Mikrobiota jelitowa i zmiany metabolomiki w cukrzycy typu 2: Wgląd z sekwencjonowania 16S rDNA i bioinformatyki

Podsumowanie

To badanie identyfikuje zmniejszoną różnorodność mikroflory jelitowej i zmienione szlaki metaboliczne w cukrzycy typu 2 (T2DM), podkreślając zwiększoną obecność proteobakterii i zmniejszenie korzystnych taksonów, co sugeruje, że dysbioza mikrobiomu jest związana z T2DM i może przyczyniać się do jej patofizjologii.

Streszczenie

Globalny wzrost częstości występowania cukrzycy typu 2 podkreśla potrzebę lepszego zrozumienia jej podstawowych mechanizmów biologicznych, szczególnie tych związanych z interakcjami gospodarz–mikrobiota. Niniejsze badanie miało na celu charakteryzację różnorodności mikrobioty jelitowej, składu taksonomicznego oraz przewidywanych ścieżek metabolicznych u nowo rozpoznanych pacjentów z cukrzycą typu 2 w porównaniu z dopasowaną grupą niecukrzycową (NM). Świeże próbki kału zostały przeanalizowane za pomocą sekwencjonowania 16S rDNA. Obliczono różnorodność alfa (wskaźniki Chao, ACE, Shannon i Simpson) oraz beta w celu oceny struktury społeczności mikrobioty. Różnice taksonomiczne zostały oceniane za pomocą testów Wilcoxon rank-sum oraz analizy efektu wielkości dyskryminacyjnej liniowej (LEfSe). Przewidywanie ścieżek funkcjonalnych przeprowadzono za pomocą filogenetycznego badania społeczności przez rekonstrukcję niezaobserwowanych stanów (PICRUSt2) na podstawie adnotacji KEGG i MetaCyc. Analiza randomizacji mendelowskiej (MR), obejmująca zwężenie odwrotnej wariancji, MR-Egger oraz ważone metody median, została zastosowana do oceny genetycznie przewidywanych skojarzeń między taksonami mikrobiomu a cukrzycą typu 2. Wyniki wykazały zmniejszoną różnorodność mikrobiomu, co odzwierciedla niższe wskaźniki Chao i ACE, oraz zmienioną strukturę różnorodności, co odzwierciedla niższy wskaźnik Shannon i wyższy wskaźnik Simpson u pacjentów z cukrzycą typu 2, wraz ze znaczącymi przemianami składowymi. Zaobserwowano zwiększoną względną obfitość Proteobakterii i zmniejszoną obfitość korzystnych taksonów, takich jak Lachnospiraceae i Blautia. Przewidywanie funkcjonalne wskazało na zmniejszoną obfitość ścieżek związanych z nieoksydacyjną drogą pentozofosforanową, biosyntezą izobutanolu oraz biosyntezą L-izoleucyny. Analiza MR dostarczyła uzupełniających dowodów na poparcie skojarzeń między określonymi taksonami mikrobiomu a podatnością na cukrzycę typu 2. Podsumowując, cukrzyca typu 2 wiąże się ze zmniejszoną różnorodnością mikrobiomu, zmienioną strukturą różnorodności oraz wyraźnymi zmianami taksonomicznymi i funkcjonalnymi. Te odkrycia podkreślają znaczenie mikrobioty jelitowej w cukrzycy typu 2 oraz wspierają potencjalną przydatność biomarkerów i strategii terapeutycznych opartych na mikrobiomie. Dalsze badania są wymagane, aby zweryfikować te wyniki i wyjaśnić leżące u ich podstaw mechanizmy.

Wprowadzenie

Cukrzyca typu 2 (T2DM) stała się jedną z najszybciej rozwijających się przewlekłych chorób na całym świecie, napędzaną przez szybki rozwój urbanizacji, zachodnie wzorce żywieniowe i coraz bardziej siedzący tryb życia^1,2. Jest to główny czynnik przyczyniający się do globalnej morbidydy i mortalności oraz nakłada znaczne obciążenie na zdrowie publiczne³. Chociaż podatność genetyczna odgrywa rolę, szybki wzrost zachorowalności na T2DM podkreśla znaczenie czynników środowiskowych i metabolicznych⁴. Identyfikowanie modyfikowalnych mechanizmów biologicznych jest zatem niezbędne dla poprawy wczesnego wykrywania i strategii zapobiegania. Ostatnie osiągnięcia wykazały, że mikrobiota jelitowa jest kluczowym regulatorem homeostazy metabolicznej⁵. Mikrobiocenoza jelitowa wpływa na metabolizm glukozy, funkcję odpornościową, integralność bariery jelitowej i przewlekłe, niskoskalowe zapalenie, które są kluczowe dla patogenezy T2DM⁶. Dysbioza była związana z otyłością, opornością na insulinę, endotoksemią i zaburzeniem równowagi energetycznej, co sugeruje łącze mechanizmu między zmianami mikrobiomu a progresją choroby⁷. Ponadto metabolity mikrobiomu, w tym kwasy tłuszczowe krótkołańcuchowe, kwasy żółciowe i rozgałęzione aminokwasy łańcucha, były implikowane w modulacjach wrażliwości na insulinę i metabolizmu żywiciela⁸.

Mimo że rosnące dowody potwierdzają rolę mikrobiomu jelitowego w T2DM, większość istniejących badań opiera się na projektach obserwacyjnych, które ograniczają wnioski przyczynowe. Alternatywne podejścia, takie jak shotgun metagenomics i ukierunkowane metabolomiczne, mogą zapewnić bardziej szczegółowe wglądy funkcjonalne, ale są często ograniczone kosztami, złożonością obliczeniową i ograniczoną wykonalnością w badaniach eksploracyjnych lub pilotażowych. W przeciwieństwie do tego, sekwencjonowanie 16S rDNA jest opłacalną, powszechnie stosowaną metodą profilowania składu społeczności mikrobiomu, choć jego rozdzielczość taksonomiczna jest ograniczona do poziomu gatunku i nie może bezpośrednio ilościowo oceniać metabolitów funkcjonalnych. Dlatego sekwencjonowanie 16S rDNA zostało wybrane w niniejszym badaniu jako opłacalne, skalowalne podejście odpowiednie dla eksploracyjnych kohortow klinicznych, umożliwiając jednocześnie integrację z prognozowaniem funkcjonalnym i uzupełniającymi ramami analitycznymi. Dlatego integracja profilowania mikrobiomu opartego na 16S z prognozowaniem funkcjonalnym bioinformatycznym i uzupełniającymi podejściami, takimi jak randomizacja mendelowska (MR), może zapewnić zrównoważoną ramę dla eksploracji zarówno składowych, jak i potencjalnie przyczynowych relacji.

Warto zauważyć, że nadal istnieje względna niedostateczność danych skupiających się szczególnie na nowo rozpoznanych, niepoddanych leczeniu pacjentach z T2DM. W takich populacjach, zmiany mikrobiomu są mniej podatne na zakłócenia przez interwencje farmakologiczne, szczególnie metforminę, która jest znana z znaczącego przekształcania składu i funkcji mikrobiomu jelitowego⁹. Reprezentuje to istotną lukę w obecnej literaturze, ponieważ wiele istniejących badań obejmuje heterogeniczne populacje pacjentów z różnymi narażeniami na leczenie i ograniczonym integrowaniem profilowania mikrobiomu z genetycznie informowanymi podejściami analitycznymi.

W tym kontekście, niniejsze badanie miało na celu scharakteryzowanie różnorodności mikrobiomu jelitowego, składu taksonomicznego i przewidywanych ścieżek funkcjonalnych u nowo rozpoznanych pacjentów z T2DM w porównaniu z grupą NM, przy użyciu sekwencjonowania 16S rDNA i analizy bioinformatycznej. Ponadto, randomizacja mendelowska została zastosowana z wykorzystaniem publicznie dostępnych danych z genomu całego organizmu w celu zbadania potencjalnych genetycznie przewidywanych związków między określonymi taksonami mikrobiomu a ryzykiem T2DM. Ta połączona strategia analityczna umożliwia uzupełniające wglądy z profilowania społeczności mikrobiomu i danych genetycznych na poziomie populacji. W szczególności sekwencjonowanie 16S rDNA zapewnia bezpośredni charakter składu mikrobiomu w populacji badanej, podczas gdy randomizacja mendelowska wykorzystuje narzędzia genetyczne z niezależnych kohortow do oceny, czy obserwowane związki są zgodne z genetycznie przewidywanymi relacjami. Ta integracja ma na celu rozwiązanie kluczowej ograniczenia badań obserwacyjnych mikrobiomu, dostarczając uzupełniające dowody na poparcie solidności związków mikrobiota-T2DM. Dlatego integracja tych podejść ma na celu zapewnienie walidacji krzyżowej, a nie redundancji, wzmacniając interpretowalność związków mikrobiota-T2DM.

Niniejsze badanie koncentruje się na trzech aspektach. Po pierwsze, ocenia zmiany mikrobiomu jelitowego u nowo rozpoznanych, niepoddanych leczeniu pacjentów z T2DM, aby zmniejszyć zakłócenia związane z interwencjami farmakologicznymi. Po drugie, integruje profilowanie taksonomiczne z przewidywanymi ścieżkami funkcjonalnymi, aby zapewnić systemowy widok zmian metabolicznych związanych z mikrobiomą. Po trzecie, włącza analizę randomizacji mendelowski

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem osób przeprowadzane były pod nadzorem i zatwierdzane przez Komitet Etyczny Szpitala Chongqing Chenjiaqiao (numer zgody 20240131). Pisemną, świadomą zgodę na udział w badaniu uzyskało każde z uczestniczących osób przed pobraniem próbki. Wszystkie próbki kału oraz informacje o uczestnikach były przetwarzane przy użyciu anonimowych kodów badawczych, jak wymieniono w Tabeli materiałów.

Selektorka uczestników i rekrutacja

Nowo rozpoznani pacjenci z cukrzycą typu 2, którzy odwiedzili szpital Chongqing Chenjiaqiao między czerwcem a grudniem 2023 roku, byli przesiewani pod kątem kwalifikacji. Uczestnicy zostali włączeni do grupy DM, jeśli byli w wieku 20-65 lat, mieli nowo rozpoznaną cukrzycę typu 2, zgadzali się oddać świeżą próbkę kału oraz wypełnili wymagane ankiety w zakresie wywiadu lekarskiego i badań klinicznych. Zdrowi ochotnicy rekrutujący się w tym samym okresie zostali włączeni jako grupa kontrolna (NM) i dopasowani do grupy DM pod względem wieku, płci oraz ogólnych cech demograficznych. Osoby zostały wykluczone z udziału w badaniu, jeśli miały zaburzenia hematologiczne, choroby układu nerwowego, aktywną chorobę reumatyczną, chorobę autoimmunologiczną, ostrą lub przewlekłą infekcję przewodu pokarmowego, przewlekłą biegunkę, zaparcia, czynne lub gojące się wrzodzieje przewodu pokarmowego, chorobę wrzodziejącą jelit, zespół jelita drażliwego, gruźlicę jelit, nowotwory przewodu pokarmowego, inne nowotwory złośliwe, ciężką niewydolność serca, ciężką niewydolność wątroby, ciężką niewydolność nerek, inne ciężkie choroby metaboliczne, niedożywienie, niedobór odporności, wrodzone zaburzenia metabolizmu, choroby psychiczne, używanie środków uspokajających lub odurzających, lub nadużywanie narkotyków. Osoby zostały również wykluczone z udziału w badaniu, jeśli przyjmowały antybiotyki, leki hamujące kwas żołądkowy, leki na ruchliwość przewodu pokarmowego, probiotyki, glikokortykosteroidy lub immunosupresanty w ciągu miesiąca przed pobraniem próbki. Ponadto wykluczono osoby, które doświadczyły biegunki, przeszły operację przewodu pokarmowego lub endoskopową oglądarkę przewodu pokarmowego, lub zgłosiły nagłe zmiany w środowisku życia lub nawykach żywieniowych w ciągu miesiąca przed pobraniem próbki. Każdemu kwalifikującemu się uczestnikowi przypisano unikalny kod badania przed pobraniem próbki. Z kwalifikującej się kohorty wybrano 12 nowo rozpoznanych przypadków cukrzycy typu 2 i 12 przypadków grupy kontrolnej do dalszej analizy sekwencji 16S rDNA i mikrobiomu, w oparciu o dostępność próbek i wymagania dotyczące jakości sekwencjonowania.

Pobieranie i przechowywanie próbek kału

Każdemu uczestnikowi udostępniono sterylny pojemnik na kału opatrzony tylko przypisanym kodem badania, aby zapewnić anonimowość. Uczestnikom polecono opróżnić pęcherz przed defekacja, aby zminimalizować zanieczyszczenie moczem, oraz zebrać świeży kał bezpośrednio do sterylnego pojemnika bez kontaktu z wodą toaletową, moczem, środkami dezynfekującymi lub innymi potencjalnymi czynnikami zanieczyszczającymi. Zaraz po pobraniu, około 1-2 g kału przeniesiono do sterylnej rurki kriogenicznej za pomocą sterylnego jednorazowego łyżkowego szczypców. Rurę szczelnie zamknięto i natychmiast umieszczono na zimnym lodzie lub w wstępnie schłodzonej pojemniku transportowym. Wszystkie próbki przewieziono do laboratorium w ciągu 2 godzin od pobrania. Po przybyciu do laboratorium zweryfikowano kod badania i sprawdzono każdą rurkę pod kątem wycieku lub widocznego zanieczyszczenia. Zakres czasu pobrania i przechowywania zapisano dla wszystkich próbek. Następnie próbki kału przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji DNA. Próbki uważano za nadające się do dalszej analizy tylko wtedy, gdy pozostały całkowicie zamrożone podczas przechowywania i transportu oraz nie wykazywały oznak wycieku lub zewnętrznego zanieczyszczenia.

Ekstrakcja DNA

Próbki kału usunięto z przechowywania w temperaturze -80 °C i umieszczono na lodzie przed przetworzeniem. Każdą próbkę rozmrażano tylko do momentu uzyskania możliwości wykonania homogenizacji, aby zminimalizować degradację związaną z wielokrotnymi cyklami zamrażania i rozmrażania. Około 200 mg kału przeniesiono do sterylnej mikroprobówki, a bufor lizyjny dostarczony w zestawie do ekstrakcji DNA z kału dodał się zgodnie z instrukcjami producenta zawartych w Tabeli materiałów. Próbki gwałtownie mieszano przez 30 s, aby osiągnąć całkowitą homogenizację, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5-10 min, aby ułatwić lizę komórek. Po lizie próbki wirowano w temperaturze 4 °C przez 10 min przy prędkości 12 000 x g. Nadstawę ostrożnie przeniesiono do nowej sterylnej mikroprobówki bez zakłócania osiadłego pelletu. Następnie eluowano DNA genomiczne przy użyciu bufora elucyjnego dostarczonego z zestawem lub wody bez nukleaz zgodnie z protokołem produce

Wyniki

Dane demograficzne i kliniczne charakterystyki początkowej przesiewowej kohorty klinicznej są przedstawione w Tabeli 1. Następnie wybrano podgrupy reprezentatywne, składające się z 12 nowo rozpoznanych przypadków T2DM i 12 uczestników NM do sekwencji 16S rDNA i dalszej analizy mikrobiomu.

Ocena głębokości sekwencjonowania

Obliczono indeks Shannona i narysowano krzywą rzadkości, aby ocenić głębokość sekwencjonowania. W sumie wykryto ...

Dyskusja

W ostatnich latach mikrobiom człowieka, szczególnie mikrobiota jelitowa, wyłoniła się jako złożony i wpływowy czynnik w metabolizmie gospodarza, regulacji odporności i rozwoju chorób. W zdrowym gospodarzu mikrobiota jelitowa przyczynia się do homeostazy immunologicznej i integralności bariery jelitowej¹¹. Dysbioza została powiązana z szeregiem stanów patologicznych, w tym zaburzeniami metabolicznymi, chorobami autoimmunologicznymi i nowotworami^12,

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16S rRNA Primers (V3–V4)	Sangon Biotech	Custom	Uniwersalne primery dla bakteryjnego regionu 16S
80 °C Freezer	Haier Biomedical	DW-86L626	Długotrwała przechowywanie próbek
Agarose Gel System (Sub-Cell GT)	Bio-Rad	170-4401	Walidacja produktu PCR
AMPure XP Magnetic Beads	Beckman Coulter	A63880	Oczyszczanie DNA i selekcja wielkości
Bead-beating Tubes (Lysing Matrix E)	MP Biomedicals	116913050	Mechaniczne lizysowanie komórek mikrobiowych
Bioinformatics Workstation	Dell	Precision 7920	Analiza danych za pomocą QIIME2 i R
DADA2 pipeline	Bioconductor	Version 1.28	Filtracja sekwencyj i generowanie ASV; https://benjjneb.github.io/dada2
Deblur	QIIME2	Version 2023.5	Filtracja sekwencyj i korekcja błędów; https://docs.qiime2.org
European Genome-Phenome Archive	EMBL-EBI	EGAS00001005020	Publiczny repozytorium danych metagenomicznych; https://ega-archive.org
GWAS Catalog	NHGRI-EBI	Accessions GCST90032172–GCST90032644	Publiczna baza danych z podsumowaniem skojarzeń genomowych; https://www.ebi.ac.uk/gwas
Illumina MiSeq Sequencing System	Illumina	SY-410-1003	Platforma sekwencji o wysokiej wydajności
KEGG database	Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes	Release 107	Baza danych dotyczących funkcyjnych ścieżek; https://www.genome.jp/kegg
MetaCyc database	SRI International	Version 27.1	Baza danych dróg metabolicznych; https://metacyc.org
Microcentrifuge	Eppendorf	5424R	Centryfuga chłodząca do przygotowania próbki
Nextera XT Library Prep Kit	Illumina	20018705	Preparaty do biblioteki do sekwencjonowania
PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix)	Takara Bio	RR350A	Do wysokiej wierności PCR
PCR Thermocycler	Bio-Rad	T100	Instrument do amplifikacji PCR
PICRUSt2	PICRUSt2 Development Team	Version 2.5.2	Predykcja funkcyjnej ścieżki z danych sekwencjonowania 16S rDNA; https://github.com/picrust/picrust2
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Ekstrakcja DNA z próbek kału
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704	Oczyszczanie DNA z żelu agarozowego
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33226	Ilościowe określanie DNA
R software	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.3.1	Analiza statystyczna i analiza randomizacji Mendelowskiej; https://www.r-project.org
SILVA 138 database	SILVA ribosomal RNA database project	Release 138	Baza danych referencyjna do analizy taksonomicznej; https://www.arb-silva.de
Stool Collection Tube	Sarstedt	76.9923.001	Sterylna rura do pobierania próbek kału
Stool DNA Kit	Omega	D4015-02	Zestaw do ekstrakcji DNA
TwoSampleMR package	MR-Base	Version 0.5.7	Analiza randomizacji Mendelowskiej w R; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR