Protokół wzbogacania kropli lipidów z komórek nabłonka i tkanek mlekowych bydła na podstawie wielkości

Podsumowanie

Protokół ten ma na celu uzyskanie rozdzielania i wzbogacania kropelek lipidowych na podstawie rozmiaru poprzez sekwencyjną wirowanie, umożliwiając dokładne, powtarzalne badania mechanizmów metabolizmu lipidów oraz procesów biologicznych związanych z kropelkami lipidowymi.

Streszczenie

Protokół ten opisuje sekwencyjne zróżnicowane podejście wirowania w celu wzbogacenia kropelek lipidowych (LD) o różnych rozmiarach z komórek nabłonka mlekowego bydła (BMEC) oraz tkanek mlekowych, umożliwiając analizę rozdzielczą na podstawie rozmiaru wykraczającą poza konwencjonalne metody izolacji LD objętościowej. Jako dynamiczne węzła regulacyjne intrakomórkowego metabolizmu lipidów, LD pełnią kluczowe funkcje, magazynując neutralne lipidy (takie jak trójglicerydy i estery cholesterilowe) oraz koordynując ich syntezę, hydrolizę i transport. Odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy energetycznej, wspieraniu biogenezy błon oraz ułatwianiu komórkowej transdukcji sygnałów. Ekstrakcja LD jest niezbędna do badania mechanizmów regulacyjnych metabolizmu lipidów. Badanie metabolizmu lipidów gruczołów mlecznych ma istotne znaczenie dla rozwoju niemowląt, zdrowia człowieka, ekonomii rolnictwa oraz podstawowej biologii komórki. Dlatego opisujemy metodę różnicowej wirowania do ekstrakcji LD z BMEC i tkanki gruczołu mlecznego. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść do izolacji LD w masie, protokół ten umożliwia wzbogacenie subpopulacji LD oparte na rozmiarze poprzez sekwencyjną korektę sił odśrodkowych. Integralność i względne wzbogacenie frakcji LD są wstępnie oceniane za pomocą barwienia BODIPY493/503, co zapewnia praktyczne i powtarzalne podejście do dalszych analiz metabolizmu lipidów i procesów związanych z LD.

Wprowadzenie

Krople lipidowe (LD) to dynamiczne organelli w komórkach, które służą jako główne miejsca przechowywania neutralnych lipidów¹. Nieprawidłowe gromadzenie się LD wiąże się z szerokim zakresem chorób, wykraczając poza otyłość, obejmując takie schorzenia jak stłuszczenie wątroby², choroby sercowo-naczyniowe³, cukrzyca⁴ oraz rak⁵. Z kolei niewystarczająca liczba LD może mieć poważne konsekwencje, prowadząc do utraty rezerw energii komórkowej i późniejszych upośledzeń funkcji⁶. W kontekście ekonomii rolnictwa niewystarczające wartości LD u przeżuwaczy mogą prowadzić do niewystarczającej wydzieliny tłuszczu mlecznego, co prowadzi do depresji tłuszczu mlecznego, a to z kolei zagraża wartości odżywczej i atrakcyjności produktów mlecznych⁷. Obecnie regulacja metabolizmu LD stała się istotnym obszarem badań.

Rozwój technik ekstrakcji LD od XX wieku konsekwentnie dążył do pozyskiwania LD w większych ilościach, o wyższej czystości i lepiej zachowanej aktywności biologicznej. Oznacza to ciągłe ustanawianie i optymalizację metodologii. Obecnie kilka firm zaprojektowało komercyjne zestawy separacji LD⁸. Chociaż te zestawy znacznie skracają czas separacji i wymagają jedynie użycia konwencjonalnych wirówek, w próbkach trudnych do dysocjacji nie można regulować odczynnika, a optymalizacja kroków testowych jest trudna. Ponadto ekstrakcja LD odgrywa nieodłączną rolę w wyjaśnianiu mechanizmów chorobowych, w tym chorób metabolicznych, takich jak stłuszczenie wątroby⁹, rak¹⁰ oraz choroby neurodegeneracyjne¹¹, służąc jako wielowymiarowa sonda do rozszyfrowania szlaków patologicznych. Skład białek i lipidów można również rozłożyć na czynniki pierwsze poprzez ekstrakcję LD, aby ujawnić różnorodność funkcji biologicznych LD¹².

Tworzenie tłuszczu mlecznego to nie jedynie proces degradacji podłoża; Zamiast tego reprezentuje wysoce zorganizowany proces syntezy i pakowania lipidów realizowany przez komórki nabłonka mlecznego. ¹³. Wytwarzanie tłuszczu mlecznego u krów mlecznych zależy od mechanizmu wydzielania błony wierzchołkowej tych komórek: trójglicerydy syntetyzowane w retikulum endoplazmatycznym tworzą cytoplazmatyczne LD, które następnie są transportowane do błony wierzchołkowej i wydzielane przez pączkowanie. Podczas tego procesu LD są otaczane błoną tłuszczu mlecznego pochodzącą z błony wierzchołkowej, co skutkuje powstawaniem strukturalnie stabilnych kulek tłuszczu mlecznego¹⁴. Gruczoł mleczny bydła służy jako klasyczny model do badania laktacji u ssaków, a podstawowe mechanizmy rządzące syntezą i wydzielaniem LD są u ludzi silnie zachowane¹⁵. Opracowanie metod ekstrakcji LD zarówno z BMEC, jak i tkanki mlecznej może połączyć produkcję zwierząt z zdrowiem ludzi. Analizy proteomiczne i lipidomiczne wyekstrahowanych LD mogą być następnie wykorzystywane do poprawy wydajności i jakości mleka, zapewniając bezpieczeństwo i ochronę.

Obecna metoda opiera się głównie na niskiej gęstości charakterystycznej dla LD, która powoduje ich unoszenie się na szczyt gradientu podczas wirowania¹⁶. Procedura ekstrakcji składa się z trzech głównych etapów: pobierania próbek, ultrawirowania do flotacji LD oraz płukania LD. Do buforu dodaje się sacharozę (2,5 M), aby chronić LD, a prędkość wirowania jest następnie dostosowywane do wymagań eksperymentalnych; zazwyczaj duże LD mogą być wzbogacane przy siłach poniżej 10 000 x g, natomiast wyższe prędkości (powyżej 10 000 x g) są wykorzystywane do wydobycia małych LD, ponieważ większe LD mogą pękać w takich warunkach. Na koniec ekstrahowane LD przechodzą wielokrotne płukania, aby zapobiec zanieczyszczeniu, a czystość ekstrakcji jest wstępnie oceniana za pomocą barwienia BODIPY493/503.

Konwencjonalne metody izolacji LD pozwalają przede wszystkim uzyskać masowe odzyskanie heterogenicznych populacji LD, ograniczając analizę różnic strukturalnych i funkcjonalnych zależnych od rozmiaru. Niniejszy protokół rozszerza standardowe podejścia, umożliwiając wzbogacanie subpopulacji LD oparte na wielkości poprzez sekwencyjną wirówkę różnicową, ułatwiając badania wzrostu LD, przemiany, transportu wewnątrzkomórkowego oraz różnicowego wykorzystania przez szlaki lipolityczne lub autofagiczne. Takie podejście prowadzi do wzbogacenia zamiast absolutnego oczyszczenia, a częściowe nakładanie się ułamków rozmiarów może wystąpić z powodu ciągłych rozkładów rozmiarów i wspólnych właściwości fizycznych.

Protokół

Określ docelową wielkość kropelki lipidowej dla wzbogacenia (Rysunek 1).

1. Ustawienie odczynnika

1. PBS: Waż 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3,58 g Na₂HPO₄·12H₂O oraz 0,24 g KH₂PO₄ w 800 mL ddH₂O. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl, dokładnie wymieszaj i zwiększ objętość do 1 L. Przechowuj w 4 °C do roku po autoklawingu.
2. Sacharoza (2,5 M): Waż 856 g sacharozy i rozpuszczaj ją w 400 mL ddH₂O. Dokładnie wymieszaj, aż sacharoza całkowicie się rozpuści, następnie dostosuj objętość do 1 L. Roztwór w autoklawie przechowuj w 4 °C przez maksymalnie 3 miesiące.
3. Bufor A: Waż 1,79 g trycyny i rozpuszcza ją w 400 mL ddH₂O. Reguluj pH do 7,8 przy użyciu KOH. Po regulacji pH dodaj 50 ml przygotowanego roztworu sacharozy o pojemności 2,5 m. Dokładnie wymieszaj i dostosuj objętość do 500 mL. Po autoklawowaniu bufor można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
4. Bufor B: Waż 0,95 g HEPES, 1,49 g KCl i 0,038 g MgCl₂·6H₂O osobno w 180 mL ddH₂O. Reguluj pH do 7,4 z KOH, dokładnie wymieszaj i zwiększ objętość do 200 mL. Po autoklawowaniu przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
5. PMSF (1 000x, 0,2 M): Waż 0,175 g PMSF i rozpuszcza go w 5 mL DMSO. Przechowuj je chronione przed światłem w temperaturze -20 °C przez maksymalnie jeden rok.
   UWAGA: PMSF jest wysoce toksyczne; Należy podjąć odpowiednie środki ochronne. Podczas przygotowań należy zapewnić pełną ochronę przed światłem; PMSF jest trudny do rozpuszczenia i można go alicytać do rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL.

2. Ekstrakcja LD z komórek

1. Kultura BMECs
   1. Wyjmij pięć rurek z zamrożonymi ogniwami BMEC z lodówki o temperaturze -80 °C i szybko rozmroz je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po całkowitym rozmrażeniu wiruj probówki w dawce 250 x g przez 4 minuty i 30 sekund.
   2. Usuń pożywkę kriopkonserwacyjną pipetorem, dodaj 1 mL 10% FBS, aby ponownie zawiesić komórki, wymieszaj i delikatnie dodaj komórki do naczynia do hodowli komórek o średnicy 100 mm zawierającej 6 ml 10% FBS. Delikatnie kołysz naczynie, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO₂.
   3. Monitoruj morfologię komórek pod mikroskopem i wykonuj subkulturę, gdy komórki osiągną łączność 80%–90%.
      UWAGA: Zapewnij optymalny stan komórek i odpowiednią liczbę komórek przed ekstrakcją LD, aby poprawić wydajność i powtarzalność.
   4. Wyrzuć oryginalne medium hodowlane do szalki Petriego pipetą i dodaj 1 mL PBS wzdłuż ścianki każdej miseczki. Po dwukrotnym umyciu dodaj 1 ml trypsyny do każdego naczynia i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3 minuty i 30 sekund.
   5. Obserwuj, czy komórki są całkowicie strawione pod mikroskopem, dodaj 1 ml 10% FBS, aby zakończyć trawienie po zakończeniu trawienia. Delikatnie zawiesz komórki pipetowaniem, przelej je do rurki mikrowirówki o pojemności 2 mL i wiruj w 250 x g przez 4 minuty i 30 sekund.
   6. Usuń supernatant i powtórz procedury opisane w kroku 1.2.
   7. Rozbuduj komórki za pomocą około 30 misek hodowlowych lub większych naczyń hodowlanych, albo używaj większych misek hodowlowych do hodowli komórek. Dodaj 150 μmol/l t10,c12-CLA (rozcieńczonego w DMEM) w celu leczenia komórek noc przed ekstrakcją. Użyj 7 ml medium hodowlanego na naczynie o średnicy 100 mm. Czas hodowli zależy od wielkości LD, które trzeba rozdzielić.
      UWAGA: Na podstawie wcześniejszej optymalizacji traktuj BMEC t10,c12-CLA przez 6 godzin, aby wzbogacić duże LD, lub przez 12–24 godziny, aby wzbogacić małe LD. Ponieważ komórki zawierają niewiele LD, zwykle dodaje się egzogenne kwasy tłuszczowe, aby wywołać ich nagromadzenie. W tym badaniu dodano t10,c12-CLA do hodowanych komórek, aby wywołać nagromadzenie LD.
2. Zbieranie próbek
   1. Usuń oryginalne medium, dodaj 1 ml lodowatego PBS i przemyj 3 razy. Nie wyrzucaj PBS podczas ostatniego prania. Na przykładzie 30 misek z ogniwami o średnicy 100 mm, zbieraj komórki z każdej 10 płytek do jednej rurki wirówki o pojemności 15 mL, każda zawiera około 1x108, co daje łącznie 3 rurki wirówkowe.
      UWAGA: Utrzymywać wszystkie próbki w temperaturze ≤4 °C przez cały proces ekstrakcji, aby zapobiec degradacji białek w LD.
   2. Po wyważeniu wiruj w 1000 x g, 4 °C przez 10 minut.
   3. Usuń PBS. Dodaj 10 mL przygotowanego buforu A oraz 10 μL PMSF (1000x, 0,2 M) do rurki wirówki. Dokładnie wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 20 minut.
3. Liza komórek i frakcjonowanie początkowe
   1. Komórki rozbij, używając sondowego homogenizatora ultradźwiękowego działającego w cyklach impulsowych 5 s WŁĄCZONY i 10 s wyłączony, co daje łączny efektywny czas sonifikacji wynoszący 10 minut w ciągu 30 minut. Ustaw przyrząd na 40% mocy (odpowiadającej amplitudzie sondy około 76 μm) za pomocą sondy o średnicy 3 mm.
      UWAGA: Trzymaj próbki na lodzie przez cały zabieg, aby zapobiec przegrzaniu.
   2. Wiruj homogenat w temperaturze 3 000 x g i 4 °C przez 10 minut, aby usunąć jądra i zanieczyszczenia komórkowe. Zbierz supernatant jako postjądrowy supernatant (PNS).
4. Ultrawirowanie pływających LD
   1. Przefiltruj supernatant przez sitko o pojemności 100 μm.
   2. Pipeta 10 mL PNS do rurki wirówki o pojemności 15 mL. Kolejno dodaj 2 mL sacharozy (2,5 M) i 2 mL Buforu B na górę pchódu (objętość sacharozy można odpowiednio zmniejszyć przy jednoczesnym zwiększaniu objętości Buforu B, aby zwiększyć czystość LD), a następnie po raz pierwszy wiruj (5 000 x g, 4 °C, 20 min).
   3. Po wirowaniu zbieraj mleczną, kremową warstwę LD na górze rurki. Aby zebrać LD, najpierw dodaj 100 μL Buforu B do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, a następnie użyj pipety 20 μL, aby delikatnie zasysać unoszącą się warstwę LD wielokrotnie, zbierając jak najwięcej LD.
      UWAGA: LD tworzą unoszącą się warstwę kremową na górze; Unikaj jak największego zasysania podłoża, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
   4. Wykonaj drugą wirówkę (10 000 x g, 4 °C, 30 min) i pobierz LD.
   5. Przelej roztwór do rurki ultrawirówki kompatybilnej z wirnikem z łyżką obrotową, zakręć ją i wyważ rurki. Trzecią wirówkę wykonuj w ultrawirówce (50 000 x g, 4 °C, 40 min) i zbieraj LD.
      UWAGA: Precyzyjnie wyważ rurki (do 0,0001 g), aby zapewnić bezpieczną pracę w ultrawirówce.
   6. Po wyważeniu wykonaj czwartą wirówkę (150 000 x g, 4 °C, 50 min), aby kontynuować zbieranie LD. Optymalizuj prędkość i czas trwania zgodnie z docelowym rozmiarem LD.
      UWAGA: Długotrwała lub powtarzająca się wirówka o wysokiej prędkości może zakłócać LD. Natomiast krótkotrwała wirówka o stężeniu 10 000 x g podczas mycia głównie usuwa zanieczyszczenia i ma minimalny wpływ na integralność LD. Ta metoda jest adaptowalna; optymalizacja może być wymagana dla różnych typów komórek lub tkanek.
5. Mycie LD
   1. Ponownie zawiesić zebrane LD w zimnym buforze B i wirować w 10 000 x g i 4 °C przez 5 minut.
   2. Ostrożnie usuń supernatant i powtórz proces mycia co najmniej cztery razy, używając tej samej objętości bufora, siły odśrodkowej i czasu wirowania. W przypadku małych LD zwiększ siłę odśrodkową w razie potrzeby, aby zapewnić efektywne rozdzielanie.
   3. Po ostatnim myciu zgromadzić frakcje LD, delikatnie wymieszać i przechowywać w temperaturze −80 °C.
      UWAGA: Nie pomijaj kroków mycia, nawet jeśli pewne straty LD są nieuniknione. Kontynuuj mycie, aż nie pozostanie żaden widoczny odpad z błony.

3. Ekstrakcja LD z tkanek

1. Zbieranie próbek
   1. Pobierz próbki tkanki mlecznej bydła z ciekłego azotu. Zważ 5 g tkanki i rozmroź ją na lodzie, aż nie zostanie żaden kryształek lodu.
   2. Przepłucz tkankę PBS lub solą fizjologiczną.
   3. Pokrój tkankę na kawałki o grubości 1-2 mm nożyczkami chirurgicznymi.
   4. Przełóż posiekaną tkankę do wcześniej schłodzonej zaprawy zawierającej 12 mL Buforu A i 10 μL PMSF (1 000x, 0,2 M). Miel mieszankę na lodzie przez około 10 minut.
   5. Inkubuj homogenat na lodzie przez 20 minut.
   6. Po dokładnym zmieleniu zbierz homogenat do rurki wirówki o pojemności 15 mL.
   7. Wirówka w 2 500 x g, 4 °C przez 10 minut. Powstałym supernatantem jest PNS.
2. Ultrawirowanie pływających LD
   1. Przefiltruj supernatant przez sitko o pojemności 100 μm.
   2. Pipeta 10 mL PNS do rurki wirówki o pojemności 15 mL. Kolejno dodawaj 2 mL sacharozy i 2 mL Buforu B. Wykonaj pierwsze wirowanie (4 000 x g, 4 °C, 20 minut). Zbierz mleczny, kremowy materiał.
   3. Wykonaj drugą wirówkę (7 000 x g, 4 °C, 30 min) i pobierz LD.
   4. Wykonaj trzecią wirówkę (10 000 x g, 4 °C, 40 min) i pobierz LD.
   5. Przelej supernatant do rurki SW40 i wykonaj ultrawirowanie (50 000 x g, 4 °C, 50 min). Zbieraj LDs.
   6. Wykonaj piątą wirówkę (100 000 x g, 4 °C, 60 minut). Zbieraj LDs.
3. Mycie LD
   Należy się odnieść do metody płukania LD ekstrahowanych przez komórki.

4. Wstępna walidacja czystości LD poprzez barwienie

1. Przygotuj 10 μg/mL neutralny roztwór fluorescencyjny lipidów z wyprzedzeniem, w warunkach chronionych przed światłem (BODIPY: Bufor B = 1:100, V/V).
2. Dodaj odpowiednią ilość mieszanych LD i buforu B do rurki mikrowirówki. W warunkach chronionych przed światłem dodaj odpowiednią ilość neutralnego roztworu fluorescencyjnego lipidowego. Dokładnie wymieszaj i inkubuj przez 10 minut.
3. Przygotuj czyste szkiełko mikroskopowe. Na pokrywkę należy wysypać 2,5 μL mieszanki. Delikatnie połóż szkiełko na mieszance, unikając pęcherzyków powietrza. Obserwuj pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.

5. Weryfikacja czystości LD metodą Western blot

1. Stężenie białek w frakcjach LD zmierzono za pomocą zestawu do analizy białek BCA.
2. Do analizy Western blot wymieszaj 20 μg białka z każdej próbki z 5x buforem SDS i podgrzej w temperaturze 99 °C przez 10 minut, aby zapewnić pełną denaturację.
3. Następnie rozdziel białka za pomocą SDS–PAGE na żelach poliakrylomidowych o gradientzie 10% według ich mas cząsteczkowych.
4. Po elektroforezie przenieś białka na wcześniej aktywowane membrany PVDF, a następnie blokuj je 5% BSA w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Następnie inkubuj błony przez noc w temperaturze 4 °C z głównymi przeciwciałami, w tym króliczym anty-Perilipiną 2 (1:500) oraz króliczym anty-β-aktyną (1:5000).
5. Płucz błony trzy razy 1 razem TBST przez 10 minut każdy, a następnie inkubuj z przeciwciałem przeciwkróliczym przeciw królikom sprzężonym z HRP (1:5000) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Po trzech dodatkowych myciach TBST wykryj pasma białkowe za pomocą zestawu do ulepszonej chemiluminescencji (ECL) i wizualizuj za pomocą systemu obrazowania żelowego.

6. Punkty pauzy i wytyczne dotyczące przechowywania

1. Utrzymuj PNS w lodzie do 1–2 godzin przed ultrawirowaniem.
2. Trzymaj zebrane LD na lodzie do 1–2 godzin przed umyciem. Do przechowywania krótkoterminowego przechowuj LD w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny. Do długotrwałego przechowywania należy przechowywać LD w temperaturze −80 °C i ograniczać cykle zamrożenia i rozmrażania do maksymalnie jednego, aby zachować integralność LD.
3. Podczas wszystkich przerw eksperymentalnych trzymaj próbki na lodzie z zamkniętymi kapslami na rurkach, aby zminimalizować zanieczyszczenie.

7. Rozwiązywanie problemów

1. Cienka warstwa pływająca: dostosuj objętość bufora lub siłę wirowania.
2. Słaba ulewność: zwiększ prędkość wirowania lub wydłuż czas.
3. Zanieczyszczenia: zapewnij sterylny kontakt i filtrowane bufory.
4. Pęknięcie LD: trzymaj próbki na lodzie, zmniejszaj siłę wirowania lub delikatnie je zawieszaj.

Wyniki

Przepływ pracy i ramy metodologiczne
Schemat drzewa decyzyjnego (Rysunek 1) został opracowany, aby kierować wyborem warunków wirowania zgodnie z celami eksperymentalnymi. Konkretnie, siły odśrodkowe ≤10 000 x g były wykorzystywane do wzbogacania dużych LD (≥2 μm), natomiast siły >10 000 x g do wzbogacania małych LD (<1 μm). Ten framework stanowi praktyczną podstawę do osiągnięcia separacji LD opartej na rozmiarze. Ogólny proces izolacji LD od BMEC-ów i...

Dyskusja

LD to unikalne organelle charakteryzujące się neutralnym rdzeniem lipidowym otoczonym przez monowarstwę fosfolipidową. Pączkują z siatkówki endoplazmatycznej i dynamicznie zmieniają swój rozmiar oraz liczbę, ułatwiając transport wewnątrzkomórkowy oraz rozległą komunikację z innymi strukturami podkomórkowymi w celu koordynacji homeostazy lipidów komórkowych 17,18,19. To dynamiczne zachowanie jest dodatkowo modulowane przez ogólno...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco	25200072	Odczynnik
Szybkie zestawy przygotowawcze 10% PAGE Gel	Beijing BIOMAN	PG112	Odczynnik
100 μ Sitnik komórek M	Beyotime	FSTR100	Odczynnik
Naczynie hodowli komórek o średnicy 100 mm	Corning	490167	Odczynnik
Amersham Imager 600	GE Healthcare Nauki o Życiu	600	Wyposażenie
Autoklaw	Panasonic	MLS-3751L	Wyposażenie
Zestaw do testowania białka BCA	Pekin, Dingguo.	BCA01	Odczynnik
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Odczynnik
Wirówka	Eppendorf		Wyposażenie
DMEM	HyClone	SH30022.01	Odczynnik
DMSO	Solarbio	D8370	Odczynnik
Surowica bydła płodowa	Gibco	2492319	Odczynnik
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	Odczynnik
Przeciwciało przeciwtorowe przeciw królikom AffiniPure sprzężone z HRP	Proteintech	SA00001-2	Odczynnik
KCl	HUSHI	20030666	Odczynnik
KH2PO4	HUSHI	10017608	Odczynnik
MgCl2	HUSHI	20059028	Odczynnik
Na2HPO4· 12H2O	HUSHI	S112623	Odczynnik
NaCl	HUSHI	10019328	Odczynnik
Omni-Easy Instant Protein Load Buffer	Technologia Biomedyczna Shanghai Epizyme	LT101S	Odczynnik
Zestaw do wykrywania chemiluminescencji ultra-czułej Omni-ECL	Technologia Biomedyczna Shanghai Epizyme	SQ201	Odczynnik
PBS	HyClone	SH30256.01	Odczynnik
Penicylina i Streptomycyna 100 razy;	NCM Biotech	CLOOC5	Odczynnik
pH miernik	METTLER TOLEDO	S220K	Wyposażenie
Pipeta	Eppendorf		Wyposażenie
PMSF	Coolaber	CP8651	Odczynnik
Zestaw do transferu membranowego PVDF	GenScript	eBlot L1	Odczynnik
Królik anty-Perilipin 2	Abcam	15294-1-AP	Odczynnik
Króliczy anty-beta;-aktyna	Proteintech	20536-1-AP	Odczynnik
Mikroskop fluorescencyjny klasy badawczej z odwróconą fluorescencją	Olympus	IX73	Wyposażenie
Sacharoza	Solarbio	S8271	Odczynnik
Wirnik SW 40 Ti	BECKMAN COULTER	331301	Wyposażenie
Trans-10, cis-12 sprzężony kwas linolowy	KAJMANY	90145	Odczynnik
Trycyna	Coolaber	CT11331	Odczynnik
Ultrawirówka	BECKMAN COULTER	Optima XE-100	Wyposażenie
Ultradźwiękowa kruszarka ogniwowa	SCIENTZ	JY92-11N	Wyposażenie