Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Miografia drutowa dla tętnic oporowych grzbietowej i krezkowej u myszy i szczurów

574 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70186

⸱

27 lutego 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Oferujemy szczegółowy protokół miografii side-by-side wire, aby ocenić reaktywność naczyniową w przewodach w porównaniu do tętnic oporowych izolowanych od myszy i szczurów.

Streszczenie

Miografia drutowa to szeroko stosowana technika ex vivo do ilościowej oceny funkcji naczyń w tętnicach izolowanych. Ponieważ duże przewody i tętnice o małym oporze różnią się zasadniczo pod względem struktury i roli fizjologicznej, analiza obu klas naczyń równolegle za pomocą tętnic pobranych z tej samej myszy lub szczura umożliwia porównania parowe, które zmniejszają zmienność między zwierzętami i ujawniają specyficzne dla naczyń zmiany funkcjonalne. W tym artykule przedstawiono krok po kroku protokół oceny reaktywności naczyniowej w izolowanych myszych, przewodach i tętnicach oporowych za pomocą izometrycznej miografii drutowej. Opisujemy przygotowanie świeżego, natlenionego buforu fizjologicznego; staranne sekcjonowanie, czyszczenie i montaż segmentów tętnic; oraz normalizację, aby naczynia zbliżyły się do ich optymalnej długości do generowania siły aktywnej. Przedstawiono przewodnik po rozwiązywaniu problemów oraz przykładową sekwencję eksperymentalną generowania skumulowanych krzywych stężenia-odpowiedzi na standardowe naczynio-duszczące i wazodylatatory. Protokół ten pozwala na ilościowe pomiary funkcji zarówno śródbłonka, jak i mięśni gładkich oraz ułatwia wykrywanie specyficznych dla naczyń zmian w reaktywności naczyniowej związanych z chorobami naczyń, takich jak nadciśnienie.

Wprowadzenie

Nadciśnienie charakteryzuje się zmienioną reaktywnością naczyniową, taką jak dysfunkcja śródbłonka oraz nadreaktywność mięśni gładkich naczyń na zwężające naczynia1. Te zmiany funkcjonalne, wraz z przebudową i rozrzedzeniem mikronaczyń, przyczyniają się do upośledzenia perfuzji tkanek i zaburzenia ciśnienia krwi 2,3,4. Badania ex vivo naczyń izolowanych są potężnymi narzędziami do rozkładania mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących napięcie naczyniowe w zdrowiu i chorobie, ponieważ umożliwiają precyzyjną kontrolę mikrośrodowiska naczyniowego oraz selektywną farmakologiczną manipulację szlakami sygnalizacyjnymi mięśni gładkich i śródbłonka.

Reaktywność naczyń w izolowanych tętnicach jest powszechnie oceniana za pomocą dwóch komplementarnych technik ex vivo: miografii drutowej oraz miografii ciśnieniowej 5,6. W miografii drutowej pierścienie lub segmenty naczyń są mocowane na szpilkach lub drucie, a siła izometryczna jestrejestrowana 7,8. W miografii ciśnieniowej nienaruszone segmenty naczyń są kanulowane i ciśnione pod ciśnieniem określonym wewnątrzświatłowym, a średnica naczynia jest śledzona za pomocą mikroskopii wideo9. W przeciwieństwie do miografii druciowej, miografia ciśnieniowa pozwala kontrolować ciśnienie transmuralne i przepływ wewnątrzświatłowy. W ten sposób dokładniej oddaje środowisko hemodynamiczne in vivo tętnic oporowych i jest powszechnie wykorzystywane do badania tonu miogennego, odpowiedzi pośredniczonych przepływem oraz właściwości strukturalnych lub mechanicznych naczyń 9,10. Z kolei miografia drutowa jest technicznie łatwiejsza do wdrożenia (brak kanylacji ani mikroskopii wideo), umożliwia wyższą przepustowość przy użyciu komercyjnych systemów wielokomorowych i jest dobrze przystosowana do generowania powtarzalnych krzywych koncentracji-odpowiedzi farmakologicznej w tętnicach małych i średnich o średnicach rzędu od dziesiątek do kilkuset mikrometrów 5,6. W związku z tym często preferuje się miografię drutową do równoległego profilowania farmakologicznego reaktywności naczyniowej w tętnicach przewodowych i oporowych izolowanych od myszy lub szczurów.

Arterie przewodowe (duże elastyczne) i oporowe (małe mięśnie) różnią się zasadniczo pod względem struktury i funkcji, a te różnice determinują odrębne rozważania eksperymentalne i punkty końcowe. Tętnice przewodowe (np. zstępująca aorta piersiowa) zawierają duże ilości tkanki slastkiej i znaczną masę mięśni gładkich; Tętnice oporowe (np. tętnice krezkowe) mają stosunkowo większy stosunek gładkich mięśni do lumenów i są głównymi czynnikami determinującymi opór obwodowy oraz lokalną autoregulację11,12. Ponieważ ten sam agonista może aktywować różne odpowiedzi molekularne w tych warstwach naczyń, porównanie przewodów i naczyń oporowych tego samego zwierzęcia dostarcza cennych uzupełniających informacji. Na przykład w tętnicach przewodów uwalnianie tlenku azotu pochodzącego z śródbłonka jest dominującą drogą rozluźniającą acetylocholinę (ACh) indukującą relaksację naczyń13,14. Natomiast w tętnicach o małym oporze ACh wywołuje relaksację za pomocą tlenku azotu, prostacykliny oraz, co ważne, czynników hiperpolaryzujących pochodzących z śródbłonka (EDHF)15,16. W związku z tym, miografia przewodowa side-by-side tętnic przewodów i oporu pobranych od tej samej myszy lub szczura umożliwia parowe porównania, które ułatwiają wykrywanie specyficznych dla naczyń zmian funkcjonalnych, jednocześnie zmniejszając zmienność między zwierzętami.

Dokładna interpretacja danych z miografii drutowej zależy od dokładnej uwagi wobec zestawu zmiennych technicznych: składu i tlenienia roztworu soli fizjologicznej (PSS), obsługi i sekcji tkanek, techniki montażu, optymalnego pretensji spoczynkowego (normalizacji), temperatury kąpieli oraz wyboru odpowiednich kontrol farmakologicznych6. Normalizacja odnosi się do technicznej procedury ustalania mechanicznego punktu pracy statku tak, aby zoptymalizować rozwój siły aktywnej i przybliżać warunki pracy fizjologicznej5. W praktyce, dla pierścieni aortalnych, powszechną praktyką jest stosowanie stałego pretensji, często określanego empirycznie, aby uniknąć nadmiernego rozciągania przy jednoczesnym dawaniu stabilnych reakcji. W przypadku tętnic o małym oporze normalizacja polega najpierw na określeniu obwodu wewnętrznego odpowiadającego równoważnemu ciśnieniu transmuralnemu 100 mmHg (IC100). Następnie naczynie ustawia się na określony ułamek tej wartości, aby ustalić znormalizowany obwód wewnętrzny (IC1). W praktyce wiele protokołów ustawia IC1 w pobliżu 0,9 × IC100 dla MRA szczurów i około 1,0 × IC100 dla MRA myszy, choć wartości te mogą być dostosowywane w zależności od typu naczynia, gatunku i celów eksperymentalnych 5,17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z ustalonymi wytycznymi i został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kampusu Nauk Zdrowia Uniwersytetu w Toledo.

UWAGA: Zanim zaczniesz, prosimy o przestrzeganie wytycznych Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) oraz Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Instytucjonalnego (IBC) przez cały czas; używanie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE); zachowanie ostrożności przy użyciu narzędzi chirurgicznych lub innych ostrych; konsultować się i przestrzegać odpowiednich kart bezpieczeństwa (SDS) podczas obsługi chemikaliów i tkanek biologicznych; obsługa gażoniku jako ciśnieniowej butli gazowej przy użyciu zatwierdzonych regulatorów i bezpiecznego przechowywania; oraz utylizować odpady biologiczne i chemiczne zgodnie z procedurami instytucjonalnymi.

1. Przygotowanie bufora z wodorowęglanem PSS/zmodyfikowanego Krebsa (Krebs)

UWAGA: Skład buforowy Krebsa (końcowe stężenia, pH 7,4): 130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mM KH2PO4, 1,6 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glukozy i 0,03 mM EDTA.

  1. Przygotuj zapas o dużej objętości: rozpuszcz wszystkie składniki oprócz NaHCO3, glukozy i CaCl2 w wodzie podwójnie destylowanej, aby stworzyć bulion. Przechowuj ten zapas w temperaturze 4 °C.
  2. W dniu eksperymentu należy aliquotować wymaganą objętość zapasu (np. 1 L), kolejno dodawać NaHCO3, glukozę i CaCl2, a następnie ciągle tlenić karbogen (95% 02/5%CO2).
    UWAGA: Aby zminimalizować wytrącanie soli wapniowej, przygotuj i przechowuj bulion 1 M CaCl2 w temperaturze 4 °C i powoli dodawaj wymaganą objętość do bufora dopiero po pełnym rozpuszczeniu NaHCO3 , mieszając ciągłie. Utrzymuj bulgotanie węglowodanów podczas dodawania CaCl2 (patrz krok 1.3), aby ograniczyć powstawanie węglanu wapnia. Jeśli wystąpią widoczne opady, wyrzuć i przygotować świeży bufor.
  3. Aby wyrównać pH, bąbelkuj bufor karbogenem przez co najmniej 20 minut, następnie zmierz pH i w razie potrzeby dostosuj pH do 7,4.
    UWAGA: Typowe pH przed bulgotaniem ≈ 7,7; ciągłe bąbelki obniżają pH do fizjologicznych ≈7,4.
  4. Przygotuj komory myografu, napełniając je świeżo przygotowanym buforem Krebsa i zacznij delikatnie bulgotować węglowodem. Dostosuj tempo bąbelków, aby zapewnić odpowiednią wymianę gazów bez gwałtownego mieszania.
  5. Zarezerwuj aliquot świeżo przygotowanego, natlenionego bufora Krebsa i schłodzić go na lodzie do sekcji tkanek. Podgrzej pozostałą tlenową buforową temperaturę do 37 °C (z ciągłym bulgotaniem węglowodanów) do wykorzystania podczas eksperymentów.

2. Rozwarstwienie zstępującej aorty piersiowej i arkady krezkowej

  1. Uśpić zwierzę zgodnie z wytycznymi IACUC. Ustandaryzuj czas eutanazji i pobrania tkanek w ciągu 2 godzin, aby zminimalizować potencjalne efekty okołodobowe.
  2. Natychmiast otwórz jamę klatki piersiowej i brzusznej przez nacięcie w linii środkowej i odbij ścianę klatki piersiowej bocznie, odsłaniając serce i naczynia wielkie.
    UWAGA: Nie wykonuj perfuzji systemowej w standardowych warunkach, ponieważ może to nieumyślnie spowodować uszkodzenie śródbłonka. Ponadto zatrzymana krew w naczyniach krezkowych poprawia rozróżnienie wzroku między tętnicami a żyłami oraz ułatwia ocenę integralności tętnic. Jednak w niektórych modelach patologicznych (np. zaburzenia zakrzepowe) zaleca się delikatną, niskociśnieniową perfuzję z heparynizowanym, lodowatym buforem fizjologicznym, aby usunąć zatykające zakrzepy przy jednoczesnym minimalizowaniu uszkodzenia śródbłonka.
  3. Usuń zstępującą aortę piersiową. Aby ułatwić sekcję, usuń płuca i przełyk dla lepszej wizualizacji. Nie chwytaj bezpośrednio zstępującej aorty piersiowej; zamiast tego delikatnie trzymaj łuk aorty lub tłuszcz około-przygodowy, lekko unieś i ostrożnie odetnij naczynia międzyżebrowe od spodu aorty. Usuń zstępującą aortę piersiową, przecinając tuż przed przejściem przez przeponę i umieść ją w szalce Petriego pokrytej powłoką Sylgarda, zawierającej lodowato natleniony bufor Krebsa.
    UWAGA: Utrzymuj niską temperaturę, aby zminimalizować spontaniczny ton i zachować żywotność. Black Sylgard zwiększa kontrast podczas sekcji naczyń.
  4. Wyciąć całą krezkową arkadę. Delikatnie unieś arkadę krezkową, aby zlokalizować tętnicę krezkową górną rozgałęzioną od aorty odbrzusznej ogonowej do przepony. Przetnij tętnicę krezkową górną proksimalnie i uwolnij arkadę krezkową od otaczającej tkanki łącznej bez bezpośredniej manipulacji naczyń. Umieść arkadę krezkową w osobnej szalce Petriego pokrytej powłoką Sylgarda, zawierającej lodowato natleniony bufor Krebsa.

3. Izolacja i montaż pierścieni aortowych na miografach z szpilkami

  1. Przypięć bliższe i dalsze końce schodzącej aorty piersiowej szpilkami do przecięcia, aby wyprostować naczynie. Unikaj nadmiernego rozciągania, aby zapobiec uszkodzeniom mechanicznym.
    UWAGA: Umieść szpilki w tłuszczu periadentywnym, a nie przez ścianę naczynia, aby zminimalizować uszkodzenia.
  2. Pod stereomikroskopem z zewnętrznym źródłem światła ostrożnie usuń tłuszcz okosemnowy i tkankę łączną za pomocą cienkich nożyczek Vannas i kleszczy. Unikaj uszkodzenia ściany naczynia.
    UWAGA: Powszechną praktyką jest usuwanie tłuszczu okołośowego, chyba że celem jest badanie roli tkanek przyrodo-naczyniowych w regulacji napięcia naczyniowego.
  3. Wytnij pierścienie aortalne o średnicy 2 mm, wykonując czyste, prostopadłe cięcia. Usuwaj pierścienie, które są przebite lub widocznie uszkodzone. Gdy to możliwe, próbkować porównywalne lokalizacje u różnych zwierząt, aby zminimalizować zmienność.
  4. Odłącz jedną komorę zawierającą natleniony bufor Krebsa od maszyny do miografii i ostrożnie przetransportuj ją do stereomikroskopu.
    UWAGA: Potrząsanie komorą może wpłynąć na przetwornik i wpłynąć na wyniki, więc trzymaj komorę ostrożnie i delikatnie odłóż.
  5. Pod stereomikroskopem użyj mikrometru, aby zbliżyć piny myografu i przesunąć pierścień aorty na te piny, minimalizując manipulacje powierzchnią światła.
  6. Zwróć uwagę na odczyt mikrometru przy całkowicie rozluźnionym pierścieniu; Delikatnie rozciągnij tkankę, aby zabezpieczyć ją przed transportem.
  7. Podłącz komorę do instrumentu i przywróć naczynie do pierwotnego odczytu mikrometru.
  8. Po zamontowaniu wszystkich pierścieni podgrzej komory do 37 °C i monitoruj temperaturę dostarczoną sondą (zazwyczaj 20-30 minut, by osiągnąć 37 °C).
  9. Wyzeruj odczyty siły w interfejsie użytkownika, uruchamiaj oprogramowanie do akwizycji danych i rozpocznij nagrywanie.
  10. Stopniowo stosuj napięcie pierścieni aorty do wartości stałej odpowiedniej dla naczynia za pomocą mikrometru.
    UWAGA: Typowa wartość napięcia dla pierścieni aorty myszy wynosi 5 miliniutonów (mN)5. Chociaż zgłaszane wartości pretensji dla pierścieni aorty szczurów różnią się w zależności od badań, wcześniejsza optymalizacja wspiera pretensję 10 mN w tym protokole18.
  11. Wyrównuj pierścienie aortalne przez 45-60 minut przy wybranym napięciu, z powtarzanymi zmianami bufora przy użyciu 37 °C Krebsa.
    UWAGA: Często pierścienie aortalne częściowo tracą napięcie, przez co wymagają drobnej regulacji napięcia kilkukrotnie za pomocą mikrometru, zanim napięcie się ustabilizuje.
  12. Zeruj odczyty siły na interfejsie użytkownika przed rozpoczęciem protokołów eksperymentalnych.

4. Izolacja i montaż MRA na myografach przewodowych

  1. Przypięć arkadę krezkową zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyprostować gałęzie krezkowe. Zacznij od zabezpieczenia naczyń, a następnie przypiąć kolejne rozciągnięcia jelita cienkiego zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby delikatnie naprężyć naczynia krezkowe bez nadmiernego rozciągania. Wymień bufor na świeże Krebs w razie potrzeby, aby usunąć krew lub zanieczyszczenia.
  2. Zidentyfikuj górną tętnicę krezkową w centrum naczynia, gdzie promieniują arkady.
  3. Wybierz odpowiedni MRA do izolacji; Typowe cele: średnica wewnętrzna 200-250 μm (ustalana później podczas normalizacji).
    UWAGA: U dorosłych zwierząt doświadczalnych zazwyczaj odpowiada to 2 gałęziomrzędu u myszy oraz 3 gałęziom rzędurzędu 1 u szczurów. Kolejność gałęzi definiowana jest przez kolejne bifurkacje względem tętnicy krezkowej górnej. Gałązki pierwszego rzędu wywodzą się bezpośrednio z tętnicy krezkowej górnej, 2 gałęzie rzędudrugiego rzędu z gałęzi pierwszego rzędu i tak dalej.
  4. Pod stereomikroskopem rozciń towarzyszącą żyłę i usuń tłuszcz okołoadzeniowy oraz tkankę łączną za pomocą nożyczek Vanna i cienkich kleszczy.
    UWAGA: MRA można odróżnić od żył po grubszych ścianach i mniejszych lumenach, które łatwo można zobrazować po obecności pozostałej krwi wewnątrzświatłowej.
  5. Rozluźnij pobliskie szpilki jelitowe, które rozciągają ścianę jelita przylegającą do wybranego naczynia, zanim wycinasz tętnicę, aby zapobiec jej odrzutowi.
  6. Wyciąć całą długość wybranego MRA (powinien mieć długość >2 mm), wykonując czyste, prostopadłe cięcia. Za pomocą cienkich kleszczy należy chwycić jeden koniec tętnicy i przenieść go do czystej szalki Petriego zawierającej lodowato zimny bufor Krebsa (zwykłe, niepowlekane naczynia Sylgard ułatwiają późniejsze montaże). Sprawdź tętnicę pod kątem uszkodzeń; Obecność krwi wewnątrzświatłowej ułatwia wizualną ocenę integralności.
  7. Wyciąć segment o grubości około 2 mm z nienaruszonego obszaru. Usuń wszystkie obszary, które były dotykane podczas transportu lub wykazują widoczne uszkodzenia.
    UWAGA: Użycie przezroczystych naczyń niepokrytych powłoką Sylgard pozwala umieścić linijkę pod talerzem, aby dokładnie zmierzyć długość naczynia.
  8. Przygotuj dwa odcinki drutu ze stali nierdzewnej o długości 2,5 cm 40 μm do montażu.
  9. Używając cienkich kleszczy, ostrożnie przeciągaj przewody, jeden po drugim, przez lumen, aby z obu końców wystające były wystarczające druty do montażu. Minimalizuj uraz śródbłonka. Po włożeniu obu przewodów zapisz dokładną długość linijką do użycia w procedurze normalizacji (patrz krok 5.2).
    UWAGA: To jeden z najbardziej technicznych i czasochłonnych etapów protokołu, wymagający cierpliwości i powtarzających się ćwiczeń, aby zminimalizować uszkodzenia śródbłonka. Po włożeniu pierwszego przewodu często łatwiej jest zacisnąć oba przewody razem i przesunąć je przez naczynie.
  10. Odłącz jedną komorę zawierającą natleniony bufor Krebsa od maszyny do miografii i ostrożnie przetransportuj ją do stereomikroskopu.
  11. Pod stereomikroskopem przenieś MRA (druty trzymające na obu końcach) do komory myografu. Za pomocą mikrometru zbliż szczęki myografu, aby zacisnąć końce drutów między nimi, tak aby tętnica była swobodnie zawieszona między nimi.
    UWAGA: Na tym etapie zaleca się zacisnąć przewody tak, aby leżały na sobie. To zabezpiecza przewody na miejscu i zapobiega ich skręcaniu.
  12. Przymocuj górny przewód pod śrubami montażowymi po stronie blisko mikrometru, owijając końce zgodnie z ruchem wskazówek zegara; Powtórz to dla drugiego przewodu po stronie przetwornika.
    UWAGA: Dokręć śruby delikatnie, ale mocno. Jeśli śruby są zbyt luźne, naczynie może się ześlizgnąć; jeśli przewód lub przetwornik zostanie zbyt mocno dokręcony, może ulec uszkodzeniu. Po zamocowaniu pierwszego końca lekko rozwiąż szczelinę między szczękami myografu, zanim zabezpiecz przeciwległy koniec, aby zapewnić równomierne napięcie drutu.
  13. Delikatnie rozstaw szczęki i wyrównaj przewody tak, by leżały równolegle i współpłaszczyznowo, niemal się stykając.
    UWAGA: Wszystkie regulacje przewodów wykonuj z dala od zamontowanego naczynia, aby zminimalizować uszkodzenia.
  14. Powtarzaj montaż dla wszystkich MRA.
  15. Podgrzewanie komor do 37 °C i monitorowanie temperatury (typowo 20-30 minut).
  16. Zeruj odczyty siły na interfejsie użytkownika przed rozpoczęciem procedury normalizacji.

5. Procedura normalizacji MRA

UWAGA: Pierścienie aortalne są montowane na stałym, z góry określonym napięciu. Dlatego nie wykonuje się osobnego etapu normalizacji.

  1. Ustaw parametry normalizacyjne w oprogramowaniu do akwizycji danych: kalibracja okularu = 1; ciśnienie docelowe = 13,3 kPa (≈ 100 mmHg); znormalizowany obwód wewnętrzny (IC1) = 0,9 dla MRA szczurów i 1,0 dla MRA myszy; czas uśredniania = 2 s; opóźnienie = 60 s.
  2. Wprowadź parametry specyficzne dla naczynia do modułu normalizacyjnego w następujący sposób:
    1. Dla punktów końcowych tkanek (mm): ustaw a1 = 0 oraz a2 = zmierzoną długość MRA w milimetrach (dokładna długość zarejestrowana podczas wycięcia).
    2. Wprowadź średnicę przewodu: 40 μm.
    3. Odczyt mikrometru: wpisz wartość bazową mikrometru zarejestrowaną przy zamontowaniu i pełnym rozluźnieniu naczynia.
  3. Rozpocznij procedurę normalizacji od stopniowego rozciągania zamontowanego MRA w krokach po 50 μm. Po każdym rozciągnięciu wprowadź nowy odczyt mikrometru do modułu normalizacyjnego i odczekaj 60 sekund między kolejnymi krokami.
    UWAGA: Nagłe spadki napięcia po regulacji mikrometru zwykle wskazują na przesunięcie naczynia. Śruby mocujące należy dokręcać delikatnie, ale mocno.
  4. Poczekaj, aż moduł normalizacyjny wykreśli napięcie ściany spoczynkowej (mN/mm) względem obwodu wewnętrznego (μm) i dopasuje krzywą wykładniczą. Za pomocą mikrometru kontynuuj stopniowe rozciąganie, aż krzywa napięcia i obwodu przecina izobar o średnicy 100 mmHg. W pobliżu skrzyżowania zmniejsz długość kroku do 10-30 μm, aby uniknąć nadmiernego rozciągnięcia naczynia.
  5. Gdy krzywa przecina izobar o średnicy 100 mmHg, należy zauważyć obwód wewnętrzny obliczony przez oprogramowanie i ustaw mikrometr na odpowiadającą wartość obliczoną przez moduł, tak aby preparat spoczywał na docelowym normalizowanym obwodzie wewnętrznym (IC₁).
    UWAGA: Słabe dopasowanie krzywej zwykle oznacza nieprawidłowe parametry wprowadzone do oprogramowania, takie jak długość tkanki, średnica drutu czy odczyty mikrometru.
  6. Powtórz procedurę normalizacji dla wszystkich zamontowanych MRA, a następnie pozwól naczyniom na równowagę przez 30-45 minut z powtarzanymi zmianami buforów przy użyciu 37 °C Krebsa.
  7. Zresetuj odczyty siły na interfejsie użytkownika tuż przed rozpoczęciem eksperymentów.
    UWAGA: Kluczowe różnice parametrów między myszami a szczurami są podsumowane w Tabeli 1.
ParametrMyszSzczur
Wartość pretensji dla pierścieni aortowych5 mN10 mN
Docelowy stosunek IC1 dla MRA10.9
Typowe zamówienie gałęzi MRA dla średnicy wewnętrznej 200-250 μm2.3.– czwarty dzień

Tabela 1: Kluczowe różnice parametrów między myszami a szczurami.

6. Protokół eksperymentalny (przykładowa sekwencja)

  1. Sprawdzenie żywotności: Wywołanie odpowiedzi kurczliwej przy depolaryzującym wyzwaniu wysokim K⁺ (np. 120 mM KCl).
    UWAGA: Bufor o wysokiej wartości K⁺ (KPSS) jest przygotowywany przez równomolarne podstawienie NaCl z KCl ze standardowego buforu Krebsa, aby utrzymać osmolarność i jest nieprzerwanie tlenowany 95% O2/5%CO2. Aby uniknąć szoku zimnego, podgrzej KPSS do 37 °C przed użyciem. Skład buforu KPSS (końcowe stężenia, pH 7,4): 120 mM KCl, 14,7 mM NaCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mM KH2PO₄, 1,6 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glukozy i 0,03 mM EDTA.
  2. Wykonaj co najmniej trzy kolejne płukania świeżym buforem Krebsa o temperaturze tlenowym 37 °C, aż przywróci stabilne pasywne napięcie podstawowe.
    UWAGA: Wszystkie etapy mycia wykonuje się przez całkowite usunięcie roztworu kąpielowego i zastąpienie go świeżym, tlenowym buforem Krebsa o stężeniu 37 °C. Komercyjne miografy często mają wbudowaną funkcję płukania, która odprowadza odwadniające komory miograficzne.
  3. Generuj skumulowaną krzywą stężenia-odpowiedzi (CRC) do fenylefryny (PE), dodając rosnące stężenia (przykładowy zakres 10⁻9 do 10⁻4 M). Pozwól, by każde stężenie się ustabilizowało przed dodaniem kolejnego, aż osiągniemy stabilny maksymalny plateau.
  4. Wykonaj co najmniej trzy kolejne płukania świeżym buforem Krebsa o temperaturze tlenowym 37 °C, aż przywróci stabilne pasywne napięcie podstawowe.
  5. Ocena funkcji śródbłonka: Wstępne zwężenie przy submaksymalnym stężeniu PE, pozwól na stabilizację odpowiedzi, a następnie oceniaj relaksację zależną od śródbłonka za pomocą ACh (przykładowy zakres 10⁻⁹ do 10⁻⁵ M). Pozwól każdej koncentracji osiągnąć plateau przed dodaniem kolejnej, aż osiągniesz stabilne maksymalne rozluźnienie. Zarejestruj procentowy relaks względem tonu zwężonego (patrz krok 7.4). Preparaty wykazujące relaksację <70% są wyłączone.
    UWAGA: Choroby ścian naczyń, takie jak nadciśnienie, często wiążą się z dysfunkcją śródbłonka, co często prowadzi do zaburzonej reakcji naczyniowej zależnej od śródbłonka naACh 19. W tych warunkach preparaty wykazujące relaksację <70% nie powinny być automatycznie wyłączone, ponieważ może to oznaczać prawdziwą dysfunkcję śródbłonka związaną z chorobą, a nie awarię techniczną.
  6. Wykonaj co najmniej trzy kolejne płukania świeżym buforem Krebsa o temperaturze tlenowym 37 °C, aż przywróci stabilne pasywne napięcie podstawowe.
  7. Testuj inne środki naczyniowe, zarówno z inhibitorami specyficznymi dla szlaków, jak i bez, zgodnie z wymaganiami pytania eksperymentalnego.
  8. Na koniec eksperymentu usuń wszystkie zamontowane naczynia, wyczyść wszystkie komory kwasem octowym 8%, następnie trzykrotnie przemyć wodą, a na końcu wyłączyć zbiornik gazu i maszynę.
  9. Utylizacja odpadów biologicznych i chemicznych zgodnie z procedurami instytucjonalnymi.

7. Analiza i raportowanie danych

  1. Definicja bazowa i nagrywanie. Zapisz napięcie wyjściowe tuż przed rozpoczęciem każdego wyzwania wazodurcowego (np. wyzwanie wysokiego K⁺, CRC zwężającego naczynia lub preskurczowanie przed CRC rozszerzającym naczynia).
    UWAGA: Do dalszej analizy praktycznie łatwiej jest wyzerować odczyty siły na interfejsie użytkownika po odpowiednim myciu wcześniejszej stymulacji, tuż przed rozpoczęciem jakiegokolwiek wyzwania wazozdusującego (czyli wyświetlane napięcie bazowe = 0).
  2. Wyzwanie High-K⁺. Oblicz siłę czynną jako: Siła czynna = Maksymalny ton po KCl - Napięcie bazowe (jednostki: mN). Wyrazić siłę czynną znormalizowaną do jednostki długości (mN/mm) lub przekroju poprzecznego (mN/mm 2) zamontowanego segmentu tętnicy. Pomiar powierzchni przekroju poprzecznego wymaga późniejszej analizy histologicznej zamontowanych segmentów tętnicy w celu określenia grubości ściany.
    UWAGA: Ponieważ pierścienie aorty często wywołują odpowiedź nieplateauującą, należy zmierzyć maksymalną odpowiedź wysokiego K⁺ w określonym czasie (np. 10 minut) we wszystkich preparatach, aby zminimalizować zmienność. W MRA maksymalna odpowiedź wysokiego K⁺ zwykle osiąga się w ciągu kilku sekund po stymulacji.
  3. Kurczliwe CRC. Dla każdego stężenia w kurczliwym skumulowanym CRC (np. PE) oblicz siłę czynną w następujący sposób. Wyraź siłę aktywną przy każdej koncentracji jako procent odpowiedzi wywołanej przez wyzwanie o wysokim K⁺. Użyj tych wartości procentowych do dopasowania kurczliwych CRC (patrz krok 7.5).
    Siła aktywna = Maksymalny ton po zastosowaniu leku - Napięcie bazowe (jednostki: mN)
    UWAGA: Niektóre warunki mogą powodować zmienność maksymalnych odpowiedzi wysokich K⁺ w zależności od preparatów (np. zmiany masy mięśni gładkich lub stan różnicowania wynikający z patologii). W tych warunkach wyraża się siłę czynną przy każdym stężeniu znormalizowaną do jednostki długości (mN/mm) lub przekroju poprzecznego (mN/mm 2) zamontowanego segmentu tętniczego.
  4. Relaksujące CRC. Dla relaksacyjnych CRC po submaksymalnym prezwężeniu (tonu prezwężenia) oblicz procentową relaksację przy każdym stężeniu w następujący sposób. Użyj tych wartości procentowych do dopasowania CRC relaksacyjnych (patrz krok 7.5).
    Relaksacja = (Ton przedzwężający – Ton po zastosowaniu leku) / (Ton przedzwężający – napięcie wyjściowe) × 100.
  5. Dopasowywanie krzywizny. Dla skumulowanych CRC kurczliwych lub relaksujących narysuj log [stężenie agonisty] na osi x w porównaniu do normalizowanej odpowiedzi na osi y. Dopasuj wykreśloną krzywą czteroparametrowym modelem logistycznym z wykorzystaniem regresji nieliniowej. Ekstrakt Emax (maksymalny efekt) i pEC50 (−logEC50) dla porównań statystycznych, gdzie EC50 to stężenie agonisty generujące 50% Emax.
  6. Prezentacja danych: Przedstawienie znormalizowanych CRC. Dla każdego z punktów danych na krzywej używamy średniej grupy ± błędu standardowego średniej (SEM) lub odchylenia standardowego (SD). Należy uwzględnić reprezentatywne oryginalne ślady i dostarczyć tabelę parametrów podsumowującą wartości Emax ipEC 50 (średnia ± SEM lub SD).
  7. Analiza statystyczna:
    1. Porównaj CRC między grupami eksperymentalnymi za pomocą dwukierunkowej powtarzanej analizy wariancji (ANOVA) z odpowiednim testem post-hoc (np. Bonferroni). Jednak sprawdzać założenia (sferyczność, normalność) i stosować alternatywne podejścia (np. modele efektów mieszanych), gdy brakuje lub jest niezrównoważona z danymi.
    2. Porównaj pEC50 iE max między dwiema grupami eksperymentalnymi za pomocą niesparowanego testu t lub jednokierunkowego ANOVA, jeśli porównujemy więcej niż dwie grupy eksperymentalne. Alternatywnie, stosuj testy nieparametryczne, gdy założenia wariancji dotyczące jednorodności i normalności są naruszane. Ustaw istotność statystyczną na p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat przedstawiający ogólny przebieg miografii drutowej w tętnicach przewodowych i oporowych izolowanych od myszy lub szczurów przedstawiono na Rysunku 1. Reprezentatywne obrazy izolacji i montażu pierścienia piersiowego aorty myszy oraz MRA drugiego rzędu pokazano odpowiednio na Rysunku 2 i Rysunku 3. Zrzuty ekranu oprogramowania przedstawiające procedury pretension i normalizacji z użyciem pierścienia aortowego szczu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Miografia drutowa pozostaje potężnym, wysokorozdzielczym podejściem do badania funkcji naczyniowych ex vivo. Przy starannym zastosowaniu metoda ta dostarcza wiarygodnych ilościowych punktów końcowych, które odpowiadają na różne pytania biologiczne, jednocześnie umożliwiając rygorystyczne porównanie łóżek makro- i mikronaczyniowych w obrębie tego samego zwierzęcia. Badania tętnic przewodowych ujawniają zmiany w globalnej mechanice tętnic i reaktywności dużych naczyń istotnych dla ciśnienia pulsacyjnego i sztywnoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Prace były wspierane przez nagrodę NHLBI (R00 HL153896 dla I.O.) oraz fundusze początkowe Uniwersytetu w Toledo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowe rurki do wirówek o pojemności 15 mLThermo Fisher Scientific14-959-70C
Stożkowe rurki wirówkowe 50 mLThermo Fisher Scientific14-959-49A
Kwas octowyThermo Fisher ScientificA490-212
AcetylocholinMillipore SigmaA6625-100G
Analityczna równowagaMettler ToledoMX304
CaCl2Thermo Fisher ScientificC79-500
Węglowodan (95% O2/5% CO2)AirgasCD USP50
Mikroskop sekcjonacyjny  ZEISSZEISS Stemi 305
Sekcja szalki PetriegoInstrumentacja systemów żywychDD-90-S-BLK
Szpilki do sekcjiDuńska technologia Myo400626
Zestaw narzędzi do sekcjiDuńska technologia Myo101017Zestaw składa się z nożyc do sekcji (1), nożyczek wielofunkcyjnych (1), szalek Petriego (5), kleszczy (3) oraz szpilek do sekcji.
Dumont #5 - Cienkie kleszczeNarzędzia Nauki Ścisłej11254-20
EDTAThermo Fisher ScientificBP2482-500
Zamrażarka (-20 i stopni; C)Thermo Fisher ScientificTSG2325FA
Pudełka zawiasowe do zamrażarkiUSA Scientific2310-5848
Rękawice (duże)Thermo Fisher Scientific19-041-171D
Rękawice (średnie)Thermo Fisher Scientific19-041-171C
Rękawice (małe)Thermo Fisher Scientific19-041-171B
GlukozaThermo Fisher ScientificD16-500
Cylindr z podziałemThermo Fisher Scientific08-572G
GraphPad PrismOprogramowanie GraphPadNie maAnaliza danych i prezentacja graficzna
Roztwór kwasu solnegoThermo Fisher ScientificSA48-1
Wiadro z lodemThermo Fisher Scientific03-395-156
KClThermo Fisher ScientificP217-500
KH2PO4Thermo Fisher ScientificP380-500
Oprogramowanie LabChart 8AD InstrumentsNie maOprogramowanie do przechwytywania danych
Lodówka laboratoryjnaThermo Fisher ScientificFBG49RPGA
Źródło światła LEDThermo Fisher ScientificAMPSILED21
Mieszadło magnetyczneThermo Fisher ScientificFB30786159
Magnetyczne mieszadłowe batony (duże)Thermo Fisher Scientific14-513-68
Magnetyczne mieszadłowe batony (średnie)Thermo Fisher Scientific14-513-61
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63-500
Zestaw do próbek mikrołyżek i szpatułThermo Fisher ScientificS43322
Rurki mikrowirówkoweUSA Scientific1615-5510
Mini mikrowirówkaThermo Fisher Scientific07-203-954
Mini-śrubokrętThermo Fisher ScientificNC1349489
System wieloprzewodowy miografuDuńska technologia MyoDMT 620M
NaCl Thermo Fisher ScientificS271-3
NaHCO3Thermo Fisher ScientificS233-500
Miernik pHThermo Fisher Scientific01-912-351Zawiera miernik pH, czujnik LE420, instalacyjny QuickGuide oraz pakiet startowy bufora pH
Fenylefryna  Millipore SigmaP6126-5G
Kontroler PipetThermo Fisher Scientific01-001-023
Końcówki pipetek w stojakach (10 & micro; L)USA Scientific1111-3810
Końcówki do pipetek w stojakach (1000 & micro; L)USA Scientific1111-2830
Końcówki do pipetek w stojakach (200 & micro; L)USA Scientific1111-1810
Butelki do przechowywania nośników wielokrotnego użytku PYREXThermo Fisher Scientific06-414-1D
Pipety serologiczne (10 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-204
Pipety serologiczne (25 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-205
Wielopakiet mikropipety jednokanałowejThermo Fisher Scientific13-684-2503x pipety (0,5-10 &m; L, 10-100 μ L, 100-1000 μ L)
Drut ze stali nierdzewnej (40 μ m)Duńska technologia Myo400447
TimerThermo Fisher Scientific02-261-840
System Ultra Czystej WodySartoriusH2O-MM-UV-SET-US
Vannas Spring ScissorsNarzędzia Nauki Ścisłej15000-00
Kolba objętościowaThermo Fisher Scientific13-756-400
Vortex MixerThermo Fisher Scientific10-320-807
Kąpiel wodnaThermo Fisher Scientific07-202-155
Ważenie naczyńThermo Fisher Scientific02-202-101

Bibliografia

  1. De Oliveira, M. G., Nadruz, W. Jr, Mónica, F. Z. Endothelial and vascular smooth muscle dysfunction in hypertension. Biochem Pharmacol. 205, 115263(2022).
  2. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med. 8, (2022).
  3. Touyz, R. M., et al. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc Res. 114 (4), 529-539 (2018).
  4. Serné, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., Ijzerman, R. G., Stehouwer, C. D. A. Microvascular dysfunction. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  5. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  6. Del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods Mol Biol. 1339, 255-276 (2015).
  7. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  8. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. J Vis Exp. (138), e58064(2018).
  9. Halpern, W., Osol, G., Coy, G. S. Mechanical behavior of pressurized in vitro prearteriolar vessels determined with a video system. Ann Biomed Eng. 12 (5), 463-479 (1984).
  10. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Intravital assessment of vascular function. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  11. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension. Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).
  12. Lee, R. M. K. W., Dickhout, J. G., Sandow, S. L. Vascular structural and functional changes in hypertension: models, remodeling and relevance. Hypertens Res. 40 (4), 311-323 (2017).
  13. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in arterial smooth muscle relaxation. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  14. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for endothelium-derived relaxing factor activity. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  15. Brandes, R. P., et al. An endothelium-derived hyperpolarizing factor distinct from nitric oxide and prostacyclin. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9747-9752 (2000).
  16. Garland, C. J., Hiley, C. R., Dora, K. A. EDHF: spreading the influence of the endothelium. Br J Pharmacol. 164 (3), 839-852 (2011).
  17. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of resistance vessels in hypertensive rats. Circ Res. 41 (1), 19-26 (1977).
  18. Grano De Oro, A., et al. Spontaneous vascular dysfunction in Dahl salt-sensitive rats without high-salt diet. Physiol Rep. 12 (14), e16165(2024).
  19. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  20. Mulvany, M. J. Structure and function of small arteries in hypertension. J Hypertens Suppl. 8 (7), S225-S232 (1990).
  21. Huda, K., Lawrence, D. J., Thompson, W., Lindsey, S. H., Bayer, C. L. In vivo noninvasive systemic myography in pregnant mice. Nat Commun. 14 (1), (2023).
  22. Choi, R., et al. Optimization of resting tension for wire myography in rat pulmonary arteries. Physiol Rep. 12 (1), e15911(2024).
  23. Lu, X., Kassab, G. S. Assessment of endothelial function across vessel sizes using a unified myograph. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H94-H100 (2011).
  24. Hou, T., Guo, Z., Gong, M. C. Circadian variations of vasoconstriction and blood pressure. Curr Opin Pharmacol. 57, 125-131 (2021).
  25. Li, T., et al. sex-dependent vascular responsiveness mediated by estrogen receptor pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (8), H1105-H1115 (2014).
  26. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels. Front Physiol. 14, 1176748(2023).
  27. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta. J Thorac Cardiovasc Surg. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  28. Ameer, O. Z., et al. Regional abnormalities within the aorta in metabolic syndrome. Exp Physiol. 106 (3), 771-788 (2021).
  29. Mezhenskyi, O. R., Philyppov, I. B. Regional differences in endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta. Physiol Rep. 12 (6), (2024).
  30. Zhang, L., Rong, S., Dong, H. Functional heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in mesenteric arteries. Microvasc Res. 158, 104777(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Reaktywność naczyniowatętnice krezkowemiografia izometrycznapreparaty tętnicfunkcja naczyniowafunkcja śródbłonkafunkcja mięśni gładkich

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.