Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Summary

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Abstract

Mikroskopia superrozdzielcza (SRM) pokonuje ograniczenie dyfrakcyjne konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, umożliwiając wizualizację struktur podkomórkowych na skalę nano. Jednak powszechne stosowanie technik takich jak mikroskopia stymulowanego redukcji emisji (STED), fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna (PALM) / stochastyczna mikroskopia optyczna rekonstrukcji (STORM) oraz mikroskopia iluminacji strukturalnej (SIM) może być utrudnione przez czynniki takie jak wysoka fototoksyczność, specjalistyczne przygotowanie próbek czy złożone operacje. Przedstawiamy tutaj kompleksowy protokół wykorzystujący laserową platformę konfokalną zintegrowaną z multipleksowanym detektorem superrozdzielczości. System ten, w połączeniu z przetwarzaniem obliczeniowym, umożliwia proste przejście między obrazowaniem konfokalnym a superrozdzielczym w ramach tego samego workflow. Protokół zapewnia przyjazne dla użytkownika podejście do szybkiego, wysokorozdzielczego i niskofototoksycznego obrazowania. Szczegółowa metoda obejmuje możliwości obrazowania multimodalnego, w tym fluorescencję wielokolorową, różnicowy kontrast interferencyjny (DIC), trójwymiarową rekonstrukcję stosu Z, obrazowanie w żywych komórkach poklatkowych w czasie poklatkowym, płytkowanie dużych obszarów oraz różne tryby superrozdzielczości oferowane przez detektor multipleksowany matrycą. Systematyczne porównania pokazują, że tryby superrozdzielczości osiągają rozdzielczość boczną około 120 nm, co stanowi około dwukrotną poprawę względem limitu dyfrakcyjnego konwencjonalnej mikroskopii szerokokątnej oraz znaczącą poprawę zarówno rozdzielczości, jak i stosunku sygnału do szumu (4-8 razy) w porównaniu ze standardową pracą konfokalną na tej samej platformie. Dyskusja obejmuje również kluczowe kwestie modelu wspólnego zarządzania zasobami, niezbędnego do wspierania zrównoważonego funkcjonowania tej technologii. Ten zintegrowany przewodnik stanowi cenne źródło zarówno dla nowych, jak i doświadczonych badaczy oraz kierowników obiektów, dążących do przyjęcia i maksymalizacji potencjału tej dostępnej formy zaawansowanego obrazowania w badaniach nauk przyrodniczych.

Introduction

Wizualizacja dynamicznych struktur podkomórkowych jest fundamentalna dla rozwoju badań w naukach przyrodniczych. Jednak rozdzielczość tradycyjnej mikroskopii optycznej jest ograniczona dyfrakcją do około 200 nm bocznie, co ogranicza jej zdolność do rozróżniania dynamicznych procesów podkomórkowych. Aby pokonać tę barierę, opracowano różne techniki superrozdzielczości. Jednak techniki takie jak mikroskopia STED, PALM/STORM i SIM często stanowią bariery dla szerokiego przyjęcia w środowiskach wieloużytkownikowych, w tym wysoką fototoksyczność, potrzebę specjalistycznych fluoroforów lub przygotowania próbek, złożone procedury wyrównania czy intensywne przetwarzanie obliczeniowe ^1,2,3.

W tym kontekście systemy mikroskopu konfokalnego wyposażone w multipleksowany detektor matrycowy stanowią atrakcyjną alternatywę, umożliwiając obrazowanie w superrozdzielczości poprzez wykrywanie wielopikselowe i reassignment obliczeniowe, co znacząco obniża próg techniczny⁴. Podejście to wykorzystuje 32-elementową matrycę detektorów z foszenikiem arsenku galu (GaAsP) do zbierania większej liczby fotonów z każdego punktu skanowania. Kolejne inteligentne algorytmy dekonwolucyjne przydzielają te informacje, skutecznie zmniejszając objętość detekcji. Proces ten osiąga rozdzielczość przestrzenną około 120 nm bocznie i 350 nm osiowo, co reprezentuje około 2x poprawę w stosunku do limitu dyfrakcyjnego mikroskopii szerokopolnej i daje 4-8-krotny wzrost stosunku sygnału do szumu w porównaniu ze standardowym trybem konognistycznym tego samego instrumentu ^4,5,6. To unikalne połączenie zwiększonej rozdzielczości, lepszej jakości sygnału oraz kompatybilności z powszechnymi fluorescencyjnymi etykietami i protokołami stanowi jego główną zaletę w szerokim zastosowaniu.

W konsekwencji ta forma dostępnej mikroskopii superrozdzielczej znalazła szerokie zastosowanie w badaniach nauk przyrodniczych, umożliwiając szczegółowe badania morfologii organelli, dynamiki cytoszkieletu, interakcji wirus-gospodarz oraz współlokalizacji molekularnej zarówno w komórkach stałych, jak i żywych ^7,8. Jego względna łagodność sprawia, że jest szczególnie odpowiedni do długich obserwacji próbek żywych w czasie poklatkowym.

Integracja tak zaawansowanych systemów z kluczowymi obiektami jest kluczowa dla demokratyzacji dostępu, ale ich trwała i skuteczna eksploatacja stawia przed sobą szczególne wyzwania. W instytucjach podstawowych, takich jak Szkoła Medyczna Uniwersytetu Zhejiang, optymalna wydajność i wpływ w kluczowym stopniu zależą od trzech filarów: (1) ustandaryzowanych i powtarzalnych protokołów obrazowania, (2) rygorystycznej rutynowej konserwacji oraz (3) skutecznych ram zarządzania zapewniających współdzielony dostęp. Chociaż istnieją cenne zasoby dotyczące konkretnych aspektów, takich jak metody obrazowania dla wcześniejszych systemów⁹czy ogólne zasady zarządzania obiektami^10,11, obecnie brakuje kompleksowego przewodnika integrującego szczegółowe, powtarzalne protokoły dla nowoczesnych multipleksowanych platform detektorów z sprawdzonym modelem zarządzania współzasobami. Ten artykuł protokołu ma na celu zniwelowanie tej luki.

Głównym celem jest zapewnienie kompleksowego, krok po kroku przewodnika po skutecznym wdrożeniu i wykorzystaniu systemu konfokalnego z detektorem multipleksowanym matrycowym do obrazowania o nadrozdzielczości w środowisku współdzielonych zasobów. Jest przeznaczony dla dwóch głównych odbiorców: badaczy wymagających rozdzielczości przekraczającej konwencjonalne limity konfokalne (~250-300 nm), ale dla których kluczowa jest kompatybilność z żywymi komórkami, łatwość obsługi i przepustowość; oraz menedżerowie obiektów tworzący lub optymalizujący taką usługę. Systematycznie szczegółowo przedstawiamy konfigurację systemu, protokoły obrazowania multimodalnego (obejmujące tryby wielokolorowe, 3D, live-cell, tiling i super-resolution) oraz sprawdzony model współdzielonego zarządzania. Ten zintegrowany przewodnik służy jako źródło maksymalizacji potencjału i dostępności tej potężnej metody obrazowania.

Protocol

Wszystkie eksperymenty z udziałem próbek biologicznych przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i przepisami Głównych Obiektów Wydziału Medycznego Uniwersytetu Zhejiang i zatwierdzono je Komitet ds. Bezpieczeństwa Instytucjonalnego (Certyfikat Zatwierdzenia nr BSL20235710079).

UWAGA: Wszystkie procedury związane z hodowlami komórek muszą być wykonywane w warunkach sterylnych w szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy II, chyba że zaznaczono inaczej. Protokół ten zakłada, że system mikroskopu jest zainstalowany, a moc lasera skalibrowana. Szczegółowe specyfikacje i zalecani dostawcy kluczowych odczynników, materiałów eksploatacyjnych i sprzętu (np. talerze obrazujące, szkło osłonowe, nośnik montażowy) są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie próbki

UWAGA: Udane obrazowanie superrozdzielczości zaczyna się od optymalnego przygotowania próbki. Zastosowanie wysokiej jakości szkielistych anten obrazujących o grubości 1,5 mm (0,17 mm) jest niezbędne, aby dopasować się do kołnierza korekcyjnego obiektywów immersyjnych o wysokiej zawartości oleju i uniknąć aberracji sferycznej. Wszystkie kroki wirowania powinny być wykonywane przy 300 × g przez 5 minut, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowanie próbki stałej komórki do wielokolorowego obrazowania superrozdzielczości (np. komórki COS7)
   UWAGA: Protokół ten opisuje immunobarwienie mikrotubul (Alexa Fluor 568) i mitochondriów (Alexa Fluor 488), z użyciem jądrowego kontrastu 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI), jak pokazano na Rysunku 1.
   1. Hodowanie komórek COS7 w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) Dulbecco z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydła (FBS) w temperaturze 37°C w inkubatorze nawilżającym 5%_CO2 .
   2. Komórki płytowe na szklanym dnie o średnicy 35 mm z gęstością 1,0 × 10^{5 komórek} na antenę. Pozwól komórkom przylgać i rosnąć do 60-70% konfluencji (zazwyczaj 24 godziny).
   3. Aspiruj podłoże hodowlane i delikatnie umyj komórki podgrzewaną (37°C) solą fosforanową (PBS). Ustabilizuj komórki, dodając 1 ml 4% paradehydu (PFA) do PBS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   4. Aspiruj roztwór PFA (poddaj się jako odpady niebezpieczne). Umyj komórki trzy razy 2 mL PBS, inkubując przez 5 minut przy każdym płukaniu z delikatnym kołysaniem.
   5. Permeabilizacja i blokowanie: Inkubuj komórki 1 mL buforu permeabilizacyjnego/blokującego (0,1% v/v) Triton X-100, 1% (w/v) bérijnej albuminy surowicy (BSA) w PBS) przez 30 minut w RT.
   6. Inkubacja przeciwciał pierwotnych: Inkubować komórki mieszaniną przeciwciał pierwotnych przeciwko α-tubulinie (myszy monoklonalna) i TOMM20 (królicza poliklonalna) w buforze rozcieńczającym przeciwciał (1% BSA w PBS) w temperaturze 4°C przez noc (lub 1-2 godziny w RT). Użyj 300 μL na naczynie, aby pokryć powierzchnię szkła.
   7. Mycie: Ostrożnie zasysaj roztwór przeciwciał podstawowych. Przemyj komórki trzy razy 2 mL PBS zawierającego 0,05% Tween-20 (PBST), 5 minut na każde przemycie.
   8. Przeciwciała wtórne i barwienie jądrowe: Przygotuj mieszankę fluorescencjowych przeciwciał wtórnych i DAPI w buforze rozcieńczającym przeciwciała (1% BSA/PBS), chronionym przed światłem.
      1. Użyj osiołowego anty-mysich IgG spójiętego z Alexa Fluor 568 (1:500) oraz osiołowego antykróliczego IgG spójiętego z Alexa Fluor 488 (1:500).
      2. Uwzględnij DAPI w końcowym stężeniu 1 μg/mL do barwienia jądrowego. Należy nałożyć 300 μL tej mieszaniny na komórki i inkubować przez 1 godzinę w stanie RT w ciemności.
   9. Końcowe mycie: Aspiruj roztwór barwiący i myj komórki trzy razy 2 mL PBS, 5 minut na każde mycie.
   10. Zastosowanie medium mocujące: Ostrożnie zasysaj PBS z talerza obrazowania, pozostawiając próbkę lekko wilgotną. Natychmiast nałóż niewielką kroplę (~20 μL) utwardzonego medium anty-fade mocującego (np. ProLong Gold) bezpośrednio na obszar szklanego dna.
   11. Cover and cure: Delikatnie opuszcz wysokoprecyzyjne szkło #1.5 na kroplę, unikając powstawania bąbelków. Pozwól montantowi utwardzić się przez noc w stanie RT w ciemności lub przez 2-4 godziny w 37°C, jeśli wymagane jest szybsze utwardzanie.
2. Przygotowanie próbki żywych komórek do obrazowania poklatkowego (np. komórki Hep3B wyrażające fluorescencyjną białkową markę).
   UWAGA: Protokół ten opisuje obrazowanie komórek Hep3B stabilnie wyrażających fluorescencyjne białko (np. EGFP) skierowane do mitochondriów.
   1. Hoduj komórki Hep3B w minimalnym nośniku niezbędnym (MEM) z 10% FBS. Komórki płytowe na obrazowce o szklanym dnie 35 mm (1,5 szklanego szkła pokrywowego) o gęstości 0,8 × 10⁵komórki na talerz. Pozwól komórkom rosnąć do około 70-80% konfluencji dla optymalnego zdrowia i gęstości obrazowania (zazwyczaj 18-24 godziny).
   2. Przygotowanie do obrazowania: W dniu obrazowania delikatnie zastąpić standardowe medium hodowlane 2 mL pre-równoważonego (37°C, 5% CO₂ ) przez co najmniej 30 minut, pośrednika obrazowania o niskiej fluorescencji bez fenolu i czerwieni fenolowej, uzupełnionego o 10% FBS oraz, jeśli jest to konieczne, 25 mM buforu HEPES do stabilizacji pH poza inkubatorem_CO2 . Minimalizuje to fluorescencję tła i utrzymuje fizjologiczne pH podczas obrazowania.
      UWAGA: Pozostawić talerz do aklimatyzacji na podgrzanym stopniu mikroskopu wewnątrz komory środowiskowej przez co najmniej 30-45 minut przed rozpoczęciem pobierania w trybie poklatkowym, aby zapewnić stabilizację temperatury, ostrości i stanu komórek.

2. Uruchamianie, inicjalizacja i podstawowe wyrównywanie systemu mikroskopowego

1. Zasilanie na główną jednostkę mikroskopu, moduł wystrzelenia lasera (zawierający lasery półprzewodnikowe o zasięgu 405, 488, 561 i 640 nm), źródło światła LED oraz komputer sterujący.
   1. Pozwól laserom się rozgrzać i ustabilizować przez co najmniej 15-20 minut. Jest to kluczowe dla stabilnej mocy lasera, zwłaszcza w eksperymentach ilościowych lub poklatkowych.
2. Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu.
3. Z głównego interfejsu wybierz 'Mikroskop' > 'Inicjalizuj' lub przejdź za kreatorem uruchamiania oprogramowania.
4. W oprogramowaniu przejdź do panelu 'Akwizycja'. W rozwijanym menu obiektywu obiektywu wybierz 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil ' lub odpowiedni obiektyw do eksperymentu.
5. Nałóż kroplę oleju immersyjnego (współczynnik załamania = 1,518) bezpośrednio na przednią soczewkę obiektywu. Unikaj wprowadzania bąbelków.
6. Do obrazowania żywymi komórkami aktywuj komorę środowiskową oraz system stabilizacji aktywnej ostrości (np. 'Definite Focus' >) co najmniej 45-60 minut przed obrazowaniem. Ustaw temperaturę na 37°C, CO₂ do 5%, a wilgotność na >60%. Pozwól systemowi się ustabilizować. Sprawdź stabilność za pomocą czujników komory.
7. System jest obecnie gotowy do ładowania próbek i konfiguracji parametrów obrazowania.

3. Wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne

1. Umieść przygotowaną próbkę na scenie mikroskopu. Ostrożnie podnieś scenę, aż szkło pokrywowe styka się z olejem immersyjnym.
2. W oprogramowaniu do przejęcia przejdź do zakładki 'Akwizycja' i wybierz Utwórz nowy eksperyment.
3. Dodaj wiele ścieżek obrazowania (kanałów) odpowiadających używanym fluoroforom. Dla przykładu na Rysunku 1 skonfiguruj:
   1. Ścieżka 1 (DAPI): Wzbudzenie 405 nm, detekcja 410-480 nm.
   2. Ścieżka 2 (Alexa Fluor 488): Wzbudzenie 488 nm, detekcja 495-550 nm.
   3. Ścieżka 3 (Alexa Fluor 568): Wzbudzenie 561 nm, detekcja 570-620 nm.
4. Dla każdego toru ustaw średnicę otworku konfokalnego na 1 jednostkę Airy'ego (1 AU).
5. Optymalizuj moc lasera i wzmocnienie detektora dla każdego kanału, stosując następujący proces iteracyjny:
   1. Wybierz pierwszy kanał (np. DAPI). Przełącz się na tryb skanowania "Live".
   2. Ustaw początkową moc lasera na niską wartość (np. 0,1-0,5%). Ustaw wzmocnienie detektora na umiarkowany poziom w jego zakresie liniowym (np. 700 V dla PMT GaAsP).
   3. Stopniowo zwiększ moc lasera, aż struktury docelowe będą wyraźnie widoczne ponad tłem na obrazie na żywo.
   4. Otwórz wyświetlacz histogramu . Upewnij się, że nie ma nasycenia pikseli (histogram nie jest nałożony na prawej krawędzi). Zmniejsz moc lasera, jeśli to konieczne.
   5. Reguluj wzmocnienie detektora , aby uzyskać jasny, niskoszumowy obraz. Unikaj wzmocnień powyżej 850 V, aby zapobiec nadmiernemu hałasowi.
   6. Powtórz kroki 3.5.1-3.5.5 dla wszystkich pozostałych kanałów fluorescencyjnych.
      UWAGA: Zrównoważ moc lasera, wzmocnienie i czas zatrzymania pikseli, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu przy jednoczesnym minimalizowaniu uszkodzeń fotograficznych. W przypadku ogniw żywych priorytetowo traktuj niższą energię i krótszy czas oczekiwania.
6. Ustaw format obrazu (liczbę pikseli) i czas zatrzymywania pikseli.
   1. Ustaw rozmiar piksela spełniający kryterium Nyquista: rozmiar piksela ≤(rozdzielczość / 2,3). Dla standardowego obrazowania konfokalnego (rozdzielczość boczna ~250 nm) ustaw rozmiar piksela ≤108 nm.
   2. Użyj przycisku 'Nyquist ', aby automatycznie to obliczyć, jeśli jest dostępne.
   3. Ustaw czas zatrzymania pikseli. Dla wyższego stosunku sygnału do szumu należy użyć dłuższego czasu zatrzymania (np. 1,0-2,0 μs), lub krótszego czasu zatrzymania (np. 0,5-1,0 μs) dla szybszego obrazowania.
7. Upewnij się, że tryb 'Sequential Scan' jest wybrany między ścieżkami, aby zminimalizować przesłuchy.
8. Kliknij 'Start', aby uzyskać pojedynczy obraz. Zapisz obraz z odpowiednimi metadanymi.

4. Obrazowanie różnicowym kontrastem interferencyjnym (DIC)

1. W zakładce 'Akwizycja' oprogramowania akwizycyjnego wybierz 'Dodaj nowy kanał ' i skonfiguruj go do wykrywania światła przesyłanego.
2. Wybierz odpowiedni detektor światła transmisyjnego (często nazywany T-PMT (lampa fotopowielacza światła przepuszczonego) lub ESID (detektor interfejsu zewnętrznego systemu) w oprogramowaniu).
3. Konfiguracja pryzmatu i polaryzatora DIC:
   1. Z panelu sterowania sprzętowego lub interfejsu programowego wybierz pryzmat DIC dopasowany do twojego celu (np. 'DIC III' dla obiektywu 63x).
   2. Włóż wybrany pryzmat w ścieżkę światła.
4. Reguluj polaryzator i suwak DIC dla optymalnego kontrastu:
   1. Obróć analizator (polaryzator), aż tło na obrazie 'Live' będzie ciemne lub bardzo przyciemnione.
   2. Podczas obserwacji obrazu na żywo powoli dostosowuj pozycję suwaka DIC w małych krokach.
   3. Optymalizuj tak, aż cechy komórkowe (np. błony, jądra) pojawią się z wyraźnym, rzucanym cieniami, pseudo-trójwymiarowym reliefem na neutralnym szarym tle.
5. Ustaw długość fali oświetlenia dla DIC na wartość w zakresie widzialnym (np. 488 nm lub 546 nm).
6. Dostosuj intensywność transmisji (moc lasera lub lampy) oraz wzmocnienie detektora dla kanału światła transmitowanego, aby uzyskać wyraźny obraz bez nasycenia.
7. Zdobądź obraz DIC.

5. Pozyskiwanie stosu Z do rekonstrukcji trójwymiarowej

UWAGA: Przed zdefiniowaniem stosu Z, skonfiguruj wszystkie parametry obrazowania (moc lasera, wzmocnienie, otwórka, rozmiar piksela) na jednej, optymalnej płaszczyźnie ogniskowej, zgodnie z Sekcją 3. Zapewnia to spójne ustawienia we wszystkich sekcjach optycznych.

1. W zakładce 'Akwizycja' wybierz tryb 'Z-stack'.
2. Zdefiniuj objętość, która jest przedmiotem zainteresowania:
   1. Korzystając z szybkiego skanowania na żywo, skup się na najwyższej budowie zainteresowania.
   2. Kliknij 'Set First' (lub 'Top').
   3. Ostrożnie skup się na najniższej budowie zainteresowania.
   4. Kliknij 'Set Last' (lub 'Bottom'). Oprogramowanie wyświetli całkowitą głębokość.
3. Ustaw rozmiar kroku Z, aby spełniał kryterium próbkowania Nyquista w kierunku osiowym. (zazwyczaj d_r/2.3, gdzie d_r to rozdzielczość osiowa). Dla obiektywu olejowego 63x/1,4 NA użyj 0,3-0,4 μm.
4. Alternatywnie, można użyć przycisku "Optymalny" lub "Nyquist" w oprogramowaniu, aby automatycznie obliczyć rozmiar kroku.
5. Konfiguruj parametry obrazowania (moc lasera, wzmocnienie, otwórek na dziurkę = 1 AU) dla każdego kanału, zgodnie z opisem w Sekcji 3. Dla sygnałów słabych rozważ niewielkie zwiększenie mocy lub wzmocnienia lasera w porównaniu do pojedynczego obrazu 2D.
6. Rozpocznij akwizycję, aby zebrać cały stos obrazów.
   UWAGA: Całkowity czas akwizycji = (Czas klatki z pojedynczego fragmentu) × (Liczba fragmentów)
   Planuj odpowiednio, zwłaszcza przy próbkach na żywo.
7. Rekonstrukcja i wizualizacja 3D:
   1. Użyj modułu "Processing" (np. funkcji projekcji 3D) lub otwórz stos obrazów w dedykowanym oprogramowaniu, takim jak ImageJ/Fiji.
   2. Generuj projekcje maksymalnej intensywności (MIP), aby zobaczyć wszystkie sygnały ostrości w jednym obrazie 2D.
   3. Aby uzyskać prawdziwą reprezentację 3D, zastosuj renderowanie objętościowe. Dostosowuj jasność, krycie i oświetlenie w razie potrzeby.
   4. Generuj widoki ortogonalne (przekroje XZ i YZ) do inspekcji zasięgu osiowego i rejestracji.

6. Obrazowanie poklatkowe dla żywych komórek

1. Przygotuj żywe komórki zgodnie z Sekcją 1.2. i zamontować antenę na podgrzewanej stóle mikroskopu w komorze środowiskowej.
2. Pozwól próbce aklimatyzować się przez co najmniej 45-60 minut, zgodnie z Sekcją 2.6, aby zapewnić stabilizację.
3. Przejdź do pola widzenia z zdrowymi, dobrze rozmieszczonymi komórkami i uzyskaj pojedyncze wysokiej jakości zdjęcie, korzystając z parametrów zoptymalizowanych zgodnie z Sekcją 3.5.
4. Włącz aktywny system stabilizacji ostrości (np. Definite Focus lub podobny). Jest to nie do negocjacji w długoterminowych eksperymentach kompensujących dryf termiczny.
5. W zakładce 'Akwizycja' wybierz tryb 'Seria czasowa'.
6. Wybierz odpowiedni tryb obrazowania na podstawie wymaganej równowagi między prędkością, rozdzielczością i fototoksycznością:
   1. Aby uzyskać maksymalną rozdzielczość przestrzenną w mniej dynamicznych procesach, wybierz tryb 'SR' (SuperResolution).
   2. Aby uzyskać równowagę odpowiednią dla wielu dynamik organelli, wybierz 'SR 2 Y ' lub 'SR 4 Y ' (przyspieszone tryby superrozdzielczości).
   3. Aby uzyskać bardzo szybkie obrazowanie bez superrozdzielczości, wybierz tryb 'Confocal' lub 'Co 2 Y'.
7. Zdefiniuj eksperymentalną oś czasu: Ustaw całkowity czas trwania eksperymentu oraz odstęp czasu (Δt) między kolejnymi klatkami. (np. 5-30 sekund dla ruchliwości mitochondrialnej)
8. Optymalizuj parametry obrazowania, aby zminimalizować uszkodzenia foto:
   1. Zacznij od najniższej mocy lasera, która daje wykrywalny sygnał.
   2. Dostosuj wzmocnienie detektora w jego liniowym zakresie (600-850 V), aby uzyskać użyteczny poziom sygnału, preferując wzmocnienie od wzrostu mocy lasera.
   3. Używaj najszybszej prędkości skanowania (najkrótszego czasu zatrzymania pikseli) zgodnej z wymaganiami dotyczącymi jakości obrazu.
9. Rozpocznij akwizycję w czasie poklatkowym. Monitoruj pierwsze kilka klatek pod kątem stabilności ostrości i zdrowia komórek.

7. Obrazowanie płytkami na dużym obszarze

1. W zakładce 'Pozyskiwanie' wybierz tryb 'Skanowanie kafelków'.
2. Zdefiniuj tilingRegion za pomocą jednej z dwóch metod:
   1. Oparty na układzie: Określ liczbę kafelków w kierunkach X i Y (np. 3 x 3).
   2. Na podstawie ROI: Ręcznie narysuj prostokąt nad obrazem 'Live', aby zdefiniować obszar zainteresowania. Oprogramowanie automatycznie oblicza liczbę potrzebnych kafelków.
3. Ustaw nakładanie się między sąsiednimi kafelkami na 10-15%.
   UWAGA: To nakładanie się dostarcza wystarczających informacji, aby algorytm łączenia oprogramowania mógł stworzyć płynny obraz kompozytowy.
4. Konfiguruj parametry obrazowania (moc lasera, wzmocnienie, rozdzielczość) dla pojedynczego kafelka tak, jak dla obrazu statycznego.
   UWAGA: Dla bardzo dużych powierzchni kafelkowych rozważ zastosowanie szybszego trybu skanowania (np. 'Co 2 Y'), aby utrzymać praktyczny czas nabycia i zminimalizować fotobielenie.
5. Rozpocznij pozyskiwanie kafelków. Oprogramowanie automatycznie pobiera i zszywa kafelki.
6. Po zdobyciu dokładnie sprawdź zszyty obraz, zwłaszcza na granicach kafelków, pod kątem artefaktów. Korzystaj z narzędzi do ręcznej regulacji szycia, jeśli to konieczne.

8. Obrazowanie superrozdzielcze z użyciem detektora multipleksowanego matrycowego

1. W zakładce 'Akwizycja' przejdź do wyboru trybu, kliknij 'Inteligentna konfiguracja' i wybierz tryb 'Airyscan'. Następnie wybierz tryb działania detektora matrycy multipleksowanej jako 'SuperResolution'.
2. Wybierz konkretny tryb pozyskiwania na podstawie priorytetów eksperymentalnych:
   1. Tryb 'SR': Dla najwyższej możliwej rozdzielczości przestrzennej (~120 nm bocznej). Zastosowanie do stałych próbek.
   2. Tryb 'SR 2 Y': Zapewnia równowagę między rozdzielczością a szybkością.
   3. Tryb 'SR 4 Y': Najszybszy tryb superrozdzielczości (teoretycznie do ~25 fps), zoptimizowany do obrazowania na żywych komórkach, aby zminimalizować dawkę światła.
   4. Tryb 'Co 2 Y': Oferuje prędkość obrazowania podobną do konfokalnej z ulepszonym stosunkiem sygnału do szumu, gdy nie jest wymagana superrozdzielczość.
      UWAGA: Wartości rozdzielczości (np. 120 nm) są specyfikacją systemu w idealnych warunkach¹². Rzeczywista rozdzielczość zależy od przygotowania próbki, stosunku sygnału do szumu oraz prawidłowego przetwarzania.
3. Konfiguruj parametry obrazowania (moc lasera, wzmocnienie detektora).
   1. W obrazowaniu żywych komórek zacznij od niższej mocy lasera niż w trybie konfokalnym, aby zmniejszyć uszkodzenia fotograficzne.
   2. Dla słabych, stałych próbek może być potrzebna wyższa moc lasera i/lub wzmocnienie, aby osiągnąć odpowiedni stosunek sygnału do szumu.
   3. Znajdź minimalną moc lasera, która daje czysty, wysokokontrastowy obraz w trybie 'Live'.
4. Ustaw rozmiar piksela i czas zatrzymania.
   1. Aby uchwycić zwiększoną rozdzielczość, ustaw rozmiar piksela spełniający kryterium Nyquista: rozmiar piksela ≤(pożądana rozdzielczość / 2.3). W trybie SR (docelowe 120 nm) ustaw rozmiar piksela ≤~52 nm.
   2. Użyj przycisku "Optymalny" lub "Nyquist", aby automatycznie to obliczyć, jeśli jest dostępny.
5. Zdobądź obraz. Surowe dane zawierają sygnały multipleksowane i nie są jeszcze superrozdzielone.
6. Przetwarzaj zebrane dane, aby osiągnąć superrozdzielczość:
   1. Przejdź do modułu przetwarzania oprogramowania.
   2. Wybierz zbiór danych i wybierz funkcję 'SuperResolution Processing'.
   3. Zacznij od ustawień 'Auto'. Dla danych o niskim SNR ręcznie dostosuj "Strength" i "Noise Filter", aby zwiększyć ostrość bez wprowadzania artefaktów.
   4. (Opcjonalnie) Aby uzyskać najwyższą wierność, zwłaszcza w stosach 3D, zastosuj dodatkowy krok dekonwolucji łączeń (jDCV).
   5. Wykonaj przetwarzanie. Porównaj przetworzone i nieprzetworzone widoki, aby zweryfikować poprawność rzeczywistych szczegółów.
7. (Opcjonalnie) Dla ilościowego porównania stosunku sygnału do szumu (SNR) między trybami:
   1. Zrób zdjęcia tej samej próbki w różnych trybach.
   2. W oprogramowaniu analitycznym zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) na jednolitej strukturze i mierz średnią intensywność sygnału.
   3. Zdefiniuj ROI tła i zmierz odchylenie standardowe intensywności tła.
   4. Oblicz SNR = (średni sygnał) / (odchylenie standardowe tła).
8. (Opcjonalnie) Do empirycznego pomiaru rozdzielczości układowej z użyciem fluorescencjowych kulek:
   1. Przygotuj próbkę fluorescencyjnych koralików o średnicy 100 nm.
   2. Zdobądź Zstack izolowanego koralika w trybie SR z próbkowaniem Nyquista.
   3. Przetwarzaj stos z superrozdzielczością i (opcjonalnie) jDCV.
   4. Użyj narzędzia "PSF Measurement" w oprogramowaniu, aby dopasować 3D Gaussian i zapisać pełną szerokość przy wartościach półmaksymalnych (FWHM).

Results

Obrazowanie fluorescencji wielokolorowej
Wykonano wielokolorowe obrazowanie fluorescencji stałych komórek COS7 zgodnie z opisem w Sekcji 3. Przeciwciała przeciwko α-tubulinie (mikrotubule) oraz TOMM20 (mitochondria) były stosowane z jądrowym przeciwbarwieniem DAPI. Jak pokazano na Rysunku 1, jądra (niebieskie), mitochondria (zielone, Alexa Fluor 488) oraz mikrotubule (czerwone, Alexa Fluor 568) zostały wyraźnie wyodrębnione z wysoką swoistością i minimalnym przesłuchem ...

Discussion

Przedstawiony tutaj zintegrowany protokół stanowi kompleksową mapę drogową wdrażania zaawansowanych możliwości obrazowania nowoczesnego systemu mikroskopu konfokalnego wyposażonego w multipleksowaną matrycę superrozdzielczości, w ramach zrównoważonego systemu współdzielonych zasobów. Ta sekcja syntetyzuje kluczowe aspekty metody, jej praktyczne zastosowanie oraz jej pozycję w dziedzinie bioobrazowania. Pomyślne wdrożenie tego protokołu zależy od kilku kluczowych kroków. Po pierwsze, skrupulatne przygotowanie próbek jest ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komórki COS7	ATCC (lub podobny)	CRL-1651	Linia komórek fibroblastu nerek afrykańskiej małpy zielonej. Wykorzystywany do przygotowywania próbek z komórkami stałymi do wielokolorowego obrazowania w superrozdzielczości
IgG przeciwmyszy osioł, sprzężony Alexa Fluor 568	Invitrogen (lub podobny)	A10037	Przeciwciało wtórne do barwienia mikrotubul. Stosowany w rozcieńczeniu 1:500
Dulbecco' Zmodyfikowane medium orła (DMEM), wysoka zawartość glukozy	Gibco (lub podobny)	11965092	Standardowe pożywki hodowlane dla komórek COS7, uzupełnione 10% FBS.
Serum bydlęce płodu (FBS), nieaktywowane na gorąco	Gibco (lub podobny)	10082147	Suplement surowicy stosowany w stężeniu 10% (v/v) we wszystkich pożywkach hodowlanych komórek.
Obrazownik z szklanym dnem (35 mm, &mikro; -Talerz, #1,5 polimerowa pokrywa, grubość 0,17 mm)	Ibidi (lub podobne)	81156	Podłoże do płytowania komórek i obrazowania. Kluczowe dla kompatybilności z obiektywami immersyjnymi o wysokiej zawartości oleju azotowego.
Przetwarzanie obrazu i obróbka obrazu Oprogramowanie analityczne (moduły ZEN)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (niebieski)	Wykorzystywany do rekonstrukcji 3D, przetwarzania superrozdzielczości (np. Airyscan Processing), pomiarów PSF oraz analizy SNR.
ImageJ / Fidżi	Open Source	Nie ma	Wykorzystywane do dodatkowej rekonstrukcji 3D, generowania widoków ortogonalnych oraz ogólnej analizy obrazów.
Olej immersyjny (współczynnik załamania = 1,518)	Carl Zeiss (lub podobny)	444960-0000-000	Do użycia z obiektywami immersyjnymi olejowymi (np. 63x/1.4 NA).
Laserowy skanujący system mikroskopu konfokalnego z detektorem multipleksowym (np. ZEISS LSM 900 z Airyscan 2)	Carl Zeiss AG	LSM 900 (Airyscan 2)	Główna platforma obrazowania używana dla wszystkich trybów konfokalnych i superrozdzielczych opisanych w protokole.
Minimalne Niezbędne Medium (MEM) z Earlem' s Salts	Gibco (lub podobny)	11095080	Standardowa pożywka hodowla dla komórek Hep3B, uzupełniona 10% FBS.
Mysze przeciwciało monoklonalne przeciwciało anty-&alfa;-tubulinowe (klon DM1A)	Sigma-Aldrich (lub podobny)	T6199	Główne przeciwciało do znakowania mikrotubul. Stosowany w rozcieńczeniu 1:500
Paraformaldehyd (PFA), 4% w PBS	Jinpan   (lub podobne)	TBS5083	Utrwalacz dla komórek. Używaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Postępuj z odpowiednią ostrożnością.
Medium obrazujące wolne od fenolu	Gibco (lub podobny)	21063029	Ośrodek o niskiej autofluorescencji stosowany do obrazowania w komórkach żywych. Wstępnie wyważony z 5% CO2 przy 37 stopiach i stopień; C przed użyciem.
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), 1X, pH 7,4	CellWorld (lub podobny)	C0162-311	Używany jako bufor do mycia i rozcieńczania przez cały protokół.
ProLong złoty montaż antyfady	Invitrogen (lub podobny)	P36930	Utwardzone medium montażowe do zachowania fluorescencji w próbkach stałych.
Triton X-100	Sigma-Aldrich (lub podobny)	T8787	Stosowany w stężeniu 0,1% (v/v) do permeabilizacji komórek
Tween-20	Sigma-Aldrich (lub podobny)	P9416	Stosowany w stężeniu 0,05% (v/v) w PBS (PBST) do fazy mycia po inkubacji przeciwciał.
Albumina surowicy bydła (BSA), Frakcja V	Sigma-Aldrich (lub podobny)	A7906	Stosowany w stężeniu 1% (w/v) w PBS do blokowania oraz jako składnik buforu rozcieńczania przeciwciał.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol)	Sigma-Aldrich (lub podobny)	D9542	Nuklearna barwa do kontrastu. Stosowany w końcowym stężeniu 1 & mikro; g/mL.
IgG antykrólikowy osioł, Alexa Fluor 488 sprzężony	Invitrogen (lub podobny)	A21206	Przeciwciało wtórne do barwienia mitochondrialnego. Stosowany w rozcieńczeniu 1:500
Fluorescencyjne mikrosfery (kulki), średnica 100 nm	Invitrogen (np. TetraSpeck™) lub podobny	T7279	Wykorzystywane do pomiaru empirycznego układu' funkcji rozrzutu punktowego (PSF) oraz rozdzielczości.
Komórki Hep3B stabilnie wyrażające mitochondria EGFP	IMMOCELL	IM-H367	Linia komórkowa ludzkiego wątroby zaprojektowana tak, aby stabilnie ekspresowała EGFP skierowany do matrycy mitochondrialnej. Wykorzystywane do obrazowania czasowego na żywej komórki.
Roztwór buforowy HEPES, 1 M	Gibco (lub podobny)	15630080	Stosowany w końcowym stężeniu 25 mM w medium obrazującym do stabilizacji pH podczas obrazowania na żywo, poza inkubatorem CO2.
Wysokoprecyzyjne szkło osłonowe (#1,5, grubość 0,17 mm)	Marienfeld (lub podobne)	107052	Używany do montażu stałych próbek.
Oprogramowanie operacyjne mikroskopu (np. edycja ZEN blue)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (niebieski)	Wykorzystywane do sterowania systemem, akwizycji obrazu oraz podstawowego przetwarzania obrazów.
Obiektyw: Plan-apochromat 63x/1.40 NA Oil DIC	Carl Zeiss AG	421462-9900-000	Główny cel używany do obrazowania w wysokiej rozdzielczości.
Poliklonalne przeciwciało królika anty-TOMM20	Abcam (lub podobny)	ab186735	Główne przeciwciało do znakowania mitochondriów. Stosowany w rozcieńczeniu 1:1000