Artykuł metodologiczny

Model szczura z kanulacją przewodu limfatycznego szyjnego do oceny transportu limfatycznego z głowy i mózgu

844 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70217

⸱

10 marca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Natural Medicines, School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, 2MOE Joint International Research Laboratory of Target Discovery and New Drug Innovation, China Pharmaceutical University, 3Department of Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten eksperymentalny protokół demonstruje głęboki model szczura z kaniulowaniem przewodów wędrowych szyjnych, który umożliwia bezpośrednią i ilościową ocenę drenażu limfatycznego z okolic głowy. Model umożliwia szczegółową analizę substancji rozpuszczonych pochodzących z ośrodkowego układu nerwowego (OUN), populacji komórek odpornościowych oraz dystrybucję i oczyszczanie terapii ukierunkowanych na OUN.

Streszczenie

Limfa przepływa z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) przez szereg naczyń limfatycznych (LV) i węzłów chłonnych, które łączą się w przewodach limfatycznych szyjnych. Oprócz utrzymania równowagi płynów, te przewody limfatyczne odgrywają kluczową rolę w transportowaniu szerokiego spektrum substancji, w tym endogennych metabolitów, cząsteczek sygnałowych, komórek odpornościowych oraz leków małych i makromolekularnych. Jest to kluczowe dla homeostazy fizjologicznej i funkcji odpornościowej zarówno wewnątrzczaszkowej (np. mózg), jak i pozaczaszkowej (np. jamy nosowej i jamy ustnej). Upośledzony drenaż limfatyczny z mózgu coraz częściej wiąże się z różnymi zaburzeniami neurologicznymi i neurodegeneracyjnymi. Kanylacja przewódów limfatycznych szyjnych umożliwia zbieranie krwi odprowadzającej odpływ z głowy i mózgu, umożliwiając pomiar stężenia i szybkości transportu różnych substancji przez układ limfatyczny. Zmiany tych czynników w odpowiedzi na różne wyzwania (np. leki, stres, trauma) i choroby (np. udar, infekcje, choroba Alzheimera) również mogą być określane. Tutaj opisujemy znieczulony, głęboko sterylizowany model szczura z głębokim przewodem chłonnym szyjnym, który umożliwia pobieranie chłonności przez kilka godzin po operacji. Metoda ta może być łączona z technologiami obrazowania i multiomiki do pomiaru szerokiego zakresu parametrów zainteresowanych limfą. Ułatwia to podstawowe badania fizjologiczne i patofizjologiczne regionu głowy i szyi, a także badania farmakokinetyczne i farmakodynamiczne leków, szczególnie w leczeniu chorób OUN.

Wprowadzenie

Układ limfatyczny, rozmieszczony w całym ciele, jest niezbędny do utrzymania homeostazy płynów, regulacji odpowiedzi immunologicznych oraz ułatwiania transportu składników odżywczych i cząsteczek sygnałowych1. Limfatyczne obwodowe zaczynają się w naczyniach włosowatych limfatycznych, które zbierają płyn śródmiąższowy i rozpuszczone substancje, a następnie odprowadzają wody do większych naczyń limfatycznych (LV), które posiadają otaczającą warstwę mięśni gładkich; Naczynia te następnie dostarczają limfę do lokalnych węzłów chłonnych w celu przetwarzania odpornościowego 2,3. Sieć limfatyczna drenujące obszar głowy jest ważna dla homeostazy zarówno narządów śródczaszkowych (np. mózg), jak i pozaczaszkowych (np. jamy nosowej i jamy ustnej). Struktura i organizacja sieci limfatycznej pozaczaszkowej uważa się za podobną do tych limfatycznych obwodowych w całym ciele, podczas gdy układ limfatyczny wewnątrzczaszkowy wykazuje unikalne cechy anatomiczne i funkcjonalne (patrz Rysunek 1 dla szczegółowego schematycznego przedstawienia w modelach szczurów)4,5. Chociaż typowe LV są nieobecne w parenchymie mózgu, funkcje limfatyczne są pośredniczone przez wyspecjalizowany, zależny od gleja układ transportu limfatycznego (glimfatyczny), który ułatwia wymianę płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) z płynem śródmiąższowym (ISF)6. Podczas gdy układ glymfatyczny umożliwia mieszanie ISF w parenchymie mózgu z płynem mózgowym, LV oponowego, okołonaczyniowego i nosowogardłowego transportują substancje rozpuszczone z płynu mózgowo-płynowego z jamy czaszkowej. Konkretnie, szlak limfatyczny mózgowo-rdzeniowy kieruje płyn mózgowo-rdzeniowy z przestrzeni podpajęczynuszowej do LV oponowych, łącząc dynamikę płynów wewnątrzczaszkowych z obwodowym czyszczeniem limfatycznym7. Równolegle szlaki okołowo-nerwowe umożliwiają wypływ płynu mózgowo-rdzeniowego i powiązanych substancji rozpuszczonych wzdłuż osłonek nerwów czaszkowych i rdzeniowych, najbardziej przez nerwy węchowe do splotu chłonnego nosowo-gardłowego 5,8. Równoczesne badania tych systemów utrzymują homeostazę płynów w mózgu 6,7,8. Najnowsze osiągnięcia w zrozumieniu układu limfatycznego drenującego OUN dostarczyły nowych informacji na temat fizjologii i patofizjologii mózgu. Te odkrycia mogą oferować nowe możliwości interwencji terapeutycznej w chorobach OUN9.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie szlaków oczyszczania limfatycznego OUN. Szlaki te składają się z (A) szlaku glymfatycznego przez przestrzenie okołonaczyniowe; (B) szlak limfatyczny nosowogardłowy oraz (C) LV oponkowe (LV). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sieci limfatyczne odprowadzające odwady z głowy i OUN zbiegają się do przewodów limfatycznych szyjnych znajdujących się w szyi, gdzie limfa jest filtrowana przez węzły chłonne szyjne, zanim wejdzie do krążenia ogólnoustrojowego. Węzły chłonne szyjne dzielą się na powierzchowne (sCLN) i głębokie węzły chłonne szyjne (dCLN) zgodnie z ich anatomicznym położeniem w obrębie szyi. Zmiany w składzie płynu limfatycznego w przewodach limfatycznych szyjnych uważa się za odzwierciedlenie podstawowych zmienności patofizjologicznych w mózgu, przy czym choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), uraz mózgu pourazowy (TBI) oraz poudarowe zaburzenia poznawcze (PSCI) są przykładami reprezentatywnymi 9,10,11,12,13 . Warto zauważyć, że w przypadku AD upośledzony drenaż białek amyloid-β (Aβ) i fosforylowanych białek tau (P-tau) przez te szlaki limfatyczne został uznany za czynnik przyczyniający się do postępu choroby 9,10,14. Poprzez bezpośrednie połączenie przewodów limfatycznych z sąsiednimi żyłami w celu przekierowania drenażu limfatycznego, badanie jest stosowane zarówno u zwierząt, jak i ludzi jako strategia terapeutyczna mająca na celu zwiększenie wypływu limfatycznego z OUN, co ułatwia oczyszczanie Aβ z mózgu i potencjalnie opóźnia postęp AD 6,15,16. Znaczenie tego szlaku ilustrują dodatkowo obserwacje u myszy poddanych chirurgicznemu usunięciu węzłów chłonnych szyjki (limfadenektomia), co skutkowało zmniejszoną czystością limfatyczną szyjki macicy. Upośledzona klirenacja prowadzi do toksycznego nagromadzenia Aβ i P-tau, a następnie aktywacji szlaków sygnalizacji kinaz patologicznej. Zmiany te wiążą się z postępującym pogorszeniem się tauopatii podobnej do AD oraz zwiększonym ryzykiem zachowań podobnych do lęku i depresji14,16. Ponadto badania oparte na OUN sugerują, że guzy OUN, takie jak chłoniaki mózgu, mogą fizycznie blokować oczyszczanie limfatyczne przez głębokie przewody cerwiowe szyjne, jednocześnie podwyższając stężenia onkoproteiny w CSF 9,17,18. Dowody z badań zapalnych ośrodkowego układu nerwowego wskazują również, że komórki pochodzące z opon mózgowych mogą migrować przez oponowe LV do węzłów chłonnych szyjnych 8,19. Komórki te składają się głównie z limfocytów, z mniejszymi populacjami komórek dendrytycznych, makrofagów i komórek śródbłonka 19,20. Podczas stanu zapalnego lub po urazie lub operacji OUN, transport limfatycznych komórek odpornościowych jest wyraźnie zwiększony, a towarzyszy mu podwyższony poziom biomarkerów immunologicznych, takich jak cytokiny, chemokiny i inne mediatory zapalne21.

Oprócz swoich funkcji patofizjologicznych, sieć limfatyczna szyjki macicy jest coraz częściej uznawana za ważny kanał do użycia leków. Wcześniejsze badania na zwierzętach wykazały, że kilka preparatów przeznaczonych do podawania OUN może przejść oczyszczanie z mózgu przez przewody chłonne szyjki i węzły chłonne (w różnym stopniu), czego przykładem są środki na bazie nanocząsteczek podawane wewnątrz mózgu (np. lamotrygina, talazoparib) oraz leki biologiczne (np. przeciwciała monoklonalne, białka znacznicze radioaktywnie)22,23,24,25. U ludzi badania obrazowe MRI wykazały, że niektóre cząsteczki, takie jak gadobutrol, przechodzą aktywny transport z układu glymfatycznego do przewodów limfatycznych szyjnych26.

Jak wspomniano wcześniej, węzły chłonne szyjne, zarówno sCLN, jak i dCLN, odprowadzają odprowadzanie chłonności z różnych obszarów głowy; jednak konkretne obszary czaszki drenowane przez każdy węzeł pozostają niejasne27,28. Nakładające się obszary drenażowe, zmienność anatomiczna między osobami oraz potencjalne różnice strukturalne międzygatunkowe dodatkowo komplikują opis wzorców drenianu limfatycznego szyjki macicy zarówno u zwierząt, jak i ludzi29. W złożonej sieci limfatycznej szyjki szyjnej zidentyfikowano głębokie przewody wyprowadzające szyjne jako główne drogi odpływu płynu mózgowo-rdzeniowego, położone poniżej LV nosowogardła i oponowych8. W porównaniu z powierzchownymi przewodami limfatycznymi szyjki, które tworzą drobne i zmienne sieci w tkance podskórnej i znacznie różnią się rozmiarem oraz rozgałęzieniem między poszczególnymi szczurami, głęboki przewod limfatyczny szyjny zapewnia bardziej dostępną i praktyczną drogę do zbierania limfy pochodzącej z OUN w modelach małych zwierząt20,30. Obecny protokół koncentruje się zatem na ustanowieniu wiarygodnej metody pobierania chłonności z głębokiego przewodu limfatycznego szyjnego.

Tylko ograniczona liczba badań przeprowadzonych w ostatniej dekadzie opisywała zbieranie płynów chłonnych szyjki macicy w celu badania chorób OUN lub analizy dystrybucji leków. Poprzednie badanie opisywało pomiar stężeń leków w limfie szyjnej szyjki przez płukanie lub wyciskanie płynu z izolowanych przekrojów tkanek (takich jak te sąsiadujące z pojedynczym dCLN)31. Jednak eksperymentalne protokoły dotyczące ciągłego pobierania limfy z przewodów limfatycznych szyjnych u małych zwierząt laboratoryjnych, zwłaszcza szczurów, pozostają niedopracowane. Protokół ten ustanawia łatwo dostępną i powtarzalną metodę kanulacji przewodu chłonnego szyjki szyjnej, umożliwiając ciągłe zbieranie chłonów oraz badanie transportu limfatycznego OUN, odpowiedzi immunologicznej i farmakokinetyki. Jej kluczową zaletą jest możliwość ilościowego określania przepływu i składu limfy w określonych przedziałach czasowych, co umożliwia ilościowe pomiary leków, lipidów, kwasów tłuszczowych i składników komórkowych. Model ten w szczególności obejmuje procesy transportu limfatycznego, które nie są odpowiednio reprezentowane przez metody pobierania próbek osocza/CSF lub techniki obrazowania, oferując nowatorskie wglądy w rozmieszczenie leków w OUN, transport lipidów i składników odżywczych oraz sygnalizację immunologiczną20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez uniwersytecką komisję etyki zwierząt i przeprowadzone zgodnie z eksperymentalnymi wytycznymi etycznymi Chińskiego Uniwersytetu Farmaceutycznego. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek procedur związanych ze zwierzętami uzyskaj niezbędne zgody od odpowiedniej instytucjonalnej lub organizacyjnej komisji etyki. Samce szczurów Sprague-Dawley (SD) ważące od 220 do 250 g są wykorzystywane jako zwierzęta doświadczalne. Zwierzęta pozyskuje się od autoryzowanych dostawców zwierząt doświadczalnych (patrz Tabela Materiałów) i są trzymane w dedykowanych klatkach z nieograniczonym dostępem do jedzenia i wody aż do rozpoczęcia eksperymentu. W tym protokole opisywana jest kanulacja głębokiego przewodu chłonnego szyjnego lewego boku. Obecnie istnieją ograniczone dowody na różnice anatomiczne między lewym a prawym głębokim przewodem chłonnym szyjnym. Na podstawie obserwacji z wcześniej przeprowadzonych eksperymentów nie zaobserwowano istotnych różnic między obiema stronami, w tym w przepływie limfy.

1. Środki ostrożności i procedury bezpieczeństwa

  1. Wszystkie procedury wykonuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa, a cały personel powinien przejść odpowiednie szkolenie z technik mikrochirurgicznych, pracy ze zwierzętami doświadczalnymi oraz bezpieczeństwa chemicznego przed rozpoczęciem tego protokołu.
  2. Przez cały zabieg należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny osobisty (PPE), w tym fartuch laboratoryjny, rękawice chirurgiczne oraz gogle ochronne. Ponieważ stosuje się lotny środek znieczulający (izofluran), który może powodować depresję ośrodkowego układu nerwowego oraz toksyczność sercowo-naczyniową u ludzi po długotrwałej ekspozycji, wykonuj zabieg w dobrze wentylowanym środowisku. Jedzenie i napoje nie mogą być przynoszone do laboratorium i zapewnić, że bieżąca woda jest zawsze łatwo dostępna.
  3. Obchodzić się ze wszystkimi ostrymi przedmiotami, w tym igłami do strzykawek, żyletkami i mikronożyczkami, ostrożnie i natychmiast po użyciu wyrzucać je do wyznaczonych pojemników na ostre przedmioty; Pod żadnym pozorem nie wolno ponownie używać jednorazowych ostrych przedmiotów.
  4. Traktuj wszystkie próbki biologiczne (np. zebrane limfy) oraz płyny ustrojowe zwierząt (np. krew) jako potencjalnie niebezpieczne, a cały sprzęt do zbierania należy obchodzić ostrożnie, trzymając próbki z dala od miejsca operacji. W przypadku przypadkowego nakłucia igłą lub kontaktu skóry z substancjami niebezpiecznymi natychmiast umyj dotknięte miejsce mydłem i wodą oraz zgłoś incydent zgodnie z procedurami bezpieczeństwa instytucjonalnego.

2. Przygotowania dzień przed operacją

UWAGA: Jest to procedura terminalna u szczurów; dlatego nie jest wymagana ścisła technika aseptyczna ani analgezja pooperacyjna. Jednak obszar doświadczalny powinien być utrzymywany w czystym i higienicznym stanie przez cały czas trwania zabiegu.

  1. Postuj lub karm szczury zgodnie z wymaganiami konkretnego eksperymentu. Protokół ten nie nakazuje konkretnego stanu na czczo ani karmienia.
  2. Przygotuj roztwór antykoagulant, rozcieńczając heparynę lub etylendiaminetetraoctowy kwas (EDTA) do końcowego stężenia 10 IU/mL. Wstępnie załadować tę mieszankę (około 0,7 mL) do sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 1 mL z igłą 30 G, aby pokryć wewnętrzną powierzchnię kaniuli polietylenowej (PE) (używanej do kaniulowania przewodów limfatycznych). Przechowuj przygotowaną mieszankę w sterylnych warunkach aż do użycia.
  3. Przygotuj kanniulę do pobierania próbek limfatycznych, składając kaniulę PE w konfiguracji głowa do końca, używając rurek o średnicy zewnętrznej 0,5 mm (OD), 0,3 mm średnicy wewnętrznej (ID) dla obu sekcji końcowych oraz rurki o średnicy 0,6 mm OD i 0,5 mm ID, w środkowej części.
    1. Przetnij segmenty kanyli na długości 2 cm dla części bliższej łączącej się z igłą strzykawki, 40 cm dla środkowej części oraz 8 cm dla części dystalnej przeznaczonej do kanilowania.
    2. Przetnij i skośnie zakończ dalszy koniec zespołu kaniuli pod kątem około 45°, aby ułatwić płynne wprowadzenie do przewodu limfatycznego szyjnego. Zobacz Rysunek 2 , aby zobaczyć szczegółową ilustrację zespołu kaniuli.
      UWAGA: Ten fazowy układ ułatwia płynne wprowadzenie do przewodu limfatycznego i zmniejsza ryzyko zatkania poprzez zwiększenie efektywnej powierzchni przekroju. Po udanej kanilowacji sekcja bliższa (2 cm) jest odłączana, a chłonka jest pobierana bezpośrednio z odsłoniętego bliższego końca środkowej części (jak opisano szczegółowo w krokach 4.9 i 4.10).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat zespołu kaniuli (nie w skali). Diagram ilustruje wymiary każdego elementu złożonej rurki PE użytej do wykonania kaniuli. Od lewej do prawej złożona kanula będzie odtąd nazywana odpowiednio końcem bliższym, środkową częścią i końcem dystalnym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

  1. Przygotuj system inhalacji znieczulnej, wstępnie ładując płynny izofluran do ciśnieniowego pojemnika wyposażonego w waporyzator. Przed użyciem wykonaj test (gruntowanie) waporyzatora, aby potwierdzić szczelność i zapewnić stabilny oraz stały przepływ gazu.
  2. W razie potrzeby przygotować kandydata na lek testowy w odpowiednim pojeździe. Przeprowadz badania stabilności w celu potwierdzenia integralności formuły podczas przechowywania i całego okresu podawania. Uwzględnij dodatkowe środki (np. barwniki biologiczne, takie jak Evans Blue), jeśli to dotyczy.
  3. Przygotuj pojemniki do pobierania limfy, wstępnie ważąc sterylne rurki mikrowirówki i rejestrując ich początkowe masy. Każdą lampę oznaczaj kolejno zgodnie z planowanymi punktami czasu pobrania (np. odstępami godzinowymi). Do każdej probówki dodaj skoncentrowaną heparynę (lub EDTA) i usuń rozpuszczalnik przez odparowanie azotu, pozostawiając od 2 do 5 IU suszonej heparyny (EDTA) w każdej probówce, aby zapobiec nierównomiernemu rozcieńczeniu zebranej limfy.

3. Przygotowania bezpośrednio przed operacją

  1. Sprawdź przechodność każdej kaniuli, przepłukując przygotowanym roztworem przeciwzakrzepowym. Podłącz strzykawkę do bliższego końca złożonej kaniuli i delikatnie wypuści niewielką objętość roztworu. Upewnij się, że roztwór wychodzi płynnie z dalszego końca bez oznak przecieku. Jeśli wykryje się wyciek, co zwykle wskazuje wyciek płynu w punktach połączenia, należy odrzucić cały zespół kaniulowy i odtworzyć nowy zgodnie z krokiem 2.3.
    UWAGA: Ten etap jednocześnie wstępnie pokrywa wewnętrzną powierzchnię kaniuli antykoagulantem (ten etap może być również wykonany dzień przed zabiegiem, więc kaniula jest wcześniej pokrywana przez noc).
  2. Rozpocznij podawanie wdechowego izofluranu w przezroczystej komorze indukacyjnej z przepływem 0,6 L/min poniżej 101,3 kPa przy 20 °C. Daj szczurowi około 5 minut na pełne znieczulenie przed rozpoczęciem kolejnych kroków. Przed rozpoczęciem potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia za pomocą testu uszczypnięcia palca.
    1. Wyjmij szczura z komory indukacyjnej i kontynuuj znieczulenie za pomocą maski nosowej. Utrzymuj znieczulenie przez cały zabieg z niższą dawką 0,4 L/min.
    2. Stale monitoruj głębokość znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu. Jeśli zauważą się oznaki niepokoju lub niestabilności fizjologicznej, natychmiast uśpij szczura.
  3. Ułóż szczura na plecach na podgrzewanej podustawie chirurgicznej utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Przechyl głowę i wyprostuj szyję, używając niewielkiego podparcia (poduszki), jeśli to konieczne, aby maksymalizować ekspozycję okolicy szyjki. Zabezpiecz głowę w masce znieczulnej, aby zapewnić ciągłe podawanie izofluranu, i delikatnie unieruchom kończyny przednie za pomocą gumek lub taśm chirurgicznych, aby zminimalizować ruch podczas zabiegu.
  4. Płucz sierść na okolicy szyjnej sterylną solą fizjologiczną, aby ułatwić golenie. Dokładnie ogol całe miejsce operacji (używając obosiecznej żyletki bezpieczeństwa), zazwyczaj szyję i obojczyk, aby zapewnić całkowite usunięcie sierści przed nacięciem (patrz Rysunek 3A , gdzie można zobaczyć przykład ogolonej szyi).
  5. Oczyść cały ogolony obszar środkami dezynfekującymi, takimi jak środek zawierający jod.
  6. Oznacz miejsce operacji, rysując 2,5 cm przerywaną linię, aby potwierdzić długość początkowego nacięcia. Ustaw linię lekko na prawo od linii środkowej ciała szczura. Umieść górny koniec nacięcia około 1 do 1,5 cm poniżej dolnej wargi (patrz Rysunek 3B , gdzie można zobaczyć przykład miejsca nacięcia, z pomiarami wspomaganymi linijką).

figure-protocol-2
Rysunek 3: Przygotowanie miejsca operacji. (A) Okolica szyi jest ogolona w przygotowaniu do nacięcia; (B) przybliżoną długość i miejsce nacięcia, oznaczone linią przerywaną o szerokości 2,5 cm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Kanylowacja przewodu limfatycznego szyjnego

  1. Ustaw szczura tak, by głowa była skierowana w stronę operatora. Do tego etapu używaj mikroskopu ze względu na stosunkowo małą średnicę przewodu limfatycznego szyjnego.
  2. Używając sterylnego skalpela, ostrożnie nacinaj powierzchowną warstwę mięśni szyjnych wzdłuż wspomnianego 2,5 cm długiego znaku, ustawionego niemal równolegle do linii środkowej (patrz Rysunek 4A dla otwartej warstwy powierzchniowej skóry).
  3. Delikatnie rozdziel pozostałe warstwy mięśni, głównie powierzchowną powięzi szyjnej, aby odsłonić tętnicę szyjną, którą zazwyczaj można odróżnić po czerwonym zabarwieniu.
  4. Wycofać mięsień mostkowy i gruczoł podżuchwy i ostrożnie odchylić je od pola chirurgicznego, aby ułatwić identyfikację przewodu chłonnego szyjnego. Użyj rozszerzacza tkanek, aby utrzymać okno chirurgiczne, a patyczek wacikowy tymczasowo odchyli tkankę mięśniową podczas lokalizowania węzła chłonnego i towarzyszącego przewodu chłonnego. Upewnij się, że ekspander tkankowy jest na miejscu przez cały proces kanilowacji (patrz Rysunek 4B , gdzie znajduje się otwarte okno chirurgiczne z ekspanderem tkankowym).
  5. Zlokalizowanie przewodu limfatycznego szyjnego (najlepiej pod mikroskopem): Przewód wygląda jako nieprzezroczyste, bezbarwne naczynie o średnicy około 0,2 do 0,5 mm i biegnie bezpośrednio równolegle do tętnicy szyjnej. Często można zaobserwować jeden lub więcej sąsiednich, cielesnych dCLN wzdłuż przewodu limfatycznego szyjki szyjnej (patrz Rysunek 4C , aby zobaczyć mikroskopowy widok odsłoniętego głębokiego przewodu limfatycznego szyjnego i sąsiedniego dCLN).
    UWAGA: Przewody chłonne szyjki macicy mają zazwyczaj kolor bardzo podobny do otaczających tkanek, a ich identyfikacja często wymaga dokładnej inspekcji, szczególnie u szczurów z większą ilością tkanki tłuszczowej. Do celów chirurgicznych (ale nie do badań nad transportem leków lub substancji endogennych do limfy) Evans Blue może być podskórnie wstrzykiwana pod szyję na początku operacji, aby lepiej zobaczyć przewód limfatyczny szyjny podczas odpływu przez limfatyczne.
  6. Używając pary tępych kleszczy, delikatnie przeprowadź przez rozdzielone tkanki łączne i utrzymując kleszcze w miejscu, aby przewod limfatyczny szyjny pozostał wyraźnie widoczny w polu chirurgicznym.
  7. Ostrożnie izoluj przewod limfatyczny szyjki od otaczających tkanek łącznych i tłuszczowych za pomocą tępego przecięcia, ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć uszkodzeń, ponieważ naczynie jest niezwykle delikatne.
  8. Użyj pary mikronożyczek, aby zrobić małe nacięcie w górnej połowie odsłoniętego przewodu. Nie odłączaj całkowicie przewodu; Obie połowy muszą pozostać nienaruszone.
  9. Sprawdź i upewnij się, że przygotowana kaniula wcześniej pokryta roztworem antykoagulującym (zgodnie z Krokiem 2.3) jest wolna od pęcherzyków powietrza, wykonując delikatne przepłukanie. Bezpośrednio przed włożeniem ostrożnie chwyć dalszy koniec kaniuli za pomocą kleszczy, ustawiając ją tak, aby fazowana powierzchnia była skierowana ku górze. Następnie delikatnie przesuń kaniulę o około 2 mm w głąb kanału przez nacięcie, kierując ją w stronę głowy (patrz Rysunek 4D, aby zilustrować udane kaniulowanie). Rzeczywista głębokość wszczepienia może się różnić w zależności od konkretnego szczura.
    UWAGA: Ponieważ wstawienie kaniuli jest stosunkowo płytkie w tym zabiegu, pomocne może być dodatkowe miejsce fiksacji w okolicy. Osiąga się to poprzez wykonanie małego wtórnego nakłucia skóry (otworu) około 1,5 cm od okna chirurgicznego za pomocą nożyczek. To otwarcie będzie dodatkowo stabilizowane w kolejnych etapach (np. za pomocą szwów lub kleju). Rysunek 4E pokazuje ten etap w kontekście stosowania kleju tkankowego. Kanyulę należy przeprowadzić przez otwór, aby ułatwić jej utrzymanie.
  10. Odłącz strzykawkę insulinową wraz z krótkim (2 cm) proximalnym segmentem kaniuli od reszty zespołu kaniuli. Limfę można następnie pobierać bezpośrednio z odsłoniętego bliższego końca środkowego segmentu o większej średnicy. Obserwuj dalszy koniec tego segmentu zbiorczego przez 1–2 minuty. Potwierdzenie skutecznej kaniulacji poprzez widoczny, powolny i stały odpływ płynu limfatycznego z przewodu wykanulowanego.
  11. Po potwierdzeniu sukcesu kaniuli zabezpiecz kaniulę, nakładając niewielką kroplę kleju tkankowego cyjanoakrylanem pipetą zarówno w miejscu nacięcia przewodu limfatycznego, jak i w dziurze wtórnym (patrz Rysunek 4E , aby pokazać fiksację kaniuli). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zatkać naczynia lub nie utrudnić przepływu limfy.
  12. Obserwuj przepływ limfy przez kilka minut, aby potwierdzić stały odpływ (widoczna kropla zwykle tworzy się na końcu kaniuli w ciągu minuty). Po potwierdzeniu ostrożnie usuń ekspander tkanki z okna chirurgicznego i przestaw gruczoł podżuchwy na pierwotne miejsce.
  13. Przymocuj wcześniej oznakowaną rurkę mikrowirówki z powłoką antykoagulantową (patrz Krok 2.6) do dalszego końca kaniuli, aby zebrać swobodnie płynącą limfę.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Kanylowacja przewodu limfatycznego szyjnego. (A) miejsce nacięcia w okolicy szyi; (B) okno chirurgiczne otwierało się z założonym ekspanzerem tkankowym, a gruczoł podżuchwy cofnął się w prawo; (C) przewodu chłonnego szyjki i jednego dCLN widocznego pod mikroskopem. (D) Udana kanilacja, oznaczona zieloną linią przerywaną (widok mikroskopowy). (E) Na miejsce nacięcia nałożono klej tkankowy, a następnie wykonano wtórne nakłucie skóry za pomocą pipety. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

5. Okres pooperacyjny i podawanie leków

  1. Po zakończeniu kanilowacji przewodów limfatycznych szyjnych należy przenieść wszystkie warstwy mięśniowe na pierwotne miejsca. Następnie zamknąć nacięcie skórne za pomocą szwów i/lub kleju tkankowego; zazwyczaj nacięcie o długości 2,5 cm można prawidłowo zamknąć za pomocą 8 szwów (patrz Rysunek 5A dla okna chirurgicznego zamkniętego szwem). Po zakończeniu tego etapu usuń gumkę lub taśmy chirurgiczne z kończyn przednich.
  2. Podawaj leki do płynu mózgowo-rdzeniowego odpowiednią drogą, taką jak intra-cisterna magna (ICM), intra-cerebroventrikularna (ICV) lub douszkowa (LIT) do lędźwia (LIT). Na przykładzie podawania ICM zidentyfikuj miejsce wstrzyknięcia przy cisterna magna, położone u podstawy czaszki i widoczne jako jedyne miękkie zagłębienie na grzbietowej powierzchni. Ogol otaczającą sierść zgodnie z potrzebami, aby ułatwić wizualizację (patrz Rysunek 5B , aby zaznaczyć odpowiednie miejsce do wstrzyknięcia ICM).
    UWAGA: Aby utrzymać ciśnienie wewnątrzczaszkowe (ICP) podczas wstrzyknięcia ICM, przed podáním leku często pobiera się równoważną objętość płynu mózgowo-płynowego. Zaleca się używanie nowej, wcześniej napełnionej strzykawki do zastrzyków. Zgięcie igły strzykawki ułatwia podanie (patrz Rysunek 5C , gdzie można zobaczyć demonstrację iniekcji ICM z użyciem zgiętej igły).
  3. Utrzymuj szczura na plecach na podgrzewanej poduzie chirurgicznej (utrzymywanej w temperaturze 37 °C), aby utrzymać temperaturę ciała po wstrzyknięciu i przez cały czas pobierania próbki.

figure-protocol-4
Rysunek 5: Zarządzanie po operacji. (A) Zamknięte miejsce nacięcia za pomocą szwów jedwabnych. (B) Przybliżone położenie cisterna magna z ogolonym futrem. (C) Podanie ICM kandydata na lek za pomocą strzykawki insulinowej z wygiętą igłą. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

6. Pobieranie próbek limfy i analiza

  1. Zbieraj limfę nieprzerwanie do rurek mikrowirówek pokrytych antykoagulantem, wymieniając je w określonych odstępach czasu (zazwyczaj co godzinę). Przechowywać zebrane próbki w okładach lodowych w chłodni. Zobacz Rysunek 6 , aby zobaczyć pobraną próbkę limfatywną szyjki macicy w probówce mikrowirówki.
  2. Po zakończeniu procesu pobierania limfy uśpij szczura humanitarnie, zgodnie z odpowiednimi protokołami.
  3. Określ przepływ limfy, mierząc objętość limfy zbieranej w każdym planowanym przedziale (co godzinę).
  4. Mierz stężenia leków (lub substancji interesujących) w limfie za pomocą odpowiednich metod analitycznych, w tym HPLC, HPLC-MS lub dostępnych komercyjnie zestawów do testów, aby scharakteryzować kinetykę oczyszczania z OUN przez układ limfatyczny.
  5. Oblicz transport masy leku limfatycznego, mnożąc zmierzone stężenia leku przez odpowiadające mu objętości limfy.

figure-protocol-5
Rysunek 6: Pobieranie próbek limfy. Fotografia jednej pobranej próbki (ok. 100 μL) w rurce mikrowirówki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

7. Obsługa po procedurze i utylizacja odpadów

  1. Tymczasowo przechowuj uśpione szczury w wyznaczonych pojemnikach na odpady medyczne w specjalnym chłodni (np. lodówce), aż zostaną odebrane i utylizowane przez profesjonalny zespół zajmujący się przetwarzaniem odpadów medycznych.
  2. Zbieraj wszystkie wyrzucone ostre przedmioty do wyznaczonego pojemnika na ostre przedmioty, oddzielnego od pozostałych odpadów.
  3. Wszystkie inne nieostre przedmioty użyte w eksperymencie (np. patyczki kosmetyczne, gumki, kantylki PE) należy utylizować do worków na odpady medyczne i nie wyrzucać ich z odpadami domowymi ani ogólnymi. Upewnij się, że do tej torby nie zostaną włożone ostre przedmioty.
  4. Oczyść i zdezynfekować wszystkie pozostałe narzędzia wielokrotnego użytku zgodnie z protokołami laboratoryjnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywny zbiór danych godzinowych przepływów limfy (mL/h) uzyskano za pomocą modelu kanilowości limfy szyjnej (patrz Rysunek 7 dla odpowiedniego wykresu). W tym eksperymencie z udziałem trzech (n = 3) szczurów limfa była zbierana nieprzerwanie do rurek mikrowirówkowych, które były wymieniane co godzinę przez okres 6 godzin.

figure-results-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten ustanawia powtarzalną metodę kaniulowania przewodu chłonnego szyjki u szczurów, umożliwiając ciągłe zbieranie chłonności przez dłuższy czas. Dzięki odpowiedniemu szkoleniu mikrochirurgicznemu, zabieg może być przeprowadzany efektywnie i dostarcza stałe próbki limfy w stabilnych warunkach fizjologicznych, utrzymywanych przez ciągłą anestezję, co czyni go odpowiednim do rutynowych zastosowań eksperymentalnych. Po opanowaniu zabieg chirurgiczny zazwyczaj zajmuje około 40 do 50 minut, co pozwala na przetwarzanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają znanych konkurujących ze sobą interesów finansowych ani relacji osobistych, które mogłyby wpłynąć na prace opisane w tym artykule.

Podziękowania

Autorzy serdecznie dziękują panu Zhenglin Hao oraz pani Jie Zhao z Centrum Eksperymentów Zwierzęcych Chińskiego Uniwersytetu Farmaceutycznego za wsparcie w prowadzeniu eksperymentów na zwierzętach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła 30 gaugeYushou HealthUżywany do łączenia bliższego końca kaniuli (0503) ze strzykawką heparynową
Dozownik znieczulenia z waporyzatoremFirma Instrumentów YYUN
Tępe kleszczeNauki o życiu z napędem na tylne kołaF22002-10 
Patyki watoweQingdao Shultz BiotechnologyMQ-02Używane do tymczasowego utrzymywania tkanki mięśniowej na miejscu
Podgrzewana podkładka chirurgicznaShanghai Yiheng InstrumentsWymiar 15 i razy; 20 cm
Heparyna sodowaTechnologia biochemiczna Szanghajskiego AladynaH123383Przed użyciem wymagane rozcieńczenie
Strzykawka insulinowa (1 mL)Yushou HealthU100-1MLStosowany wyłącznie do wstępnego powlekania heparyny
Roztwór izofluranu do inhalacjiNauki o życiu z napędem na tylne kołaR510-22-10Stosowany do znieczulenia przez waporyzator
MarkeryKażda markaNie ma
Rurka mikrowirówki (1,5 mL)Eksperymentalny sprzęt Nantong HairuiHR10003Wykorzystywany do pobierania limfy
MikronożyczkiNauki o życiu z napędem na tylne kołaGD234BA0007925
Nylonowe szwy chirurgiczne & nbsp;Shanghai Yiheng Instruments4-0 35CM
Pipeta (regulowana objętościowo, zakres pomiarowy od 5 do 50 i mu; L)Dragon Laboratory Instruments Limited7030301006Używany wyłącznie do pomiaru kleju tkankowego
Porady do pipetek Biosharp Nauki o życiuBS-10-TUżywany wyłącznie do przenoszenia kleju tkankowego, bez wymaganej konkretnej objętości
Kanulala polihylenowa (PE) 0,5 mm średnica średnicy, 0,3 mm średnica (0503)AniLab Instrumenty Naukowe (Ningbo)PE-0503
Kanyula poliehylenowa (PE) 0,6 mm średnica średnicy, 0,5 mm średnica (0605)AniLab Instrumenty Naukowe (Ningbo)PE-0605
ŻyletkiGillette ShanghaiQ31/0115000301C004Używany wyłącznie do golenia futra
Gumka gumowaKażda markaNie maWykorzystywane do unieruchamiania przednich kończyn szczurów
WładcaKażda markaNie ma
Ostrza szcapel (#23)Nauki o życiu z napędem na tylne kołaS31010-01
Roztwór chlorku sodu (0,9%) do infuzjiShijiazhuang Nr 4 PharmaceuticalH20066533 (numer zatwierdzenia)Używany wyłącznie do płukania futra
Szczury Sprague-DawleyLaboratorium Rzeki Życiowej w Pekinie – Technologia Zwierząt101Waga od 220 do 250 gramów, bez wymagań wiekowych
Światło chirurgiczneBeijing Heo Bio-TechXHA011-1
Mikroskop chirurgicznyTechnologia Optoelektroniczna Shanghai CeweiSMZ755TMikroskop rozcinający bez mechanicznej sceny może być wyposażony w wysuwaną podstawkę
Klej tkankowy3M Vetbond1469SBGłówny składnik cyjanoakrylan 
Ekspander tkankowy (Colibri)Nauki o życiu z napędem na tylne kołaR22029-04Zakres rozszerzalności 20 mm/4 cm

Bibliografia

  1. Hu, D., et al. Lymphatic system identification, pathophysiology and therapy in the cardiovascular diseases. J Mol Cell Cardiol. 133 (1), 99-111 (2019).
  2. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Compr Physiol. 9 (1), 207-299 (2018).
  3. Moore, J. E. Jr, Bertram, C. D. Lymphatic system flows. Annu Rev Fluid Mech. 50, 459-482 (2018).
  4. Dupont, G., et al. Our current understanding of the lymphatics of the brain and spinal cord. Clin Anat. 32 (1), 117-121 (2019).
  5. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
  6. Xu, J., et al. The lymphatic system: a therapeutic target for central nervous system disorders. Neural Regen Res. 18 (6), 1249-1256 (2023).
  7. Raper, D., Louveau, A., Kipnis, J. How do meningeal lymphatic vessels drain the CNS. Trends Neurosci. 39 (9), 581-586 (2016).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. J Clin Invest. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Salvador, A. F. M., Abduljawad, N., Kipnis, J. Meningeal lymphatics in central nervous system diseases. Annu Rev Neurosci. 47 (1), 323-344 (2024).
  10. Guo, X., et al. Emerging roles of meningeal lymphatic vessels in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 94 (S1), S355-S366 (2023).
  11. Mestre, H., et al. Cerebrospinal fluid influx drives acute ischemic tissue swelling. Science. 367 (6483), eaax7171(2020).
  12. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  13. Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8 (1), 7(2019).
  14. Wu, C., et al. Tauopathy after long-term cervical lymphadenectomy. Alzheimers Dement. 21 (4), e70136(2025).
  15. Fang, Y., et al. A new perspective on cerebrospinal fluid dynamics after subarachnoid hemorrhage: from normal physiology to pathophysiological changes. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (4), 543-558 (2022).
  16. Yen, Y. H., Chen, M. W., Lim, J. X., Chew, K. Y. Exploring lymphovenous anastomosis for Alzheimer's disease: addressing brain lymphatic dysfunction, feasibility, and outcome metrics. Plast Reconstr Surg. , (2025).
  17. Rubenstein, J., Ferreri, A. J., Pittaluga, S. Primary lymphoma of the central nervous system: epidemiology, pathology and current approaches to diagnosis, prognosis and treatment. Leuk Lymphoma. 49 (1), 43-51 (2008).
  18. Camilleri-Broët, S., et al. A uniform activated B-cell-like immunophenotype might explain the poor prognosis of primary central nervous system lymphomas: analysis of 83 cases. Blood. 107 (1), 190-196 (2006).
  19. Papadopoulos, Z., Herz, J., Kipnis, J. Meningeal lymphatics: from anatomy to central nervous system immune surveillance. J Immunol. 204 (2), 286-293 (2020).
  20. Hoang, T. A., et al. Development and application of a novel cervical lymph collection method to assess lymphatic transport in rats. Front Pharmacol. 14 (1), 1111617(2023).
  21. Licastro, E., et al. Glymphatic and lymphatic communication with systemic responses during physiological and pathological conditions in the central nervous system. Commun Biol. 7 (1), 229(2024).
  22. Sarker, A., et al. Intrathecal [(64)Cu]Cu-albumin PET reveals age-related decline of lymphatic drainage of cerebrospinal fluid. Sci Rep. 13 (1), (2023).
  23. Khang, M., et al. Intrathecal delivery of nanoparticle PARP inhibitor to the cerebrospinal fluid for the treatment of metastatic medulloblastoma. Sci Transl Med. 15 (720), eadi1617(2023).
  24. Pizzo, M. E., et al. Intrathecal antibody distribution in the rat brain: surface diffusion, perivascular transport and osmotic enhancement of delivery. J Physiol. 596 (3), 445-475 (2018).
  25. Yan, J., et al. Lymphatic clearance is the main drainage route of lamotrigine-loaded micelles following delivery to the brain. J Pharm Pharmacol. 71 (10), 1488-1496 (2019).
  26. Ringstad, G., Eide, P. K. Glymphatic-lymphatic coupling: assessment of the evidence from magnetic resonance imaging of humans. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 131(2024).
  27. Pan, W. R., Suami, H., Taylor, G. I. Lymphatic drainage of the superficial tissues of the head and neck: anatomical study and clinical implications. Plast Reconstr Surg. 121 (5), 1614-1624 (2008).
  28. Bou-Assaly, W. The forgotten lymph nodes: review of the superficial head and neck lymphatic system. Radiol Imaging. 1 (1), 9-13 (2016).
  29. Yağmurlu, K., et al. Anatomical features of the deep cervical lymphatic system and intrajugular lymphatic vessels in humans. Brain Sci. 10 (12), 953(2020).
  30. Suami, H., Scaglioni, M. F. Lymphatic territories (lymphosomes) in the rat: an anatomical study for future lymphatic research. Plast Reconstr Surg. 140 (5), 945-951 (2017).
  31. Zawieja, D. C., et al. Lymphatic cannulation for lymph sampling and molecular delivery. J Immunol. 203 (8), 2339-2350 (2019).
  32. Hoang, T. A., et al. Quantifying the lymphatic transport of model therapeutics from the brain in rats. Mol Pharm. 21 (5), 2473-2483 (2024).
  33. Hoang, T. A., et al. Acute neuroinflammation alters the transport of a model therapeutic protein from the brain into lymph and blood. Mol Pharm. 21 (10), 5138-5149 (2024).
  34. Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
  35. Trevaskis, N. L., et al. The mesenteric lymph duct cannulated rat model: application to the assessment of intestinal lymphatic drug transport. J Vis Exp. (97), e52389(2015).
  36. Gakuba, C., et al. General anesthesia inhibits the activity of the glymphatic system. Theranostics. 8 (3), 710-722 (2018).
  37. Miao, A., et al. Brain clearance is reduced during sleep and anesthesia. Nat Neurosci. 27 (6), 1046-1050 (2024).
  38. Bachmann, S. B., et al. Differential effects of anaesthesia on the contractility of lymphatic vessels in vivo. J Physiol. 597 (11), 2841-2852 (2019).
  39. Ruscic, K. J., Padera, T. P. Silence of the lymphs: some anaesthetic regimens inhibit lymphatic pumping. J Physiol. 597 (11), 2827-2828 (2019).
  40. Dahan, A., et al. The effect of general anesthesia on the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs: comparison between anesthetized and freely moving conscious rat models. Eur J Pharm Sci. 32 (4), 367-374 (2007).
  41. de Jong, W. H., et al. Long-term cannulation of the vena cava of rats for blood sampling: local and systemic effects observed by histopathology after six weeks of cannulation. Lab Anim. 35 (3), 243-248 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

uk ad limfatyczny m zgukanulacja szczurapobieranie ch onkio rodkowy uk ad nerwowyklirens limfatycznymodel neurozapaleniaklirens lek wpomiar przep ywu ch onki

Powiązane artykuły