Ilościowa identyfikacja zmian w jednostkach tworzących kolonie bifidobakterii i mlekowo-pałeczki podczas leczenia rifaksiminą oraz żelu synbiotycznego u zdrowych ochotników

Summary

To badanie kliniczne oceniało liczbę bifidobakterii i laktobacyli po tygodniu leczenia rifaksiminą oraz żelu synbiotycznego składającego się z Lactobacillus acidophilus NCFM i Bifidobacterium lactis Bi07, z agawinową inuliną, podczas leczenia rifaksiminą i 4 tygodnie po zabiegu, w porównaniu z żelem placebo, wykazując, że żel synbiotyczny może pomagać w utrzymaniu mlekowych i bifidobakterii.

Abstract

Chociaż mikrobiota jelitowa jest zazwyczaj stabilna, może być na nią wpływana przez leczenie antybiotykami. Rifaksimin, stosowana w leczeniu zaburzeń przewodu pokarmowego, jest często podawana wraz z probiotykami, aby zmniejszyć ryzyko dysbiozy. Lactobacillus acidophilus wchodzi w interakcje z komórkami jelit i wykorzystuje związki prebiotyczne. Bifidobakterie, szczególnie Bifidobacterium infantis ssp. lactis Bi07, to probiotyk związany z korzystnymi efektami w jelitach. Badania in vitro wykazały wyższość fruktanów agawy nad inuliną cykoriową. Żadne badania nie udokumentowały zmian w liczbie laktobacyli i bifidobakterii w kałach po jednoczesnym podawaniu rifaksiminy i synbiotyku. Naszym celem było ocenenie zmian w liczbie CFU bifidobakterii jelitowych i laktobacyli u zdrowych ochotników po spożyciu żelu synbiotycznego, który zawiera Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 oraz agawiową inulinę jako prebiotyk, podczas 1 tygodnia leczenia rifaksiminą i przez 4 tygodnie po nim. W randomizowanym, placebo-kontrolowanym, podwójnie ślepym badaniu klinicznym, Zdrowi uczestnicy bez leczenia przeciwdrobnoustrojowego w poprzednim miesiącu zostali losowo przydzieleni w stosunku 1:1 w dwóch grupach (10 uczestników na grupę). Grupa Synbiotic Gel otrzymała 10,32 g agawinowej inuliny jako prebiotyk oraz 4 × 10⁹ CFU/g Lactobacillus acidophilus NCFM i 4 × 10⁹ CFU/g Bifidobacterium lactis Bi07 dziennie przez 5 tygodni oraz 200 mg rifaksiminy dwa razy dziennie przez pierwszy tydzień. Grupa stosująca żel placebo otrzymywała żel placebo przez 5 tygodni oraz 200 mg rifaximiny dwa razy dziennie przez pierwszy tydzień. Zmiany bakteryjne oszacowano poprzez ilościowe określenie CFU na podstawie oceny mikrobiologicznej kału. Pięć tygodni później populacje mlekobakterii i bifidobakterii nie uległy zmianie. Wykrycie Lactobacillus acidophilus NCFM i Bifidobacterium lactis Bi07 w niektórych próbkach kału sugeruje kolonizację przejściową i częściową, podkreślając potrzebę badań dawka-odpowiedź z tym produktem synbiotycznym.

Introduction

Ludzka mikrobiota jelitowa to gęsto zaludniona społeczność, która obejmuje stale obecne rodzime gatunki oraz inne przejściowe mikroorganizmy. Chociaż skład może się różnić u poszczególnych osób, ogólnie uważa się go za stabilny. Jednak może być zależny od wieku, infekcji oraz leczenia antybiotykami ^1,2,3. Rifaksimin, antybiotyk o szerokim spektrum o niskim wchłanianiu jelitowym, jest stosowany w leczeniu chorób jelit i może zmieniać mikrobiotę. Bakterie probiotyczne z rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium są wykorzystywane do łagodzenia tych efektów².

Szczepy Bifidobacterium spp. wykazują oporność na rifaksiminę², co ma interesujący efekt promowania bioty jelitowej zawierającej populacje Bifidobacterium spp. w wystarczającej liczbie dla korzystnych efektów probiotycznych.

Ponadto Lactobacillus acidophilus został szeroko uznany za zdolność do interakcji z nabłonkiem przewodu pokarmowego^{typu 4} oraz zdolność do wykorzystywania prebiotyków, takich jak polisacharydy, oligosacharydy i fruktooligosacharydy. Jednak zidentyfikowano tylko kilka szczepów probiotycznych, takich jak szczep Lactobacillus acidophilus North Carolina Food Microbiology (NCFM). Dlatego ważne jest badanie ich efektów in vivo, podobnie jak obecność Bifidobacterium lactis Bi07 w przewodzie pokarmowym, która wiąże się z różnymi korzyściami wspierającymi zdrowie ^2,5. Te probiotyki wymagają prebiotyku, aby rosły optymalnie, dlatego synbiotyk zawierający zarówno probiotyk, jak i prebiotyk działa synergicznie; to znaczy, jego korzystny efekt jest wyższy niż sam probiotyk. Wraz z prebiotykami, które stanowią podłoże dla probiotyków, oczekuje się, że ta symbioza poprawi przeżywalność mikroorganizmów probiotycznych w przewodzie pokarmowym, prowadząc do większej odbudowy^mikrobioty.

Ważnym źródłem prebiotyków są agawe fruktany, które wykazują lepsze efekty in vitro na mikrobiotę niż te z korzenia cykorii (Cichorium intybus L.)⁷. Badania wykazały skutki spożycia probiotyków; na przykład Engelbrektson i in. ocenili, czy spożycie probiotyków podczas i po podaniu antybiotyku może zmniejszyć zmiany w mikrobiocie wywołane przez antybiotyki⁸. Stwierdzili, że grupa, która otrzymała mieszankę probiotyczną, wykazywała szybszą regenerację normalnej mikrobioty niż osoby bez niej⁸. Ponadto Koning i in. badali dysbiozę mikrobioty jelitowej u 40 zdrowych ochotników leczonych 500 mg amoksycyliny dwa razy dziennie przez 7 dni oraz możliwe powrót do zdrowia mikrobioty po spożyciu mieszanki probiotycznej. Wyniki wykazały, że leczenie amoksycyliną wpływa na skład rodzimej mikrobioty. Po podaniu mieszanki probiotycznej mikrobiota znacząco się zregenerowała po dwóch miesiącach spożycia⁹.

Jednak literatura wskazuje, że żadne badania nie badały wpływu spożycia synbiotyków (z agawą jako prebiotykiem) na mikrobiotę jelitową podczas i po podaniu antybiotyku, takich jak rifaksimin; Znaleźliśmy jedynie badania z udziałem probiotyków. Dlatego badanie to oceniło zmiany w liczbie CFU bifidobakterii jelitowych i laktobacyli u zdrowych ochotników po spożyciu żelu synbiotycznego, który zawiera Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 oraz agawową inulinę jako prebiotyk, w ciągu 1 tygodnia leczenia rifaksiminą i przez 4 tygodnie po niej.

Protocol

Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Badań Biomedycznych u Ludzi (CIIBH) Instytutu Narodowego Nauki Medikasów i Nutrición Salvador Zubiran (INCMNSZ) (REFERENCJA 1734). Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę przed włączeniem do tego badania.

Projekt badania i populacja

Było to randomizowane, placebo kontrolowane, podwójnie ślepe badanie kliniczne z 5-tygodniowym okresem obserwacji. Pracownicy INCMNSZ zostali zaproszeni do udziału w badaniu, a zdrowi wolontariusze w wieku 20–50 lat bez leczenia przeciwdrobnoustrojowego w poprzednim miesiącu, którzy zaakceptowali i podpisali formularz świadomej zgody, zostali uwzględnieni w latach 2011–2012. Uczestnicy badania zostali losowo przydzieleni w stosunku 1:1 do grupy żelu synbiotycznego z 10,32 g agawiowej inuliny jako prebiotyku oraz 4 × 10⁹ CFU/g Lactobacillus acidophilus NCFM oraz 4 × 10⁹ CFU/g Bifidobacterium lactis Bi07 dziennie, zawartych w 4 saszetkach przez 5 tygodni, oraz 200 mg rifaksiminy dwa razy dziennie przez pierwszy tydzień. Grupa stosująca Placebo Gel otrzymała 4 opakowania po 15 g żelu placebo, o takich samych właściwościach prezentacyjnych i sensorycznych jak Synbiotic Gel, przez 5 tygodni oraz 200 mg rifaximiny dwa razy dziennie przez pierwszy tydzień (Rysunek 1).

Ocena kliniczna

W obu grupach badania objawy i wygląd stolca oceniano za pomocą skali Bristol. Mierzono także wagę, wzrost oraz wskaźnik masy ciała (BMI). Do oceny spożycia żelu synbiotycznego, żelu placebo i rifaksiminy oraz do rejestrowania obecności lub braku skutków ubocznych związanych z przyjmowaniem żelu użyto dziennika.

Zużycie błonnika

Spożycie błonnika oceniano za pomocą dziennika żywieniowego oraz 24-godzinnego przypomnienia co tydzień w obu grupach.

Przestrzeganie leczenia

Przestrzeganie stosowania rifaksiminy i stosowania żelu oceniano, licząc liczbę dawek rifaksiminy oraz liczbę saszetek żeli synbiotycznych i placebo spożywanych na uczestnika. Obecność Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium lactis wykryto za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Ocena mikrobiologiczna kału

Podczas wizyt 0 i co tydzień przez 5 wizyt (6 wizyt) w każdej grupie, liczebność Lactobacilli, Bifidobacteria i Enterobacteria została oceniona w 120 próbkach kału metodą liczenia tablic. Metoda ta mierzy jednostki tworzące kolonie (CFU) poprzez umieszczanie rozcieńczonych próbek na specjalistycznych nośnikach stałych¹⁰. Na początku każdej wizyty pobierano próbki stolca.

Aby zidentyfikować mikroorganizmy, pobierano próbki kału i przechowywano je w probówkach BBL. Fiolka PBG była używana do zwalczania bakterii beztlenowych, a próbki kału transportowano w chłodziarce styropianowej zawierającej mrożone żelowe okładki, aby utrzymać niską temperaturę przed przetwarzaniem w laboratorium. Zdejmowano pokrywkę fiolki PBG do koprokultury, a próbkę kału pobrano za pomocą wymazu, co zapewniło, że wymaz został zaimpregnowany tą próbką. Następnie aplikator umieszczano w tubce zawierającej stałe medium hodowlane.

W przypadku bakterii beztlenowych fiolki zostały zważone, a 5–10 g kału pobrano łyżką. Następnie stolec wymieszano z zawartością fiolki i szczelnie zamykano. Do przetwarzania próbek ważono fiolki zawierające próbki oraz sterylne worki Stomacher. Próbkę opróżniano do worka, wirowano przez 60 sekund, a następnie dodano 4,5 mL wody z peptonem o stężeniu 0,1%. Następnie 500 μL próbki zostało przelane do fiolki i przerobione w wirze, aby ujednolicić mieszaninę. Po tym, jak 100 μL próbki zostało zaszczepione w duplikacie na każdej płytki konkretnego medium selektywnego, Man Rogosa Sharpe (MRS) dla mlekowych płaści oraz DP Beerens z cysteiną + cykloheksimidem (w celu eliminacji niepożądanej flory) dla bifidobakterii, do rozcieńczenia 8 (współczynnik rozcieńczenia 0,1 mL). Dla enterobakterii zastosowano podłoże MacConkey w rozcieńczeniach 5–8 (współczynnik rozcieńczenia 0,1 mL), gdzie rozdzielano kolonie bakterii i mierzono¹¹. Każdy proszek podłoża rozpuszczano w oczyszczonej wodzie destylowanej, roztwór podgrzewano do wrzenia, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie, a następnie sterylizowano w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Mieszanka była chłodzona do 46,5 °C, aby wykonać technikę wylewania, wlewając 1 mL na płytę w duplikacie do sterylnych szalek Petriego zawierających 15–20 mL medium hodowlanego, pozwalając płytom zastygnąć. Próbki zaszczepiane były inkubowane w temperaturze 37 °C w atmosferze wzbogaconej w_CO2 w beztlenowych systemach GasPak, aby utrzymać warunki beztlenowe przez 24–48 godzin. Jednostki tworzące kolonie (CFU) były oznaczone długopisem i liczone¹². Zastosowano następujący wzór:

CFU/mL = (liczba kolonii × całkowity współczynnik rozcieńczenia)/objętość powodowanej kultury (mL)

Identyfikacja cech morfologicznych mlekowych i bifidobakterii

Do identyfikacji cech morfologicznych okazu użyto barwienia Gram. Próbka kolonii bakteryjnych z każdego szczepu była umieszczana na szkiełku mikroskopowym, barwiona kryształowym fioletem przez 1 minutę, a następnie płukana wodą destylowaną. Roztwór jodu nakładano przez 1 minutę, a następnie płukano wodą destylowaną. Przez 10 sekund stosowano roztwór alkoholowo-acetonowy jako odbarwiacz i płukano wodą destylowaną. Na koniec safranyna została nałożona jako kontrast przez 1 minutę i spłukana wodą destylowaną. Preparaty mikroskopowe obserwowano pod mikroskopem optycznym za pomocą oleju immersyjnego z obiektywem 100x.

Całkowita ilościowa analiza została przeprowadzona za pomocą konwencjonalnej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na losowo wybranych próbkach kału od pięciu osób w każdej grupie, otrzymując łącznie 60 próbek w ciągu 5 tygodni. Izolaty z podłoża hodowlanego były przetwarzane do ekstrakcji materiału genetycznego. PCR wykonano przy użyciu uniwersalnych starterów bakteryjnych do amplifikacji fragmentu genu^16S rRNA 13. Produkty PCR zostały oczyszczone i sekwencjonowane. Sekwencje zostały zweryfikowane i przesłane do bazy GenBank w celu potwierdzenia obecności szczepów mlekowych i bifidobakterii wyizolowanych z próbek kału.

Analiza statystyczna

Dane są prezentowane jako częstotliwość bezwzględna i względna lub mediana (s. 25-75). Skumulowane nasilenie objawów określano na podstawie wyniku Likerta (łagodny, 1; umiarkowany, 2; ciężki, 3) podczas każdej kontroli. Porównania międzygrupowe przeprowadzono za pomocą testu sumy rangi Wilcoxona oraz chi-kwadratu lub testu dokładnego Fishera. Porównania wewnątrzgrupowe między tygodniami 0 a 5 przeprowadzono za pomocą testu Friedmana oraz wielokrotnych porównań z testem Durbin-Conover. Istotność statystyczna została ustalona na P < 0,05.

Results

Dwudziestu zdrowych ochotników zostało losowo podzielonych na grupę Synbiotic Gel (n = 10) oraz grupę Placebo Gel (n = 10) (Rysunek 2 i Tabela 1). W grupie Synbiotic Gel siedmiu stanowili mężczyźni, a trzy kobiety, z medianą wieku 31 lat (zakres 27–35 lat); w grupie stosowanej żelem placebo trzech stanowili mężczyźni, a siedem kobiet, z medianą wieku 33 lat (zakres 28–38 lat). Grupy były podobne pod względem wieku, płci, wagi i BMI. Przestrzeganie leczenia w...

Discussion

W niniejszym badaniu stwierdziliśmy istotny spadek liczby enterobakterii w próbkach kału u osób z grupy placebo z pierwszego tygodnia interwencji oraz u osób z grupy z żelem synbiotycznym w pierwszym i drugim tygodniu. Zmianę tę można wyjaśnić rifaksyminą, która została opisana jako łagodząca patogenny rozrost bakterii¹⁴. W naszym badaniu grupa stosująca żel synbiotyczny po rifaksiminie wykazała pozytywny efekt: mediana populacji szczepu Lactobacillus nie zmieniła się względem wartości wyjściowej ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rurka BBL	NA	NA	Można używać dowolnej marki
Medium DP	NA	NA	Można używać dowolnej marki
Mrożone żelowe opakowania
Medium MacConkey	NA	NA
MRS medium	NA	NA	Można używać dowolnej marki
Fiolka PBG			Bufor fosforanowy, żelatyna, sole 0,05% cysteiny jako środek redukujący dla 02
Szalki Petriego
Placebo Blend	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Te same właściwości fizyczne i sensoryczne co żel iotyczny sym, ale bez aktywnych składników
Styropianowy kontynent
Mieszanka symbiotyczna	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Produkt nienabiałowy składający się z Lactobacillus acidophilus NCMF oraz Bifidobacterium infantis Bi-07 (2 x 109  CFU/g), oraz 17,2 g agawowej inuliny jako prebiotyku w pakowaniu 15 g