Artykuł metodologiczny

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

DOI:

10.3791/70192

⸱

27 marca 2026

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krio-elektronowa tomografia (cryo-ET) umożliwia trójwymiarową wizualizację natywnej ultrastruktury komórkowej, jednak jej zastosowanie w grubych tkankach jest ograniczone przez brak niezawodnej witryfikacji i niskoprzepustowego przygotowania lamelli. Przedstawiono tutaj kompleksowy workflow, który integruje zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF; ~2100 bar; czas od sekcji do zamrożenia ≤90 s) z wykorzystaniem zespołu "gofrowego" z folią miedzianą do wstępnego przecieńczania tkanek, wyjmowanie kriogenifikacji (FIB) oraz kontrolowane przerzedzanie do lameli 120–200 nm z kompensacją przechylenia. Powłoka przewodząca jest standaryzowana (sputter-Pt 30 mA/15 s; Limit GIS 0,5–1,0 μm), aby zminimalizować zasłony. Zautomatyzowane, symetryczne pobieranie danych o symetrycznych dawkach (0°, ±3°, ±6°... do ±60–66°; krok 2–3°; całkowita dawka 100–150 e⁻/Å2) jest realizowane za pomocą skryptów PACEtomo, gdzie początkowy kąt nachylenia jest wyprowadzany z kąta frezowania i orientacji próbki. Przetwarzanie w AreTomo 3 zapewnia funkcje korekcji ruchu, estymacji CTF, wyrównania oraz rekonstrukcji WBP w czasie niemal rzeczywistym; IsoNet może opcjonalnie zmniejszyć anizotropię brakujących klinów. Uśrednianie subtomogramów (RELION 4.0) stosuje strategię pseudo-subtomogramu, z raportowaniem rozdzielczości opartym na progu FSC wynoszącym 0,143. Demonstrowane na hipokampie myszy, workflow rutynowo generuje dobrze witryfikowane próbki i jednolite lamele (grubość celu 150 ± 40 nm) oraz umożliwia wysokoprzepustowe zbieranie serii pochyleń (zazwyczaj seria 5–8 min/tilt). Protokół ten oferuje powtarzalną drogę badania biologii strukturalnej in situ bezpośrednio z złożonych środowisk tkankowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krio-tomografia elektronowa (cryo-ET) stała się kluczową techniką wizualizacji makrocząsteczkowych kompleksów i architektur komórkowych w ich rodzimym, nawodnionym stanie 1,2,3,4,5. Rekonstruując trójwymiarowe objętości z serii obrazów projekcyjnych z serią przechylenia, krio-ET łączy kontekst komórkowy z rozdzielczością bliską atomowej, oferując bezprecedensowe wglądy w biologię strukturalną in situ 6. Chociaż workflowy tomografii krioelektronowej dla próbek komórkowych7 (w tym komórek przecieńczonych krio-FIB w zawiesinach i komórkach przylegających) są już dobrze ugruntowane, ich bezpośrednie rozszerzenie na grube, architektonicznie nienaruszone tkanki pozostaje bardzo wymagające 8,9,10. Dotyczy to szczególnie tkanek o wysokiej zawartości wody, takich jak brain11, gdzie niezawodna witryfikacja i przygotowanie elektronowo przezroczystych lamel (zazwyczaj <200 nm) nadal stanowią trwałe wąskie gardła12.

Osiągnięcie witryfikacji tkanek jest trudne ze względu na wysoką zawartość wody i ograniczoną przenikanie ciepła. Chociaż zanurzanie zamrożenia jest skuteczne dla cienkich próbek (≤20 μm)13, nie działa dla większości tkanek. Zamrożenie pod wysokim ciśnieniem (HPF) tłumi nukleację lodu poprzez zastosowanie wysokiego ciśnienia, co pozwala teoretycznie na witryfikację próbek do ~200 μm. Jednak wydajność konwencjonalnego HPF często jest nieoptymalna dla witryfikacji tkanek. Aby poprawić wyniki, ostatnie działania stosują takie strategie jak dodanie krioprotektantów14 oraz wstępne sekcjonowanie 15,16 (np. za pomocą wibratomu), aby mechanicznie zmniejszyć grubość próbki przed zamrożeniem11,17. Chociaż te metody mogą poprawić jakość witryfikacji, często wymagają długotrwałego traktowania ex vivo oraz stosowania dodatków chemicznych, które mogą zmienić strukturę rodzimą. Aby rozwiązać te ograniczenia, badanie to zmodyfikowało strategię nośników "waflowych" pierwotnie opracowaną przez Kelleya i in.18, wprowadzając kluczową optymalizację: tkanka mózgowa jest fizycznie spraszana za pomocą dwóch polerowanych miedzianych nośników przed zamrożeniem, co wstępnie rozrzedza próbkę, jednocześnie zabezpieczając ją między siatką filmowaną a folią miedzianą. Ten projekt nie tylko sprzyja szybkiemu i równomiernemu witryfikacji, ale także znacząco zwiększa stabilność mechaniczną, skutecznie zapobiegając uszkodzeniu siatki i utracie próbek podczas dalszej obróbki, tworząc solidne podstawy do uzyskania nienaruszonych, wysokiej jakości próbek tkanek mrożonych.

Po witryfikacji przerzedzanie pozostaje główną przeszkodą zarówno dla przepustowości, jak i jakości. Jako wczesna i szeroko stosowana technika, krio-ultramikrotomia umożliwia liczne podstawowe badania strukturalne in situ. Niemniej jednak często wprowadza artefakty kompresji i cięcia, które naruszają integralność konstrukcyjną. Dla porównania, kriofokusowana wiązka jonowa (krio-FIB)frezowanie 21 oferuje doskonałą precyzję i minimalne zniekształcenia 7,22. Początkowo krio-FIB było stosowane bezpośrednio do próbek zwitrowanych na kratkach, aby uzyskać lamele23; Jednak to podejście in situ jest skuteczne głównie dla cienkich próbek24,25 (np. hodowli komórek lub obszarów tkanek obwodowych) i nie może dotrzeć do głębszych struktur w grubych, masywnych tkankach. Aby przezwyciężyć to ograniczenie głębokości, opracowano strategie wyciągania26, umożliwiające specyficzną ekstrakcję obszarów zainteresowania (ROI) z wnętrza próbek. Kolejne postępy metodologiczne, w tym seryjne usuwanie27 oraz sekcjonowanie serializowane na siatce (SOLIST)28, dodatkowo zwiększyły przepustowość, stabilność lamelarną oraz precyzję korelacji 3D w złożonych tkankach. W ostatnich latach innowacje nadal rozwijają tę dziedzinę, w tym metoda sześciostronnego mocowania według Tanga i in.29, która poprawia stabilizację mechaniczną podczas wyjmywania i przerzedzania, a także nowatorskie metody frezowania na siatce Benjamina C. Creekmore'a i in.11, które umożliwiają dostęp do głębokiej struktury przy zachowaniu kontekstu rodzimych tkanek. Pomimo tych postępów, protokoły nadal różnią się pod względem efektywności, powtarzalności i adaptowalności w zależności od typów tkanek. Pozostaje kluczowa luka w ustanowieniu ustandaryzowanego, łatwego do powtórzenia i szeroko stosowalnego workflow, który integruje te optymalizacje w spójny pipeline dla różnorodnych grubych tkanek.

Luka ta została tu wypełniona, syntetyzując kluczowe szczegóły techniczne z ustalonych metodologii i dopracowując je w uogólniony, kompleksowy pipeline. Protokół ten nie tylko wykorzystuje ulepszoną metodę HPF-waflowa do solidnej witryfikacji, ale także zawiera szereg zoptymalizowanych kroków w wyjmowaniu i rozrzedzaniu kriogenifikacji FIB, takich jak systematyczna kompensacja przechylenia, standaryzowana powłoka przewodząca oraz skalibrowane sekwencje frezowania, które łącznie zwiększają jednolitość lamelli, redukują artefakty (np. zasłony) i poprawiają przepustowość. W przeciwieństwie do protokołów dostosowanych do konkretnych typów komórek lub organizmów modelowych, ten workflow został zaprojektowany z myślą o uogólnialności w swojej istocie, zapewniając wszechstronne ramy adaptowalne do szerokiego zakresu grubych, złożonych tkanek, w tym tych stosunkowo miękkich i podatnych na ucisk, poza demonstrowanym hipokampem myszy.

Demonstrowany w wymagającym modelu hipokampa myszy, znanym z podatności na uszkodzenia spowodowane lodem i złożoności strukturalnej, ten zintegrowany i uogólniony workflow niezawodnie generuje wysokiej jakości lamele (120–200 nm) i wspiera efektywne pozyskiwanie serii przechyleń (5–8 min/seria). Konsolidacja najlepszych praktyk w spójny, dostępny i szeroko stosowany protokół zapewnia powtarzalne ramy, które obniżają barierę techniczną w wdrażaniu krio-ET w badaniach nad tkankami grubymi w różnych kontekstach biologicznych i biomedycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące tkanek zwierzęcych były zgodne z SUSTech IACUC (Protokół SUSTech-JY202501019). Regentowie oraz używany sprzęt są wymienieni w Tabeli Materiałów.

1. Przykładowe przygotowanie wsparcia

  1. Przygotowanie nośnika HPF (patrz Rysunek 1A)
    1. Uzyskaj parę miedzianych nośników HPF o średnicy 6 mm (typ B). Upewnij się, że jeden z transporterów ma płaską powierzchnię.
    2. Zwilż płaską powierzchnię nośnika i zacznij szlifować. Najpierw użyj papieru ściernego o ziarnistości 8000, aż oryginalne ślady obróbki zostaną całkowicie usunięte. Następnie przełącz się na papier ścierny o ziarnistości 12000 i kontynuuj szlifowanie, aż zadrapania z poprzedniego etapu zostaną w dużej mierze usunięte, co daje jednolite gładkie wykończenie. Rysunek 2 przedstawia typowe obrazy powierzchni nośnika podczas procesu szlifowania i polerowania.
    3. Poleruj powierzchnię brudzoną miękką tkaniną metalograficzną i pastą diamentową W0.5: najpierw nałóż pastę na tkaninę, następnie poleruj powierzchnię ruchami okrężnymi przez 1–2 minuty, aż uzyskamy gładkie, wysoce wypolerowane wykończenie. Dokładnie opłucz nośnik etanolem, a następnie wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości ścierne.
    4. Zanurz polerowane nośniki w 1-heksadekinie na co najmniej 4 godziny (lub noc) przed ich użyciem.
      UWAGA: Polerowane i impregnowane nośniki można przechowywać zanurzone w 1-heksadecenie.
      UWAGA: 1-Heksadecen jest łatwopalny i szkodliwy po wdychaniu; Pracuj w okapie z ochroną środków ochrony osobistej.
  2. Przygotowanie siatki nośnej TEM (patrz Rysunek 1B)
    1. Użyj miedzianych siatek o średnicy 100 siatki z ciągłą folią podtrzymującą Formvar/carbon.
    2. Sprzątaj obie strony siatek złotem za pomocą sputter coatera: ustaw prąd na 50 mA i pokrywaj każdą stronę przez 120 sekund, aby uzyskać warstwę około 6 nm na bok.
  3. Przygotowanie folii miedzianej (patrz Rysunek 1C)
    1. Uzyskaj miedzianą folię o wysokiej czystości o grubości 1 μm.
      UWAGA: Przewodność cieplna miedzi zmienia się wraz z czystością, a niższa czystość skutkuje niższą przewodnością cieplną. Dlatego wymagana jest miedziana folia o wysokiej czystości (Cu ≥ 99,9%).
    2. Przebij miedzianą folię na tarcze o średnicy 3 mm za pomocą okrągłego dziurkacza.

2. Zamarzanie pod wysokim ciśnieniem

  1. Umieść kroplę 10 μL roztworu 10% sacharozy na czystą szklaną powierzchnię.
  2. Szybko rozcinaj hipokamp świeżo uśpionej myszy. Usuń małe fragmenty tkanki o grubości około 0,5–1 mm3 za pomocą ostrego żyletki (patrz Rysunek 1D).
  3. Przenieś tkankę na miedziane siatki TEM (siatka 100) wewnątrz nośnika HPF za pomocą wykałaczki lub szczoteczki drobnej. Użyj 2-metylpentanu, aby delikatnie ustawić tkankę na miejsce, minimalizując jednocześnie mechaniczne obciążenia siatki.
    UWAGA: 2-metylpentan jest niezwykle łatwopalny. Obsługuj to w okapie spalinowym bez źródeł zapłonu.
  4. Okryj tkankę i siatkę tarczą miedzianą o średnicy 3 mm. Zakończ montaż, umieszczając na wierzchu drugi nośnik HPF (płaski zakryty do dołu), aby utworzyć szczelną kanapkę "gofrową" (patrz Rysunek 1E).
    UWAGA: Miedziana folia pełni kluczową funkcję mechaniczną w zespole gofrów. Umieszcza tkankę pomiędzy siatką TEM a samą folią. Podczas montażu ta konfiguracja wywiera delikatny nacisk, pomagając utworzyć cieńszy, bardziej jednolity plaster tkanki idealny do witryfikacji. Ponadto folia zapobiega utracie tkanek podczas manipulacji i pomaga rozłożyć ciśnienie podczas zamarzania pod wysokim ciśnieniem, zmniejszając ryzyko uszkodzenia siatki. Po zamrożeniu folia ułatwia także oddzielenie nośników od zwiniętej siatki próbek. Jednak ta metoda przygotowania może powodować uszkodzenia mechaniczne spowodowane kompresją i może nie być odpowiednia dla próbek wrażliwych na artefakty wywołane ciśnieniem. W przypadku takich próbek należy rozważyć alternatywne techniki cięcia, które osiągają odpowiednią grubość bez kompresji, takie jak sekcjonowanie wibratomowe lub dziurkowanie próbek.
  5. Natychmiast rozpocznij procedurę zamrażania pod wysokim ciśnieniem zgodnie z protokołem operacyjnym producenta. Ustaw docelowe ciśnienie na ~2100 barów i upewnij się, że całkowity czas od sekcji tkanki do zamrożenia nie przekracza 90 sekund.
    UWAGA: Cały proces od sekcji do zamrożenia powinien zostać ukończony w ciągu 90 sekund, aby zminimalizować zmiany strukturalne związane z wydłużonym czasem ex vivo . Zakres grubości tkanek mózgu wynosi około 20–40 μm.

3. Frezowanie i wysuwanie FIB

UWAGA: Wykonaj następujące kroki za pomocą mikroskopu dwuwiązkowego wyposażonego w krio-stopień. Utrzymuj temperaturę próbki poniżej -170 °C przez cały czas.

  1. Przygotowanie siatki odbiornika
    1. Zdobądź nową siatkę o rozmiarze 300 siatki złota, która będzie służyć jako ostateczna siatka odbiorcza do procesu wyjmowania.
    2. Pod stereomikroskopem w temperaturze pokojowej delikatnie przypięć siatkę do kompatybilnego pierścienia krio-FIB AutoGrid.
    3. Skład AutoGrid należy przechowywać bezpośrednio w suchym piecu utrzymywanym w temperaturze około 40 °C, aby zminimalizować nagromadzenie się szronu przed użyciem.
      UWAGA: Podczas przycinania upewnij się, że siatka leży płasko i wycentrowana, aby zapobiec zginaniu lub nieustawieniu.
  2. Pobranie i montaż siatki tkankowej z witryną
    1. Podczas ciągłego zanurzania zespołu w ciekłym azocie (LN₂), ostrożnie oddziel zwitryfikowaną siatkę TEM (zawierającą tkankę i miedzianą folię) od otaczających elementów zespołu "gofrowego".
      UWAGA: Dystans folii miedzianej zazwyczaj ułatwia oddzielenie siatki od nośników.
    2. Na wstępnie schłodzonej stacji roboczej do załadunku kriogenicznego zamontuj izolowaną siatkę tkanek w drugim pierścieniu krio-FIB AutoGrid pod ochroną LN₂.
  3. Siatki współładowane na prom kriotransferowy
    1. Załaduj oba AutoGridy do wyznaczonych slotów promu kriotransferowego.
    2. Ustawij każdy AutoGrid tak, aby nacięcie frezujące było skierowane na zewnątrz i pionowe.
    3. Trzymaj załadowany prom pod zanurzeniem LN₂ lub wstępnie schładzony aż do przeniesienia do mikroskopu FIB/SEM.
  4. Lokalizacja i powłoka przewodząca w FIB/SEM
    1. Po przejściu kriogenicznym do mikroskopu przejdź do siatki tkankowej przy niskim powiększeniu SEM.
    2. Nałóż przewodzącą i ochronną powłokę na całą powierzchnię siatki.
      1. Powierzchnię siatki pokryj sputter-coat platyną (Pt) o mocy 30 mA przez 15 s.
      2. Nałóż organometalową pokrywę Pt o grubości 0,5–1,0 μm, używając systemu wtrysku gazu (GIS).
      3. Na powierzchnię siatki nałóż ostatnią warstwę Pt powlekaną sputter przy napięciu 30 mA przez 15 sekund.
        UWAGA: Limit GIS jest kluczowy dla ograniczenia artefaktów zasłon.
  5. Izolacja i wyjście bloku tkankowego (patrz Rysunek 3)
    1. Wybór lokalizacji i orientacja
      1. Przejdź do wybranego obszaru zainteresowania (ROI) na siatce tkankowej, korzystając z obrazu wiązki elektronów SEM.
      2. Ustawij próbkę do frezowania front-side. Typowa pozycja etapu jest ustawiona na obrót 110° i pochylenie 7°, a ta pozycja prezentuje powierzchnię próbki pod kątem odpowiednim do dostępu wiązką jonów.
        UWAGA: W przypadku braku markerów fluorescencyjnej można zastosować strategię wstępnego przesiewu. Strategia ta ma na celu zlokalizowanie docelowego obszaru tkanki i wykluczenie obszarów zawierających krioprotektant lub inne komponenty nietkankowe. Po wybraniu obszaru pozornie wolnego od powierzchniowego lodu, wycieraj mały rów testowy z użyciem wyższego prądu belki (np. 15 nA przy 30 kV) w standardowej orientacji front-side i poleruj przy użyciu niższego prądu wiązki (np. 1 nA przy 30 kV). Przełącz się na wiązkę elektronów, aby zbadać przekrój: tkanka wykazuje doskonały kontrast pod wiązką elektronów, co jest szczególnie widoczne w strukturach błoniastych i regionach bogatych w ciężkie pierwiastki; Natomiast krioprotektant zazwyczaj wykazuje jednolity kontrast pod wiązką elektronów. Pozwala to na szybką weryfikację przed rozpoczęciem pełnej procedury wyciągania.
    2. Frezowanie rowowe w celu izolacji bloku (rysunek 3A)
      1. Zdefiniuj prostokątny rów otaczający blok tkanki docelowej za pomocą wiązki jonowej pracującej przy napięciu 30 kV.
      2. Rozpocznij frezowanie w określonej odległości od bloku, używając stosunkowo wysokiego prądu 15 nA, aby szybko usunąć materiał.
      3. Gdy ściany rowu zbliżają się do bloku na kilka mikrometrów, zmniejsz prąd wiązki jonowej do 7 nA. Zmniejszenie prądu pozwala na precyzyjniejszą kontrolę oraz minimalizuje uszkodzenia wiązki jonowe oraz nagrzewanie materiału biologicznego w interesującym się obszarze.
      4. Zostaw jedną stronę bloku przymocowaną do materiału masowego jako "zaczepkę", która tymczasowo go przytrzyma.
    3. Opcjonalne frezowanie podcięte dla grubych bloków (rysunek 3B)
      1. Dla bloków tkankowych o szacowanej grubości większej niż 20 μm wykonaj krok frezowania podciętego od strony odwrotnej, aby ułatwić ostateczne wyjmowanie.
      2. Obróć scenę (np. o -70°) i dostosować nachylenie sceny (np. do 23°), aby uzyskać dostęp do dolnej części bloku.
      3. Frezuj połączenie dolne za pomocą FIB przy napięciu 30 kV i prądzie 3 nA.
    4. Mocowanie do igły mikromanipulatora (Rysunek 3C)
      1. Aby przymocować próbkę do igły, wykonaj sekwencyjne wzory frezowania przekrojowego.
        UWAGA: Blok złota można wydobyć z sztabki siatki o rozmiarze 300 siatki.
    5. Uniesienie bloku tkankowego (Rysunek 3D)
      1. Odetnij pozostały "zaczep" łączący blok z próbką masową za pomocą FIB (30 kV, 1 nA).
      2. Ostrożnie manewruj igłą mikromanipulatora, aby podnieść teraz izolowany blok tkanki tak, aby był całkowicie wolny od rowu i otaczającej go oryginalnej siatki. Następnie cofnij igłę i przenieś blok do siatki odbiornika.
    6. Transfer bloków, spawanie i ponowne powlekanie
      1. Przejdź przez igłę do wcześniej schłodzonej siatki odbiornika o rozmiarze 300 metek.
      2. Opuszczaj blok na wybrany kwadrat siatki. Zetknij blok tkanki z filmem na siatce, a następnie podnieś blok pionowo, aby przerwać kontakt. Przeciąć kawałek o grubości ~3–4 μm z bloku na warstwę siatki za pomocą wiązki jonowej (30 kV, 1 nA) (rysunek 3E).
        UWAGA: Jeśli obecne są szczątki lodowe, oczyść miejsce przymocowania prostokątnym wzorem (30 kV, 50 pA). Upewnij się, że blok styka się z folią siatki, aby zmniejszyć ładunek elektrostatyczny, który może losowo przesunąć przekroj.
      3. Spawaj szczelnie przekroj, frezując z użyciem wzorów przekroju czyszczącego po obu stronach złącza (30 kV, 30 pA) (rysunek 3F).
      4. Ponownie nałóż powłokę przewodzącą/ochronną zgodnie z krokiem 3.4.2 (Rysunek 3G).
        UWAGA: W tym etapie poszycia GIS czas działania można skrócić w zależności od rozmiaru bloku.
    7. Przerzedzenie lamelli
      1. Obróć stopień (np. o -70°) i ustaw początkowy kąt nachylenia (np. 15°) (Rysunek 3H).
        UWAGA: Uchwyt na próbkę ma wstępne nachylenie 45°.
      2. Określ ostateczną pozycję lamelli w gładkim obszarze bloku tkankowego.
        UWAGA: Potwierdź, że wybrany obszar jest wolny od zanieczyszczenia lodem.
      3. Wykonaj systematyczne frezowanie z użyciem prądów wiązki jonowej określonych w Tabeli 1. Postęp od wyższych do niższych prądów następuje w miarę zbliżania się do płaszczyzny celu (rysunek 3I,J). Opcjonalnie, gdy mieścimy się w odległości do 1–2 μm od lameli, rów odciążający może być frezowany około 1,5 μm dalej, aby zapobiec zginaniu lub zginaniu lamelli30,31.
        UWAGA: Gdy pozostały materiał znajduje się w granicy ~1 μm od granicy docelowej płaszczyzny, grubość usuwana jest na przejście.

4. Zbieranie danych krio-ET

  1. Po pomyślnym przygotowaniu lamelli ostrożnie załaduj siatkę do transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) wyposażonego w kriogeniczny uchwyt, filtr energii oraz oprogramowanie do tomografii (np. SerialEM).
  2. Zdobądź mapę atlasową całej siatki (np. Rysunek 4A; typowe powiększenie wynosi 155×).
  3. Przejdź do pozycji lamelli i pobierz mapę montażową (np. Rysunek 4B; typowe powiększenie to 3600× z defokusem -100 μm).
  4. Ustaw nominalne powiększenie nagrywania i sprawdź, czy rozmiar piksela odpowiada zamierzonej rozdzielczości; w obecnym badaniu zastosowano rozmiar piksela 2,109 Å. Dostosuj odpowiednie parametry oświetlenia, w tym rozmiar plamki, średnicę apertury C2 oraz powierzchnię oświetlenia, aby uzyskać zoptymalizowaną dawkę dla detektora elektronów bezpośrednich.
  5. Konfiguruj warunki ostrości i oświetlenia próbnego tak, aby odpowiadały tym ustawionym dla parametru Record.
  6. Zbieranie danych za pomocą skryptów PaceTomo32, zgodnie z poniższymi krokami:
    1. Wstępnie wybierz cele na mapie montażowej za pomocą funkcji "dodaj punkty" w nawigatorze, zapewniając, że pierwsza cecha wykazuje wystarczający kontrast.
    2. Wybierz cele za pomocą PACEtomo_selectTargets.py script32, w razie potrzeby dostosowując wyróżniony obszar przy powiększeniu podglądu. Typowe obszary zainteresowania przedstawiono na Rysunku 4C.
    3. Uzyskaj serię nachylenia za pomocą schematu symetrycznego dawkowo-symetrycznego (np. 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... do ±60°–66°) z przyrostem 2° lub 3°. Ustaw parametry pozyskiwania w PACEtomo.py skrypcie: początkowy kąt pochylenia jest określany przez kąt frezowania określony w kroku 3.7.1 (tj. 8°), a jego znak zależy od orientacji ładowania próbki w krio-EM; minimalny i maksymalny kąt nachylenia odnoszą się do wartości bezwzględnych; a rozmiar kroku odpowiada przyrostowi nachylenia (np. 3°).
      UWAGA: Ten początkowy kąt nachylenia ma na celu ustawienie lamelli poziomo i prostopadle do wiązki elektronów. Jeśli kąt frezowania jest nieznany, przechyl obraz, aby pokazać lamellę na jej największej widocznej wysokości; zapewnia to wystarczająco dokładne ustawienie.
    4. Utrzymuj skumulowaną dawkę elektronów 100–150 e⁻/Å2 rozłożoną na wszystkie nachylenia. Jeśli jest dostępny, użyj filtra energetycznego o szczelinie 10 eV.
    5. Rozpocznij akwizycję danych. Automatyczne ustawianie ostrości i śledzenie są implementowane przy każdym kącie pochylenia. Typowy czas nabycia dla serii pojedynczych tiltów wynosi 5–8 minut.
      UWAGA: Przewodnik po rozwiązywaniu problemów znajduje się w Tabeli 2.

5. Przetwarzanie danych

  1. Procesowa korekta ruchu serii pochylenia, estymacja CTF, wyrównanie oraz rekonstrukcja tomogramów 3D z użyciem AreTomo 333 wykonuje trzy kluczowe kroki: (1) korekcję ruchu surowych klatek obrazu, (2) estymację funkcji transferu kontrastu (CTF) dla każdego obrazu pochylenia oraz (3) wyrównanie całej serii pochylenia.
    1. Po wyrównaniu rekonstruuj trójwymiarowe (3D) tomogramy za pomocą algorytmu ważonej projekcji wstecznej. Wymagane dane wejściowe do tego kroku obejmowały: surowe klatki obrazu, pliki metadanych mdoc (dokumentujące parametry przejęcia serii tilt) oraz ustaloną oś obrotu próbki.
  2. Brakująca korekta klina
    1. Po rekonstrukcji generowane tomogramy poddane są brakującej korekcji klina przy użyciu IsoNet34.
  3. Wybieranie i kuratorowanie cząstek
    1. Przeprowadz pobieranie cząstek w EMAN 2.935 z wykorzystaniem metody dopasowania szablonów. Po automatycznym wybieraniu ręcznie wykluczano fałszywie pozytywne wyniki (tj. regiony niedocelowe lub błędnie wybrane regiony), aby zapewnić jakość wybranego zbioru danych cząstek.
  4. Uśrednianie subtomogramów
    1. Zaimportuj serię nachylenia i odpowiadające im współrzędne cząstek do RELION 4.0. Wykonaj uśrednianie subtomogramów zgodnie ze standardowym workflow opisanym w dokumentacji RELION 4.0 (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html), co zapewnia przestrzeganie ustalonych najlepszych praktyk w zakresie powtarzalności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczne zastosowanie tego protokołu umożliwia produkcję wysokiej jakości, szklistych lamel tkanek oraz późniejszą rekonstrukcję tomogramów, które ujawniają natywną ultrastrukturę komórkową. Poniższe wyniki, wykazane na tkance hipokampa myszy, są reprezentatywne dla udanego eksperymentu.

Bloki tkanek przetwarzane metodą "gofrów" przetworzone przez wysokie ciśnienie miały jednolity i elektronowo przezroczysty wygląd (rysunek 4B,C). W pełni zwitrza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj workflow ustanawia uogólniony, zoptymalizowany i powtarzalny tok do in situ krio-elektronowej tomografii rodzimych, grubych tkanek. Jego głównym wkładem nie jest wynalezienie technik pojedynczych, lecz systematyczna integracja, udoskonalanie i szczegółowa standaryzacja całego procesu, od solidnej witryfikacji przy użyciu zmodyfikowanej metody waffle-HPF po precyzyjnie skalibrowany protokół wyjmowania i rozrzedzania krio-FIB. Ta synteza rozwiązuje krytyczną lukę w powtarzalności i dostępności,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują pracownikom Centrum Krio-EM na Southern University of Science and Technology za wsparcie techniczne. Projekt ten był wspierany przez National Science and Technology Innovation (Brain Science and Brain-like Intelligence Technology – National Science and Technology Major Project, grant nr 2022ZD0211905) oraz National Natural Science Foundation of China (grant nr 32200998 i 32161133022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-HeksadeceneSigma-AldrichH2131Chemikalia i Odczynniki
2-metylpentanSigma-AldrichM65807Chemikalia i Odczynniki
Pierścień zaciskowyThermo Fisher Scientific1131750; 1188953Materiały jednorazowe
Folia miedzianaMateriały metalowe Fengcheng1 & mikro; m grubościMateriały jednorazowe
Siatki TEM wspierające miedź (siatki 100)Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., LtdBZ10021bMateriały jednorazowe
Cryo-EMThermo Fisher ScientificKrios G4Sprzęt  
Kriogeniczna fibrylacjaThermo Fisher ScientificAquilos 2Sprzęt  
Krio-FIB AutogridThermo Fisher Scientific1205101Materiały jednorazowe
Siatki (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)QuantifoilAltrAufoilMateriały jednorazowe
Zamrażarka wysokociśnieniowaLeica MicrosystemsEM ICESprzęt  
Nośnik HPF, miedźLeica Microsystemstyp B (6 mm)Materiały jednorazowe
Powłoka jonowa rozpryskającaKworumQ150RS plusSprzęt  
Metalograficzna pasta polerskaLab-testecW0.5Materiały jednorazowe
Tkanina polerskaGORALB00809Materiały jednorazowe
Papier ściernyPapier ścierny marki Eagle8000-grit, 12000-gritMateriały jednorazowe
StereomikroskopLeica MicrosystemsS9iWyposażenie 
SacharozaSigma-Aldrich200-334-9Chemikalia i Odczynniki
Oprogramowanie do pozyskiwania serii tilthttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9Oprogramowanie
Geometria i geometria serii przechyleń Oprogramowanie do rekonstrukcjihttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 AreTomo 3Oprogramowanie
Oprogramowanie do pozyskiwania serii tilthttps://github.com/eisfabian/PACEtomoPaceTomoOprogramowanie
Geometria i geometria serii przechyleń Oprogramowanie do rekonstrukcjihttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetOprogramowanie
Geometria i geometria serii przechyleń Oprogramowanie do rekonstrukcjihttps://github.com/cryoem/eman2EMAN2Oprogramowanie
Geometria i geometria serii przechyleń Oprogramowanie do rekonstrukcjihttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.htmlRelion 4Oprogramowanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52 (1), 573-595 (2023).
  2. Baumeister, W. Cryo-electron tomography: A long journey to the inner space of cells. Cell. 185 (15), 2649-2652 (2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: The resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52 (1), 339-360 (2023).
  4. Nogales, E., Mahamid, J. Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy. Nature. 628 (8006), 47-56 (2024).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 58, 1-9 (2019).
  6. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ—the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  7. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  8. McCafferty, C. L., et al. Integrating cellular electron microscopy with multimodal data to explore biology across space and time. Cell. 187 (3), 563-584 (2024).
  9. Pöge, M., et al. Making plant tissue accessible for cryo-electron tomography. Elife. 106455, 1-41 (2025).
  10. Bäuerlein, F. J. B., et al. Cryo-electron tomography of large biological specimens vitrified by plunge freezing. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  11. Creekmore, B. C., Kixmoeller, K., Black, B. E., Lee, E. B., Chang, Y. -W. Ultrastructure of human brain tissue vitrified from autopsy revealed by cryo-ET with cryo-plasma fib milling. Nat Commun. 15 (1), 2660(2024).
  12. Chen, Z., Guo, Q. Innovations in cryo-electron tomography for tissues: Challenges and future prospects. Curr Opin Struct Biol. 93, 103112(2025).
  13. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (2009).
  14. Matsui, A., et al. Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses. Elife. 13, RP98458(2024).
  15. Ning, J., et al. Uncovering synaptic and cellular nanoarchitecture of brain tissue via seamless in situ trimming and milling for cryo-electron tomography. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  16. Zhang, J., et al. Vhut-cryo-fib, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography. J Struct Biol. 213 (3), 107763(2021).
  17. Glynn, C., et al. A generalizable and targeted molecular biopsy approach for in situ cryogenic electron tomography of vitreous brain tissue. Cell Rep Methods. 5 (7), 101080(2025).
  18. Kelley, K., et al. Waffle method: A general and flexible approach for improving throughput in fib-milling. Nat Commun. 13 (1), 1857(2022).
  19. Pierson, J., Ziese, U., Sani, M., Peters, P. J. Exploring vitreous cryo-section-induced compression at the macromolecular level using electron cryo-tomography; 80s yeast ribosomes appear unaffected. J Struct Biol. 173 (2), 345-349 (2011).
  20. Alamoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 150 (1), 109-121 (2005).
  21. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  22. Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. J Struct Biol. 192 (2), 262-269 (2015).
  23. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nat Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  24. Engel, B. D., et al. Native architecture of the Chlamydomonas chloroplast revealed by in situ cryo-electron tomography. Elife. 4, e04889(2015).
  25. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 172 (2), 180-190 (2010).
  26. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo transmission electron microscopy. J Struct Biol. 180 (3), 572-576 (2012).
  27. Schiøtz, O. H., et al. Serial lift-out: Sampling the molecular anatomy of whole organisms. Nat Methods. 21 (9), 1684-1692 (2023).
  28. Nguyen, H. T. D., et al. Serialized on-grid lift-in sectioning for tomography (solist) enables a biopsy at the nanoscale. Nat Methods. 21 (9), 1693-1701 (2024).
  29. Tang, X., et al. Step-by-step procedure for an optimized serial lift-out cryo-focused ion beam milling technique in tissue analysis. Biophys Rep. 11, 1-13 (2025).
  30. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of fib-milled cryo-lamellae. J Struct Biol. 208 (3), 107389(2019).
  31. Berger, C., Watson, H., Naismith, J. H., Dumoux, M., Grange, M. Xenon plasma focused ion beam lamella fabrication on high-pressure frozen specimens for structural cell biology. Nat Commun. 16 (1), 2286(2025).
  32. Eisenstein, F., et al. Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae. Nat Methods. 20 (1), 131-138 (2022).
  33. Peck, A., et al. Aretomolive: Automated reconstruction of comprehensively-corrected and denoised cryo-electron tomograms in real-time and at high throughput. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  34. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  35. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  36. Yang, Q., et al. The reduction of fib damage on cryo-lamella by lowering energy of ion beam revealed by a quantitative analysis. Structure. 31 (10), 1275-1281.e4 (2023).
  37. Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. J Struct Biol. 213 (3), 107743(2021).
  38. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Elife. 11, e82891(2022).
  39. Yang, J., et al. Integrated fluorescence microscopy (IFLM) for cryo-fib-milling and in-situ cryo-ET. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  40. Li, S., et al. Eli trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  41. Medeiros, J. M., et al. Robust workflow and instrumentation for cryo-focused ion beam milling of samples for electron cryotomography. Ultramicroscopy. 190, 1-11 (2018).
  42. Goetz, S. K., et al. A modular platform for automated cryo-fib workflows. Elife. 10, e70506(2021).
  43. Eisenstein, F., Fukuda, Y., Danev, R. Smart parallel automated cryo-electron tomography. Nat Methods. 21 (9), 1612-1615 (2024).
  44. Swulius, M. T., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cryo Electron TomographyHigh Pressure FreezingMouse HippocampusTissue Lamella PreparationCryo FIB MillingPlatinum Sputter CoatingSubtomogram AveragingCorrelative MicroscopyNative Cellular UltrastructureSynaptic Structures

Powiązane artykuły