Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
† These authors contributed equally
To badanie przedstawia nieinwazyjną metodę in vivo wykorzystującą mikroskopię dwufotonową i generację drugiej harmoniki do długotrwałego monitorowania morfologii trzonu włosa, dynamiki melaniny i gęstości kolagenu w skórze przez cały cykl mieszków włosowych u myszy, zapewniając solidne ramy metodologiczne dla badań terapeutycznych nad wypadaniem włosów.
Tradycyjne oceny cyklu mieszków włosowych opierają się na inwazyjnych metodach histologicznych, ograniczając ciągłą obserwację wzdłużną. Założono, że nieinwazyjne obrazownie optyczne, szczególnie dwufotonowa fluorescencja pobudzona (TPEF) i generacja harmonicznej drugiej (SHG), mogą dokładnie śledzić i szacować in vivo dynamiczne zmiany w włosach, melaninie i kolagenie w wielu cyklach mieszków włosowych. Włosy myszy C57BL/6 były monitorowane in vivo podczas fazy anagen, katagen i telogen za pomocą dermatoskopii, fotografii i mikroskopii elektronowej. Szczególnie, TPEF pod ekscytacją 800 nm i obrazowanie były używane do szacowania dynamiki melaniny, podczas gdy SHG pod ekscytacją 950 nm był używany do obserwacji zmian kolagenu między mieszkami. Aby zapewnić dokładność, in vivo pomiary optyczne były zweryfikowane krzyżowo: dynamika melaniny została potwierdzona poprzez fotografię skóry dla ogólnego wyglądu tkanki i barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) dla ekspresji cebulki włosa, podczas gdy zmiany kolagenu zostały zweryfikowane poprzez ocenę gęstości i orientacji włókien za pomocą systemu polaryzacyjnego obrazu z kryształami ciekłymi na sekcjach barwionych czerwienią Syriusza. Wyniki obserwacji wykazały, że podczas fazy anagen średnica włosa i produkcja melaniny stopniowo wzrastały, co towarzyszyło znacznemu zmniejszeniu gęstości kolagenu między mieszkami. Podczas fazy katagen i telogen, poziomy melaniny stopniowo spadały, a gęstość kolagenu stopniowo wracała do poziomów wyjściowych. Ten projekt ustanawia zweryfikowaną, nieinwazyjną metodę in vivo dla oceny kompleksowych dynamiki mieszków włosowych, zapewniając solidną ramę eksperymentalną dla przedklinicznej oceny aktywnych substancji w leczeniu wypadania włosów.
Mieszki włosowe myszy C57BL/6 wykazują synchroniczność i regularność, co zapewnia wygodę eksperymentalną i sprawia, że są częstym modelem zwierzęcym do badań nad chorobami skóry1,2. Mieszki włosowe przechodzą w drugą fazę telogenu w siódmym tygodniu po urodzeniu myszy C57BL/63. W przypadku braku sztucznej interwencji faza telogenu utrzyma się do dwunastego tygodnia po urodzeniu4. Ten wydłużony okres telogenu jest częstym punktem czasowym wykorzystywanym w badaniach do synchronizacji cyklu wzrostu mieszków włosowych5. Po sztucznej depilacji myszy mieszki włosowe natychmiast zaczynają przechodzić w fazę anagen6.
Po wejściu w fazę wzrostu, komórki macierzyste w obszarze pęcherzyka proliferatują i różnicują się w warstwę zewnętrzną cebulki włosowej, rosnąc w dół, aby zwiększyć długość mieszka7. Podstawa trzonu włosa rozciąga się w górę, gdy mieszek się pogłębia8. Komórki macierzyste w cebulce ciągle różnicują się w trzon włosa i wewnętrzną warstwę cebulki9. Sekrecja kolagenu i melaniny w skórze również szybko zmienia się podczas fazy anagen10, odgrywając ważną rolę w rozwoju mieszków włosowych11,12. W badaniach dotyczących wypadania włosów sekrecja melaniny jest ogólnie oceniana na podstawie koloru skóry, co nie pozwala na precyzyjne ilościowe określenie13. Do tej pory badania nad kolagenem koncentrowały się głównie na rozwoju i starzeniu się, a nie na cyklicznej dynamice ilościowej.
Obecnie główną ograniczeniem w ocenie cykli mieszków włosowych i terapii regeneracyjnych jest poleganie na niszczących punktach końcowych histologicznych, co wymaga eutanazji różnych grup zwierząt w określonych punktach czasowych14. Uniemożliwia to ciągłe, długotrwałe śledzenie dokładnie tego samego mikrośrodowiska mieszkowego przez wiele cykli. Ponadto konwencjonalne techniki nieinwazyjne, takie jak dermatoskopia, nie mają wystarczającej penetracji tkankowej, aby wizualizować głębokie zmiany w mieszkach15, a makroskopijna obserwacja nie pozwala na precyzyjne ilościowe określenie melaniny, co sprawia, że melanino-deficytny korzeń włosa maczugowatego jest trudny do wykrycia podczas późnej regresji i fazy spoczynku16,17. Chociaż różne technologie optyczne poszerzyły długotrwałą obserwację in vivo18,19, takie jak polarymetria cieczy krystalicznych do oceny włókien kolagenu20,21, konfokalna mikroskopia skóry do obserwacji pigmentacji22,24 i tomografia optyczna koherencji do pomiaru grubości skóry25,26,27, mikroskopia multifotonowa oferuje unikalnie przekonujące rozwiązanie. Połączone zastosowanie dwufotonowej ekscytacji fluorescencji (TPEF) i generacji drugiej harmonicznej (SHG) zapewnia wyraźne zalety: umożliwia bezznacznikowe, wysokorozdzielcze optyczne przekroje głęboko w skórze właściwej, umożliwiając jednoczesne ilościowe in vivo określenie autofluorescencji melaniny i struktury włókien kolagenu bez stosowania zewnętrznych barwników28,29. W niniejszym badaniu autorzy hipotetyzują, że nieinwazyjne obrazy TPEF/SHG mogą dynamicznie i precyzyjnie ilościowo określić te zmiany strukturalne z dokładnością porównywalną z inwazyjnymi złotymi standardami histologicznymi. Rozwiązując ten kluczowy problem naukowy, niniejsze badanie ma na celu ustanowienie solidnej, długotrwałej ramy obrazu in vivo na potrzeby nieinwazyjnej oceny środków terapeutycznych przeciw wypadaniu włosów30.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie metody zakładające stosowanie podmiotów kręgowych były wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Wszystkie procedury eksperymentów na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Zastosowania Instytucjonalnego Centrum Badań Eksperymentalnych Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (Kod protokołu: ERCCACMS11-2210-03). Wszystkie materiały użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
Przygotowanie zwierząt i obserwacja makroskopowa
Samce myszy C57BL/6, w wieku 6–7 tygodni i ważące 20 ± 2 g, zostały uzyskane od komercyjnego dostawcy. Myszy zostały podzielone na grupę analizy histologicznej (n = 39) i ciągłą grupę in vivo obrazowania (n = 3). Sierść grzbietowa wszystkich myszy została usunięta, aby zsynchronizować cykl roślinności włosów. Stan wzrostu włosów był sprawdzany co drugi dzień od dnia 2 do dnia 26 po usunięciu siersci. Grzbiety myszy z grupy obrazowania były fotografowane co drugi dzień do dnia 26 za pomocą kamery. Utrzymano stałą odległość ogniskową 15 cm, a aby dokładnie udokumentować makroskopowe zmiany, zapewniono konsekwentne, standardowe warunki oświetlenia laboratoryjnego.
In vivo TPEF i SHG obrazowanie
Sesje obrazowania przeprowadzano w dniach 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 i 26 po usunięciu siersci. Myszy zostały znieczulone za pomocą izofluranu. Całkowita utrata świadomości została potwierdzona poprzez obserwację częstości oddechów i testowanie odruchu stopy za pomocą delikatnego szczypnięcia palca. Znieczulony mysz został zamocowany na stole mikroskopu dwufotonowego. Do obrazowania TPEF melaniny mikroskop został wyposażony w obiektyw 25x do zanurzenia w wodzie (apertura numeryczna = 1,05), a długość fali wzbudzającej została ustalona na 800 nm. Przeprowadzono skan z-stack autofluorescencji melaniny, osiągając całkowitą głębokość skanowania 45 µm. Wielkość kroku została ustalona na 2 µm, rozdzielczość obrazu na 1024 × 1024 pikseli, a szybkość akwizycji na 4 µs/piksel. Do obrazowania SHG włókien kolagenowych długość fali wzbudzającej została ustalona na 950 nm przy użyciu tego samego obiektywu 25x do zanurzenia w wodzie. Inicjowano skan z-stack od górnej powierzchni dermy do całkowitej głębokości skanowania 45 µm, utrzymując wielkość kroku 2 µm, rozdzielczość obrazu 1024 × 1024 pikseli i szybkość akwizycji 4 µs/piksel. Po zakończeniu sesji obrazowania mysz została ostrożnie usunięta ze stołu mikroskopu, izofluran został przerwany, a mysz została umieszczona na podgrzewanym podkładzie, aż całkowicie odzyska świadomość przed powrotem do klatki domowej.
Pobieranie tkanek i przetwarzanie histologiczne
Wydzielona, oddzielna grupa trzech myszy z grupy histologicznej była zwalczana co drugi dzień od dnia 2 do dnia 26, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, upewniając się, że żadna mysz nie była ponownie używana do długotrwałego pobierania próbek histologicznych. Precyzyjnie pośrodku przecięcia linii poziomych i pionowych na grzbiecie każdej myszy, chirurgicznie wycięto próbkę tkanki skóry pełnej grubości o wymiarach 2 cm × 2 cm. Wycięta tkanka skóry została położona płasko na twardej karcie, aby zapobiec zwijaniu się krawędzi i natychmiast zanurzona w probówce zawierającej 4% paraformaldehyd. Utkane tkanki zostały odwodnione i wkomponowane, aby przygotować 6 µm grube sekcje parafinowe. Przed odparafinowaniem, sekcje parafinowe zostały podgrzewane na grzejnicy przez 120 min. Sekcje zostały wybarwione hematoksyliną i eozyną (HE) oraz Czerwienią Syriusza za pomocą standardowych zestawów barwników zgodnie z instrukcjami producenta. Sekcje zostały zamontowane w żywicy neutralnej i obserwowane za pomocą mikroskopu odwróconego. Do obrazowania w polaryzatorze ciekłokrystalicznym, odparafinowane i zabarwione Czerwienią Syriusza sekcje zostały sfotografowane pod mikroskopem polaryzacyjnym. Zjednoczony kąt polaryzatora został ustalony poprzez skrzyżowanie polaryzatora i analizatora pod kątem dokładnie 90°, aby osiągnąć maksymalnie ciemne tło (stan wygaszenia), a ten specyficzny kąt był konsekwentnie blokowany dla wszystkich kolejnych uchwytów obrazu.
In vivo dermoskopia i mikroskopia elektronowa trzonków włosów
Przed wyrywaniem, obszar wzrostu siersci grzbietowej był ewaluowany in vivo za pomocą klinickiego dermatoskopu o powiększeniu 20x. Regeneracja włosów została zliczona za pomocą standardowego systemu punktacji 0–3 na podstawie pojawienia się i gęstości trzonków włosów (0 = żaden widoczny włos; 1 = rzadkie pojawianie się włosów; 2 = umiarkowanie gęsta gęstość włosów; 3 = gęsta, pełna pokrywa włosowa). Aby zapewnić niezaangażowane pobieranie próbek,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Obserwacja sierści myszy
Obserwacje fotograficzne wzrostu sierści mysiej przedstawiono na Rysunku 1A. Pojawianie się włosów przez powierzchnię skóry rozpoczęło się w 10. dniu, a dalszy rozwój utrzymywał się między 12. a 16. dniem (p < 0,05). Pokrycie sierścią osiągnęło następnie plateau od 18. do 26. dnia (p > 0,05) (Rysunek 1B). Ponadto dermoskopia umożliwiła nieinwazyjną obserwację dynamiki wzrostu włosów in viv...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Model myszy C57BL/6 został wybrany, ponieważ jego druga faza telogenu trwale trwa od 7. do 12. tygodnia. Ponieważ 26-dniowe okno obserwacji wpada w całości w tę statyczną fazę, głębokie dynamiczne zmiany obserwowane są wyraźnie napędzane przez progresję cyklu indukowaną depilacją, całkowicie wykluczając naturalne fluktuacje związane z wiekiem. Gdy depilacja jest przeprowadzana podczas fazy telogenu, mieszki włosowe natychmiast wchodzą w fazę anagen. Według wiedzy autora, niniejsze badanie przedstawia nową nieinwazyjną me...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują, że nie mają znanych konkurencyjnych interesów finansowych ani osobistych relacji, które mogłyby wpłynąć na prace opisane w niniejszym artykule. Preprint tego artykułu jest dostępny w publicznym repozytorium BioRxiv w następującym odniesieniu42.
Praca ta była wspierana przez China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (ID: CI2025C001), Scientific and Technological Innovation Project of the China Academy of Chinese Medical Sciences (Grant No. NLTS2025004) oraz fundusze na badania podstawowe dla centralnych instytutów badawczych dobroczynnych (Grant No. JJPY2025002).
Wkład autorów: Konceptualizacja, Gaiying He i Yi Wang; badania, Menghua Liu, Xiaoyu Wang i Fenglong Wang; kuracja danych, Menghua Liu; pisanie—przygotowanie oryginalnego projektu, Menghua Liu; pozyskiwanie funduszy, Yi Wang. Wszyscy autorzy przeczytali i wyrazili zgodę na opublikowaną wersję rękopisu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Myszy C57BL/6, | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | SCXK (Jing) 2021-0006 | Używane w modelach zwierzęcych |
| Aparat cyfrowy DSLR | Canon | EOS 80D | Używany do robienia zdjęć grzbietów myszy |
| Zestaw do barwienia H&E | LtdSolarbio Science & Technology Co. | G1120 | Używany do barwienia przekrojów tkankowych |
| Mikroskop odwrócony | Olympus | BX51 | Używany do robienia zdjęć |
| Izofluran | RWD Life Science Co. | R510-22-16 | Używany do znieczulania zwierząt |
| Mai Tai DeepSee | SpectraPhysics | Mai Tai HP | Używany do TPEF i SHG w obrazowaniu in vivo |
| Medyczny elektronik Dermatoskop | China Chuanghong Medical Technology Co. | CH-DSIS-2000 | Używany do obrazowania in vivo kolorów skóry |
| Mikroskop świetlny spolaryzowanego światła | Olympus | BX51-P | Używany do obrazowania barwienia Sirius Red |
| Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) | Hitachi High-Tech Corporation | SU8010 | Do obserwacji ultrastruktury trzonków włosowych |
| Zestaw do barwienia Sirius Red | Solarbio | G1472 | Do barwienia włókien kolagenowych |
| Maszynka do znieczulania małych zwierząt | RWD Life Science Co. | R500 | Używany do znieczulania zwierząt |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.