dependent base editing as a therapeutic strategy for rare monogenic disorders. Front Genome Ed. , 7(2025).
  9. Zhang, F., Wen, Y., Guo, X. CRISPR/Cas9 for genome editing: Progress, implications and challenges. Hum Mol Genet. 23, R40-R46 (2014).
  10. Matuszek, Z., Brown, B. L., Yrigollen, C. M., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Current trends in gene therapy to treat inherited disorders of the brain. Mol Ther. 33, 1988-2014 (2025).
  11. Reddy, B. K., Annaiyappa, N., Bhattacharya, A., Chattarji, S., Pal, R. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cell-derived astrocytes lacking fragile X messenger ribonucleoprotein. J Vis Exp. (220), e68081(2025).
  12. Ren, B., Dunaevsky, A. Modeling neurodevelopmental and neuropsychiatric diseases with astrocytes derived from human-induced pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 22 (4), 1692(2021).
  13. Meng, X., et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).
  14. Pan, T., et al. A multi-electrode array platform for modeling epilepsy using human pluripotent stem cell-derived brain assembloids. J Vis Exp. (211), e67396(2024).
  15. Wu, S. R., Nowakowski, T. J. Exploring human brain development and disease using assembloids. Neuron. 113 (8), 1133-1150 (2025).
  16. Sharma, V., Chhawari, H., Joshi, P., Nehra, S., Singhal, N. In vitro modeling of Down syndrome neurogenesis using human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (217), e67382(2025).
  17. Lee, K. M., et al. The application of human pluripotent stem cells to model the neuronal and glial components of neurodevelopmental disorders. Mol Psychiatry. 25, 368-378 (2020).
  18. Sharma, S. D., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42, 112344(2023).
  19. Mojica, F. J. M., Garrett, R. A. Discovery and seminal developments in the CRISPR field. CRISPR-Cas systems: RNA-mediated adaptive immunity in bacteria and archaea. Barrangou, R., van der Oost, J. , 1-31 (2013).
  20. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  21. Enright, A. L., Heelan, W. J., Ward, R. D., Peters, J. M. CRISPRi functional genomics in bacteria and its application to medical and industrial research. Microbiol Mol Biol Rev. 88 (2), e00170-e00222 (2024).
  22. Kristof, A., et al. Engineering novel CRISPRi repressors for highly efficient mammalian gene regulation. Genome Biol. 26, 164(2025).
  23. Jaudon, F., Thalhammer, A., Zentilin, L., Cingolani, L. A. CRISPR-mediated activation of autism gene Itgb3 restores cortical network excitability via mGluR5 signaling. Mol Ther Nucleic Acids. 29, 462-480 (2022).
  24. Meng, X., et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).
  25. Teter, O. M., et al. CRISPRi-based screen of autism spectrum disorder risk genes in microglia uncovers roles of ADNP in microglia endocytosis and synaptic pruning. Mol Psychiatry. 30, 4176-4193 (2025).
  26. Liang, R., et al. Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells. Nat Biotechnol. 42, 1867-1875 (2024).
  27. Musunuru, K., et al. Patient-specific in vivo gene editing to treat a rare genetic disease. N Engl J Med. 392 (22), 2235-2243 (2025).
  28. Benezra, D., et al. Bilateral optic nerve abnormalities associated with a 4-10 chromosomal translocation. Ophthalmic Paed Gen. 5 (3), 151-154 (1985).
  29. Prasad, D., Shukla, P. A comprehensive review on neurodevelopmental disorders. 12, 5(2025).
  30. Pinheiro, J., Honavar, M. F. Focal cortical dysplasia: updates. Indian J Pathol Microbiol. 65, S189-S197 (2022).
  31. Pejhan, S., Rastegar, M. Role of DNA methyl-CpG-binding protein MeCP2 in Rett syndrome pathobiology and mechanism of disease. Biomolecules. 11 (1), 75(2021).
  32. Koch, I., et al. Measuring enzymatic activity of neurodevelopmental disorder-associated deubiquitylating enzymes via an in vitro ubiquitin chain cleavage assay. J Vis Exp. (211), e67367(2024).
  33. Chen, E., et al. Rates and classification of variants of uncertain significance in hereditary disease genetic testing. JAMA Netw Open. 6, e2339571(2023).
  34. Al Eissa,, et al. Reclassifying variations of unknown significance in diseases affecting Saudi Arabia's population reveal new associations. Front Genet. 14, 1250317(2023).
  35. Maljevic, S., et al. Spectrum of GABAA receptor variants in epilepsy. Curr Opin Neurol. 32 (2), 183-190 (2019).
  36. Brunklaus, A., et al. Gene variant effects across sodium channelopathies predict function and guide precision therapy. Brain. 145 (12), 4275-4286 (2022).
  37. Knox, A. T., et al. Genotype-function-phenotype correlations for SCN1A variants identified by clinical genetic testing. Ann Clin Transl Neurol. 12 (3), 499-511 (2025).
  38. Davakan, A., et al. Electrophysiological classification of CACNA1G gene variants associated with neurodevelopmental and neurological disorders. Front Pharmacol. 16, 1613072(2025).
  39. McCready, F. P., et al. Multielectrode arrays for functional phenotyping of neurons from induced pluripotent stem cell models of neurodevelopmental disorders. Biology. 11, 316(2022).
  40. The practice of patch clamping. Patch clamping. , 95-114 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Edycja gen wmodele kom rek macierzystychwalidacja wariant w genetycznychtesty molekularnetesty kom rkowezaburzenia spektrum autyzmuniepe nosprawno intelektualnaepilepsja

Powiązane artykuły