Reprodukowalny przepływ obliczeniowy do odkrywania leków w celu standaryzacji farmakologii sieciowej i analiz molekularnego dokowania

Podsumowanie

Ten standaryzowany protokół łączy farmakologię sieciową i dokowanie molekularne z symulacjami dynamiki molekularnej (MD) w celu odkrywania leków. Ustala ilościowe kryteria przesiewowe oraz powtarzalne kroki, odpowiednie do wielocelowych badań przesiewowych na leki z wykorzystaniem publicznych zbiorów danych i poprawiające wiarygodność wyników.

Streszczenie

Farmakologia sieciowa i molekularne dokowanie są szeroko stosowane w odkrywaniu leków, jednak fragmentaryczne procesy i niespójne operacje często podważają powtarzalność wyników. Opisano tutaj ustandaryzowany protokół integrujący te podejścia w powtarzalne ramy badań przesiewowych i mechanizmów analizy, z procesem pracy zorganizowanym w trzy kolejne fazy: przygotowanie danych, analiza obliczeniowa oraz walidacja. W fazie przygotowania biblioteki związków z publicznych baz danych są filtrowane według kryteriów absorpcji, dystrybucji, metabolizmu, wydalania i toksyczności (ADMET), w tym biodostępności doustnej, podobności do leku oraz przewidywania toksyczności, podczas gdy potencjalne cele terapeutyczne są pozyskiwane poprzez przewidywanie celów i integrację baz danych związanych z chorobą, aby kompleksowo zidentyfikować kandydatów na interakcje lek-choroba. W fazie analizy obliczeniowej nakładające się cele przechodzą analizy wzbogacania Ontologii Genów (GO) i Encyklopedii Genów i Genomów z Kioto (KEGG) oraz analizę topologiczną sieci interakcji białko-białko w celu identyfikacji kluczowych celów; Dokowanie molekularne jest skonfigurowane za pomocą dwóch ustandaryzowanych, opcjonalnych strategii, które mają wyraźne zalety. Dwustopniowa strategia progresywna wykorzystuje AutoDock Vina do wysokoprzepustowego wstępnego przesiewania biblioteki związków, po czym następuje precyzyjne ponowne dokowanie z YASARA, co eliminuje fałszywe pozytywy z przesiewów o wysokiej przepustowości i generuje kompleksy białko-ligandowe natywnie kompatybilne z kolejnymi symulacjami dynamiki molekularnej YASARA (MD), aby uniknąć odchyleń strukturalnych spowodowanych konwersją formatów między programami. Strategia jednoetapowa kończy cały proces dokowania wyłącznie za pomocą YASARA, co upraszcza przepływ pracy, poprawia efektywność eksperymentów i jest w pełni przydatna do konkretnych celów badawczych. W fazie walidacji standaryzowane symulacje MD oceniają stabilność kompleksu ligand-białko na podstawie podstawowych wskaźników: odchylenia średniej kwadratowej korzeni (RMSD) oraz fluktuacji średniej kwadratowej (RMSF). Ten zintegrowany, powtarzalny pipeline zwiększa wiarygodność farmakologii sieciowej i badań dokowania oraz ułatwia porównania w badaniach krzyżowych w komputerowym odkrywaniu leków.

Wprowadzenie

Farmakologia sieciowa to podejście badawcze, które rozszyfrowuje wzorce interakcji między lekami a organizmem z holistycznej perspektywy sieci¹. Poprzez konstruowanie i analizę sieci interakcji obejmującej komponent-składnik-cel-chorobę-biologiczną ścieżkę, ilościowo identyfikuje kluczowe cząsteczki, szlaki kluczowe oraz synergiczne mechanizmy, dzięki którym leki wywierają swoje działanie. Ten system analityczny jest zgodny z międzynarodowym standardem farmakologii sieci, który kładzie nacisk na integrację danych multi-omics i analizę sieci topologicznej, a ostatecznie wyjaśnia ogólne efekty terapeutyczne leków, przewiduje potencjalne skutki uboczne lub dostarcza systematycznych wskazówek dla rozwoju nowych leków. Taka strategia została z powodzeniem zastosowana w różnych dziedzinach, w tym w rozszyfrowaniu szlaków sygnalizacyjnych związanych z białkami docelowych niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) przeciwko COVID-19 oraz badaniu mechanizmu działania w leczeniu chorób takich jak osteosarcoma i cukrzyca typu 2⁽cukrzyca ^2,3,4). Ta przewaga napędza przejście od odkrywania leków jednocelowych do wielocelowych w nowoczesnej farmakologii.

Dokowanie molekularne to technika symulacji obliczeniowej wykorzystująca modelowanie algorytmiczne do oceny zgodności przestrzennej i siły oddziaływania między związkami małocząsteczkowymi a biologicznymi celami makrocząsteczkowymi, przewidując tym samym optymalne konfiguracje wiązania ^5,6. Morris i in. wprowadzili AutoDock4 i AutoDockTools4, które umożliwiają automatyczne dokowanie z selektywną elastycznością receptorów; Narzędzia te opierają się na dynamice molekularnej i geometrii molekularnej i oceniają stabilność wiązania oraz powinowactwa, obliczając różnice energetyczne między cząsteczkami⁷. Klasyczne narzędzia, takie jak AutoDock, wykorzystują półelastyczne modelowanie ligand-receptor i stały się złotym standardem w ocenie powinowactwa wiązań w takich symulacjach⁷.

W odkrywaniu leków często stosuje się techniki przesiewowe farmakologii sieciowej do identyfikacji kluczowych składników, które następnie są weryfikowane poprzez dokowanie molekularne w celu oceny ich wiązania z białkami docelowymi, ostatecznie ustalając związek między lekiem a chorobą⁸. Jednak obecne aplikacje często cierpią na niespójne projektowanie eksperymentów, nieustandaryzowane procedury operacyjne oraz brakujące kroki walidacji. Systematyczna ocena badań sieciowych farmakologii związanych z lekami ziołowymi udokumentowała ten powszechny problem, zauważając, że heterogeniczność danych w różnych bazach danych oraz niewystarczająca walidacja eksperymentalna prowadzą do niepowtarzalnych wyników⁹. Te ograniczenia nie tylko podważają powtarzalność i wiarygodność wyników badań, ale także utrudniają przekładanie przewidywań obliczeniowych na walidację eksperymentalną. W przeciwieństwie do izolowanych badań farmakologii sieci, które nie mają eksperymentalnej walidacji lub fragmentarycznych przepływów dokowania z dowolnymi parametrami, protokół ten integruje oba podejścia ze standaryzowanymi progami i operacjami krok po kroku. Ten framework eliminuje subiektywny wybór parametrów, zapewniając, że workflow może być odtwarzany przez różnych operatorów z spójnymi wynikami.

Dlatego ustanowienie ustandaryzowanych procedur operacyjnych do identyfikacji potencjalnych celów i szlaków leków poprzez przesiewowe badania farmakologii sieciowej, w połączeniu z dokowaniem molekularnym w celu weryfikacji aktywności wiązania leku z celem, może dostarczyć dowodów eksperymentalnych do badania mechanizmów działania leków i przesiewowych leków^{kandydatów 10}. Protokół ten jest szczególnie odpowiedni do wielocelowego testu testowego składników leku i syntetycznych małych cząsteczek z wykorzystaniem publicznie dostępnych baz danych omikowych, chemicznych i struktur białek; Nie ma zastosowania do celów bez rozdzielonych struktur kryształowych ani do testów przesiewowych na leki dla pojedynczego celu, bez znanych sieci interakcji związanych z chorobą.

Protokół

Protokół ten obejmuje wyłącznie analizy obliczeniowe publicznie dostępnych baz danych i nie wykorzystuje użycia ludzi, kręgowców ani tkanek biologicznych. Wszystkie podsumowane workflowy opisane w tej sekcji są zilustrowane na Rysunku 1.

Rysunek 1: Podsumowanie przepływu pracy. Zielone prostokąty reprezentują alternatywne składniki leku, czerwone prostokąty choroby, żółte elipsy zawierają strony internetowe i używane oprogramowanie, pomarańczowe prostokąty zawierają uzyskane pliki lub dane oraz kluczowe kroki, a fioletowe diamenty oznaczają ostateczne wymagane wyniki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

1. Pozyskanie składników i celów leku

1. Przeszukaj bazę danych PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), używając nazw chemicznych jako słów kluczowych, aby uzyskać odpowiadające mu ciągi tekstów SMILES (Simplified Molecular-Input Line-Entry System).
2. Przejdź na stronę ADMETlab 3.0 (https://admetlab3.scbdd.com/), wybierz opcję Ocena ADMET w zakładce Usługi, wpisz znaki SMILES i kliknij przycisk WYŚLIJ .
3. Filtruj wyniki ADMET na podstawie wskaźników: wchłanianie, dystrybucji, metabolizmu, wydalania, toksyczności, chemii medycznej oraz zasad dotyczących toksykoforu. Zachowuj tylko związki spełniające wszystkie wcześniej określone kryteria progowe dla każdego wskaźnika (Tabela 1).
4. Uzyskaj dostęp do strony ProTox 3.0 (https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home), wprowadź ciągi SMILES filtrowanych związków, wybierz moduł TOX PREDICTION , zaznacz wszystkie pożądane opcje predykcji (np. toksyczność narządów, rakotwórczość) i przejdź prognozę.
5. Przesiewaj związki o przewidywanych toksycznościach przekraczających określone progi bezpieczeństwa na podstawie wyników ProTox 3.0 (Tabela 2).
6. Skompiluj związki, które przechodzą zarówno badania ADMET, jak i ProTox 3.0, do uporządkowanej bazy danych składników leku (np. Excel lub CSV) z kolumnami nazwy związku, SMILES i statusu przesiewu.
7. Przejdź na stronę SwissTargetPrediction (https://swisstargetprediction.ch/), wybierz Homo sapiens z rozwijanego menu organizmu, wprowadź łańcuchy SMILES składników do bazy składników leku, kliknij przycisk Predict targets i zbierz wszystkie przewidywane cele z wynikiem prawdopodobieństwa większym niż 0.
8. Wejdź na stronę SEA (Similarity Ensemble Approach) (https://sea.bkslab.org/) i wprowadź te same ciągi SMILES, które użyto powyżej do przewidywania celu, a następnie przefiltruj wyniki, aby zachowały tylko wpisy w polu Target Key kończące się na _Human i mające wartość p poniżej 0,05.
9. Połącz listy celów uzyskane ze SwissTargetPrediction i SEA w jedną bibliotekę celów z działaniem leków. Usuń zduplikowane cele i standaryfikuj nazwy celów do oficjalnych symboli genów (np. korzystając z wytycznych HGNC) za pomocą Uniprot (https://www.uniprot.org/).
   UWAGA: Biblioteka celów działania lekowego może być zapisana jako plik CSV do późniejszego użycia.

Tabela 1: ADMETlab 3.0 kryteria progowe do badania bezpieczeństwa leków. Tabela podsumowuje zalecane wartości progowe i zakresy klasyfikacji dla kluczowych właściwości fizykochemicznych, parametrów ADME, interakcji metabolicznych, punktów końcowych toksyczności, szlaków toksyczności oraz reguł toksykoforowych. Przewidywania są podzielone na trzy poziomy ryzyka (niski, średni i wysoki) na podstawie wartości prawdopodobieństwa (< 0,3, 0,3 - 0,7, > 0,7) lub zakresów ilościowych, co umożliwia systematyczną ocenę profili bezpieczeństwa związków podczas wczesnego odkrywania leków. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Kryteria progowe ProTox-3.0 dla przewidywania toksyczności w odkrywaniu leków. Tabela podsumowuje kluczowe punkty końcowe toksyczności przewidywane przez ProTox 3.0, ze szczególnym uwzględnieniem parametrów kluczowych dla oceny bezpieczeństwa leków podczas wczesnego odkrywania leków. Każdy punkt końcowy zwraca klasyfikację binarną (Aktywny lub Nieaktywny) wraz z wynikiem prawdopodobieństwa (0-1), gdzie Aktywny oznacza potencjalne ryzyko toksyczności. Priorytet należy przyznawać toksyczności narządów (hepatotoksyczność, kardiotoksyczność), końcowe punkty toksyczności (rakotwórczość, mutagenność, immunotoksyczność) oraz hamowanie metabolizmu CYP, ponieważ są to główne przyczyny zaniku klinicznego. Wielokrotne aktywne uderzenia na punktach końcowych sugerują szeroki potencjał toksyczności i uzasadniają depriorytetyzację związków. Ostra toksyczność ocenia się na podstawie przewidywanych LD50 i klas GHS, przy czym klasy 1 - 3 (< 300 mg/kg) są uznawane za wysoce toksyczne. Wyniki prawdopodobieństwa dostarczają poziomów pewności dla każdej prognozy. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Pozyskiwanie celów chorób

UWAGA: Podczas przesiewania baz danych standaryzuj konwencje nazewnictwa genów docelowych, aby zapobiec pominięciam spowodowanym rozbieżnościami w nazewnictwie.

1. Uzyskaj dostęp do pięciu baz danych związanych z chorobą: OMIM (https://www.omim.org/), Disgenet (https://disgenet.com/), TTD (https://ttd.idrblab.cn/), GeneCards (https://www.genecards.org/) oraz PharmGkb (https://www.pharmgkb.org/). Stosuj następujące kryteria przesiewowe specyficzne dla bazy danych: dla GeneCards filtruj wpisy z oceną Trafności ≥ 1.0; dla DisGeNET wybrane wpisy związane z chorobą docelową; dla PharmGKB ogranicz wyniki do wpisów związanych z genem, wybierając opcję Gene ; dla TTD zachowaj wpisy, gdzie kolumna Choroba odpowiada chorobie docelowej.
2. Dla każdej bazy danych używaj oficjalnej nazwy choroby docelowej (np. choroby Alzheimera) jako słowa kluczowego, aby pobrać wszystkie powiązane cele.
3. Zbierz listy celów ze wszystkich pięciu baz danych w jeden arkusz kalkulacyjny. Usuń zduplikowane cele, porównując symbole genów na różnych listach.
4. Standaryzuj wszystkie pozostałe nazwy celów do oficjalnych symboli genów za pomocą Uniprot, aby rozwiązać niespójności w nazewnictwie. Zapisz ustandaryzowaną, zdeduplikowaną listę jako bibliotekę docelową chorób (format CSV lub Excel).
   UWAGA: Biblioteka celów chorobowych może być zapisana wraz z biblioteką celów leków (Krok 1.9) do późniejszego wykorzystania w kroku 3.

3. Pozyskiwanie typowych celów lekowo-chorobowych

1. Uzyskaj dostęp do narzędzia webowego Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/). Importuj bibliotekę celów leków (Krok 1.9) oraz bibliotekę celów chorób (Krok 2.4) do dwóch pól wejściowych Venny 2.1.0, aby stworzyć diagram Venna pokazujący nakładanie się tych dwóch zestawów docelowych.
2. Wyodrębniaj cele przecięć z wyników diagramu Venna. Oznacz je jako typowe cele leków i chorób (potencjalne punkty interakcji) i zapisz jako plik CSV.

4. Budowa sieci interakcji białko-białko (PPI) oraz analiza celów rdzeniowych

1. Uzyskaj dostęp do bazy danych STRING (https://cn.string-db.org/). Wybierz Homo sapiens jako organizm z menu rozwijanego.
2. Importuj typowe cele chorobowe leków (Krok 3.2) do pola wejściowego STRING. Ustaw minimalny wymagany parametr oceny interakcji na wysoki poziom pewności (0,700) i kliknij Wyszukaj , aby wygenerować dane PPI. Eksportuj dane PPI jako plik TSV (wartości rozdzielone tabulatorami).
3. Otwórz oprogramowanie Cytoscape z wstępnie zainstalowaną wtyczką CytoNCA. Zaimportuj plik PPI TSV do Cytoscape za pomocą menu File > Import > Network z menu File .
4. Uruchom wtyczkę CytoNCA, klikając Aplikacje > CytoNCA > otwarte. Wybierz pięć wskaźników referencyjnych do podstawowego przesiewania celów: Pomiędzy (Betweenness), Closeness (Bliskość), stopień, Wektor własny (Eigenvector) oraz LAC.
   UWAGA: Pięć kluczowych metryk topologicznych to między (centralność pomiędzy (centralność pomiędzy (pomiar częstotliwości pojawiania się celu na wszystkich najkrótszych ścieżkach w sieci), bliskość (centralność bliskości, odzwierciedlająca średnią najkrótszą długość drogi od celu do wszystkich innych celów w sieci), stopień (stopień połączenia lokalnego, ilościowy określający liczbę bezpośrednich interakcji między celem a innymi celami), Wektor własny (centralność wektora własnego, ważąca zarówno własną łączność celu, jak i znaczenie jego połączonych celów) oraz LAC (lokalna średnia łączność, oceniająca gęstość połączeń między bezpośrednimi sąsiadującymi węzłami celu).
5. Uruchom analizę sieci, klikając Narzędzia > menu Analizuj Sieci , a następnie kliknij OK. Eksportuj wyniki analizy do tabeli CSV.
6. Oblicz wartość mediany dla wszystkich pięciu wskaźników i zachowaj cele spełniające lub przekraczające medianę. Powtarzaj Krok 4.5 wielokrotnie, aż zostanie 10 do 20 celów.
7. Uszereguj pozostałe cele według metryki stopnia (od najwyższego do najniższego) i wstępnie wybierz 10 najlepszych celów jako geny rdzeniowe. Zapisz listę genów rdzeniowych jako plik CSV.
   1. Aby zmniejszyć liczbę fałszywie dodatnich i zapewnić, że tylko obiekty strukturalnie odpowiednie będą podlegać dokowaniu, przeprowadź dalszą ocenę wykonalności strukturalnej i podatności na ukolegowanie: sprawdź bazę danych PDB pod kątem dostępnych wysokorozdzielczych struktur kryształowych (≤ 2,5 Å) lub oceń, czy można skonstruować wiarygodny model homologiczny; używaj narzędzi do przewidywania kieszonek, aby potwierdzić obecność odpowiednich miejsc wiązania; oraz porównać z literaturą lub bazami danych funkcjonalnych w celu potwierdzenia udokumentowanego związku z tą ścieżką chorobową.
   2. Priorytetem należy do celów pozbawionych strukturalnej dostępności, zastępowalnych kieszeni lub znaczenia dla chorób w badaniach dokowania. Analizy wzbogacania GO i KEGG mogą być nadal wykonywane z wykorzystaniem pełnej listy celów rdzeniowych z tego etapu, ponieważ nie wymaga informacji strukturalnych.
      UWAGA: Liczba genów w krokach 4.6 i 4.7 może być zmieniana w razie potrzeby. Zazwyczaj po kroku 4.6 pozostaje od 10 do 20 celów, a zaleca się utrzymanie co najmniej 10 genów podstawowych w kroku 4.7, aby zapewnić odpowiednią ilość danych do wiarygodnej analizy wzbogacania GO i KEGG oraz spójnych trendów wizualizacji.

5. Analiza i wizualizacja wzbogacania GO i KEGG

UWAGA: Ta część wyjaśnia funkcje genów na poziomie komponentu komórkowego, funkcjonalnego oraz szlaku wewnątrzkomórkowego.

1. Uzyskaj dostęp do narzędzia internetowego DAVID (https://davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp). Wybierz Listę Genów jako typ wejściowy i importuj geny podstawowe do pola wejściowego.
2. Ustaw identyfikator na OFFICIAL_GENE_SYMBOL i wybierz Homo sapiens w Wybierz gatunki. Następnie kliknij Wyślij listę , aby przesłać geny rdzeniowe.
3. Do analizy wzbogacania GO wybierz kategorie GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT i GOTERM_MF_DIRECT .
4. Do analizy wzbogacenia KEGG wybierz kategorię KEGG_PATHWAY . Ustaw próg istotności na p < 0,05 dla analiz GO i KEGG.
5. Kliknij Wykres Funkcjonalnych Adnotacji , aby wygenerować wyniki wzbogacenia. Eksportuj wyniki GO i KEGG jako pliki CSV. Użyj oprogramowania R Studio z ggplot2, aby tworzyć wykresy słupkowe lub wykresy bąbelkowe dla 10 najważniejszych wzbogaconych terminów/ścieżek.
   UWAGA: Liczbę wyświetlanych terminów/ścieżek można dostosować do wymagań.

6. Dokowanie molekularne z użyciem Autodock Vina

UWAGA: Krok 6 i Krok 7 to oba kroki dokowania molekularnego. Krok 6 korzysta z oprogramowania AutoDock Vina 1.1.2, natomiast w kroku 7 korzysta z YASARA 10.3.16. Wykorzystanie YASARA ułatwia późniejszą symulację dynamiki molekularnej YASSARA. Jeśli wymagane są wyniki dokowania z AutoDock Vina, wyniki dokowania w YASARA powinny być zgodne z tymi z AutoDock Vina. To eliminuje rozbieżności spowodowane przełączaniem oprogramowania, a także zapewnia wiarygodność wyników walidacji symulacji dynamiki molekularnej, z pomocą szczegółowej metody: Otwórz wynik "result.pdb" kroku 6.31 za pomocą LigPlot+ (wersja 2.3), aby wygenerować dwuwymiarowy diagram interakcji, zidentyfikuj kluczowe reszty oddziałujące z ligandem, a następnie wybierz kluczowe reszty w kroku dokowania 7.18 YASARA, i ustawił rozmiar pudełka tak, aby pokrywał kieszeń wiązań, aby zmaksymalizować spójność miejsc dokowania między Viną a YASARA. Następnie, wybierając optymalne wyniki dokowania w kroku 7.19, upewnij się, że kluczowe oddziałujące reszty między ligandem a receptorem pozostają zgodne z tymi zidentyfikowanymi w wynikach AutoDock Vina. Wymóg spójności koncentruje się na zachowaniu istotnych wzorców interakcji, a nie na dokładnej zgodności atomowej; Oczekuje się drobnych zmian w konformacjach reszt obwodowych ze względu na różnice w parametryzacji pola siłowego i elastyczności łańcucha bocznego. Dopóki krytyczne interakcje z kluczowymi pozostałościami w aktywnym miejscu są zachowane, wyniki dokowania można uznać za spójne do celów walidacji krzyżowej. Jeśli nie jest wymagane dokowanie AutoDock Vina (Krok 6), można wykonać bezpośrednio krok 7.

1. Pobierz SDF (Structure Data File) związków leków o nazwie ligand.sdf z bazy danych PubChem, wyszukując odpowiadające mu ciągi tekstów SMILES (Krok 1.1).
2. Otwieraj pliki SDF za pomocą oprogramowania Chem3D. W opcji Obliczenia wybierz MM2 i kliknij Minimalizuj energię , aby wykonać redukcję energii swobodnej struktury złożenia.
3. Zapisz zminimalizowaną strukturę jako plik ligand.mol2 przez wybór pliku > Zapisz jako. Pobierz plik w formacie PDB (Protein Data Bank) receptora białkowego rdzenia genu z bazy danych RCSB PDB (https://www.rcsb.org/ wyszukaj według ID PDB lub nazwy genu) o nazwie receptor.pdb.
   1. Priorytetyzuj struktury o rozdzielczości ≤ 2,5 Å oraz rozwiązłe miejsca wiązania, jeśli są dostępne. Przy wyborze struktury należy sprawdzić wpis pod kątem kompletności (np. obecności wszystkich oczekiwanych domen, braku dużych nierozwiązanych pętli), potencjalnych mutacji mogących wpływać na wiązanie ligandów oraz tego, czy uwzględniane są funkcjonalnie istotne kofaktory (np. hem, jony metali) lub ligandy współkrystalizowane.
   2. Dla celów z znanymi zespołami oligomerowymi należy rozważyć, czy forma monomeryczna czy wielomierna jest odpowiednia dla pytania badawczego; Zespół biologiczny można pobrać, jeśli istotne są interakcje dimeryczne lub wyższego rzędu. Wybrana konstrukcja będzie poddawana dalszym przygotowaniom w kolejnych etapach, więc wstępna inspekcja pomaga uniknąć komplikacji w dalszej fazie biegu.
4. Otwórz receptor.pdb za pomocą oprogramowania PyMOL. Wpisz remove organic w linii poleceń i naciśnij Enter , aby wyeliminować ligandy małocząsteczkowe ze struktury białka.
   UWAGA: Jeśli używasz współkrystalizowanego ligandu do zdefiniowania miejsca wiązania, najpierw zapisz trójwymiarowe współrzędne centrum liganda, następnie wpisz remove organic w wierszu poleceń PyMOL i naciśnij Enter , aby usunąć współkrystalizowane małe cząsteczki; w przeciwnym razie należy bezpośrednio uruchomić polecenie usuwać organiczne, aby usunąć współkrystalizowane małe cząsteczki.
5. Wpisz remove solvent w wierszu poleceń i naciśnij enter , aby usunąć wolne cząsteczki wody ze struktury białka; użyj polecenia select metal_cofactor, resn [nazwa reszty kofaktora docelowego], aby zidentyfikować funkcjonalnie krytyczne jony metali lub kofaktory (np. HEM, Zn²⁺, Mg²⁺) i potwierdzić ich zachowanie w strukturze.
6. Eksportuj wyczyszczony receptor z PyMOL jako receptor_clean.pdb, klikając File > Export Molecule > Save.
7. Otwórz receptor_clean.pdb w UCSF Chimera 1.19. Wyświetlaj sekwencję, klikając Narzędzia > Sekwencja > Sekwencja , aby sprawdzić brak pętli sąsiadujących z miejscem wiązania (brakujące obszary są oznaczone czerwonymi ramkami konturu). Jeśli brakujące pętle występują, odbuduj je, wybierając Structure > Modeller (pętle/udoskonalenie) z menu okna sekwencji, wybierając nieterminalną brakującą strukturę, ustawiając odpowiednią liczbę modeli (np. 5) i kontynuując obliczenia. Po zakończeniu wybierz najbardziej rozsądny model.
8. Zoptymalizuj strukturę w Chimerze. Użyj narzędzia Rotamers (biblioteka Dunbrack) na wybranych resztach, aby zoptymalizować łańcuchy boczne, dodając Clashy i Wiązania H za pomocą menu Kolumny do oceny i wybierania konformacji z minimalnymi kolizjami (0 - 1 preferowane) i korzystnymi wiązaniami H. Następnie dodaj wodór i przypisz ładunki za pomocą Dock Prep (AMBER ff14SB). Na koniec wykonaj minimalizację energii za pomocą narzędzia Minimize Structure, naprawiając atomy szkieletowe poprzez ich wybór (sel @ca,c,n,o), odwracając wybór i włączając atomy stałe. Zapisz przetworzoną strukturę jako receptor_optimized.pdb, wybierając File > Save PDB.
   UWAGA: Pomiń optymalizację łańcucha bocznego dla dobrze uporządkowanych reszt. Dock Prep automatycznie obsługuje protonacje. Minimalizacja powinna być wykonywana przy stałym kręgosłupie.
9. Ponownie otwórz receptor_optimized.pdb w PyMOL i zdefiniuj kanoniczną stronę wiązania. Jeśli obecny jest współkrystalizowany ligand, użyj jego współrzędnych, aby wycentrować siatkę: zapisz centrum liganda, a następnie usuń go za pomocą usuwania organicznego. Jeśli nie ma współkrystalizowanego ligandu, zdefiniuj miejsce wiązania na podstawie znanych kluczowych reszt z literatury (np. select binding_site, resi XXX-XXX) lub poprzez wizualne zidentyfikowanie domniemanej kieszeni wiązania za pomocą narzędzi predykcyjnych kieszeni w kieszonkach, aby zweryfikować wizualną ocenę. Zapisz trójwymiarowe współrzędne centrum (x/y/z) zdefiniowanego miejsca do ustawienia siatki w pudełku.
   UWAGA: Współrzędne zapisane tutaj służą do wyśrodkowania siatki AutoDock Vina. Dla definicji opartej na resztach należy obliczyć geometryczny środek wybranych reszt; Dla kieszeni zidentyfikowanej wizualnie lub za pomocą narzędzi predykcyjnych wykorzystuje się środek tej komory. Przy definiowaniu miejsca wiązania należy wziąć pod uwagę, czy planowana strategia dokowania jest skierowana na miejsce ortosteryczne (aktywne), czy na miejsce allosteryczne. Dla celowania ortosterycznego miejsce wiązania powinno być definiowane na podstawie współkrystalizowanego ligandu lub zachowanych pozostałości aktywnego miejsca opisanych w literaturze. Do celów allosterycznych można stosować narzędzia przewidywania kieszonkowego do identyfikacji potencjalnych miejsc allosterzycznych, szczególnie tych o znanych regulacjach allosterycznych. W braku wcześniejszych informacji globalne dokowanie połączone z grupowaniem przewidywanych hotspotów wiązania może pomóc w identyfikacji potencjalnych miejsc allosterycznych. Ta elastyczność pozwala protokołowi uwzględniać zarówno kampanie odkrywania leków ortosterycznych, jak i allosterycznych.
10. Eksportuj ostateczną zoptymalizowaną strukturę z PyMOL jako receptor.pdb, klikając File > Export Molecule > Save.
11. Otwórz receptor.pdb w AutoDock Tools 4.2.6, klikając File > Read Molecule. Zdefiniuj elastyczne reszty. Kliknij Edytuj > Elastyczne Reszty > Wybierz Reszty i wybierz reszty miejsc wiązania, które spodziewają się zmian konformacyjnych po wiązaniu ligandu (wybierz ≤ 10 pozostałości).
    UWAGA: Ten etap pozwala wybranym łańcuchom bocznym przesuwać się podczas dokowania, uwzględniając efekty indukowanego dopasowania.
12. Zapisz receptor z elastycznymi resztami jako plik PDB. Kliknij File > Zapisz, wybierz Write PDB z menu rozwijanego. W oknie Dostępne rekordy PDB zaznacz ATOM i CONECT, kliknij ADD, a następnie OK. Zapisz plik jako receptor.pdb.
    UWAGA: Ten plik PDB zawiera informacje o elastycznych resztach i zostanie użyty do wygenerowania pliku PDBQT.
13. Przygotuj makrocząsteczkę do dokowania. Kliknij Siatka > Makromolekuła > Wybierz, wybierz plik receptor.pdb i kliknij Wybierz Cząsteczkę. Zapisz receptor jako plik PDBQT, klikając File > Zapisz jako i nazwij go receptor.pdbqt.
    UWAGA: AutoDock Tools przypisuje ładunki i typy atomów, zapisując odbiornik w natywnym formacie PDBQT AutoDock, gotowy do generowania grid boxów i obliczeń dokowania.
14. Kliknij menu Ligand , wybierz Input, a następnie kliknij Otwórz. Wybierz ligand.mol2 i kliknij OK. Kliknij menu Ligand , wybierz Torsje, a następnie kliknij Wykryj Torsje. AutoDock Tools automatycznie identyfikuje rotacyjne wiązania w strukturze ligandu (np. pojedyncze wiązania w łańcuchach alkilowych, wiązania amidowe z wyłączeniem wiązań peptydowych).
15. W oknie wyboru torsji weryfikuj wykryte wiązania obrotowe (zachowuj wszystkie ważne wiązania obrotowe, wyłączając wiązania sztywne, takie jak pierścieniowe aromatyczne). Kliknij Ustawy, aby potwierdzić definicje torsji, a następnie kliknij Zamknij.
    UWAGA: Zachowanie prawidłowych więzów obrotowych zapewnia, że ligand może przyjmować różne konformacje podczas dokowania (ligand elastyczny), jednocześnie utrzymując receptor w sztywności — to jest sedno półelastycznego dokowania w AutoDock Vina.
16. Kliknij ponownie menu Ligand , wybierz Output, a następnie Zapisz jako PDBQT. Nazwij plik ligand.pdbqt i zapisz go w tym samym katalogu co receptor.pdbqt.
17. Kliknij menu Display , wybierz Secondary Structure. Kliknij Tylko wyświetlanie, następnie wybierz Linie i Undisplay, aby uprościć widok białka.
18. Kliknij menu Siatka , wybierz Ramka Siatki. Dostosuj wartości x, y, z (współrzędne środkowe) i Spacing(Å), aby ustawić pudełko nad aktywnym miejscem białka.
    UWAGA: Jeśli miejsce wiązania jest nieznane, użyj narzędzi predykcyjnych kieszeni (np. CASTp, DoGSite) do identyfikacji domniemanych kieszeni wiązania. Pokrywanie całego białka znacząco zwiększa fałszywie pozytywne wyniki i koszty obliczeniowe, dlatego nie jest zalecane.
19. Kliknij File > Close save current, następnie kliknij Grid > Output > Save GPF , aby zapisać ustawienia grid box jako Grid.gpf.
20. Otwórz Grid.gpf w edytorze tekstu i zapisz gridcentre (wartości x, y, z) oraz npts (rozmiar x, y, z) z pliku.
21. Stwórz nowy plik tekstowy o nazwie Config.txt i wpisz następujące treści:
    receptor = receptor.pdbqt
    ligand = ligand.pdbqt
    center_x = [wartość x-gridcentre z Grid.gpf]
    center_y = [wartość y w centrum gridu z Grid.gpf]
    center_z = [wartość z w gridcentre z z Grid.gpf]
    size_x = [npts x wartość z Grid.gpf]
    size_y = [npts wartość y z Grid.gpf]
    size_z = [npts z z Grid.gpf]
    energy_range = 5
    num_modes = 10
    Zamień tekst w nawiasach wartościami z Grid.gpf (Krok 6.19).
    UWAGA: Parametr energy_range powinien być ustawiony jako maksymalna dopuszczalna różnica energii względem optymalnego modelu połączonego, z jednostkami w kcal/mol. Na przykład ustawienie na 5 oznacza, że AutoDock Vina zakończy obliczenia, gdy różnica energii od modelu optymalnego osiągnie 5 kcal/mol. Dodatkowo num_modes określa liczbę modeli wiązań do wygenerowania, która zazwyczaj jest ustawiona na 10.
22. Umieść pliki vina_split.exe i vina.exe w tym samym katalogu co receptor.pdbqt, ligand.pdbqt i Config.txt.
23. Otwórz konsolę systemu Windows, przejdź do katalogu za pomocą polecenia cd (np. cd C:\DockingFiles).
24. Wpisz następujące polecenie i naciśnij Enter: vina.exe --config config.txt --log log.txt --out output.pdbqt
25. Czekaj, aż dokowanie zostanie zakończone (czas trwania zależy od systemu). Pojawią się dwa pliki: log.txt (wyniki dokowania) oraz output.pdbqt (struktura ligandów o najniższej energii). Aby zapewnić powtarzalność, przeprowadza się trzy niezależne przejazdy dokowania z różnymi losowymi nasionami. RMSD < 1,0 Å wśród górnych pozycji potwierdza spójność.
    UWAGA: Jako empiryczne odniesienie, energie wiązania AutoDock Vina (kcal/mol) można interpretować jako: ≤ -7 (wysokie powinowstwo, potencjalne aktywne konformacje), -7 do -5 (umiarkowane powinowactwa), ≥ -5 (niskie powinowactwo). Progi te zależą od systemu i powinny być weryfikowane za pomocą danych eksperymentalnych.
    1. Aby ocenić dokładność dokowania i zdolność dyskryminacji dla konkretnego celu, zaleca się dwie uzupełniające się metody walidacji. Do oceny tego, czy protokół potrafi odtworzyć eksperymentalnie obserwowane tryby wiązania, wykorzystaj walidację ponownego dokowania z użyciem ligandów krystalograficznych, przy czym standardowym kryterium akceptacji jest RMSD < 2.0 Å.
    2. Wykorzystaj analizę wzbogacenia z wykorzystaniem publicznych zestawów danych benchmarkowych (np. DUD-E) do oceny zdolności protokołu do rozróżniania prawdziwych związków aktywnych od wabików dopasowanych do właściwości; obejmuje to obliczanie krzywych ROC (zapewniających globalną miarę wydajności klasyfikacji) oraz czynników wzbogaca, takich jak EF1% (ilościowe wzbogacenie składników aktywnych w najwyżej ocenianym ułamku). Razem te kroki walidacyjne pomagają ustalić odpowiednie granice powinowactwa i zapewniają wiarygodne wyniki badań dla docelowej klasy zainteresowań.
26. Otwórz oprogramowanie PyMOL. Importuj output.pdbqt i receptor.pdbqt, klikając File > Otwórz. Zapisz połączoną strukturę jako result.pdb, klikając File > Zapisz jako.
27. Wyczyść przestrzeń roboczą PyMOL, klikając File > New Session, a następnie ponownie otwórz result.pdb, aby zwizualizować kompleks ligand-białko.

7. Dokowanie molekularne z użyciem YASARA

UWAGA: Ten etap służy jako precyzyjne ponowne dokowanie i wstępne przetwarzanie do kolejnej symulacji dynamiki molekularnej (MD) oraz jest stopniową weryfikacją wstępnych wyników wysokoprzepustowych testów przesiewowych z etapu 6. Krok 6 wykorzystuje AutoDock Vina, złoty standard narzędzia do wysokoprzepustowego wirtualnego przesiewania, do szybkiego przesiewania kandydatów na cząsteczki o doskonałym powinowactwie wiązanym z biblioteki związków. Ten etap wykorzystuje YASARA do dokowania, ponieważ moduł dokujący jest w pełni kompatybilny z platformą symulacji MD YASARA MD, co pozwala uniknąć odchyleń strukturalnych spowodowanych konwersją formatu pliku i przełączaniem oprogramowania, a także zapewnia ustandaryzowaną początkową złożoną strukturę dla kolejnych symulacji MD. Dla wszystkich kandydatów badanych przez AutoDock Vina w kroku 6, wyniki dokowania (w tym pozycję wiązania w aktywnej kieszeni oraz kluczowe interakcje aminokwasów) uzyskane w tym kroku muszą być zgodne z tymi z AutoDock Vina, a względny ranking powinowactwa wiązania musi zachować ten sam trend przed przejściem do symulacji MD. Absolutne wyniki dokowania nie są bezpośrednio porównywalne między tymi dwoma programami ze względu na różne algorytmy obliczeniowe. Ten wymóg spójności może wyeliminować fałszywie dodatnie wyniki spowodowane różnicami w oprogramowaniu, zapewnić stabilność cech wiązania kandydatów na cząsteczki oraz zagwarantować wiarygodność i logiczną ciągłość kolejnych symulacji MD.

1. Wykorzystaj OpenBabel do konwersji pliku ligand.sdf na plik ligand.pdb.
   UWAGA: OpenBabel jest tutaj używany wyłącznie do konwersji formatów. Rzeczywista parametryzacja ligandu dla dynamiki molekularnej zostanie automatycznie wykonana przez YASARA w kolejnych etapach.
2. Otwórz oprogramowanie YASARA. Kliknij File > Załadowaj i wybierz ligand.pdb , aby zaimportować ligand. Kliknij Edytuj > Czyść > Wszystko , aby usunąć wady strukturalne liganda.
   UWAGA: Ten etap wykonuje podstawowe czyszczenie geometrii. YASARA automatycznie przypisze parametry pola siłowego ligandowi, wykorzystując wbudowaną technologię AutoMILES, która stosuje ładunki General AMBER Force Field (GAFF) oraz AM1-BCC, aby zapewnić kompatybilność z polem siłowym AMBER14 używanym dla białka. Ta parametryzacja jest niezbędna do dokładnych obliczeń energii zarówno w symulacjach dokowania, jak i MD.
3. Kliknij Opcje > Domyślne pH, wybierz odpowiednie pH (np. 7,4 dla schorzeń fizjologicznych) i kliknij OK.
4. Kliknij Dock > pole siłowe , aby ustawić pole siłowe dokowania, zapewniając spójność parametrów w kolejnych symulacjach MD.
   UWAGA: AMBER14 jest zalecanym polem siłowym dla tego procesu odkrywania leków w YASARA 10.3.16, ponieważ zapewnia kompleksowe pokrycie parametrów białek i jest w pełni zgodny ze standardowymi protokołami symulacji MD. Dla standardowych reszt białkowych parametry są automatycznie przypisywane na podstawie wbudowanych szablonów pola siłowego. Dla ligandów małocząsteczkowych YASARA automatycznie wykonuje parametryzację za pomocą wbudowanej technologii AutoMILES, która przypisuje typy atomów GAFF (General AMBER Force Field) oraz ładunki AM1-BCC. Zapewnia to kompatybilność między parametrami białka i ligandu, umożliwiając dokładne obliczenia energii zarówno w symulacjach dokowania, jak i MD. Bardziej odpowiednie pole siłowe można wybrać w zależności od faktycznej wersji YASARA oraz specyficznych cech systemu.
5. Kliknij Symulator > Zdefiniuj > komórek symulacyjnych wokół wszystkich atomów , aby ustawić roboczą granicę. Kliknij Symulator > Granice komórek > Periodic , aby umożliwić okresowe warunki brzegowe.
6. Kliknij Opcje > Wybierz eksperyment > minimalizacji energii, a następnie kliknij Uruchom, aby zminimalizować energię ligandu.
7. Kliknij File > Zapisz jako, nazwaj plik ligand.pdb i OK, aby nadpisać oryginalny plik ligand PDB. Kliknij File > Nowy , aby wyczyścić przestrzeń roboczą, następnie kliknij File > Load i wybierz plik receptor.pdb.
8. Powtórz kroki 7.2 do 7.7 dla receptora białkowego, zapisując przetworzony plik jako nowy plik receptor.pdb.
9. Kliknij File > Nowy, następnie File > Load i wybierz zarówno ligand.pdb , jak i receptor.pdb. Powtórz kroki od 7.3 do 7.5, aby ustawić pH, zdefiniować komórkę symulacji i włączyć okresowe granice dla kompleksu.
10. Kliknij Procesory > Określ CPU i wybierz liczbę rdzeni CPU do użycia. Kliknij Procesory > Ustaw GPU i wybierz urządzenie GPU, aby przyspieszyć obliczenia.
11. Kliknij File > Zapisz jako > scenie YASARA, nazwij plik sce\nesult.sce (utwórz folder SCE, jeśli nie istnieje) i kliknij OK.
12. Kliknij Opcje > Macro&Film > Ustaw cel, wybierz sce\nesult.sce i kliknij OK. Kliknij Opcje > Macro&Film > Odtwarzaj makro, wybierz plik makro dock_run.mcr i kliknij OK.
13. Kliknij Symulator > Zdefiniuj > komórki symulacyjnej wokół wybranych atomów i powtórz 7.5, a następnie kliknij Kontynuuj, aby rozpocząć dokowanie.
14. Poczekaj na zakończenie dokowania. Generowane będą pliki z przyrostkiem yob; name.log zawiera energię wiązania oraz reszty receptorów kontaktowych.
    UWAGA: Aby zapewnić racjonalność walidacji symulacji dynamiki molekularnej, wybierz wynik dokowania w YASARA, który jest zgodny z wynikiem dokowania AutoDock Vina.

8. Symulacja dynamiki molekularnej

1. Kliknij Plikuj > Nowy , aby wyczyścić przestrzeń roboczą. Następnie kliknij File > Load > YASARA Object i wybierz result.yob.
2. W panelu ZAWARTOŚĆ SCEN (po prawej stronie) rozwiń wszystkie wpisy Mol. Kliknij Edytuj > Podziel > Obiekt, zaznacz całą zawartość Mol w panelu Sekwencja i kliknij OK.
3. Kliknij Edytuj > Dołącz > Obiekt, zaznacz całą zawartość Mol oprócz pierwszego i ostatniego wpisu (ligand) i kliknij OK. Wybierz pierwszy wpis Mol i kliknij OK , aby ponownie połączyć białko.
4. Przejdź do ponownego numerowania komponentów. Wybierz Renumerację w Edytuj i kliknij Obiekty. To generuje dwie części: pierwsza to kompleks białko-receptor, a druga to ligand małocząsteczkowy.
5. Kliknij Edytuj > Przenieść, a następnie wybierz opcję Obiekt z listy rozwijanej. W panelu Sekwencji najpierw wybierz zawartość ligandu małocząsteczkowego, klikając odpowiadający mu wpis. Następnie wybierz zawartość receptora białkowego, klikając jego wpis i kliknij OK , aby potwierdzić wybraną parę.
6. W następnym oknie wyskakującego zaznacz opcję zaczynającą od Fix atoms na ekranie podczas transferu i kliknij OK.
7. Powtórz kroki 7.2 do 7.5, następnie kliknij Symulator > Temperatura i wybierz 298K. Kliknij File > Zapisz jako > scenie YASARA, nazwij plik sce\nesultrun.sce i kliknij OK.
8. Kliknij Plikuj > Nowy , aby wyczyścić przestrzeń roboczą. Następnie kliknij Opcje > Macro&Film > Ustaw cel, wybierz sce\nesultrun.sce i kliknij OK.
9. Upewnij się, że pole siłowe wybrane w kroku 7.4 jest również wykorzystywane do symulacji MD; Makro md_run.mcr zazwyczaj dziedziczy aktualne ustawienia pola siłowego. Kliknij Opcje > Macro&Film > Odtwórz makro, wybierz plik makro md_run.mcr i kliknij OK , aby rozpocząć symulację dynamiki molekularnej.
10. Wykonaj trzy niezależne symulacje MD (3 x 100 ns) o różnych początkowych prędkościach dla kompleksu białko-ligandowego oraz przeprowadź analizę statystyczną trzech trajektorii, aby zapewnić wiarygodność wyników. Podczas operacji generowane są pliki w formacie symulatora. Na przykład, jeśli trajektoria jest zapisywana co 100 ps, symulacja 100 ns wygeneruje 1000 plików z sufiksem sim.
11. Po ukończeniu kroku 8.10 kliknij Opcje > Makro&Film > Ustaw cel, wybierz plik sce\nesultrun.sce i kliknij OK.
12. Kliknij Opcje > Makro i Film > Makra odtwarzania, wybierz md_analyze.mcr, md_analyzebindenergy.mcr i md_analyzeres.mcr i kliknij OK.
13. Po zakończeniu wszystkich trzech analiz zostaną wygenerowane odpowiednie pliki danych result_run_analysis.tab, result_run_bindenergy.tab i result_run_analysisres.tab.
14. Najpierw przeanalizuj result_run_analysis.tab, który dostarcza 10 parametrów rdzeniowych: Energia (całkowita energia systemu), Wiązanie (energia wiązania), Kąt (energia kąta wiązania), Dihedral (energia kąta dihedralnego), Planarity (energia planarności), Coulomb (energia elektrostatyczna), VdW (energia van der Waalsa), CA (Cα RMSD białka RMSD), Backbone (białkowy szkielet RMSD) oraz HeavyAtoms (ciężki atom RMSD).
15. Wyodrębniaj kolumnę Czas (ns) oraz odpowiadające im kolumny parametrów, aby ocenić, czy układ osiąga równowagę energetyczną. Potwierdź stabilność systemu poprzez stabilizację energii potencjalnej w wąskim zakresie fluktuacji po początkowych 10–20 ns. Ocena stabilności konformacyjnej poprzez monitorowanie odchylenia pierwiastkowego i średniego kwadratu (RMSD) atomów Cα, szkieletu białka oraz atomów ciężkich. Symulacja została uznana za stabilną strukturalnie, gdy wartości RMSD osiągnęły plateau.
16. Jako empiryczne punkty odniesienia dla kompleksów białko-ligandów o typowych rozmiarach, wartości RMSD Cα i szkieletu stagnujące poniżej 2,5 Å, wraz z RMSD ciężkich atomów poniżej 3,5 Å, można uznać za wskaźniki wspierające stabilność konformacyjną. Co istotne, należy stosować kryterium podstawowe i obowiązkowe oraz obecność wyraźnej fazy plateau w trajektorii RMSD, zamiast wyłącznie ścisłego przestrzegania tych wartości liczbowych.
    UWAGA: Te wartości progowe są empiryczne i należy je interpretować w kontekście specyficznego rozmiaru i elastyczności białka. Decydującym wskaźnikiem zbieżności jest utrzymujący się płaskowyż, wskazujący, że struktura ustabilizowała się wokół spójnego zespołu konformacyjnego.
17. Następnie przeanalizuj result_run_bindenergy.tab, który dostarcza energii wiązania między ligandem a celem na trajektorii symulacyjnej. Oblicz średnią energię wiązania przez cały okres symulacji. W implementacji MM-PBSA w YASARA więcej wartości dodatnich wskazuje na silniejsze wiązanie. Umiarkowanie silna i stabilna interakcja jest zazwyczaj oznaczana przez średnią energię wiązania, która jest dodatnia i wystarczająco duża (wartość numeryczna jest zależna od systemu, ale można ją skalibrować na podstawie znanych wiązaczy lub danych eksperymentalnych), wraz z odchyleniem standardowym niewielkim względem średniej (np. współczynnikiem zmienności < 50 - 60%). odzwierciedlając ograniczone wahania podczas symulacji.
    UWAGA: Energia wiązania podana w tym kroku jest obliczana za pomocą rygorystycznej metody MM-PBSA, w przeciwieństwie do domyślnego makro energii wiązania YASARA, które stosuje szybsze przybliżenie (BoundaryFast). Domyślne przybliżenie nadaje się do szybkiego przesiewania lub porównań względnych, natomiast metoda MM-PBSA jest zalecana do uzyskania dokładniejszych bezwzględnych energii wolnych wiązania. Jak wyraźnie stwierdził autor w nagłówku YASARA: Więcej energii dodatnich oznacza lepsze wiązanie, energie ujemne NIE oznaczają braku wiązania. Dlatego użytkownicy powinni interpretować wartości dodatnie jako oznakę silniejszego wiązania, przy czym wielkość liczbowa zależy od konkretnego układu białko-ligand.
18. Na koniec przeanalizuj plik result_run_analysisres.tab, który zawiera dane dotyczące poszczególnych resztek, w tym Residue ID, RMSD, Backbone RMSD, HeavyAtoms RMSD oraz RMSF. Skup analizę na zidentyfikowanej stabilnej fazie produkcji. Po pierwsze, zidentyfikuj reszty w aktywnym miejscu docelowym (np. te w promieniu 5 Å od liganda). Następnie wykorzystaj te dane do oceny stabilności konformacyjnej tych pojedynczych pozostałości w aktywnym miejscu podczas symulacji.
    UWAGA: Jako empiryczne punkty odniesienia dla stabilnych pozostałości w aktywnym miejscu w kompleksach białko-ligand, wartości RMSF poniżej 1,0 Å oraz fluktuacje RMSD w zakresie 1 - 1,5 Å w fazie stabilnej są zazwyczaj uznawane za oznakę dobrze utrzymanych lokalnych konformacji. Pozostałości o RMSF przekraczającym 2,0 Å mogą wskazywać na większą elastyczność; Takie reszty powinny być mapowane na trójwymiarową strukturę, aby określić, czy odpowiadają funkcjonalnie istotnym elastycznym obszarom (np. pętle lub powierzchnie), czy wskazują na potencjalną niestabilność w kieszeni wiązającej. Te wytyczne numeryczne nie są regułami absolutnymi; Głównym kryterium jest brak dużego dryfu konformacyjnego, który należy oceniać w połączeniu z ogólną konwergencją systemu.
19. Po uporządkowaniu plików danych zaimportuj je do Prism, aby wygenerować odpowiadające im wykresy.

Wyniki

Po analizie farmakologii sieciowej loratadyny przeciwko alergicznemu nieżytu nosa (AR), wybrano interakcję między loratadyną a PTGS2 jako reprezentatywne studium przypadku, aby zilustrować krok po kroku zastosowanie molekularnego dokowania i protokołu symulacji MD. Ten przykład ma na celu pokazanie wykonania przepływu pracy i interpretacji danych, a nie biologiczną weryfikację konkretnej interakcji. Do oceny ilościowej względem danych eksperymentalnych użytkownicy są zachęcani do stosowania protokołu do dobrze scharakter...

Dyskusja

Znaczenie i kluczowe kroki
Protokół ten łączy farmakologię sieci, dokowanie molekularne oraz symulację dynamiki molekularnej, co oferuje wyraźne przewagi nad samodzielnymi metodami lub procesami z podwójnymi kombinacjami i może pomóc w rozwiązywaniu kluczowych nieefektywności i luk w niezawodności w obecnych odkryciach leków. Cały proces opiera się na trzech kluczowych etapach zapewniających jego niezawodność, z których każdy odpowiada na kluczowe wyzwanie w obliczeniowym przesiewaniu narkotyków. Po...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ADMETlab 3.0	Szanghajski Instytut Materii Medicy (SIMM), Chińska Akademia Nauk	Nie ma	Platforma internetowa do prognozowania właściwości ADMET (absorpcja, dystrybucja, metabolizm, wydalanie, toksyczność); Wykorzystywane do oceny profili farmakokinetycznych i toksykologicznych ligandów (URL:  https://admetlab3.scbdd.com/)
Narzędzia AutoDock (AutoDock 4)	Instytut Badawczy Scripps	AutoDock 4.2.6	pakiet oprogramowania do symulacji dokowania molekularnego; obejmuje AutoDock 4 do dokowania oraz AutoDockTools (ADT) do przygotowywania plików wejściowych białek i ligandów (dodawanie wodorów, przydzielanie ładunków, ustawianie więzów obrotowych), definiowanie siatek dokowania oraz analizę wyników dokowania.
AutoDock Vina	Instytut Badawczy Scripps	AutoDock Vina 1.1.2	Open-source oprogramowanie do dokowania molekularnego; Wykorzystywane do przewidywania powinowactw i pozycji wiązań między ligandami małocząsteczkowymi a receptorami białkowymi
Chem3D	PerkinElmer Informatics	Chem3D 2024	Oprogramowanie do modelowania molekularnego; Wykorzystywane do konstruowania, optymalizacji i wizualizacji trójwymiarowych struktur ligandów małych cząsteczek
Cytoscape	Konsorcjum Cytoscape (Instytut Biologii Systemów)	Cytoscape 3.10.3	oprogramowanie open source do wizualizacji i analizy sieci biologicznych; Wykorzystywane do budowy i edycji sieci interakcji gen/białko
DAVID (Baza danych do adnotacji, wizualizacji i zintegrowanego odkrywania)	Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID), USA	Nie ma	Narzędzie online do analiz adnotacji funkcjonalnej i wzbogacenia; wykorzystywany do przeprowadzania analiz wzbogacania ścieżek genów docelowych (GO (Gene Ontology) oraz KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (URL:  https://david.ncifcrf.gov/)
Baza danych DisGeNET	Centrum Superkomputerowe w Barcelonie (BSC)	Nie ma	Baza danych powiązań gen-choroba; Używany do identyfikacji genów powiązanych z konkretnymi chorobami (URL:  https://disgenet.com/)
Baza danych GeneCards	Instytut Nauki Weizmanna	Nie ma	Integratywna baza danych ludzkich genów; wykorzystywane do pozyskiwania kompleksowych informacji o genach (np. ekspresji, funkcji, skojarzeń z chorobą) (URL:  https://www.genecards.org/)
LigPlus	Europejskie Laboratorium Biologii Molekularnej – Europejski Instytut Bioinformatyki (EMBL-EBI)	LigPlus 2.3	Oprogramowanie do automatycznego generowania 2D diagramów interakcji białko-ligand z plików współrzędnych 3D. Schematycznie przedstawia wiązania wodorowe, kontakty hydrofobowe oraz reszty miejsc wiązania. Dostępne po rejestracji za pomocą akademickiego e-maila pod adresem NBSP; https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/ .
Baza danych OMIM	Szkoła Medyczna Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (we współpracy z NCBI)	Nie ma	Dziedziczenie Mendla w Internecie; wykorzystywane do wyszukiwania informacji o zaburzeniach genetycznych i powiązanych genach (URL:  https://www.omim.org/)
OpenBabel	Zespół deweloperski OpenBabel	Nie ma	Open-source skrzynka narzędzi chemicznych; używany do konwersji formatów plików molekularnych (np. z .mol2 na .pdb) między różnymi platformami programowymi
Baza danych PharmGKB	Uniwersytet Stanforda	Nie ma	Baza wiedzy farmakogenomiki; wykorzystywane do pozyskiwania informacji o interakcjach gen-lek i wariantach farmakogenomowych (URL:  https://www.pharmgkb.org/)
Pryzmat	Oprogramowanie GraphPad	Prism 9	Wykorzystywany do wykresów naukowych, analizy danych (np. do rysowania krzywych rozkładu energii wiązającej, analizy słupków błędów) oraz generowania wartości publikacyjnych.
ProTox 3.0	Dobroczynność i przenikliwość; - Universitä tsmedizin Berlin, Niemcy	Nie ma	Narzędzie online do przewidywania toksykologicznych punktów końcowych małych cząsteczek; Wykorzystywane do oceny potencjalnej toksyczności ligandów kandydatów (URL:  https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)
Baza danych PubChem	Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI), USA	Nie ma	Publiczna baza danych dotyczących chemikaliów; używany do pozyskiwania struktur 2D/3D oraz właściwości fizykochemicznych ligandów małych cząsteczek (URL:  https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
PyMOL	Schrö dinger, LLC	PyMOL 2.6.1	Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej; Wykorzystywane do oglądania, edycji i generowania wysokiej jakości obrazów kompleksów białko-ligandów
R Studio	Pozit, PBC	Rstudio 2025.09.1+401	Zintegrowane środowisko programistyczne (IDE) dla programowania w R; Wykorzystywane do analizy statystycznej danych biologicznych oraz generowania wykresów GO/KEGG
Baza danych RCSB PDB	Laboratorium Badawcze dla Bioinformatyki Strukturalnej (RCSB)	Nie ma	Baza danych struktur białek; używany do pobierania struktur 3D receptorów białkowych w formacie PDB (URL:  https://www.rcsb.org/)
SEA (Podejście zespołów podobnych)	Instytut Badawczy Scripps	Nie ma	Narzędzie online do przewidywania celów na podstawie podobieństwa chemicznego; używany do uzupełniania SwissTargetPrediction w celu potwierdzenia celów ligandowych (URL:  https://sea.bkslab.org/)
STRING	STRING Consortium (EBI, SIB itd.)	Nie ma	Baza danych znanych i przewidywanych interakcji białko-białko; Wykorzystywane do konstruowania sieci interakcji gen/białko (URL:  https://string-db.org/)
SwissTargetPrediction	Szwajcarski Instytut Bioinformatyki (SIB)	Nie ma	serwer online do przewidywania potencjalnych celów białkowych małych cząsteczek; Używany do identyfikacji receptorów kandydatów na ligandy (URL:  http://swisstargetprediction.ch/)
Baza danych TTD	Instytut Odkrywania i Rozwoju Leków (IDRBL), Uniwersytet Sun Jat-sena	Nie ma	Therapeutic Target Database; Wykorzystywane do pozyskiwania informacji o zweryfikowanych i potencjalnych celach leków (URL:  https://db.idrblab.net/ttd/)
UCSF Chimera	Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics (RBVI), University of California, San Francisco	UCSF Chimera 1.19	Oprogramowanie do wizualizacji i analizy molekularnej; wykorzystywane do przygotowania struktury białek, w tym rekonstrukcji brakujących pętli (za pomocą interfejsu Modeller), optymalizacji łańcuchów bocznych (biblioteka rotamerów Dunbrack), regulacji stanu protonacji oraz minimalizacji energii za pomocą pola siłowego AMBER ff14SB. Wersja 1.19 (wydana w marcu 2025) poprawia możliwości pobierania struktury PDB . Dostępne bezpłatnie do użytku niekomercyjnego na stronie   https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ .
Baza danych UniProt	Konsorcjum UniProt (EBI, SIB, PIR)	Nie ma	Kompleksowa baza danych sekwencji i funkcji białek; Używany do pobierania sekwencji, struktur i adnotacji funkcyjnych białek (URL:  https://www.uniprot.org/)
Venny 2.1.0	Centro Nacional de Biotecnologí a (CNB-CSIC), Hiszpania	Nie ma	Narzędzie online do generowania diagramów Venna; używany do wizualizacji nakładania się między zestawami genów (np. geny docelowe z różnych baz danych) (URL:  https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)
YASARA	YASARA Biosciences	YASARA 10.3.16	Oprogramowanie do modelowania i symulacji molekularnej; wykorzystywane do dokowania molekularnego (Krok 3.7) oraz późniejszych symulacji dynamiki molekularnej do weryfikacji wyników dokowania